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Enfoques de edición del genoma para aumentar los programas de cría de ganado

Artículo en Journal of Experimental Biology · Febrero 2020

DOI: 10.1242/jeb.207159

CITAS LEE

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2 autores, incluyendo:

Alison Louise Van Eenennaam

Universidad de California, Davis

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© 2020. Publicado por The Company of Biologists Ltd | Revista de Biología Experimental (2020) 223, jeb207159. doi:10.1242/jeb.207159

REVISIÓN

Enfoques de edición del genoma para aumentar los programas de cría

de ganado
Thomas Frederick Bishop y Alison Louise Van Eenennaam*

RESUMEN donde i es la intensidad (cuán extensivamente se pueden usar los animales más

La perspectiva de la edición del genoma ofrece una serie de oportunidades elitistas como padres de la próxima generación); precisión de riesgo (cuán seguros

prometedoras para los criadores de ganado. En primer lugar, estas herramientas estamos sobre el verdadero mérito genético de los candidatos de selección); ÿA

se pueden utilizar en genómica funcional para dilucidar la función de los genes es la diversidad genética (medida por la desviación estándar genética aditiva de

e identificar las variantes causales que subyacen a los rasgos monogénicos. En la población); y L es la duración de la generación (intervalo calculado como la

segundo lugar, se pueden utilizar para introducir con precisión una variación edad promedio de los padres cuando nace la progenie).

genética útil en los programas estructurados de cría de ganado. Dicha variación Cualquier técnica que pueda aumentar i, r o ÿA de manera rentable, o disminuir L,

puede incluir la reparación de defectos genéticos, la inactivación de genes no se adoptará en los programas de mejoramiento.

deseados y el movimiento de alelos y haplotipos útiles entre razas en ausencia Cada vaca lechera de EE. UU. produce hoy más de cuatro veces la cantidad

de arrastre de enlace. La edición también podría usarse para acelerar la tasa de de leche de sus antepasadas de 1944, duplicando así la producción de leche del

progreso genético al permitir el reemplazo del linaje de células germinales de país incluso cuando la población de ganado lechero se ha reducido de 26 millones

animales reproductores comerciales con células derivadas de líneas a 9 millones de vacas. Estos notables cambios se han logrado mediante la

genéticamente elitistas. En el futuro, la edición también puede proporcionar un selección convencional basada en la variación genética natural. Como resultado

complemento útil para los enfoques en evolución para disminuir la duración del de esta selección, la huella de carbono asociada con la producción de un vaso de

intervalo generacional a través de la generación in vitro de gametos. Para que leche se ha reducido en dos tercios durante el último medio siglo (Capper y

se adopte la edición, deberá integrarse perfectamente con los esquemas de cría Bauman, 2013).

de ganado. Esto probablemente implicará la introducción de ediciones en Del mismo modo, desde 1957 hasta 2005, el crecimiento de los pollos de engorde

múltiples animales de élite para evitar cuellos de botella genéticos. También modernos aumentó más de cuatro veces (Fig. 1), con una reducción simultánea

requerirá la edición de diferentes razas y líneas para mantener la diversidad del 50 % en la relación de conversión de alimento consumido/ganancia de peso

genética y permitir el cruzamiento estructurado. Este requisito está en desacuerdo unitario (Zuidhof et al., 2014).

con el enfoque regulatorio basado en procesos y eventos que ha sido propuesto Los criadores tratan de identificar qué animales tienen variantes genéticas

por varios países para los productos de la edición del genoma. En ausencia de asociadas con rasgos de importancia económica. Esto se hace mediante un

armonía regulatoria, los investigadores de algunos países tendrán la capacidad extenso fenotipado de los candidatos de selección, típicamente los animales del

de utilizar la edición del genoma en animales destinados al consumo humano, núcleo en la parte superior de la pirámide de reproducción (Fig. 2). Por ejemplo,

mientras que otros no, lo que dará como resultado un acceso dispar a estas una empresa de cría de aves de corral recopila datos sobre más de 50 rasgos por
candidato de selección de núcleo en varias edades, y más del 50 % de estas
herramientas y, en última instancia, la posibilidad de perturbaciones en el comercio mundial.
observaciones están relacionadas con una evaluación de la salud, el bienestar y
PALABRAS CLAVE: Mejora genética, Edición del genoma, Ganadería, el estado físico general de cada ave (Katanbaf y Hardiman, 2010).
Alimentación animal, Cría de animales Debido a que estos animales están destinados a tener millones de descendientes,
se realiza una inversión considerable para obtener una estimación precisa de su
Introducción verdadero mérito genético.
Los programas de mejoramiento genético del ganado han sido una poderosa En la última década, los análisis genómicos habilitados por los datos de la
fuerza impulsora para mejorar la eficiencia y, por lo tanto, disminuir la huella secuencia del genoma completo y las plataformas económicas de genotipado han
ambiental y la intensidad de las emisiones de la producción de leche, carne y brindado una fuente adicional de información para la mejora del ganado (Georges
huevos. Al combinar el fenotipado objetivo, la información genómica, las et al., 2019). Los estudios de asociación genómica amplia (GWAS) se han
metodologías estadísticas y las técnicas reproductivas avanzadas, los criadores utilizado para descubrir asociaciones entre loci de rasgos cuantitativos (QTL) para
han podido seleccionar con mayor precisión y utilizar intensamente a los uno o más fenotipos de interés y marcadores.
progenitores genéticamente superiores para la próxima generación a fin de Sin embargo, los QTL a menudo se asocian en desequilibrio de ligamiento con
acelerar el ritmo de los programas de mejora genética. los verdaderos alelos causantes. Por esta razón, la asociación entre marcadores
La tasa de ganancia genética (ÿG) hacia el objetivo de reproducción de un y QTL puede diferir entre poblaciones, lo que dificulta la generalización de los
sistema de producción dado depende de los cuatro componentes de la ecuación resultados de GWAS en diferentes poblaciones. Por lo tanto, es de interés
de los criadores (Lush, 1937) modificada por Eberhart (1970): identificar las variantes causales asociadas con QTL para poder rastrear mejor
los alelos que impactan directamente en el fenotipo.

GD ¼ ir sa ; ð1Þ
L La secuenciación y 'resecuenciación' de genomas de ganado ha revelado una
impresionante abundancia de diversidad genética entre diferentes razas y líneas.
Por ejemplo, cuando los genetistas de ganado secuenciaron más de 2700 toros
Departamento de Ciencia Animal, Universidad de California, Davis, Davis, CA 95616,
EE. UU. de diferentes razas de todo el mundo, encontraron más de 86,5 millones de
variantes entre diferentes razas de ganado. Estas variantes incluyeron 2,5 millones
*Autor para correspondencia (alvaneenennaam@ucdavis.edu) de inserciones y deleciones (indels) de uno o más pares de bases de ADN y 84

ALVE, 0000-0003-1562-162X millones

1
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REVISIÓN
Presion
1957 1978
0 días
34 gramos 42 gramos
28 días
316 gramos 632 gramos
56 dias
905 gramos 1808 gramos
variantes de un solo nucleótido (Hayes y Daetwyler, 2019). Esta variación es
la clave para la mejora genética, y los criadores intentan de forma rutinaria
equilibrar el uso extensivo de los mejores animales para acelerar la tasa de
ganancia genética, evitando la endogamia para mantener la diversidad
genética en la población para futuras mejoras genéticas.
La selección genómica (GS) es una colección de métodos para estimar los
valores genéticos de animales individuales sobre la base de la información
del genotipo del polimorfismo de un solo nucleótido en todo el genoma. Utiliza
la información del genotipo para inferir la herencia genética de cada individuo
resultante del muestreo mendeliano y, sobre la base de grandes poblaciones
con fenotipos y genotipos, permite la predicción precisa del mérito genético de
los jóvenes candidatos a la selección. En la industria láctea, esto permite
seleccionar toros jóvenes con base en estimaciones de mérito genético
mejoradas genómicamente, lo que permite su uso como toros a una edad más
temprana. Una evaluación del impacto de 7 años de GS en ganado lechero
de EE. UU. (García-Ruiz et al., 2016) muestra que las tasas de ganancia
genética por año aumentaron entre un 50 y un 100 % para rasgos de alta
heredabilidad, como producción de leche, y entre un 300% y un 400% para
los rasgos de baja heredabilidad, como el recuento de células somáticas (una
medida de la salud de la ubre) y la tasa de embarazo de las hijas (una medida
de la fertilidad femenina). Esta innovación, GS, ahora se usa en muchos
entre las diferentes regiones del genoma. También significó que cada animal
programas de mejoramiento genético de ganado y cultivos (Meuwissen et al., 2013).
Por lo general, la mejora genética proviene de la selección de variantes
naturales que ya existen dentro de una raza. Otras razas pueden tener
Revista de Biología Experimental (2020) 223, jeb207159. doi:10.1242/jeb.207159
Fig. 1. Cambios en el tamaño relacionados con la edad (masa
corporal de sexo mixto y fotos de vista frontal) de las cepas de
2005 control de carne de la Universidad de Alberta no seleccionadas
desde 1957 y 1978, y pollos de engorde Ross 308 (2005).
Dentro de cada cepa, las imágenes son de la misma ave a los
0, 28 y 56 días de edad. Reproducido bajo licencia Creative
Commons CC BY de Zuidhof et al. (2014).
44 gramos
1396 gramos
g693,1
4202g
otras variantes útiles, y poder introducirlas de una raza a otra podría acelerar
aún más la tasa de mejora genética. Históricamente, esto se ha logrado a
través de cruces seguidos de retrocruzamientos repetidos para eliminar
rasgos no deseados que se incorporaron como arrastre de selección de la
otra raza.
La edición del genoma ofrece una nueva oportunidad para acelerar aún
más la tasa de ganancia genética en el ganado. La edición presenta un
enfoque para introducir con precisión variantes genéticas existentes útiles en
programas estructurados de cría de ganado. Estas variantes pueden reparar
defectos genéticos, inactivar o eliminar genes no deseados, o involucrar el
movimiento de alelos y haplotipos beneficiosos entre razas en ausencia de
arrastre de enlace. La generación anterior de herramientas de ingeniería
genética, que resultó en el primer ganado transgénico hace más de 30 años
(Hammer et al., 1985), se limitaba a la inserción de ADN extraño en el genoma.
Este ADN estaba generalmente en forma de una construcción de ADN
recombinante (ADNr) que comprende un promotor y una región codificante de
proteína (regulación positiva de proteína), o una región codificante de ARN
inhibidor (regulación negativa de proteína). Como la integración fue aleatoria,
no había forma de predecir todos los posibles efectos que tendría la
introducción del transgén en el animal, ya que el entorno epigenético varía
fundador modificado genéticamente tenía el gen insertado en una ubicación
diferente en el genoma.
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REVISIÓN Revista de Biología Experimental (2020) 223, jeb207159. doi:10.1242/jeb.207159

Líneas puras
Miles de 1 mujer
aves

3–4 años Bisabuelo 23,4 mujeres

Decenas de miles de pájaros

Abuelo 725 hembras

10,000,000 pájaros

Padre
24.809 mujeres
400.000.000 pájaros

pollos de engorde
3.064.000 pollos de engorde
45.000.000.000 pájaros

Fig. 2. Estructura de la industria de pollos de engorde y estimación global del número de aves junto con estimaciones de la línea de tiempo y expresiones genéticas derivadas de un solo
Pollo de engorde hembra de pedigrí. Reproducido con permiso de Van Eenennaam et al. (2014).

La edición del genoma ofrece una oportunidad para la modificación dirigida
de genes existentes y elementos reguladores, sin necesariamente
introducción de ADN extraño.
Sistemas de edición del genoma
La edición del genoma implica el uso de una nucleasa dirigida a un determinado
Secuencia de ADN para introducir una rotura de doble cadena (DSB). Una
reparación dirigida por homología (HDR) utilizando ADN homólogo como
plantilla de reparación. Se puede agregar una plantilla de reparación de ADN con el deseado
modificaciones entre regiones de homología a ambos lados de la
DSB. Esto se puede usar para introducir una variedad de ediciones del genoma, desde
mutaciones puntuales a inserciones de genes completos. El camino para reparar en gran medida
depende de la etapa del ciclo celular y de las proteínas que se asocian
con los extremos rotos del ADN.

El método que usan las células para reparar los DSB es la unión de extremos no homólogos.
(NHEJ), donde los dos extremos rotos se vuelven a unir y
los enlaces fosfodiéster se reforman. Este método es propenso a errores
y a menudo da como resultado pequeñas indeles en el sitio de división debido a errores
en el proceso de reparación. Estos alteran el sitio objetivo de la nucleasa y previenen
más eventos de escisión. Un mecanismo de reparación alternativo es
Hay tres sistemas principales de edición del genoma que se han utilizado
en ganadería (Cuadro 1), cada uno con sus pros y sus contras. dedo de cinc
Las nucleasas (ZFN) fueron la primera herramienta que permitió la focalización eficiente de
DSB a sitios específicos en el genoma (Bibikova et al., 2002). los
El dominio de unión al ADN de las ZFN consiste en un ensamblaje de zinc
dominios de dedo, cada uno de los cuales reconoce tres pares de bases de ADN. A

Tabla 1. Comparación de características de tres sistemas de edición del genoma (adaptado de Ho et al., 2018)
Dirigido al sitio
nucleasa ZFN TALEN CRISPR/Cas9

Tipo de reconocimiento Proteína–ADN Proteína–ADN ARN-ADN

nucleasa
sitio de reconocimiento
Especificidad de orientación
FokI
Típicamente, 18–36 pb (usualmente un
múltiplo de 3) por par ZFN
Pequeño número de posicionales
desajustes tolerados
FokI Cas9
Típicamente, 28–40 pb por par TALEN 22 pb seguido inmediatamente por 5ÿ-NGG-3ÿ
motivo adyacente protospacer (PAM)
Se tolera un pequeño número de desajustes posicionales Posicional y múltiple consecutivo
Se toleran los desajustes, pero es más fácil
predecir posibles sitios utilizando Watson-Crick
reglas de emparejamiento de bases

Restricciones de segmentación Difícil de apuntar a no guanina
regiones ricas
Facilidad de diseño/ Difícil: puede requerir
ingeniería proteína sustancial
ingeniería
Capacidad de multiplexación No
Ventajas Tamaño de proteína pequeño (<1 kb)
Limitaciones Longitud de la secuencia objetivo
confinado a múltiplos de 3;
métodos de clonación difíciles
Requiere proteínas de unión compensadas con definido La secuencia dirigida debe inmediatamente
espaciado preceder a un sitio PAM
Moderado: requiere clonación molecular compleja, pero Fácil: simple de diseñar y guiar secuencias
El diseño de TALEN ha sido simplificado por la se diseñan fácilmente usando estándares
disponibilidad de módulos de combinaciones repetidas procedimientos de clonación o síntesis de oligo
que reducen la cantidad de clonación
No Sí
alta especificidad Habilita la multiplexación (apuntando a múltiples
genes)
Gran tamaño de proteína Limitado a secuencias PAM; La nucleasa Cas9 es
grande (ÿ4.2 kb)

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REVISIÓN
el extremo C-terminal del dominio de unión al ADN es un dominio de escisión FokI,
que se dimeriza para formar una nucleasa no específica. Cuando dos ZFN se unen
a sitios de destino adyacentes en hebras de ADN opuestas, las subunidades de
nucleasa se combinan para formar una nucleasa funcional y crear un DSB específico
(Fig. 3A). Las especificidades de los dedos de zinc individuales pueden depender
del contexto de los dedos de zinc circundantes y del ADN diana, y no todos los
tripletes de ADN posibles tienen dominios de dedos de zinc correspondientes
disponibles. Las mejoras recientes en la orientación de ZFN incluyen la capacidad
de omitir un nucleótido entre las unidades de dedos de zinc, de modo que si una
unidad no está disponible para los 3 pb adyacentes, entonces se puede omitir 1 pb
(Paschon et al., 2019). Esto aumenta enormemente las probabilidades de que un
dedo de zinc disponible coincida con la secuencia objetivo. Otra modificación implica
la colocación del dominio de escisión FokI.
Anteriormente, las ZFN tenían la limitación de que era necesario unirse a la cadena
de ADN en cada dirección debido a los límites de la ubicación de la subunidad de
nucleasa en el extremo C 'de la ZFN. La capacidad de agregar la nucleasa al
extremo N' permite que ambos ZFN se unan al ADN en la misma dirección, lo que
aumenta la posibilidad de encontrar un sitio de unión a ZFN adecuado en la
secuencia objetivo (Fig. 3B).
Los efectores similares a activadores de transcripción (TALE) son proteínas
naturales de Xanthomonas, un género de Proteobacteria y un patógeno vegetal.
Los TALE contienen una región de unión al ADN que consta de una serie de
unidades de 33 a 35 aa de largo, cada una de las cuales reconoce un par de bases
específico determinado por dos residuos variables cerca de la mitad de cada unidad
(Kim y Kini, 2017). El dominio de escisión de ADN FokI se fusionó con TALE para
producir nucleasas TALE (TALEN) que, al igual que con ZFN, se usan en pares
para reconocer y escindir el ADN objetivo (Fig. 3C).
La repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR)-
Cas es un sistema de inmunidad adaptativa que se encuentra en muchas especies
bacterianas y arqueas, donde funciona para proteger contra los virus invasores
(Jinek et al., 2012). Este sistema utiliza pequeños ARN no codificantes para dirigir
una nucleasa Cas a secuencias de ADN específicas.
El sistema más utilizado en la actualidad es CRISPR/Cas9, que se basa en el
sistema de Streptococcus y utiliza un ARN guía corto (sgRNA) complejado con la
nucleasa Cas9. La escisión del ADN objetivo por Cas9 está dirigida por los primeros
20 nucleótidos en el extremo 5 'del sgRNA que se hibridan con el ADN genómico
correspondiente
A D
norte
norte
B mi
C norte
C F
norte
norte
Fig. 3. Ejemplos de editores de genoma y sus modificaciones. (A-E) Representaciones esquemáticas de ZFN unidos a ADN (A) con dominios C' FokI (grises) dimerizados;
(B) ZFN con salto de base y capacidad N' FokI (se muestran los dominios N' y C' FokI dimerizados); (C) TALEN con dominios FokI dimerizados; (D) sgRNA/Cas9 (sgRNA,
naranja/rojo; secuencia objetivo de sgRNA, rojo; Cas9, verde; PAM, amarillo); y (E) sgRNAs/Cas9 nickasas. Las puntas de flecha negras indican los sitios de escisión del ADN.
(F) Cas9 con sgRNA quimérico: plantilla de reparación de ARN monocatenario (ss). (G) Cas9 con plantilla de reparación de ssDNA unida covalentemente. (H) Cas9 con dominio
de unión a ADN (púrpura) y plantilla de reparación de ADN de doble cadena (ds) unida.
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objetivo, que también debe contener un motivo adyacente protospacer (por ejemplo,
PAM: 5ÿ-NGG-3ÿ) inmediatamente después de la región de homología de sgRNA
(Fig. 3D). Cas9 escinde el ADN objetivo tres nucleótidos aguas arriba de PAM, lo
que da como resultado un DSB (Ran et al., 2013).
Tanto los ZFN como los TALEN requieren que se diseñen y expresen dos
proteínas únicas para cada objetivo de ADN, lo que puede tener un costo prohibitivo
para aplicaciones que involucran múltiples objetivos. En el sistema CRISPR/Cas9,
una proteína se puede coexpresar con varios sgRNA, cada uno de los cuales guía
a la proteína Cas9 a un sitio de destino diferente. Esta característica de CRISPR-
Cas lo hace ideal para apuntar a múltiples sitios. Un estudio administró CRISPR/
Cas9 mediante microinyección de cigotos para eliminar simultáneamente tres genes
diana distintos (Zhang et al., 2018a). Los tres objetivos fueron eliminados con éxito
en 14 de los 15 ratones nacidos, y el otro ratón tenía dos de los genes eliminados y
era un mosaico para el otro. Sin embargo, la orientación conjunta de múltiples sitios
en el mismo cromosoma puede resultar en escisiones de ADN que se han informado
en más de 1 Mb de longitud (Kraft et al., 2015).
CRISPR-Cas reconoce un solo sitio de 20 nucleótidos más la secuencia PAM;
sin embargo, también puede reconocer y escindir secuencias con solo 17 o 18
nucleótidos coincidentes y PAM (Fu et al., 2014). Además de los sitios objetivo, se
ha observado que CRISPR-Cas escinde sitios fuera del objetivo (Fu et al., 2013).
Esto puede verse limitado por un diseño cuidadoso de sgRNA (Akcakaya et al.,
2018), pero esto no siempre es posible cuando la región de destino es pequeña,
especialmente con las restricciones de destino de CRISPR/Cas9. Cas9 se puede
modificar en una nickasa para que solo corte una hebra de ADN (Fig. 3E). La
creación de muescas escalonadas en el sitio objetivo por dos complejos CRISPR/
Cas9 independientes da como resultado un DSB. Esto mejora en gran medida la
especificidad de CRISPR/Cas9, ya que requiere que dos complejos independientes
se unan muy cerca (Ren et al., 2014). El requisito de una secuencia PAM adyacente
a la secuencia objetivo de CRISPR es un factor limitante para usar este sistema
para apuntar a sitios específicos para cambios de nucleótidos precisos. Las
nucleasas Cas se están produciendo/identificando con sitios PAM alternativos
(Leenay y Beisel, 2017), lo que amplía en gran medida el potencial de selección de
este sistema.
La plantilla para HDR generalmente se proporciona separada de la nucleasa y
en forma de monocatenario (ss) o bicatenario.
GRAMO
ssADN
dsADN
ARNss H
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(ds) ADN. Agregar una plantilla HDR de ARN en el extremo 3 'de un sgRNA en el núcleo. Cuando se entrega en el citoplasma, la transcripción de los
mejora HDR en arroz (Butt et al., 2017). Se sugirió que la presencia física de componentes de edición del genoma del ADN del plásmido se produce
la plantilla HDR en el momento y la ubicación del evento de nucleasa facilita después del desmontaje de la membrana nuclear durante la mitosis/meiosis
una mayor frecuencia de reparación guiada por plantilla (Fig. 3F). Estos en células en división o después del transporte al núcleo a través de los poros
experimentos en arroz se basaron en observaciones previas de pequeños ARN (Bai et al., 2017). La nucleofección es una forma de electroporación que
inducidos por DSB (diRNA) generados y localizados alrededor de DSB en también crea poros en la membrana nuclear, lo que permite una entrega más
plantas y animales (Yamanaka y Siomi, 2014). Esto sugiere que las quimeras rápida de componentes de edición del genoma o plásmidos en el núcleo
de plantilla de reparación de ARN-sgRNA también pueden mejorar la frecuencia (Gresch et al., 2004).
de HDR en animales y se debe probar un enfoque similar en líneas de células Aunque la electroporación se ha utilizado tradicionalmente para editar líneas
animales. celulares cultivadas, recientemente se ha demostrado que también es eficaz
Si la presencia física de la plantilla muy cerca del DSB en el momento de su en cigotos (Chen et al., 2016; Qin et al., 2015; Tröder et al., 2018).
creación mejora la HDR, entonces quizás los métodos para adjuntar una La inyección citoplasmática (CPI) ha sido la técnica de referencia para
plantilla de reparación de ADN a Cas9 puedan aumentar la frecuencia de la administrar componentes de edición del genoma directamente en cigotos de
HDR. De hecho, se ha informado que la unión covalente de una plantilla de ganado. La electroporación ha comenzado recientemente a mostrar su
reparación de ssDNA a Cas9 (Fig. 3G) aumentó la frecuencia HDR hasta 30 potencial para este propósito con la introducción efectiva de mutaciones indel
veces en múltiples líneas celulares (Aird et al., 2018; Savic et al., 2018). Un (a través de NHEJ) en cigotos de cerdos y ganado (Hirata et al., 2019; Miao et
método de unión alternativo para dsDNA podría incluir agregar un dominio de al., 2019; Tanihara et al., 2018, 2016). A diferencia de CPI, donde se usa una
unión de ADN específico del sitio a Cas9 e incluir su sitio de unión al final de aguja para administrar reactivos de edición del genoma en cigotos
la plantilla de reparación de dsDNA (Fig. 3H). individualmente, la electroporación permite la manipulación de cigotos en
masa, lo que reduce el tiempo y la experiencia necesarios.
Entrega de plantillas de nucleasa y reparación La entrega de componentes de edición del genoma en el cigoto evita las
En los programas de cría de animales, la transmisión de la línea germinal deficiencias de SCNT, pero tiene el inconveniente del mosaicismo cuando el
es el objetivo final porque las ediciones deben pasarse a la siguiente evento de edición ocurre en una etapa multinuclear/multicelular y se desconoce
generación para la mejora genética. Para lograr este objetivo en especies el éxito de la edición. La detección de cigotos se puede realizar mediante
de ganado de mamíferos, la edición del genoma se puede realizar en biopsias de genotipado en la etapa de blastocisto antes de la transferencia de
células somáticas y la línea celular editada posteriormente se clona mediante embriones a madres sustitutas, pero este método puede disminuir la viabilidad
transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) o en cigotos en de los embriones trasplantados (Cenariu et al., 2012). Para los animales
desarrollo. Las eliminaciones de genes dirigidos y, con menor éxito, las mosaicos, es necesario producir generaciones posteriores para obtener
inserciones de genes dirigidos, en el ganado de mamíferos generalmente animales homocigóticos no mosaicos. La introducción de reactivos de edición
se han logrado en cultivo celular, seguido de SCNT (Tan et al., 2016). Hacer del genoma directamente en cigotos ha sido un enfoque exitoso para lograr
la modificación en las líneas celulares permite una identificación más knock-outs específicos en embriones, aunque el mosaicismo puede reducir la
eficiente de los cambios genéticos, y se pueden examinar varias colonias transmisión de la línea germinal, pero las inserciones de genes dirigidos
de la misma línea para que haya más posibilidades de obtener células con todaseficientes
las modificaciones correctas.
han resultado difíciles. La vía HDR se restringe principalmente a
La entrega de cigotos tiene la ventaja de producir una diversidad de animales células en división activa (fase S/G2), y solo se vuelve muy activa hacia el final
básicos, ya que cada cigoto producirá un animal genéticamente distinto, a de la primera ronda de replicación del ADN en el cigoto de una célula (Hustedt
diferencia de los animales derivados de una línea celular clonal. El uso de y Durocher, 2016).
SCNT para derivar embriones a partir de células editadas reduce en gran La electroporación de células somáticas generalmente se usa cuando se
medida la eficiencia del método debido a la baja tasa de nacimiento de requiere HDR, y solo se han publicado algunos ejemplos de HDR por CPI de
animales sanos, particularmente en el ganado (Akagi et al., 2014; Keefer, ADN de doble cadena (dsDNA) en cigotos de especies de ganado (Park et al.,
2015). 2017b; Peng et al., 2015). Sin embargo, varios grupos han utilizado con éxito
Los componentes de edición del genoma pueden administrarse en las oligo-ADN de cadena sencilla (ssODN) para realizar mutaciones puntuales de
células objetivo a través de métodos físicos o mediante el empleo de vectores ADN o inserciones/eliminaciones de fragmentos pequeños mediante HDR
(virales o no virales). El ganado de mamíferos editado con genoma se ha (Lillico et al., 2016; Niu et al., 2018; Wei et al., 2018). ; Zhou et al., 2016b).
producido predominantemente utilizando métodos físicos, que incluyen la Otro enfoque para agregar genes completos en cigotos se usó con éxito para
electroporación de células somáticas (típicamente fibroblastos fetales) y la crear ovejas que expresan dos proteínas involucradas en la síntesis del
microinyección, o más recientemente, la electroporación de cigotos. antioxidante melatonina en su leche usando un promotor de ÿ-caseína (Ma et
Los componentes de edición del genoma pueden entregarse como proteínas al., 2017). El dsDNA lineal sin brazos de homología se inyectó directamente
maduras (o complejos de ARN/proteína en el caso de CRISPR/Cas) o en el citoplasma de los cigotos junto con Cas9 y un sgRNA dirigido al locus de
codificarse en ARN o ADN. El uso de proteínas (y en menor medida de ARN) miostatina. Los dsDNA se integraron por reparación de ADN independiente de
permite un control más preciso de la actividad del editor, lo que puede ser homología en el sitio objetivo de ~35% de corderos vivos con ~26% de
importante para limitar posibles eventos de escisión de ADN fuera del objetivo. corderos vivos que portaban ambos genes.
El requisito de una plantilla de reparación para HDR agrega otro elemento
(ADN) a la mezcla de entrega, lo que aumenta su complejidad. La edición del genoma en especies aviares se complica por la inaccesibilidad
Cada plantilla de reparación requiere brazos de homología que flanquean la del cigoto aviar (Sang, 2004). Por esta razón, la mayoría de los estudios de
edición deseada y, por lo general, son de 50 a 1000 pb para cada uno de los edición del genoma en pollos se dirigen a las células germinales primordiales
dos brazos que flanquean. El ADN lineal libre puede ser tóxico para los cigotos, (PGC). Las CGP de pollo circulan por el torrente sanguíneo de los embriones
por lo que la concentración administrada debe limitarse (Brinster et al., 1985). a las 48–60 h de incubación a medida que migran a la cresta genital de las
La electroporación utiliza pulsos de alto voltaje para inducir la formación gónadas en desarrollo (Ginsburg y Eyal-Giladi, 1986; Nakamura et al., 2007).
transitoria de poros en la membrana celular. Estos poros permiten el flujo de Las PGC de pollo se pueden propagar fácilmente in vitro donde se pueden
componentes de edición del genoma desde el líquido de suspensión hasta el administrar componentes de edición del genoma, generalmente en forma de
citoplasma celular. Los péptidos dirigidos al núcleo pueden usarse para ayudar ADN por lipofección. La lipofección es una técnica de vector no viral que
al transporte de proteínas de edición del genoma a través de la membrana nuclear.implica la formación de complejos electrostáticos de lípidos y ADN para formar

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REVISIÓN Revista de Biología Experimental (2020) 223, jeb207159. doi:10.1242/jeb.207159

lipoplejos que son absorbidos por las células. Los PGC editados se pueden examinar
e inyectado en el torrente sanguíneo de química o genéticamente
embriones de pollo con ablación de línea germinal (Smith et al., 2015) a través de un
ventana en el huevo. Alternativamente, la inyección intravenosa se puede utilizar
para apuntar directamente a las CGP circulantes con reactivos de transfección (Tyack
et al., 2013). Las aves resultantes pueden ser criadas para producir genoma
descendencia editada.
Debe enfatizarse que muchos de los procesos involucrados en
la edición del genoma del ganado requiere mucho tiempo y, en la actualidad,
ineficiente. Hay una serie de pasos y biológicos impredecibles.
variables que incluyen la recolección y maduración de gametos, introducción
de los reactivos de edición, clonación y transferencia de embriones en
presas subrogadas sincronizadas, todas las cuales tienen sus propias
limitaciones y restricciones (Fig. 4). Microinyección de embriones para
producir descendencia de mosaico y, posteriormente, reproducirse para producir
descendencia heterocigota editada, es un proceso prolongado y costoso
empresa en grandes animales destinados al consumo. Muchas ediciones del genoma
aplicaciones requieren modificaciones homocigóticas para asegurar
herencia de una copia en la generación F1, o para alelos con un
Modo de herencia recesivo. La complejidad y las ineficiencias
asociado con muchos de estos procesos hace que la edición del genoma
de ganado lejos de la rutina en el momento actual.
¿Cómo puede la edición del genoma alterar los componentes del
ecuación de los criadores?
Intensidad de selección
La intensidad de la selección (i) es un impulsor importante del cambio genético: como
se muestra en la Fig. 2, un pollo individual en el núcleo de cría en
la parte superior de la estructura de reproducción de la pirámide puede dar lugar a millones de
descendientes en un programa de reproducción bien diseñado. La generalizada
adopción de la inseminación artificial (IA) en la ganadería lechera
resultó en un cambio pronunciado en la tasa de ganancia genética en la lechería
industria, y como resultado aumentar la intensidad de selección de
toros genéticamente élite (VandeHaar y St-Pierre, 2006). un toro,
conocida como Pawnee Farm Arlinda Chief, produjo 16.000 hijas,
500.000 nietas y más de 2 millones de bisabuelos

li t mi fe
mi
metro
ales

yo at
io
ti i z
norte

ovocito
mir
enucleado
F
Cigoto
ovocito
Esperma IPC/PE
SC Tnorte

Gene
editor edición de genes
Editado genéticamente

embrión Célula somatica ovocito

edición de genes donante
Sustituto
presa

Sustituto
Embrión
presa
transferir

recogida de ovocitos
Embrión o cosecha de ovarios
transferir

+ -- -
++ No modificado
--
femenino

heterocigoto
mosaico
Homocigoto
no mosaico
+-
Sexualmente
+- maduro --

ati
norte

METRO

+- Sexualmente
heterocigoto
no mosaico
maduro +- --

+-

Fig. 4. Pasos para producir ganado con genoma editado mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) o edición de cigotos. Esquema que muestra los pasos típicos
involucrados para producir ganado homocigoto, no mosaico, ya sea mediante la clonación SCNT de células somáticas revisadas y editadas por el genoma (flechas amarillas) o citoplasmáticas
inyección (CPI)/electroporación (EP) de cigotos (flechas moradas) con componentes de edición del genoma.

6
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REVISIÓN
nietas Sus hijos también fueron sementales populares. Como resultado, los
cromosomas de Chief representan casi el 14 % del genoma en la población
Holstein actual en los Estados Unidos (Adams et al., 2016). La industria porcina
es otra industria integrada verticalmente con una estructura de cría piramidal
que se adapta bien a la introducción de la edición del genoma en los programas
de selección.
Otros sectores ganaderos no son tan adecuados para aumentar la intensidad
de la selección a través de la IA. En las industrias extensivas de pastoreo, como
la producción de ganado vacuno y ovino, es difícil rastrear y sincronizar los
ciclos estrales de las hembras cíclicas. Por estas razones, la implementación
de la IA como herramienta de mejoramiento en el ganado de carne ha sido
limitada. Dichos sistemas ganaderos suelen utilizar una jerarquía de reproducción esperma derivado de células de donantes (Ogawa et al., 2000).
escalonada para difundir la genética mejorada. El nivel superior de esta jerarquía
está compuesto por una población núcleo de élite de machos de alta precisión
examinados mediante selección genómica y/o pruebas de progenie. Sus hijos
forman el segundo nivel (multiplicadores) y se utilizan para difundir la genética
del núcleo de élite ya sea engendrando directamente animales de producción o
engendrando toros de animales de producción que forman el tercer nivel
(productores comerciales). Por lo tanto, existe un rezago en el mejoramiento
genético entre el núcleo de élite y los animales comerciales. Una forma de
disminuir este retraso sería reducir el número de niveles haciendo copias de
línea germinal de animales de élite.
Este objetivo podría lograrse mediante el uso de toros sustitutos (Gottardo et
al., 2019), lo que implica reemplazar la línea germinal de machos inferiores con
la línea germinal de machos genéticamente elite por
Élite masculino
iPSC
Biopsia
de testículo
Tejido adiposo
Cultivo ESC
o iPSC
Gene
edición
cultura MSC
PGCLC masculinos
o SSC
Padre sustituto con
ablación de línea germinal
Femenino
Revista de Biología Experimental (2020) 223, jeb207159. doi:10.1242/jeb.207159
inyectando células germinales derivadas del donante en los testículos (Fig. 5).
Las células madre espermatogoniales (SSC), que se pueden aislar de los
testículos maduros, representan una fuente de células germinales competentes
con el potencial tanto de autorrenovarse como de diferenciarse en células hijas
y, en última instancia, en espermatozoides. Se informó por primera vez en un
par de estudios de 1994 que las SSC trasplantadas de los testículos de ratones
donantes fértiles a los testículos de ratones mutantes W o tratados con busulfán,
que no muestran espermatogénesis, son capaces de producir espermatozoides
funcionales que fertilizan óvulos y dan como resultado descendencia (Brinster y
Avarbock, 1994; Brinster y Zimmermann, 1994). Otro estudio que implantó SSC
en los testículos de ratones mutantes W también produjo crías a partir de
Los trasplantes alogénicos de SSC en los testículos de receptores con escasez
de línea germinal química o con abundancia de línea germinal de varias
especies de ganado no provocaron reacciones inmunológicas ilícitas, y se
demostró que las células del donante contribuyen a la espermatogénesis (Herrid
et al., 2006, 2019; Honaramooz et al. , 2002, 2003). Sin embargo, todos estos
estudios mostraron distribuciones dispersas de células implantadas,
probablemente debido a los caminos tortuosos y la multiplicidad de túbulos testiculares.
Se necesitan métodos de administración mejorados para una distribución
homogénea de las células implantadas.
Como alternativa al tratamiento químico, se puede usar la edición para
producir mutantes infértiles a través de la inactivación de un gen de fertilidad
esencial (p. ej., NANOS2; Park et al., 2017a) que se requiere para el desarrollo
de la línea germinal, creando un toro sustituto con ablación genética de la línea germinal.
Los knockouts de NANOS2 en cerdos y ratones no tienen línea germinal, pero
Fig. 5. Clonación de línea germinal por padre sustituto. Esquema que muestra
posibles fuentes de células germinales masculinas para la transferencia a toros
sustitutos con ablación de la línea germinal (p. ej., knockout para NANOS2).
Los donantes de tejidos/células se muestran como embriones masculinos de
élite (embrión de élite), juveniles (recién nacido de élite) y adultos (macho de élite).
La coloración azul representa diferentes individuos de la misma raza. La
coloración rosa representa individuos de una raza diferente. Los círculos verdes
muestran potencial para la edición y el cultivo repetidos. ESC, célula madre
Células somáticas
embrionaria; iPSC, célula madre pluripotente inducida; MSC, célula estromal
mesenquimatosa; PGCLC, célula similar a la célula germinal primordial; SCNT,
SCNT
transferencia nuclear de células somáticas; SSC, célula madre espermatogonial.
Embrión de élite
neonato de élite
7
Machine Translated by Google
REVISIÓN
los túbulos seminíferos permanecen intactos (Park et al., 2017a; Suzuki et al., 2007). El
nicho de desarrollo vacante en los túbulos seminíferos podría llenarse con células
germinales masculinas de un macho élite para producir esperma fértil. La edición del
genoma para eliminar los genes de desarrollo de la línea germinal significaría que las
células podrían implantarse en animales más jóvenes y garantizar que todas las crías
se produzcan con esperma derivado de células de donantes. Las líneas sustitutas
podrían mantenerse mediante una selección cuidadosa del objetivo de eliminación. Por
ejemplo, los machos con un alelo NANOS2 intacto y las hembras knockout para
NANOS2 son fértiles, lo que permite una generación eficiente de machos knockout
mediante reproducción (Giassetti et al., 2019).
Otros tipos de células también podrían ser fuentes potenciales de línea germinal en
un sistema de reproducción de toros sustitutos. Las células madre embrionarias (ESC)
se pueden inducir para que se conviertan en células germinales primordiales (PGCLC)
y, posteriormente, se pueden inducir para formar espermatozoides (Hayashi et al., 2011).
Sin embargo, cuando se inyectan en los testículos de ratones con ablación de la línea
germinal, los PGCLC derivados de ESC pueden formar teratomas (Hayashi et al.,
2011), lo que impediría su uso para la cría de ganado. Hayashi et al. (2011) utilizaron
marcadores transgénicos para seleccionar una subpoblación de PGCLC derivados de
ESC que no formaban teratomas cuando se implantaban en los testículos de ratones
receptores y producían espermatozoides que posteriormente se utilizaban para fertilizar
ovocitos mediante inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
Posteriormente, el mismo grupo perfeccionó sus condiciones de cultivo para mejorar la
proliferación del subconjunto de PGCLC derivados de ESC que no forman teratomas
(Ohta et al., 2017). Cuando los PGCLC cultivados en estas condiciones se implantaron
en ratones receptores, no produjeron teratomas y pasaron a formar espermatozoides
completamente funcionales que produjeron descendencia tanto por FIV como por
apareamiento natural. Sin embargo, todavía ordenaron los PGCLC por expresión de
reporteros transgénicos. Se necesitaría establecer una alternativa a la selección por
informadores transgénicos, como los marcadores de superficie celular, para que los
PGCLC derivados de ESC tengan utilidad para la cría de ganado.
Las células estromales mesenquimales (MSC) se pueden aislar de una variedad de
tejidos adultos y neonatales y se pueden transdiferenciar en múltiples linajes celulares,
incluidos los PGCLC. Se ha demostrado que las MSC expresan múltiples marcadores
de células germinales después del tratamiento con ácido retinoico y/o varios factores
de crecimiento (Dissanayake et al., 2018; Ghasemzadeh Hasankolaei et al., 2014; Hua
et al., 2009; Luo et al., 2019). ; Shirzeyli et al., 2017; Wei et al., 2016; Yan et al., 2015).
Se han observado células haploides similares a espermátidas en cultivos y trasplantes
de PGCLC derivados de MSC (Ghasemzadeh-Hasankolaei et al., 2016a,b; Shlush et
al., 2017; Zhang et al., 2014). Las MSC no forman teratomas cuando se inyectan en
testículos de donantes e incluso se ha demostrado que ayudan a restablecer el nicho
testicular después del daño químico (Cakici et al., 2013; Maghen et al., 2017; Vahdati
et al., 2017). También se han producido PGCLC masculinos a partir de células madre
pluripotentes inducidas (iPSC), que también pueden derivarse de animales adultos
(Hayashi et al., 2011; Sasaki et al., 2015; Wang et al., 2016a). Se requieren más
experimentos para demostrar definitivamente que estos PGCLC de diferentes tipos de
células pueden cumplir la definición funcional de una célula germinal, es decir, la
capacidad de sufrir meiosis y producir un gameto.
El uso de SSC adultos, PGCLC derivados de MSC o iPSC podría permitir seleccionar
animales donantes de élite en función de observaciones y mediciones fenotípicas, lo
que puede ser especialmente importante para especies y razas donde no existe una
forma genómica de estimar su mérito genético en un joven. años. Un obstáculo que
deberá superarse para que el método de los toros sustitutos sea útil en la producción
ganadera es el bajo rendimiento de esperma después de la implantación de células de
donantes.
La etapa de cultivo celular de los métodos de reemplazo de células germinales
representa una oportunidad ideal para introducir ediciones del genoma. Si se pueden
superar los obstáculos técnicos actuales, toro sustituto
Revista de Biología Experimental (2020) 223, jeb207159. doi:10.1242/jeb.207159
la tecnología podría cambiar el diseño fundamental de los programas de cría de
animales, con componentes separados de mejora de la población y desarrollo de
productos (Gottardo et al., 2019).
Precisión de la selección
La edición del genoma podría usarse para probar hipótesis en estudios de genómica
funcional y para ayudar a identificar los alelos causales editándolos o eliminándolos con
precisión, y probando su función en otras razas o especies. Dichos estudios podrían
usarse para discernir si los alelos asociados con un mejor resultado de rasgo cuantitativo
mejoran o impiden ese resultado cuando se editan o eliminan con precisión y se prueban
en un grupo contemporáneo homogéneo. Esta información podría usarse para
determinar los mejores loci para editar entre los millones de variantes genéticas que
existen al comparar individuos.
Un estudio de simulación modeló que si se usara la edición del genoma para editar
20 loci por toro de los 10 000 loci aditivos que contribuyen a la variación genética de un
rasgo poligénico, esto podría potencialmente duplicar la tasa de ganancia genética en
relación con GS solo (Jenko et al., 2015) . Los conductos para descubrir variantes
causales que subyacen a la variación genética serán quizás el mayor desafío para
implementar la edición de rasgos poligénicos (Hickey et al., 2016). La edición del
genoma también podría usarse para fijar alelos favorables en loci beneficiosos o eliminar
alelos dominantes perjudiciales mediante la duplicación de alelos recesivos favorables
en un cruce F1. Las endonucleasas dirigidas al sitio podrían usarse para crear un DSB
en el alelo indeseable con el otro alelo proporcionando la plantilla para reparar la rotura.
Esto podría permitir que se crearan nuevas razas con la homocigosidad deseada en
alelos de rendimiento clave, pero heterocigosidad mejorada en otros loci.
Diversidad genética
La edición del genoma podría usarse para mover elementos genéticos entre razas y
especies o alterar elementos genéticos existentes para crear otros nuevos, expandiendo
efectivamente la diversidad genética disponible (ÿA).
La Tabla 2 resume la literatura revisada por pares sobre la introducción de las ediciones
deseadas en las especies de animales destinados al consumo humano que han dado
como resultado crías vivas, el método de transfección utilizado, el gen y la función
objetivo, y la nucleasa que estuvo involucrada en la edición.
Las tecnologías de edición del genoma se han utilizado para abordar rasgos que van
desde la eficiencia de producción hasta el bienestar animal, la sostenibilidad ambiental
y la resistencia a enfermedades. El poder de la edición es que puede introducir alelos
útiles en ausencia de arrastre de vinculación de otros rasgos no deseados. En ausencia
de edición, los productores de ganado pueden resistirse a la introducción de un nuevo
alelo útil asociado con tener que usar toros de mérito genético inferior o toros de otra
raza. Por ejemplo, el alelo sin cuernos, que da como resultado la falta de cuernos
(Medugorac et al., 2012), está asociado con toros lecheros de bajo mérito genético y
toros de varias razas de carne.
Usando la edición del genoma, el alelo se introdujo en la genética lechera en un
experimento de prueba de concepto (Carlson et al., 2016). Si este alelo pudiera editarse
en el genoma de varios toros lecheros de élite, entonces la inseminación artificial podría
usarse para diseminar rápidamente ese alelo dominante sin cuernos a través de la
población de ganado lechero (Mueller et al., 2019) y eliminar la necesidad de exámenes
físicos. extracción de cuernos, que es un problema de bienestar animal.
Aunque los rasgos monogénicos presentan buenos objetivos para la edición del
genoma y pueden tener resultados tangibles en la salud animal, el medio ambiente y la
economía, casi todos los rasgos del ganado económicamente importantes son rasgos
poligénicos complejos (Georges et al., 2019). Estos rasgos incluyen el rendimiento y la
composición de la leche, el rendimiento, la composición y la calidad de la canal, la
conversión alimenticia, la eficiencia alimenticia, la tasa de crecimiento, el rendimiento y
la calidad de la lana, la fertilidad, el rendimiento de los huevos y la resistencia a las
enfermedades. Algunos genes individuales pueden tener grandes efectos sobre
8
 9
Cabras Cigoto
de
oveja Ganado Tipo
de
célula
animal Tabla
2.
Experimentos
de
edición
del
genoma
para
aplicaciones
agrícolas
en
especies
de
animales
destinados
al
consumo
humano
que
han
dado
como
resultado
crías
editadas
en
vivo
Revista
de
Biología
Experimental
Cigoto Cigoto Fibroblastos
de
oreja
cabra GFF,
SCNT GFF,
SCNT Cigoto Cigoto GFF,
SCNT Fibroblastos
fetales
de
cabra Fibroblastos
de
oreja
oveja
Electroporación
MSTN Cigoto Cigoto Cigoto Cigoto Cigoto Fibroblastos
fetales
ovinos Cigoto Cigoto Cigoto Piel
fetal
bovina Fibroblasto
derivado
del
oído, BFF,
SCNT BFF,
SCNT BFF,
SCNT BFF,
SCNT Cigoto BFF,
SCNT BFF,
SCNT BFF,
SCNT Fibroblastos
fetales
bovinos
(GEF)
&
GFF,
SCNT (GFF),
SCNT (APAGADO),
SCNT fibroblastos,
SCNT SCNT (BFF),
SCNT
IPC IPC Electroporación
Alfa-
lactoalbúmina
humana
(LALBA):
principal
proteína
de
suero
en
la
leche
humana
en
– Electroporación
MSTN Electroporación
humana
LTF
en
gen
PAEP IPC IPC Electroporación
Lactoferrina
humana
(LTF):
involucrada
en
la
absorción
de
hierro,
en
PAEP
locus
HDR,
knock-
in
yKO nucleofección IPC IPC IPC pronuclear IPC Electroporación
MSTN IPC IPC IPC IPC electroporación electroporación electroporación Gen
NRAMP1
de
electroporación
(controla
las
infecciones
de
MTB)
insertado
en
la
región
intergénica electroporación electroporación citoplasmático nucleofección Electroporación
del
gen
de
la
lisozima
humana
(antimicrobiano)
en
el
locus
CSN2 electroporación nucleofección método transfección
inyección
(PNI) Inyección
MSTN
(CPI)
ASIP:
color
del
pelaje AANAT
yASMT
(involucrados
en
la
síntesis
del
antioxidante
melatonina)
MSTN PAEP MSTN MSTN
yFGF5 MSTN FGF5 Factor
de
crecimiento
fibroblastos
5
(FGF5):
regulador
negativo
de
la
longitud
de
la
lana MSTN,
proteína
de
señalización
agutí
(ASIP)
yÿ-
caroteno
oxigenasa
2 MSTN MSTN MSTN PAEP Sulfolobus
solfataricus
ÿ-
glicosidasa
(digiere
lactosa)
en
el
locus
CSN2
Extremo
mediado
por
microhomólogo Mutación
reparada
del
síndrome
IARS
en
el
gen
IARS Mutación
reparada
en
el
gen
de
la
isoleucil-
tRNA
sintetasa
(IARS)
que
causa Reemplace
el
alelo
con
cuernos
por
el
alelo
sin
cuernos Gen
Sp110
de
ratón
(controla
infecciones
MTB)
insertado
en
intergénico Miostatina
(MSTN):
regulador
negativo
del
crecimiento
muscular Gen
de
la
lisostafina
(antimicrobiano)
insertado
en
el
locus
HDR
de
la
ÿ-
caseína
(CSN2)
knock-
–
in ÿ-
lactoglobulina
(PAEP):
proteína
de
suero
alérgeno
– Gen
yfunción
locus
PAEP con
promotor
de
ÿ-
caseína
en
el
locus
MSTN (BCO2) entre
FSCN1
yACTB región
entre
SFTPA1
yMAT1A
síndrome
de
IARS
NHEJ-
KO NHEJ-
KO HDR:
knock-
in
yKO NHEJ-
KO HDR:
knock-
in
yKO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ
-ADN
independiente
de
homología
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO HDR-
KO
ssODN HDR
-sustitución
de
base
única HDR
-sustitución
de
base
única HDR
-knock-
in HDR
-knock-
in HDR
-knock-
in NHEJ-
KO NHEJ-
KO HDR
-knock-
in NHEJ
-nocaut
(KO) Mutación
unión
(MMEJ)
knock-
–
in
reparación
-knock-
in
yKO
CRISPR/
Cas9
He
et
al.,
2018 CRISPR/
Cas9
Zhou
yotros,
2017 TALEN TALEN TALEN CRISPR/
Cas9
Guo
et
al.,
2016 CRISPR/
Cas9
Wang
yotros, TALEN CRISPR/
Cas9
Ni
yotros,
2014 CRISPR/
Cas9
Zhang
yotros,
2019 CRISPR/
Cas9
Zhang
yotros,
2017 CRISPR/
Cas9 CRISPR/
Cas9
Li
yotros,
2017 CRISPR/
Cas9
Hu
et
al.,
2017 CRISPR/
Cas9
Wang
yotros, TALEN CRISPR/
Cas9
Crispo
et
al.,
2015 CRISPR/
Cas9
Han
yotros,
2014 TALEN TALEN CRISPR/
Cas9
Ishino
et
al.,
2018 CRISPR/
Cas9
Ikeda
yotros,
2017 CRISPR/
Cas9 TALEN ZFN
TALEN
TALENickase
Wu
et
al.,
2015 ZFN/
ZFNickase
Liu
et
al.,
2013 ZFN Editor
dsADN Nickase
Zhu
et
al.,
2016 Yu
et
al.,
2016 Canción
et
al.,
2016 Cui
et
al.,
2015 Wei
et
al.,
2018 Su
et
al.,
2018b Gao
et
al.,
2017 Tan
et
al.,
2013; Yu
et
al.,
2011
Ma
et
al.,
2017 Li
et
al.,
2016 Proudfoot
et
al., Proudfoot
et
al., Luo
et
al.,
2014 Liu
et
al.,
2014 Referencia
2015b 2016b 2015 2016 Carlson
et
al., 2015
Continuado
Revista de Biología Experimental (2020) 223, jeb207159. doi:10.1242/jeb.207159 REVISIÓN
Machine Translated by Google
 10
Pollos
Células
germinales
primordiales Tipo
de
célula
animal Tabla
2.
Continuación
cerdos
Revista
de
Biología
Experimental
CGP,
trasplante Cigoto PFF,
SCNT PFF,
SCNT PFF,
SCNT PFF,
SCNT PFF,
SCNT Cigoto Cigoto PFF,
SCNT PFF,
SCNT PFF,
SCNT Cigoto Cigoto Cigoto dérmica
porcina
Cigoto PFF,
SCNT PFF,
SCNT PFF,
SCNT Fibroblastos
fetales
porcinos
Cigoto Cigoto GFF,
SCNT Cigoto
trasplante (PGC), fibroblastos,
SCNT (PFF),
SCNT
electroporación Lipofección IPC electroporación nucleofección nucleofección nucleofección electroporación IPC IPC electroporación nucleofección Electroporación
MSTN IPC IPC Electroporación
MSTN Electroporación
MSTN IPC Electroporación
MSTN Electroporación
MSTN nucleofección electroporación IPC IPC electroporación IPC método transfección
DDX4:
determinante
materno
para
la
formación
del
linaje
de
células
germinales Ovoalbúmina
(OVAL)
yovomucoide
(SPINK7):
proteínas
de
clara
huevo
– Amino
peptidasa
N
(ANPEP):
receptor
para
gastroenteritis
transmisible FBXO40
(la
mutación
nula
produce
hipertrofia
muscular) Anti-
virus
de
la
peste
porcina
clásica
pequeños
ARN
de
horquilla
(ARNsh)
en
porcino gen
fat-1
en
el
locus
ROSA26
porcino NANOS2:
necesario
para
la
supervivencia
de
la
prospermatogonia Se
reemplazó
la
región
del
RELA
porcino
susceptible
al
virus
de
la
peste
porcina
africana RELA
(se
relaciona
con
la
gravedad
de
la
infección
por
el
virus
de
la
peste
porcina
africana) Gen
yfunción
IGF2 Exón
7
de
CD163
reemplazado
con
el
exón
correspondiente
de
humano Exón
7
de
CD163 Factor
de
crecimiento
similar
a
la
insulina
2
(IGF2):
promueve
el
crecimiento MSTN Proteína
desacopladora
de
ratón
1(Ucp1)
(desempeña
un
papel
clave
en
el
tejido
adiposo
marrón) Exón
7
de
CD163 MSTN Exón
7
de
CD163
(requerido
para
la
reproducción
yporcina
altamente
patógena). RELA Gen
fat-1
de
C.
elegans
(convertir
PUFA
n-6
en
PUFA
n-3)
en
el
locus
HDR
de
MSTN:
knock-
in
yKO Se
introdujo
una
mutación
puntual
en
el
gen
del
factor
de
diferenciación
del
crecimiento
9
(GDF9):
Alérgenos virus
yde
la
diarrea
epidémica
porcina locus
ROSA26 promotor
de
adiponectina
en
UCP1
endógeno
porcino
(no
funcional) termogénesis
sin
escalofríos
adaptativa
mediada
por
tejidos)
con con
ortólogo
de
(asociado
jabalí
con
la
resiliencia
de
los
cerdos
africanos) plantilla
modificada
para
codificar
la
misma
secuencia
de
aminoácidos
que
la
humana
CD163L1 lugar Fiebre) CD163L1
del
exón
11 infección
por
el
virus
del
síndrome
respiratorio)
reemplazado
usando
un
ADN
porcino aumenta
el
tamaño
de
la
camada
HDR-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ
Unión
–
del
represor
KO
ZBED6 HDR:
knock-
in
yKO NHEJ-
KO NHEJ-
KO HDR
-knock-
in NHEJ
Unión
–
del
represor
KO
ZBED6 NHEJ-
KO HDR
-knock-
in Integración
independiente
de
recursos
humanos NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO HDR:
knock-
in
yKO
ssODN HDR:
incorporación
de
EGFP
como
seleccionable NHEJ-
KO NHEJ-
KO HDR:
knock-
in
yKO NHEJ-
KO NHEJ-
KO HDR:
sustitución
de
base
única
ssODN
CRISPR/
Cas9
Niu
et
al.,
2018 Mutación
sitio
en
el
intrón
3 sitio
en
el
intrón
3 recombinasa:
KO marcador,
EGFP
extirpado
por
Cre
TALEN CRISPR/
Cas9
Oishi
yotros,
2016 CRISPR/
Cas9Whitworth
et
al., CRISPR/
Cas9
Liu
yotros,
2019 CRISPR/
Cas9
Chen
yotros,
2019 CRISPR/
Cas9
Zou
et
al.,
2018 CRISPR/
Cas9
Yang
yotros,
2018 CRISPR/
Cas9
Xie
yotros,
2018 CRISPR/
Cas9 CRISPR/
Cas9
Su
et
al.,
2018a CRISPR/
Cas9
Li
yotros,
2018 CRISPR/
Cas9
Zheng
et
al.,
2017 CRISPR/
Cas9
Wang
yotros,
2017 CRISPR/
Cas9
Park
yotros,
2017a CRISPR/
Cas9
Burkard
et
al., CRISPR/
Cas9
Tanihara
et
al., TALEN ZFN CRISPR/
Cas9
Bi
et
al.,
2016 CRISPR/
Cas9
Wang
yotros, ZFN CRISPR/
Cas9Whitworth
et
al., TALEN ZFN CRISPR/
Cas9
Zhang
et
al., Editor
Nickase
Taylor
et
al.,
2017 Xiang
et
al.,
2018 Qian
et
al.,
2015
Rao
et
al.,
2016 Lillico
et
al.,
2016 Lillico
et
al.,
2013 Lillico
et
al.,
2013 Referencia
2019 2017 2016 2015a 2014 2018b
Continuado
Revista de Biología Experimental (2020) 223, jeb207159. doi:10.1242/jeb.207159 REVISIÓN
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REVISIÓN Revista de Biología Experimental (2020) 223, jeb207159. doi:10.1242/jeb.207159

rasgos poligénicos; por ejemplo, mutaciones en el gen de la miostatina que

dan como resultado fenotipos de 'doble músculo' contribuyen en gran medida a la
2019 2016

Referencia Zhong
2016
al.,
et Dong
2011
al.,
et Dong
2014
al.,
et 2016
Qin
al.,
et 2017
Cui
al.,
et
rasgo poligénico del rendimiento de la canal. Otros alelos con más modestos
los efectos sobre los rasgos poligénicos aún podrían ser buenos objetivos para el genoma
edición, particularmente con las inevitables mejoras en el genoma
edición que cumplirá las próximas décadas.

Intervalo generacional
Nuevos avances en el desarrollo in vitro de células germinales y gametos a partir de
Editor CRISPR/
yotros,
2019
Cas9
Lee CRISPR/
yotros,
2019
Cas9
Park TALEN CRISPR/
Baloch
Cas9
al.,
et ZFN TALEN ZFN CRISPR/
Khalil
2017
Cas9
al.,
et TALEN Wargelius
CRISPR/
Cas9
al.,
et

ESCs de ratón han llevado a un interés reciente en el potencial de in vitro

cría en ganado (Goszczynski et al., 2018; Hou et al., 2018).
La ventaja de este método propuesto sería que podría
eliminar efectivamente la espera requerida para que los animales alcancen la sexualidad
madurez antes de la meiosis y la concepción. Esto tiene el potencial de
disminuir drásticamente el componente de intervalo de generación de la
ecuación de criadores (ecuación 1), y si tanto la gametogénesis in vitro como
la fertilización se puede lograr con éxito en una placa de Petri, ofrece
la posibilidad de mantener toda una población reproductora de grandes
animales en un laboratorio (Fig. 6).
La investigación en ratones ha demostrado que los PGCLC femeninos pueden ser
Mutación -knock-
NHEJ
in NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO NHEJ-
KO

producido con éxito in vitro a partir de ESC de ratón antes de ser

inducidos aún más para convertirse en ovocitos maduros completamente potentes (Hikabe
et al., 2016). También se han producido espermatozoides in vitro a partir de ratones.
PGCLC derivados de ESC, pero requieren ICSI para fertilizar ovocitos
(Hayashi et al., 2011; Zhou et al., 2016a). La capacidad de producir
gametos de células madre podría cerrar el hipotético in vitro
bucle de reproducción: ESC cultivadas a partir de embriones, PGCLC
producidos a partir de ESC, espermatozoides y ovocitos producidos a partir de germen
células y embriones producidos a partir de espermatozoides y ovocitos.
Una limitación actual para aplicar este método en ganadería
especie es que las condiciones de cultivo para producir con éxito
cultivos ESC estables y derivados de PGCLC y gametos no han sido
desarrollado. Recientemente se demostró que los cultivos ESC estables
puede ser producido eficientemente a partir de blastocistos de ganado (Bogliotti et al.,
2018). También se han logrado avances en el cultivo de ESC a partir de cerdos.
y ovejas (Brevini et al., 2010; Dattena et al., 2006; Kim et al.,
2010), aunque a la fecha el ganado vacuno es la única especie ganadera con
líneas celulares ESC establecidas y estables que exhiben todas las características de
verdaderos ESC.

El mejoramiento in vitro podría potencialmente reducir el tiempo de generación de

ganado 10 veces de aproximadamente 2,5 a 0,25 años (Goszczynski
masculinos)
cromosoma
intergénica
detección
óvulos
región
(para
de
del
la
Z germinales
células gametogénesis tarifas) pigmentación
gen
de
la et al., 2018). El aumento potencial en la tasa de ganancia genética no es
limitado a las consecuencias de un tiempo de generación reducido; in vitro
yfunción
Gen citomegalovirus
fluorescente
promotor
Proteína
(GFP)
verde
con
en
de regulador
2depósito
positivo
(G0S2):
grasa
switch
Gen
del
G0/
de
G1 deprimordial
migración
Homólogo
esencial
proteína
1(dnd1):
salida
para
de
sin
la duplicados
miostatina
duplicados
miostatina
mstnb:
genes
mstna:
genes
uno
los
de
uno
de
los
de
de deluteinizante
subunidad
hormona
Gen
de
la
la central
papel
(lhb):
beta
en determinación
crecimiento
masculina
hembras
putativo
rápido
tienen
dmrt1:
más
mstn
(las
gen
un
de primordiales;
germinales
formación
yslc45a2:
esencial
células
dnd1:
para
de
la

la cría también podría permitir la producción de miles de embriones

de un solo apareamiento, aumentando así la intensidad de la selección ( i )
y la posibilidad de obtener individuos de élite de cada padre
emparejamiento. Esto podría facilitar la producción de embriones de alta puntuación.
electroporación
de muchas combinaciones diferentes de padre y madre y ayudan a mantener
YI YI YI YI YI YI diversidad genética ( ÿ A) entre generaciones. También podría hacer presas
transfección método Lipofección Lipofección Miostatina
Inyección
(mstn)
yema
(YI)
1a
de
Doble

tan genéticamente potentes como los toros, lo que permite un aumento en la

intensidad de selección en el lado femenino.
La reproducción in vitro podría acelerar la tasa de acumulación de
alelos que contribuyen a los rasgos poligénicos, y sería un ideal
herramienta para combinar con la edición del genoma para acelerar la tasa de genética
programas de mejora. También permitiría un control
trasplante
CGP, trasplante
CGP, Cigoto Cigoto esperma
cigoto
luego Cigoto Cigoto
ambiente para introducir nuevos alelos a una raza, como sin cuernos,
sin las incertidumbres e ineficiencias asociadas con la clonación
y/o edición de embriones.
La reproducción in vitro dependería en gran medida de GS, pero la genómica
Experimental
Biología
Revista
de

Continuación
Tabla
2. animal
célula
Tipo
de Carpa esturión
Cigoto
de Cigoto
bagre
de Único salmón
Cigoto
de mycobacterium
tuberculosis.
MTB,

Se ha demostrado que las predicciones se vuelven menos precisas con el paso del tiempo.
generaciones como el desequilibrio de vinculación entre el marcado
variantes y alelos causales pueden descomponerse (Pszczola y Calus,

11
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REVISIÓN Revista de Biología Experimental (2020) 223, jeb207159. doi:10.1242/jeb.207159

AI

hora del Este

FIV o ICSI
ovocitos y espermatozoides

Clonación

PGCLC derivados de ESC

edición de genes
embriones

Selección genómica cultura ESC

Fig. 6. Cría in vitro. Representación esquemática del concepto de reproducción in vitro utilizando gametos de una cerda y un verraco de élite. El círculo rosa muestra potencial para la edición y el cultivo repetidos.
Las marcas verdes representan colonias ESC que se seleccionan mediante selección genómica, las cruces rojas representan colonias que no se seleccionan.
IA, inseminación artificial; ESC, célula madre embrionaria; ET, transferencia de embriones; ICSI, inyección intracitoplasmática de espermatozoides; FIV, fecundación in vitro; PGCLC, célula similar a la célula
germinal primordial.

2016). El genotipado directo de las variantes causales reduciría la tasa de este ninguna 'nueva combinación de material genético' y el producto final está libre de
decaimiento con el tiempo. Sin la presión selectiva de tener que formar un animal 'transgenes', entonces ese producto no estará sujeto a regulación como un organismo
fértil, estas líneas celulares podrían perder su funcionalidad para cualquier otra cosa genéticamente modificado (GMO). En este sistema, no se hace distinción entre
que no sea el ciclo in vitro. Por lo tanto, es probable que se requieran evaluaciones plantas y animales editados con genoma. En 2018, una línea de tilapia con genoma
periódicas de líneas derivadas de reproducción in vitro mediante la implantación de editado que no contenía ningún ADN extraño ni una nueva combinación de material
embriones en hembras sustitutas para garantizar la viabilidad y proporcionar genético recibió una exención regulatoria de la Comisión Nacional Asesora de
fenotipos para mantener actualizadas las ecuaciones de predicción genómica. Sin Biotecnología Agropecuaria (CONABIA) de Argentina ( https://www.prnewswire.com/
embargo, para cuando el animal pueda ser evaluado, podrían haber tenido lugar news- releases/intrexon-and-aquabounty-receive regulatory-exemption-in-development-
varias generaciones más de reproducción in vitro, por lo que habría un retraso of-gene-edited-tilapia-for more-sustainable-production-300768053.html). De manera
significativo introducido por la detección de animales vivos. similar, Brasil dictaminó que la sustitución del alelo sin cuernos dentro de la especie
que resulta en ganado sin cuernos no se regularía como OGM (MCTIC, 2018).
Aumentar nuestro conocimiento de los alelos causales ayudaría a potenciar el
potencial de la reproducción in vitro. Si se seleccionan todos los rasgos de producción
conocidos durante la reproducción in vitro, se podrían desarrollar simultáneamente Y en 2018, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) confirmó
varias líneas no relacionadas para producir líneas de abuelos divergentes que, una que 'el USDA no regula ni tiene planes para regular las plantas que de otro modo
vez cruzadas, produzcan animales comerciales con máxima heterosis. Teóricamente, podrían haberse producido a través de técnicas de cultivo tradicionales'.
estos cruces podrían ser homocigotos para los alelos de producción importantes,
pero mantener la diversidad en otros genes, acelerando así la tasa de ganancia Sin embargo, la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos
mientras se mantiene la diversidad genética requerida para la mejora genética a (FDA, por sus siglas en inglés) ha adoptado un enfoque muy diferente para los
largo plazo. animales editados, y en un borrador de guía de 2017 anunció que 'todas las
alteraciones intencionales' en el genoma de los animales se regularían como nuevos
medicamentos para animales (Maxmen, 2017). La guía explica que cada alteración
Consideraciones debería pasar por una revisión multigeneracional obligatoria de seguridad y eficacia
reglamentarias Ha habido un rumor entusiasta en torno a la perspectiva previa a la comercialización, independientemente de si esa alteración ya existe en
de la edición del genoma en los programas de cría de ganado para la especie objetivo o podría haberse logrado mediante la reproducción convencional.
acelerar la introgresión de alelos útiles. Sin embargo, la edición del Es probable que esto tenga un efecto perjudicial en la investigación de edición del
genoma aún no ha puesto un solo producto animal sobre la mesa genoma en especies de animales destinados al consumo humano. Los medicamentos
para el consumo del público en general. Además, la ingeniería para animales no aprobados no pueden ingresar a la cadena alimentaria, lo que
genética tradicional, que existe desde hace más de 30 años, solo ha hace que los animales de alimento editados genéticamente sean invendibles. Los
logrado una única aprobación, el salmón AquAdvantage de rápido ingresos derivados del excedente de animales y la leche, la carne y los huevos
crecimiento. Esto se ha debido a obstáculos tanto técnicos como producidos por la investigación universitaria y los rebaños y las manadas docentes
normativos (Van Eenennaam y Muir, 2011). A medida que se superan son una compensación integral de los costos considerables asociados con la investigación con anima
lentamente los obstáculos técnicos de la modificación genética, el Categorizar todas las ediciones del genoma, independientemente de su novedad,
aspecto regulatorio parece volverse más complicado (Van Eenennaam, 2018).
como medicamentos, excluyendo así productos vendibles del ganado editado,
Argentina fue el primer país en publicar su enfoque regulatorio propuesto para la aumentará considerablemente los costos asociados con esta investigación y
edición del genoma y otras nuevas técnicas de mejoramiento (Whelan y Lema, aumentará drásticamente los costos de desarrollo asociados con la comercialización
2015). El planteamiento argentino es que si hay del ganado editado con genoma.

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REVISIÓN Revista de Biología Experimental (2020) 223, jeb207159. doi:10.1242/jeb.207159

En 2018, el Tribunal de Justicia de la Unión Europea (TJUE) dictaminó
que los cultivos modificados genéticamente deberían estar sujetos a las
mismas normas estrictas que los OMG convencionales (Callaway, 2018). Es
probable que esto dificulte el uso de la edición del genoma por parte de los
investigadores de plantas y animales en la UE y la adopción de esta
tecnología en la agricultura europea. Varios científicos han hablado sobre el
impacto que estos enfoques regulatorios propuestos tendrán en la capacidad
de los científicos del sector público y las pequeñas empresas, en particular,
para usar la edición del genoma en especies alimenticias. Cientos de
científicos han firmado peticiones en la UE (Wight, 2018) y los EE. UU. (Van
Eenennaam et al., 2019) que piden regulaciones armonizadas, basadas en
la ciencia y centradas en el riesgo del producto asociadas con la edición del
genoma en especies alimenticias.
Conclusiones
No está claro si la edición del genoma eventualmente se utilizará para
aumentar los programas de cría de ganado en el futuro. Obviamente, existe
un potencial considerable para usar este enfoque para introducir variaciones Bogliotti, YS, Wu, J., Vilarino, M., Okamura, D., Soto, DA, Zhong, C., Sakurai, M., Sampaio, RV,
genéticas útiles en los programas de mejoramiento del ganado, y también
una multiplicidad de formas en las que podría acelerar la tasa de ganancia
genética a través del rediseño del programa de mejoramiento. Se
vislumbraron posibilidades similares hace más de 30 años cuando la
ingeniería genética se logró por primera vez en especies animales destinadas
a la alimentación. A pesar de su amplio uso en especies modelo y biología
experimental a nivel mundial durante tres décadas, la ingeniería genética se
ha dejado de lado de las aplicaciones agrícolas animales debido en gran
parte a la incertidumbre regulatoria y los costos asociados con la
comercialización de productos alimenticios. Si la edición del genoma
experimenta el mismo destino, se producirán costos de oportunidad
considerables en términos de mejora anticipada en la tasa de ganancia
genética. Actualmente, algunos países regulan la edición del genoma en el
ganado como crianza convencional, mientras que otros consideran que da comoBurkard,
Dada la importancia del comercio global de productos animales y genética,
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se proponen para la edición del genoma en los animales destinados al
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Cakici, C., Buyrukcu, B., Duruksu, G., Haliloglu, AH, Aksoy, A., Isik, A., Uludag, O., Ustun, H., Subasÿ,

Agradecimientos ALVE C. y Karaoz E. (2013) . Recuperación de la fertilidad en ratas con azoospermia después de la
agradece a Michael Dickinson y Michaela Handel por la invitación a participar en el inyección de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo : la generación de
espermatozoides. Biomed Res Int. 2013, 529589. doi:10.1155/2013/ 529589
Simposio JEB 2019 sobre Edición Genómica para Fisiología Comparada.

Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener intereses competitivos o financieros.
Financiamiento ALVE agradece a The Company of Biologists por el apoyo para asistir al
simposio de Edición del Genoma para Fisiología Comparada. Su trabajo sobre la edición del
genoma fue financiado por el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura y el programa de
Subvención de Evaluación de Riesgos de Biotecnología (BRAG), Departamento de Agricultura
de los EE. -33522-27097.
TFB fue financiado como becario postdoctoral por el premio competitivo número 2018-67030-28360
de la Iniciativa de Investigación Agrícola y Alimentaria (AFRI) del USDA.
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