GUIÓN SEMINARIO BIOQUIMICA

INTRODUCCIÓN
El CRISPR permite a los investigadores cortar y pegar secuencias de ADN. Primero, ellos
componen un conjunto de letras genéticas o “ARN guía” que, al igual que los fragmentos
originales del código viral, reconoce un tramo específico del ADN entre los millones de
letras A, T, G y C del genoma. Estas se leen igual en el mismo sentido de 5’ a 3’ y de 3’ a 5’.
Luego, introducen en la célula diana (secuencia de ADN reconocida por enzimas con
actividades hidrolasas) la secuencia guía junto con una enzima similar a Cas9, la cual
reconoce el texto correspondiente y lo abre. Los científicos usan este mecanismo para
borrar, mutar, insertar o reparar secuencias genómicas de ADN en células, animales y
seres humanos. La tecnología se desarrolló en 2012 y, en la actualidad esta tecnología se
usa en los laboratorios para estudiar las bases moleculares de las enfermedades y crear
nuevos tratamientos.

HISTORIA
Este investigador buscó en las bases de datos de información genómica y lo que descubrió
fue que en el mundo microbiano abundan las secuencias repetidas a intervalos regulares;
lo que sugería “una gran relevancia biológica”. En 2003, Mojica descubrió que la
verdadera naturaleza de estas secuencias repetidas, que él denominó CRISPR, resultaban
ser un mecanismo de defensa de los microorganismos contra los virus.
Luego, la doctora Emmanuelle Charpentier, que en la actualidad trabaja en el Instituto
Max Planck de Biología de la Infección (Berlín), descubrió una molécula clave en el sistema
CRISPR/ conocida como Cas9. A partir de este hallazgo, se puso en contacto con Jennifer
Doudna, de la Universidad de California, y lo que pasó fue que en el año 2012,
reprodujeron artificialmente el sistema y demostraron que es una potente herramienta de
edición genómica y que puede ser programada para reconocer cualquier fragmento de
ADN.

CRISPR-Cas
El registro genético de ataques previos por ácidos nucleicos extraños se almacena en las
matrices CRISPR. Estas matrices están formadas por secuencias repetitivas cortas llamadas
espaciadores. Son insertados por proteínas Cas especializadas en la matriz CRISPR durante
las infecciones al invadir ácidos nucleicos. La inmunidad adaptativa de los procariotas
contra MGE (Elementos genéticos móviles) extraños se logra mediante la formación de
endonucleasas guiadas por ARN, que constituyen los complejos efectores y son capaces de
detectar una infección secundaria por un ADN extraño que se incorporó previamente a la
matriz CRISPR.
TIPO I Y II
Los sistemas CRISPR-Cas se clasifican en dos clases (Clases 1 y 2) que se subdividen en seis
tipos (tipos I a VI). Los sistemas de clase 1 (tipos I, III y IV) utilizan múltiples proteínas Cas
en sus nucleasas efectoras de ribonucleoproteína CRISPR los CRISPR-Cas de clase 1 se
encuentran más comúnmente en bacterias y arqueas, y comprenden ~ 90% de todos los
loci CRISPR-Cas identificados.

TIPO II
Los sistemas de clase 2 (tipos II, V y VI) utilizan una única proteína Cas estos comprenden
el ~ 10% restante, existen casi exclusivamente en bacterias, y asi poder ensamblar un
complejo de ribonucleoproteína, que consiste en un ARN CRISPR ( es decir ARN traducido
de CRISPR) y una proteína Cas . El crRNA contiene información para apuntar a una
secuencia de ADN específica. Estas proteínas logran una interferencia por
complementariedad entre el crRNA y la secuencia diana después del reconocimiento de la
secuencia PAM (Motivo adyacente al protospacer), que es adyacente al ADN diana.

Cas 9
El sistema CRISPR-Cas más caracterizado es el subtipo II-A de clase II que se encuentra en
Streptococcus pyogenes ( Sp), que utiliza la proteína SpCas9, Cas9 fue la primera proteína
Cas diseñada para su uso en la edición de genes .

Cas 12
La clase 2 tipo V se clasifica además en 4 subtipos (VA, V mi B, mi CV mi U). En la
actualidad, V C y V U no se dispone de información estructural sobre estos sistemas VA
codifica la proteína Cas12a (también conocida como Cpf1)

Adaptación
Ambas funciones son realizadas por el versátil complejo de adaptación Cas1-Cas2. La
identificación del protoespaciador comienza con el reconocimiento del PAM por el
complejo de adaptación, posteriormente el espaciador (secuencia adyacente a la PAM) se
integra en la matriz CRISPR y la secuencia de repetición conservada se duplica. La
secuencia PAM está excluida de la matriz CRISPR y es uno de los primeros motivos de
reconocimiento utilizados para identificar ácidos nucleicos diana para la degradación.

EXPRESIÓN
El pre-crRNA (precursor de ARN transcrito por CRISPR) se procesa en moléculas de crRNA
más cortas, cada una de las cuales contiene un espaciador y una parte de la secuencia
repetida.
INTERFERENCIA
Esta endonucleasa está guiada por el crRNA, que después del reconocimiento de PAM se
hibrida con el ADN diana a través de su secuencia espaciadora y, finalmente, corta la
secuencia de ADN diana.
Bacteriófago: Son virus que infectan a las procariotas, en su interior puede haber ADN o
ARN y de 5000 a 500.000 pares de bases.

BIOGENESIS
Francicella Novicida: es una bacteria, patógena y son conocidos por sus capacidades
parasíticas intracelulares.
En los sistemas CRISPR de tipo II, la maduración del crRNA se realiza mediante la proteína
de mantenimiento del hospedador RNasa III junto con el crRNA trans-activador
(tracrRNA), que se empareja con la base del pre-crRNA, en presencia de Cas9 . Por el
contrario, se ha demostrado que Cas12a procesa su propio pre-crRNA en crRNA maduros,
sin el requisito de un tracrRNA, lo que la convierte en una proteína efectora única con
actividades endoribonucleasa y endonucleasa Después de que el pre-crRNA ha sido
transcrito durante la etapa de expresión, Cas12a lo corta 4 nt aguas arriba de las
estructuras de horquilla formadas por las repeticiones CRISPR, produciendo moléculas
intermedias de crRNA que se someten a un procesamiento posterior.
RNasa: Es una enzima que cataliza la hidrolisis del ARN en componentes más pequeños.
TracrARN: Es un pequeño ARN codificado trans(transreguladora) , es decir que actúa de
una molécula diferente, intermolecular.
Endoribonucleasa: es una endonucleasa que viene de u ARN monocaternario o
bicaternario, virus con acido ribonucleico en cadena sencilla o cadena doble.
Endonucleasa: Enzimas que catalizan la ruptura de enlaces fosfodiéster.

ORGANIZACIÓN DEL DOMINIO CAS 12ª Y EL ENSAMBLAJE DE EL COMPLEJO

RIBONUCLEOPROTEINA.
Ruv-C: Dominio de nucleasa
TnpB: Proteinas transposasas
Cristalográfia: Parte de la geología que estudia la forma y estructura de los inerales que se
quieren cristalizar.
Cryo-EM: Microscopia electrónica Criogénica de la Único partícula es una técnica que se
usa para deducir la estructura 3D de las macromoléculas, proteinas.
REC: Lóbulo de reconocimiento
NUC: Lóbulo con actividad nucleasa.
El lóbulo REC está compuesto por los dominios REC1 y REC2, y el lóbulo Nuc está
compuesto por los dominios RuvC, los dominios que interactúan con PAM (PI) y WED, y
además, la hélice puente (BH). El dominio de endonucleasa RuvC de este efector La
proteína se compone de tres partes discontinuas (RuvC I-III). El sitio de RNasa para
procesar su propio crRNA está situado en el subdominio WED-III, y el sitio de DNasa está
ubicado en la interfaz entre los dominios RuvC y Nuc.
WED: Silvestre
DNasa: es una enzima que cataliza en el rompimiento de los enlaces fosfodiéster en la
cadena principal de ADN degradándolo.

PAM
Cas12a emplea un mecanismo de control de calidad de varios pasos para garantizar el
reconocimiento exacto y preciso de las secuencias espaciadoras objetivo. Los dominios
que interactúan con WED II-III, REC1 y PAM son responsables del reconocimiento de PAM
y de iniciar la hibridación del ADN diana con el crRNA. Después del reconocimiento del
dsDNA por los dominios WED y REC1, la región conservada bucle-lisina helix-loop (LKL) en
el dominio PI, que contiene tres lisinas conservadas (K667, K671, K677 en FnCas12a),
inserta la hélice en el dúplex PAM con asistencia de dos prolinas conservadas en la región
LKL. Los estudios estructurales muestran que la hélice se inserta en un ángulo de 45 con
respecto al eje longitudinal del dsDNA, lo que promueve el desenrollado del dsDNA
helicoidal. El posicionamiento crítico de las tres lisinas conservadas en el dsDNA inicia el
desacoplamiento de Watson mi Crick interacción entre los pares de bases deldsDNA
después del PAM. La descompresión del dsDNA objetivo permite la hibridación del crRNA
con la hebra que contiene el PAM, la 'hebra diana (TS), mientras que la hebra de ADN
desacoplada, la hebra no diana (NTS), se conduce hacia el sitio de la DNasa por la
interacción de PAM dominio [ 24 , 26 , 35 ]. Se ha demostrado que Cas12a se dirige
eficientemente a las secuencias espaciadoras después de 5 ' Secuencia PAM rica en T.
dsADN: Virus bicaternario de doble cadena que usa el ADN para replicarse.
DESCOMPESIÓN, PROPAGACIÓN Y ESCISION DEL ADN
Se ha informado que los desajustes en la secuencia de semillas dan como resultado la
pérdida de actividad de escisión [ 31 , 34 ]. La presencia de las secuencias de semillas
promueve una mayor hibridación del ADN diana de crRNA. Los estudios estructurales han
demostrado que TS y NTS siguen diferentes vías hacia el sitio de la nucleasa [ 24 ], con
varios residuos en el dominio PI experimentando cambios conformacionales y adoptando
un 'carril ' forma para acomodar la hebra nt y eventualmente guiarla al sitio catalítico. Esta
estructura también muestra la presencia de una barrera, el septum, para evitar el recocido
del dsDNA

ENSICIÓN INDISCRIMINADA
Esta actividad es mostrada por todos los ortólogos Cas12a y degrada cualquier molécula
de ssDNA disponible en nucleótidos simples / dobles [ 40 ]. Las comparaciones de las
estructuras de Cas12a antes, durante y después de la escisión revelan los cambios
estructurales que dan como resultado una actividad tan indiscriminada.
SsDNA: es un virus en el que el material genético esta compuesto por ADN de cadena
sencilla no usando ARN para la replicación.

RECICLAJE DE ENDONUCLEASAS
Como la célula no puede permitir que se desate una degradación indiscriminada del
ssDNA. La respuesta a estos problemas se puede encontrar en los genomas bacterianos
que codifican Cas12a. El uso de una secuencia conservada del crRNA para una búsqueda
en una base de datos reveló que diferentes bacterias codifican una sola copia del gen
Cas12a, mientras que codifican múltiples copias (hasta 68) del crRNA [ 18 ]. Si se supone
que las tasas de transcripción son similares, en un momento dado, la concentración de
varios crRNA en la célula sería varias veces mayor que la de la enzima. Se ha demostrado
experimentalmente que con una concentración suficiente de una nueva molécula de
crRNA, es capaz de desplazar el bucle R escindido de la enzima, con la ayuda de proteínas
accesorias del huésped, formando un nuevo complejo de interferencia ( Fig. 3 ). Esto
muestra que Cas12a puede revertir la conformación activa para detener la actividad
inespecífica desplazando el bucle R escindido con un nuevo crRNA. Al hacerlo, vuelve a
una conformación donde la tapa molecular ' forma interacciones polares de nuevo para
hacer inaccesible la bolsa catalítica [ 36 ]. Al hacerlo, la endonucleasa no solo detiene la
actividad indiscriminada de ssDNase, sino que también recicla su actividad catalítica hacia
otros ADN diana.