1 Módulo Iv

MÓDULO IV: MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS
Generalidades
ANÁLISIS QUÍMICO INSTRUMENTAL
SANDRA LILIANA MOLINA CORREA
UNIVERSIDAD DE LA SABANA
2
Orígenes de la Cromatografía
En 1906, el botánico Ruso Mikhail Tswett

colocó un extracto de pigmentos
vegetales en la parte superior de una
columna de vidrio rellena de carbonato
de calcio. Al agregar éter, observó que
la mezcla original se separaba en
diversas bandas coloridas que
descendían a través de la columna a
diferentes velocidades.
Imagen tomada de: Skoog, D.A.; Holler, F.J.; West, D.M; Crouch, S.R. (2015) Fundamentos de Química Analítica.
México: Cengage Learning Editores. Pág 864
Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa
3
¿QUÉ ES CROMATOGRAFÍA?
La cromatografía es un método
físico de separación en el que los FASE MÓVIL
componentes a separar se Soluto
distribuyen entre dos fases, una
de las cuales constituye un lecho
estacionaria de gran amplitud Soluto
superficial, y la otra es un fluido FASE ESTACIONARIA
que pasa lo largo del lecho
estacionario
4
CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS
CROMÁTOGRÁFICOS
ESTADO FÍSICO DE LA FASE

ESTACIONARIO Y FASE MÓVIL
CLASIFICACIÓN DE
LOS MÉTODOS FUNDAMENTO DE SEPARACIÓN
CROMATOGRÁFICOS
MEDIO EN EL QUE SE ENCUENTRA

LA FASE MÓVIL Y ESTACIONARIA
5
CROMÁTOGRÁFICOS

CLASIFICACIÓN DE
CROMATOGRÁFICOS

6
CROMÁTOGRÁFICOS
La fase móvil puede ser un líquido o

un gas, y la fase estacionaria un
sólido o una película líquida sobre
un sustrato sólido. Con frecuencias
para indicar el nombre de la
técnica cromatográfica se indica
primero el tipo de fase móvil
seguido por la fase estacionaria.

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS 7
CROMÁTOGRÁFICOS: ESTADO FÍSICO DE LA
FASE ESTACIONARIO Y FASE MÓVIL

ESTACIONARIA Y MÓVIL
Líquido-Sólido Gas-Sólido Líquido-Líquido Gas-Líquido
La fase estacionaria
La fase estacionaria La fase estacionaria es un líquido no
es un líquido
es un sólido y la es un sólido y la volátil impregnada
anclado a un
móvil un líquido móvil un gas en un sólido y la
soporte sólido
fase móvil es un gas

8
CROMÁTOGRÁFICOS

CLASIFICACIÓN DE
CROMATOGRÁFICOS

9
CROMÁTOGRÁFICOS

CROMATOGRAFÍA
CLASIFICACIÓN DE LOS LÍQUIDA
MÉTODOS FUNDAMENTO DE SEPARACIÓN
CROMATOGRÁFICOS CROMATOGRAFÍADE
GASES


10
FUNDAMENTO DE SEPARACIÓN
La cromatografía se divide en varias categorías en función del

mecanismo de interacción del soluto con la fase estacionaria. Como
se muestra en el siguiente diagrama:
MECANISMO DE SEPARACIÓN
INTERCAMBIO EXCLUSIÓN
ADSORCIÓN PARTICIÓN AFINIDAD
IÓNICO POR TAMAÑO

11
IÓNICO POR TAMAÑO

Fundamento 12
ADSORCIÓN
Fase
estacionaria
Fase móvil
Tipo de
analitos
Orden de
elución
ADSORCIÓN 13
Fuerzas de Van
der Waals
Fundamento
ADSORCIÓN
Dipolo-dipolo
Fase
estacionaria Puentes de
hidrógeno
Fase móvil
Tipo de analitos
Orden de
elución
Insoluble en la fase
móvil 14
ADSORCIÓN Fundamento
Inerte
químicamente
Fase estacionaria
Tamaño de
partícula pequeño
Fase móvil
ALUMINA
Incoloro
Tipo de analitos
Ambas fases SILICA GEL

Orden de elución estacionarias son
polares
15
Solventes de
Fundamento
polaridad baja
ADSORCIÓN
Fase Solventes de
estacionaria polaridad media
Poder de elución
Elección
Fase móvil
depende de:
Serie eluotrópica
Tipo de analitos
Constante:
isocrático
Orden de Comúnmente en
elucion mezcla
Variable:
gradiente
Valor
Menor poder Solvente Polaridad
eluotrópico (ε°)
de elución
Pentano, 0 0,1 16
hexano, heptano
Xileno 0,22 2,5
Tolueno 0,22 2,4
Dietil éter 0,29 2,8
Diclorometano 0,30 3,1
ADSORCIÓN
Cloroformo 0,31 4,1

Acetona 0,43 5,1 SERIE
Dioxano 0,43 4,8
THF 0,48 4,0 ELUOTRÓPICA
MTBE 0,48 2,5
Acetato de etilo 0,48 4,4
DMSO 0,50 7,2
Acetonitrilo 0,52 5,8
Isopropanol 0,60 3,9
Etanol 0,68 4,3
Mayor poder
de elución Metanol 0,73 5,1
Agua Muy grande 10,2 Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa
17
Solventes de
Fundamento
polaridad baja
ADSORCIÓN
Fase Solventes de
estacionaria polaridad media
Poder de elución
Elección
Fase móvil
depende de:
Serie eluotrópica
Tipo de analitos
Constante:
isocrático
Orden de Comúnmente en
elucion mezcla
Variable:
gradiente
Permite obtener valores intermedios en la serie eluotrópica sin
cambiar la naturaleza química de la fase móvil
18
Es posible modificar el poder de

elución durante la separación
con un gradiente dinámico
Primero se favorece Usar fase móvil más

la retención apolar
Al final se favorece Usar fase móvil más

Imagen tomada de: (Pág. 47)
la elución polar https://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/cromatogr
afia_liquida_de_alta_eficacia.pdf
Fundamento 19
ADSORCIÓN
Fase
estacionaria
Solubles en la
Fase móvil
fase móvil
Compuestos de
Tipo de analitos
polaridad baja
Orden de Compuestos de
elución polaridad media
Fundamento 20
ADSORCIÓN
Fase
estacionaria
Fase móvil
Tipo de analitos
Primero Más apolares
Orden de
elución
Final Más “polares”
21
IÓNICO POR TAMAÑO

FE y FM líquidas 22
FE: Líquido A través de
PARTICIÓN
sobre sólido enlace químico
Fuerzas de Van Algo de
der Waals adsorción
Fundamento
Dipolo-dipolo
PARTICIÓN
Fase
estacionaria Puentes de
hidrógeno
Fase móvil
Tipo de analitos
Orden de
elución
Imagen tomada de (Pág 117): https://edu.rsc.org/download?ac=13852
móvil 23
Fundamento
Inerte
PARTICIÓN
químicamente
Fase estacionaria
Tamaño de
partícula pequeño
Fase móvil
Incoloro
Tipo de analitos
Pueden ser polares o no polares

Orden de elución

Fundamento 24
FE. Polar: Int.
Fase normal
hidrofílicas
PARTICIÓN
Fase estacionaria
FE. Apolar: Int.
Fase reversa
hidrofóbicas
Fase móvil
Menos polar Más polar
Tipo de analitos C18-C8
Fenilo (-C6H5)
Nitrilo (CN)
Orden de elución
Silica (SiO2)
En la actualidad, la cromatografía de reparto
se emplea en cerca del 80% de los estudios
Amina NH2
que involucran cromatografía
Diol
25
Preparación de las fases ligadas
Imagen tomada de: Rouessac, F.; Rouessac, A. (2007) Chemical Analysis: Modern
Instrumentation Methods and Techniques. Inglaterra: John Wiley & Sons Ltd. Pág 74
Polaridad baja 26
Fase Normal
PARTICIÓN Fundamento a media
Polaridad
Fase Fase reversa
media a alta
estacionaria
Poder de
Fase móvil Elección elución
depende de: Serie
Tipo de analitos eluotrópica
Constante:
Orden de isocrático
elucion Comúnmente
en mezcla Variable:
gradiente
Valor
Solvente Polaridad
eluotrópico (ε°)
Pentano, 0 0,1 Menor poder 27
hexano, heptano de elución
Mayor poder
de elución Xileno 0,22 2,5
Tolueno
Dietil éter
0,22
0,29
2,4
2,8
SERIE
Diclorometano 0,30 3,1 ELUOTRÓPICA
Cloroformo 0,31 4,1
FASE REVERSA
FASE NORMAL
Acetona 0,43 5,1
Dioxano 0,43 4,8
THF 0,48 4,0
MTBE 0,48 2,5
DMSO 0,50 7,2
Isopropanol 0,60 3,9
Etanol 0,68 4,3
Menor poder Metanol 0,73 5,1 Mayor poder
de elución Agua Muy grande 10,2 de elución
28
Fundamento
Solventes de
PARTICIÓN
Fase polaridad media

estacionaria
Solventes de
polaridad alta
Fase móvil
Elección
depende de: Constante:
Tipo de analitos
Comúnmente en isocrático
Orden de mezcla Variable:

elucion gradiente
Imagen tomada de: Rouessac, F.; Rouessac, A. (2007) Chemical Analysis: Modern Instrumentation
Methods and Techniques. Inglaterra: John Wiley & Sons Ltd. Pág 77
29
Fundamento
PARTICIÓN
Fase
estacionaria
Solubles en la
Fase móvil
fase móvil
Tipo de De polaridad
Fase normal
analitos baja a media
Orden de De polaridad
Fase reversa
elución media a alta
Fundamento 30
PARTICIÓN
Fase
estacionaria
Fase móvil
Tipo de analitos
Del menos polar
Fase normal
Orden de al más polar
elución Del más polar al
Fase reversa
menos polar
PARTICIÓN O REPARTO: Fase normal vs Fase reversa
CARACTERISTICA FASE NORMAL FASE REVERSA 31
Fase
Polar Apolar
estacionaria
Fase móvil De polaridad baja a media De polaridad alta a media
Tipo de analitos Separa analitos de polaridad Separa analitos de polaridad
a separar baja a media alta a media
Los analitos muy polares, se
Los analitos muy apolares, se
retienen indefinidamente y, los
Analitos retienen indefinidamente y, los
muy apolares no se retienen, ni
problema muy polares no se retienen, ni
levemente (No es
levemente (No es conveniente).
conveniente).
Desde el solvente con mayor al
Desde el solvente con menor al
de menor valor en la serie
de mayor valor en la serie
Gradiente eluotrópica (del más polar al
eluotrópica (del menos polar al
menos polar que se vaya a
más polar que se vaya a usar)
usar)
32
EJERCICIO
Indique que condiciones debe tener la fase estacionaria, la fase móvil, la forma en que
se haría un gradiente y el orden de elución, al querer separar los compuestos que se
muestran a continuación, usando:
a) Fase normal
b) Fase reversa
COMPUESTO 1 COMPUESTO 2 COMPUESTO 3 COMPUESTO 4

33
IÓNICO POR TAMAÑO

Interacciones
electrostáticas 34
Pueden ser con partículas

Fundamento Ion-ion
INTERCAMBIO IÓNICO
que presentan cargas

puntuales o tienen un
dipolo (moléculas polares)
Fase
Ion dipolo
estacionaria
Fase móvil + +
- -
REPULSIÓN
Tipo de analitos
Orden de
elución
+ - ATRACCIÓN
• Los intercambiadores aniónicos también son conocidos como SAX o WAX, por strong o weak
anion Exchange
• Los intercambiadores catiónicos también son conocidos como SCX o WCX, por strong o weak
cation Exchange
35
Fundamento
INTERCAMBIO IÓNICO
Intercambiador
Catiónica
aniónico
Fase estacionaria
Intercambiador
Aniónica
Menos polar
catiónico Más polar
Fase móvil
Tipo de analitos
Orden de elución
36
usualmente es una resina
polimérica, en la cual se usa
como agente entrecruzante
divinilbenceno y para hacer
la red poliestireno, al cual se
une covalentemente un
grupo funcional iónico
Imagen tomada de: Harvey, D. (2000) Modern Analytical Chemistry. Boston: Mc Graw Hill. Pág 591 Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa
37
FUNDAMENTO DE SEPARACIÓN:
Intercambio iónico
 Intercambiadores catiónico
TIPO GRUPO FUNCIONAL (R) EJEMPLOS
fuerte, funcionan entre 1 a
Intercambiador Ácido sulfónico -SO3- 14
catiónico fuerte (Sulfonatos) -CH2CH2SO3-
Intercambiador Ácido carboxílico -COO-  Intercambiadores catiónico
catiónico débil (Carboxilato) -CH2COO- débil, funcionan entre 4 a
Intercambiador Amina cuaternario -CH2N(CH3)3+ 14
aniónico fuerte (Amonio) -CH2CH2N(CH2CH3)3+  Intercambiadores aniónicos
Intercambiador Amina protonada -NH3+ fuerte, funcionan entre 0 a
aniónico débil (Amonio) -CH2CH2NH(CH2CH3)2+ 13
Los ácidos sulfónicos y las aminas cuaternarias son fuertes (ácidos y bases).  Intercambiadores aniónicos
Los ácido carboxílicos y las aminas protonadas son débiles (ácidos y bases). débil, funcionan entre 0 a 9
EJEMPLO DE SEPARACIÓN
38
La fase estacionaria es negativa, es

decir es un anión, y permite la OPCIÓN
interacción con cationes. Es una resina 1
de intercambio catiónico
La fase estacionaria es positiva, es

decir es un catión, y permite la OPCIÓN
interacción con aniones. Es una resina
de intercambio aniónico
2

39
Fundamento El agua es el mejor solvente para mantener estables los
INTERCAMBIO IÓNICO
iones y las sustancias polares, por su alta constante
dieléctrica
Fase
estacionaria Buffer (pH
Agua
intermedio)
Fase móvil
Modificador de Ácido fuerte
pH (pH ácido)
Tipo de analitos
Base fuerte (pH
Orden de básico)
elución El modificador de pH ayuda a mantener la especie iónica
en ese estado, en caso de que pueda protonarse o
Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa desprotonarse y convertirse en una molécula neutra
40
Intercambio iónico
INTERCAMBIO CATIÓNICO INTERCAMBIO ANIÓNICO
BUFFER RANGO DE pH BUFFER RANGO DE pH
Ácido láctico 3,6-4,3 Piridina 4,9-5,6
Ácido cítrico 4,2-5,2 L-histidina 5,5-6,0
Ácido acético 4,8-5,2 Bis-Tris 5,8-7,2
MES 5,5-6,7 Imidazol 6,6-7,1
PIPES 6,1-7,5 Trietanolamina 7,3-8,3
MOPS 6,5-7,9 Tricina 7,4-8,8
Fosfato 6,7-7,6 Tris 7,5-8,0
HEPES 6,8-8,2 Bicina 7,6-9,0
FASE MÓVIL: H2O TES

Tricina
7,2-7,8
7,4-8,9
Dietanolamina
Dietilamina
8,4-8,8
9,5-11,5
41
INTERCAMBIADOR
CATIÓNICO
La mayoría
de los
Buffer ácido
cationes son OPCIÓN
HCOOH/HCOONa
pH 4
estables en 1
fases móviles
ácidas
INTERCAMBIADOR
La mayoría de
ANIÓNICO
los aniones
Buffer básico
NH3/CH3COONH4
son estables OPCIÓN
pH 8
en fases
móviles
2
básicas

42
INTERCAMBIO IÓNICO Fundamento
Fase
estacionaria
Fase móvil Cationes

Compuestos
Tipo de iónicos
Aniones
analitos Compuestos
Orden de neutros polares
elución
43
Intercambio iónico
Seleccionando la resina adecuada
Interactúa Por lo
Resina
Catiónico con Fase tanto es
aniónica o de
estacionaria
(+) intercambio
aniónica
catiónico
ANALITOS
IÓNICOS
Interactúa Por lo Resina
Aniónico con Fase tanto es catiónica o
estacionaria de
(-) catiónica intercambio
aniónico
Analitos que son neutros pero polares, podría usarse cualquiera de las dos
44
COMPUESTO A COMPUESTO B
45
INTERCAMBIADOR
CATIÓNICO
Buffer ácido OPCIÓN

HCOOH/HCOONa
pH 4 1
COMPUESTO B
INTERCAMBIADOR
ANIÓNICO
Buffer básico
NH3/CH3COONH4
OPCIÓN
pH 8 2
COMPUESTO A
46
Fundamento
INTERCAMBIO IÓNICO
Fase estacionaria
Fase móvil
Tipo de analitos
Cambios en la
Adicionar una sal
fuerza iónica
Depende de la
Orden de elución
carga
Adicionar un buffer,
Cambios en el pH
ácido o base
47
Intercambio iónico
Orden de elución
Últimos en salir Primeros en salir
Compuestos
Compuestos
con carga Compuestos Compuestos
GRUPO GRUPO GRUPO GRUPO igual carga
opuesta de neutros neutros
4 la fase 3 polares 2 apolares 1 de la fase
estacionaria
estacionaria
• El grupo 3, saldrán en orden del menos polar al • Es posible que el grupo 1 y 2, salgan al mismo
más polar. tiempo
• Si se controla la fuerza iónica, sale del de • Si existen varias compuestos que están en estos
menos carga, al de mayor. Si es pH, depende dos grupos, entre ellos no se logran separar.
de los valores de pKa

Intercambio iónico 48
Cromatografía iónica de agua de
estanque. Los cromatogramas en la parte
superior es de una mezcla de estándares.
La concentración en los cromatogramas
de abajo son de los iones presentes en la
muestra de agua de estanque y sus
unidades son ppm. Para el análisis de los
aniones se uso una columna IonPac AS14 y
como eluente 1,0mM NaHCO3/3,5 mM
Na2CO3 con supresor de iones y un
detector de conductividad. Para el análisis
de los cationes se uso una columna IonPac
CS12A con un eluente 11 mM H2SO4, con
supresor de iones y un detector de
conductividad.
Imagen tomada de: Harris, D.C. (2010) Quantitative Chemical Analysis.

Nueva York: W. H. Freeman and Company. Pág 643

49
EJEMPLO DE SEPARACIÓN: OPCIÓN 1
Buffer ácido
HCOOH/HCOONa
pH 4
INTERCAMBIADOR CATIÓNICO COMPUESTO B

50
Intercambio iónico

51
Intercambio iónico

52
Intercambio iónico

53
Buffer básico
NH3/CH3COONH4
OPCIÓN
pH 8 2
COMPUESTO A

54
EJERCICIO
Indique que condiciones debe tener la fase estacionaria, la fase

móvil, la forma en que se haría un gradiente y el orden de
elución, al querer separar los compuestos que se muestran a
continuación, usando cromatografía de intercambio iónico
COMPUESTO 1 COMPUESTO 2 COMPUESTO 3 COMPUESTO 4 COMPUESTO 5

55
IÓNICO POR TAMAÑO

Diferencia de
56
tamaño
Filtración por gel Para moléculas
Fundamento
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
(GFC) hidrosolubles
Tipos
Permeación por Para moléculas
Fase estacionaria
gel (PFC) insolubles en agua
Fase móvil
Tipo de analitos
Orden de elución

No interactúa con el
analito 57
Fundamento Es un polímero
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
Poros diferentes y
Fase estacionaria
definidos
Algunos pueden
Fase móvil
hincharse
Posible: curvas de
Tipo de analitos
calibración por peso
Orden de elución
Imagen tomada de: Harris, D.C. (2010) Quantitative Chemical Analysis. Nueva York: W. H.
Freeman and Company. Pág 637 y 648

No debe disolver a
Fundamento
la fase estacionaria
58
Debe humectar a
EXCLUSIÓN POR
Fase estacionaria
la fase estacionaria
TAMAÑO
Fase móvil De baja viscosidad
ELUYENTE USO TEMPERATURA

Tipo de analitos THF General, varios polímeros y oligómeros Amb. a 40°C
o-Diclorobenceno Poliolefinas 130-150°C
1,2,4-triclorobenceno Poliolefinas 130-150°C
Tolueno Cauchos y elastómeros Amb. a 90°C
Orden de elución m-Cresol Poliamidas, poliésteres 100°C
Cloroformo Siliconas, resinas epoxi Ambiente
Dimetilformamida Poliuretanos, acrilnitrilos Amb. a 100°C
Triluoroetanol Poliamidas Amb. a 40°C
Polímeros biológicos, gelatina, Amb. a 90°C
poliacrilatos, polidextranos,
Agua
poliglicoles, poliacrilamidas, pulpa de
papel, polisácaridos
EXCLUSIÓN POR
Fundamento 59
Fase estacionaria
Moléculas de
TAMAÑO
diferentes tamaños
(ΔPM>10%)
Fase móvil
Principalmente
polímeros
Tipo de analitos
Biopolímeros Filtración por gel
Orden de elución
Permeación o
Polímeros sintéticos
filtración por gel

EXCLUSIÓN POR TAMÑO Fundamento 60
Fase
estacionaria
Fase móvil
Tipo de
analitos
Orden de
elución
61
IÓNICO POR TAMAÑO

FE y FM líquidas
FE: Líquido sobre A través de enlace

62
PARTICIÓN
sólido químico
Fuerzas de Van der

Algo de adsorción
Waals
Dipolo-dipolo
Fundamento
Puentes de
hidrógeno ENANTIÓMERO
AFINIDAD
Fase estacionaria
FORMACIÓN DE
DIASTEREOISOMÉROS
Fase móvil
UNIÓN LLAVE- DIASTEREOISÓMERO DIASTEREOISÓMERO DIASTEREOISÓMERO
CERRADURA
Tipo de analitos
Orden de elución ENANTIÓMERO

FE y FM líquidas 63
FE: Líquido sobre A través de enlace
PARTICIÓN
sólido químico
Fuerzas de Van der

Algo de adsorción
Waals
Dipolo-dipolo
Enlace
covalente del
Fundamento
grupo SUSTRATO
Puentes de
hidrógeno espaciador
AFINIDAD
Fase estacionaria
FORMACIÓN DE
DIASTEREOISOMÉROS
Fase móvil MATRIX
UNIÓN LLAVE- GEL
CERRADURA
Tipo de analitos
LIGANDO
Orden de elución Enlace

especifico
reversible
móvil 64
Inerte
químicamente
Fundamento
Tamaño de
AFINIDAD
partícula pequeño
Fase estacionaria
Incoloro
Fase móvil
Fase normal
Tipo de analitos
Fase reversa
Orden de elución
Pueden ser polares o no polares

Polaridad baja 65
Fase Normal
Fundamento a media
Polaridad
AFINIDAD
Fase Fase reversa
media a alta
estacionaria
Poder de
Fase móvil Elección elución
depende de: Serie
Tipo de analitos eluotrópica
Constante:
Orden de isocrático
elucion Comúnmente
en mezcla Variable:
gradiente
Valor
Solvente Polaridad
eluotrópico (ε°)
Pentano, 0 0,1 Menor poder 66
hexano, heptano de elución
Mayor poder
de elución Xileno 0,22 2,5
Tolueno
Dietil éter
0,22
0,29
2,4
2,8
SERIE
Diclorometano 0,30 3,1 ELUOTRÓPICA
Cloroformo 0,31 4,1
FASE REVERSA
FASE NORMAL
Acetona 0,43 5,1
Dioxano 0,43 4,8
THF 0,48 4,0
MTBE 0,48 2,5
DMSO 0,50 7,2
Isopropanol 0,60 3,9 Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa
Etanol 0,68 4,3

Menor poder Metanol 0,73 5,1 Mayor poder
de elución Agua Muy grande 10,2 de elución
67
Fundamento
Solventes de
polaridad media
AFINIDAD
Fase
estacionaria Solventes de
polaridad alta
Fase móvil
Elección
depende de: Constante:
Tipo de analitos
Comúnmente en isocrático
Orden de mezcla Variable:

elucion gradiente
Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa Instrumentation Methods and Techniques. Inglaterra: John Wiley & Sons Ltd. Pág 77
68
AFINIDAD Fundamento
Fase estacionaria
Solubles en la fase
móvil
Fase móvil
De polaridad baja a
Fase normal
media
Tipo de analitos
De polaridad media
Fase reversa
a alta
Orden de elución
Puede separar
compuestos quirales
Fundamento 69
AFINIDAD Fase estacionaria
Fase móvil
Del menos polar al

Tipo de analitos Fase normal
más polar
Del más polar al

Orden de elución Fase reversa
menos polar
En ambos modos
separa enantiómeros

70
Al momento de
seleccionar el método
cromatográfico
correcto, hay que tener
en cuenta su masa
molecular, solubilidad y
polaridad
Imagen tomada de: Skoog, D.A.; Holler, F.J.; West, D.M; Crouch, S.R. (2015)
Fundamentos de Química Analítica. México: Cengage Learning Editores. Pág 914

EJERCICIO
71
Los siguientes compuestos se encuentran disueltos sustentar lo propuesto es:
en un solvente ideal en el cual, todos son solubles
 Fundamento de la separación (indicar porque
o miscibles. El objetivo es purificarlos y tener cada
este es el adecuado para separar el o los
uno por parte, para tal fin, debe hacer uso
compuestos)
ÚNICAMENTE de técnicas cromatográficas.
 Fase estacionaria (debe indicar la estructura
 2-butanol (mezcla racémica)
química, mencionar las características de esta
 2-butanona fase estacionaria y buscar una referencia
comercial de la fase estacionaria propuesta)
 5-hidroxi-1,3-nonadieno
 Fase móvil (de ser posible, hacer la elución en
 Ácido 4-hidroxibenzoico forma de gradiente, y explicar cómo se debe
 Actina
realizar las modificaciones de está)
 Orden de elución (justificar la respuesta de
 Citrato de calcio
acuerdo a la estructura química de los
 Glutamato de sodio compuestos y el fundamento de la separación.
 Ribonucleasa A NOTA: Realizar el proceso en el menor número
posible de etapas. Entregar en word
La información que debe indicar y que ayudará a
72
CROMÁTOGRÁFICOS

CROMATOGRAFÍA
CLASIFICACIÓN DE LOS LÍQUIDA
MÉTODOS FUNDAMENTO DE SEPARACIÓN
CROMATOGRÁFICOS CROMATOGRAFÍADE
GASES


¿Qué compuestos pueden ser 73
analizados por cromatografía de
gases?
Las mezclas que presenten

compuestos cuyos puntos de
ebullición sean máximo de 300°C
y sean térmicamente estables,
pueden ser separadas por
cromatografía de gases.

74
Proceso cromatográfico
La muestra se volatiliza y se Fase Fase

inyecta en la cabeza de la móvil estacionaria
columna cromatográfica, entra
en esta arrastrada por la fase Fase
móvil e interactúa con la fase móvil
estacionaria. El orden de elución
de los componentes gaseosos Fase
dependerá principalmente de la móvil
temperatura de ebullición de los
componentes y de sus Este componente es el más volátil de la mezcla
interacciones con la fase
Este componente es el menos volátil de la mezcla
estacionaria.
75
EJERCICIO
Se tiene la siguiente mezcla de compuestos, y se desea hacer la

separación usando dos técnicas cromatográficas diferentes; la primera
es cromatografía en fase normal y la segunda por cromatografía de
gases. Prediga el orden de elución de los compuestos en ambos
procesos
COMPUESTO 1 COMPUESTO 2 COMPUESTO 3 COMPUESTO 4

76
CROMÁTOGRÁFICOS

CLASIFICACIÓN DE
CROMATOGRÁFICOS

CROMÁTOGRÁFICOS: MEDIO EN EL QUE SE
ENCUENTRA LA FASE MÓVIL Y ESTACIONARIA

PLANA COLUMNA
PAPEL CAPA FINA RADIAL LÍQUIDA GASES


PLANA COLUMNA

79
CROMATOGRAFÍA PLANA
Los métodos de cromatografía

pana una lámina delgada como
fase estacionaria y la fase móvil
se mueve a través de esta, ya
sea hacia arriba (cromatografía
ascendente), hacia abajo
(cromatografía descendente) u
horizontalmente (cromatografía
radial)

PLANA COLUMNA

81
Cromatografía en papel
La fase estacionaria está constituida por una tira de

papel. La muestra se deposita en un extremo
colocando pequeñas gotas de la disolución y
evaporando el disolvente. Luego el disolvente
empleado como fase móvil se hace ascender por
capilaridad. La separación se realiza en función de la
afinidad de los solutos con las dos fases, agua y el
solvente elegido como fase móvil.
La hoja de papel de celulosa de elevada pureza

recubierta de una capa de agua asociada a las fibras
de celulosa.
Imagen tomada de: Kirkland, K. (2014). The Basics of Biochemistry.
Nueva York: The Rosen Publishing Group, Inc. Pág 83 Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

PLANA COLUMNA

83
Cromatografía en capa fina
La cromatografía en capa fina se basa

en la preparación de una capa,
uniforme de un absorbente mantenido
sobre una placa, la cual puede ser de
vidrio, aluminio u otro soporte. La fase
móvil es líquida y la fase estacionaria
puede ser sólida o líquida. La fase
estacionaria y la fase móvil pueden ser
Imagen tomada de: Rouessac, F.; Rouessac, A. (2007) Chemical
Analysis: Modern Instrumentation Methods and Techniques. Inglaterra:
polar o apolar, con afinidades inversas.
John Wiley & Sons Ltd. Pág 119

Cromatografía en capa fina 84
La mezcla a analizar se deposita a una

pequeña distancia del borde inferior de
la placa y se introduce en una cubeta
que contiene la fase móvil, que
asciende a lo largo de la placa por
capilaridad, desplazando a los
componentes de la mezcla a diferentes
Caso 1:
Fase estacionaria apolar
velocidades, lo que provoca su
Fase móvil polar separación. Cuando el frente del
disolvente se encuentra próximo al
Caso 2:
Fase estacionaria polar extremo superior de la placa esta se
Fase móvil apolar saca y se visualiza.
85
Cromatografía en capa fina: Fase
estacionaria
TIPO ESPESOR TAMAÑO DE PARTÍCULA TAMAÑO DE MUESTRA

(µm) (µm) (µL)
Regular 250 10-12 >1
Portaobjetos <250 10-12 <1
Alta resolución ±150 5-6 0,05-0,5
Preparativa 500-2000 5-40 150 (aplicación en banda)
Existen diferentes tipos de cromatografía en capa fina, usando como

criterio de clasificación el tamaño de partícula de la fase estacionaria
empleada

86
estacionaria
FASE ESTACIONARIA USOS

Silica gel General
Silica gel modificada General
Alúmina General
Celulosa Compuestos inorgánicos, aminoácidos, Nucleótidos
Kieselguhr (tierra de diatomeas) Azúcares
Celulosa modificada Nucleótidos, Fosfolípidos
Geles de sephadex Macromoléculas
La naturaleza de la fase estacionaria puede ser diversa, haciendo posible

que los diferentes mecanismos de separación puedan presentarse en TLC
87
móvil
La fase móvil que se seleccione es

dependiente del mecanismo de separación:
Adsorción, partición y afinidad: Solventes

polares y/o apolares.
Intercambio iónico: Soluciones acuosas,

buffers
Exclusión por tamaño: Soluciones acuosas

con MeOH, principalmente
88
móvil
Al momento de seleccionar la fase

móvil, se debe tener en cuenta:
• Precio
• Pureza: Grado analítico o HPLC
• Mezcla
• Volatilidad
• Trazas de metales
• Amigable con el medio ambiente
89
Cromatografía en capa fina:
Detección
La visualización de los componentes en el caso de ser

compuestos coloreados es sencillo, para los
compuestos incoloros, es necesario el uso de
indicadores.
En las placas comerciales se les adiciona un

agente fluorescente que genera que los compuestos
al unirse emiten radiación en el ultravioleta (λ=254 nm).
En otros casos, puede aplicarse sobre la placa

reveladores químicos, que generan compuestos
coloreados. Los más usados son yodo y ácido sulfúrico.

90
Detección
REACTIVO APLICACIONES
Vapor de yodo Compuestos orgánicos en general
Ácido fosfomolibdico Compuestos orgánicos en general
Ácido sulfúrico Compuestos orgánicos en general
Ninhidrina Aminoácidos
2,4-dinitrofenilhidrazina Cetonas y aldehídos
Ácido cloroplatinico Alcaloides
Azul de bromotimol Lípidos

91
Bidimensional

92
Cromatografía en capa fina: factor de
retención
9 La relación entre la distancia recorrida por

8 un compuesto y por el disolvente desde el
7
origen se conoce como factor de
6
retención (Rf)
5
4
3 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜
𝑅𝑓 =
2 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒
1

93
retención
9 La relación entre la distancia recorrida por

8 un compuesto y por el disolvente desde el
7
origen se conoce como factor de
6
retención (Rf)
5
4
3
𝑫𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒄𝒐𝒎𝒑𝒖𝒆𝒔𝒕𝒐
2 𝑅𝑓 =
1 𝑫𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒔𝒐𝒍𝒗𝒆𝒏𝒕𝒆

94
retención
9
8 9 cm 𝑫𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒄𝒐𝒎𝒑𝒖𝒆𝒔𝒕𝒐
4 𝑅𝑓 =
7
𝑫𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒔𝒐𝒍𝒗𝒆𝒏𝒕𝒆
6
5 2 𝑐𝑚
3
4 𝑅𝑓2 = = 0,22
3
9 𝑐𝑚
2 2
1 2 cm Calcular el factor de retención
para el compuesto 1, 3 y 4
1


PLANA COLUMNA

96
Cromatografía radial
Video de la cromatografía radial Muestra

automatizada
Flujo del
solvente
https://www.youtube.com/watch?
v=fOOtUIppdJw&feature=emb_log
o
Mecha
Frente del
Imagen tomada
http://www.sbwave.com/chromatotron/specs.html
de: solvente
Fase estacionaria circular

PLANA COLUMNA

Cromatografía en columna 98
 Es el método más utilizado para la
separación de componentes en una
mezcla.
 La fase estacionaria se deposita en el
interior de una columna de vidrio que
termina con una placa porosa que
impide su paso y en un estrechamiento
con una llave. La mezcla se deposita
sobre la parte superior de la fase
estacionaria mientras que la fase móvil
atraviesa el sistema.
 El tiempo necesario para eluir un
compuesto de la columna se llama
tiempo de retención.
Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa Imagen tomada de https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Kromatografia.png
99
Cromatografía en columna
PREPARACIÓN PARA LA REALIZACIÓN DE

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
➢ Empaquetamiento de la fase
estacionaria
➢ Aplicación de la muestra
➢ Procedimiento de elución (Elución
isocrática o en gradiente)
➢ Recolección de los compuestos
➢ Detección
Imagen tomada de https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Kromatografia.png

100
Bibliografía
 Harris, D.C. (2010) Quantitative Chemical Analysis. Nueva York: W. H. Freeman and Company.
Pág 542-544, 599-610, 635-650
 Harvey, D. (2000) Modern Analytical Chemistry. Boston: Mc Graw Hill. Pág 546-549, 590-596
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Práctica. Argentina: Artes Gráficas Farro S.A. Pág 3-7, 90-92, 95-112, 123, 138-146, 153-164, 176-
193
 Rouessac, F.; Rouessac, A. (2007) Chemical Analysis: Modern Instrumentation Methods and
Techniques. Inglaterra: John Wiley & Sons Ltd. Pág 3-6, 24-26, 70-78, 93-100, 117-123, 135-139
 Skoog, D.A.; Holler, F.J.; Crouch, S.R. (2008) Principios de análisis instrumental. México:
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 Skoog, D.A.; Holler, F.J.; West, D.M; Crouch, S.R. (2015) Fundamentos de Química Analítica.
México: Cengage Learning Editores Pág. 857-864, 914, 921-931, 940-942

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MÓDULO IV: MÉTODOS

En 1906, el botánico Ruso Mikhail Tswett

ESTADO FÍSICO DE LA FASE

MEDIO EN EL QUE SE ENCUENTRA

ESTADO FÍSICO DE LA FASE

MEDIO EN EL QUE SE ENCUENTRA

La fase móvil puede ser un líquido o

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ESTADO FÍSICO DE LA FASE

Líquido-Sólido Gas-Sólido Líquido-Líquido Gas-Líquido

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

ESTADO FÍSICO DE LA FASE

MEDIO EN EL QUE SE ENCUENTRA

ESTADO FÍSICO DE LA FASE

MEDIO EN EL QUE SE ENCUENTRA

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

La cromatografía se divide en varias categorías en función del

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

Ambas fases SILICA GEL

Cloroformo 0,31 4,1

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

Es posible modificar el poder de

Primero se favorece Usar fase móvil más

Al final se favorece Usar fase móvil más

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

Pueden ser polares o no polares

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

Tipo de analitos C18-C8

Fase polaridad media

Orden de mezcla Variable:

COMPUESTO 1 COMPUESTO 2 COMPUESTO 3 COMPUESTO 4

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

Pueden ser con partículas

que presentan cargas

La fase estacionaria es negativa, es

La fase estacionaria es positiva, es

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FASE MÓVIL: H2O TES

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

Fase móvil Cationes

Buffer ácido OPCIÓN

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Imagen tomada de: Harris, D.C. (2010) Quantitative Chemical Analysis.

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

INTERCAMBIADOR CATIÓNICO COMPUESTO B

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

Presentación desarrollada por Sandra Liliana Molina Correa

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Indique que condiciones debe tener la fase estacionaria, la fase

COMPUESTO 1 COMPUESTO 2 COMPUESTO 3 COMPUESTO 4 COMPUESTO 5

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Fase móvil De baja viscosidad

ELUYENTE USO TEMPERATURA

Biopolímeros Filtración por gel

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