UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

MONOGRAFÍA

Tecnologías aplicando los CRISPR-Cas

PRESENTADO POR

ALTAMIRANO NUREÑA JOLY JUNIOR

MENDOZA VILLANUEVA DUVERLYN

MORENO GUERRERO SOLANGE

LIMA-PERÚ

2022

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Introducción………………………………………………………………………………………..…3

CAPÍTULO I. LA TECNOLOGÍA CRISPR/CAS

1.1 Definición………………………………………………………………………….…….……..….4

1.2 Sistema CRISPR/CAS………………………………………………………….…………..……4

1.3 Hitos………………………………………………………………………………………..………5

CAPÍTULO II: PRINCIPALES APLICACIONES

2.1 Edición………………………………………………………………………………………..……7

2.1.1 mutación inducida……………………………………………………….…………………7

2.1.2 Regulación....……………………………………………………….………………………7

2.1.3 Sistema de edición de bases……………………………………….………………...….7

2.1.4 Sistema de edición de RN………………………………………………………………..7

2.2 imagen y detección……………………………………………………………………………...7

2.2.1 Escaneo en vivo de ADN/ ARN mediante crispr/cas…………………..……………..8

2.2.2 Crispr/cas mediated chromatin immunoprecipitation………………..……..…………8

2.2.3 DNA / RNA detection………………………………………………………………...…..8

2.2.4 Screening…………………………………………………………………………………..8

Conclusiones…………………………………………………………………………………………9

Referencias bibliográficas..………………………………………………………………………...10

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 INTRODUCCIÓN

La ciencia a través del tiempo ha hecho grandes descubrimientos, que en muchas

ocasiones la ciencia ha desencadenado grandes revoluciones que tienen su origen en los
seres pequeños.

Un antecedente sobre el descubrimiento de CRISPR/Cas, fue que las secuencias repetidas

que posteriormente se conocerían como CRISPR fueron identificadas por primera vez por
un grupo de científicos japoneses en 1987, particularmente en la bacteria Streptococcus
pyogenes (Lagunas, 2019).

La tecnología CRISPR-Cas9 fue descubierta como la conocemos en 1993 por el doctor

Francisco Juan Martínez Mojica; algunos científicos trabajaron varios años en diversas
investigaciones, hasta que entre 2012 y 2013 alcanzó la aceptación de la comunidad
científica gracias a los estudios de la doctora Emmanuelle Marie Charpentier.

El sistema CRISPR/Cas9 es una herramienta biotecnológica robusta y potente la cual es

llamada popularmente conocida como el 'corta y pega genético' porque permite editar el
ADN de cualquier organismo. Este sistema está especialmente dirigido para secuencia
individual de ADN y ARN en el genoma. Se puede utilizar para apuntar a una secuencia de
knockin, knockout y reemplazo de genes, así como para monitorear y regular la expresión
génica a nivel de genoma y epigenoma mediante la unión de una secuencia específica.

En la actualidad las herramientas de CRISPR/Cas han revolucionado la biología y la

biomedicina, también son alternativas prometedoras para controlar las infecciones
multirresistentes y contribuir al control de la propagación hospitalaria.

En esta presente monografía vamos a recopilar información sobre esta innovadora

tecnología prometedora por su enorme potencial en distintas ramas de la medicina y
biología.

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 CAPÍTULO I. LA TECNOLOGÍA CRISPR/CAS

A través del tiempo los investigadores han podido desarrollar distintas tecnologías con el
fin de mejorar el desarrollo de medicamentos, en los alimentos, en las enfermedades u
otros. Pero se ha desarrollado una herramienta denominada CRISPR/Cas que ha
revolucionado los procesos de edición genética, lo cual ha contribuido al avance de la
ciencia.

1.1 DEFINICIÓN

Es también llamado “tijeretas genéticas”, es un método de defensa que tienen

algunas bacterias para protegerse de los virus, entonces es el sistema
inmune de las bacterias. Debido a que se trata de organismos unicelulares,
no pueden tener células especializadas para producir anticuerpos, por lo que
manera en que logran defenderse es creando un sistema que reconoce al
invasor, copia una parte de su material genético y lo guarda en su propio
ADN. Si vuelve a haber contacto con el mismo virus, la bacteria lo reconoce
gracias a esa información almacenada, y lo inactiva al cortar su material
genético (Melendez et al., 2021).

1.2 SISTEMA CRISPR/CAS

El sistema va a presentar tres etapas para desarrollar una respuesta inmune

completa.

En la primera etapa, va a presentar pequeños fragmentos de ADN derivados

de los virus (bacteriofagos) o plasmidos invasores se incorporan cerca de una
zona del genoma bacteriano con una gran cantidad de secuencias
palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas( CRISPR,
por sus siglas en inglés) (Lagunas, 2019).

En la segunda etapa se va a transcribir y generar un ARN no codificante

largo, ARN CRISPR(pre-crRNA, por sus siglas en inglés), el cual se procesa
mediante unas proteínas conocidas como Cas (siglas en inglés de sistema
asociado a CRISPR)y otros factores del huésped para producir crRNA cortos
y maduros (Lagunas, 2019).

Y finalmente, el cr RNA maduro se ensambla con la proteína Cas y forma un

complejo que reconoce a los ácidos nucleicos extraños y des -truye las
secuencias complementarias al segmento incorporado mediante la actividad
endonucleolítica(de corte) de las enzimas Cas, con lo cual protege a la célula
de futuras intrusiones del mismo invasor (Lagunas, 2019).

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Figura 1. Inmunidad propiciada por el sistema CRISPR/Cas en bacterias. El sistema
funciona en tres etapas. En la primera, un ADN derivado de un virus o plásmido invasor se
incorpora entre los repetidos (R), conocidos como CRISPR. En la segunda etapa, se genera
un ARN no codificante largo (pre-crRNA), que se procesa. Finalmente, se ensambla el
crRNA maduro con la proteína Cas, protegiendo así a la célula huésped de futuras
infecciones (Laguna, 2019).

1.3 HITOS

En el año 1993 se da el descubrimiento de CRISPR y su función, lo cual

Francisco Mojica, investigador de la Universidad de Alicante (España)
caracterizó por primera vez el locus CRISPR.

En el 2005 se descubrió que estas secuencias se correspondían con

fragmentos del genoma de bacteriófagos, y esto permitió a los investigadores
hipotetizar, lo que posteriormente corroborarían, que CRISPR consiste en un
sistema inmune adaptativo. A estos resultados llegó otro grupo coetáneamente
(Pourcel et al., 2005).

En el 2005 se dio el descubrimiento de la nucleasa Cas9 y del dominio PAM,

cuando el grupo Alexander Bolotin, se encontraba estudiando Streptococcus
thermophilus, encontró esta bacteria un locus CRISPR inusual. En el no se
encontraban los genes Cas habituales y en su lugar se hallaba nuevos genes
Cas entre los que se incluía uno que codificaba para una gran proteína que se
predijo que tendría actividad nucleasa (Navas, 2019).

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 En el 2007 hubo una demostración experimental de CRISPR como sistema
inmune adaptativo y la causa fue el estudio de Streptococcus thermophilus, por
su importancia alimentaria. El grupo de Philippe Horvath, de Danisco, buscó
explorar la respuesta de estas bacterias al ataque por parte de fagos, un
problema bastante extendido en la producción del yogurt. Para ello integraron
DNA nuevo de fago en la matriz CRISPR, lo cual permitió combatir las
siguientes oleadas de fagos y se demostró que cas9 es la única proteína
requerida para la interferencia siendo éste el sistema por el que CRISPR
desactiva al fago invasor (Navas, 2019). Este hallazgo condujo a la idea de que
los sistemas naturales CRISPR-Cas existentes en bacterias cultivadas
utilizadas en la industria láctea podrían aprovecharse para la inmunización
contra los fagos, siendo esta la primera aplicación exitosa de CRISPR-Cas
para fines biotecnológicos (León, 2019).

En 2012, por primera vez, se propuso que el sistema CRISPR-Cas podría

utilizarse como una herramienta de edición génica de alta eficacia en cualquier
organismo. “Fue entonces cuando las cosas se precipitaron: captó la atención
de los expertos en ingeniería genética y en los tres años siguientes la técnica
saltó a la fama. En 2015 se convirtió en descubrimiento del año según Science
y fue portada de periódicos de todo el mundo”, aseguran los autores (SINC,
2016).

En 2012 se utilizó por primera vez el sistema CRISPR/Cas como una

herramienta de ingeniería genética en cultivos de células humanas y desde
entonces se ha utilizado en muchos organismos, incluida la levadura del pan, el
pez cebra, la mosca dela fruta y algunos gusanos, plantas, ratas y
ratones,entre muchos otros modelos de investigación (Lagunas, 2019).

En la pandemia por el virus SARS-CoV-2, un grupo de investigadores buscaron

paliar el problema del costo y tiempo de ejecución de la prueba PCR mediante
el uso de CRISPR-Cas. En primera instancia, nuestra intención fue eliminar la
necesidad de extraer el arn del virus del hisopado (muestras tomadas de la
garganta y parte posterior de la nariz) antes de realizar la prueba, dado a que
el mayor costo y tiempo se generan durante este paso en la prueba
convencional de rt-pcr. Tratamos varias aproximaciones para finalmente lograr
detectar el arn del virus directamente de la muestra sin necesidad de hacer un
paso de extracción del rna (Melendez et al., 2021).

Figura 2. Aplicaciones del Sistema Crispr/Cas (Lagunas, 2019).

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 CAPÍTULO II. PRINCIPALES APLICACIONES

2.1 EDICIÓN

2.1.1 MUTACIÓN INDUCIDA

El sistema crispr cas9 es conocido mundialmente como una herramienta

de edición del genoma Cas9 corta el ADN de doble cadena para generar
una ruptura que será separada por la maquinaria de reparación celular.

2.1.2 REGULACIÓN

El sistema CRISPR/Cas tiene el potencial de usarse para regular la

expresión génica endógena incluida. La regulación tanto transcripcional
como epigenética.

2.1.3 SISTEMA DE EDICIÓN DE BASES

Sustituciones precisas de nucleótidos de manera programable. Están formados

por dos componentes, una proteína Cas y una enzima modificadora de ADN monocatenario.
Hay dos clases de editores de bases, los editores de bases de citosina y editores de bases
de adenina, capaces de introducir mutaciones de transición aunque con una limitación
importante ya que no pueden generar más allá de cuatro C→T, T→C, A→G, G→A.
(Abyntek,2022).

2.1.4 SISTEMA DE EDICIÓN DE ARN

Basados en Cas 13 se han desarrollado dos sistemas de edición de ARN,

fusionando Cas13 catalíticamente inactiva con el dominio ya sea adenina o citidina
desaminasa. Son los sistemas REPAIR que permite sustituciones de A-G y RESCUE que
permite el reemplazo de C-U.(Abyntek,2022).

2.2 IMAGEN DE DETECCIÓN

Utilizado para la visualización de elementos genómicos en células vivas.

2.2.1 ESCANEO EN VIVO DE ADN/ ARN MEDIANTE CRISPR/CAS

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 dCas9 permite la fusión de fluoróforos ,logrando la visualización de secuencias
específicas de ADN y organización de la cromatina, aunque también para la
obtención de imágenes de ARN, las modificaciones a la secuencia de ARN
genómico permite el reconocimiento y seguimiento del ARN mensajero.Esto
mejora metodologías ya existentes para la obtención de imágenes en vivo
dentro de las células como la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) y el
marcado fluorescente de proteínas de unión al ADN (Abyntek,2022).

2.2.2 CRISPR/CAS INMUNOPRECIPITACIÓN DE CROMATINA MEDIADA

Empleado para la caracterización de proteínas y ARN asociados a la

cromatina. El complejo de cromatina CRISPR/Cas9 se puede purificar
siguiendo las técnicas tradicionales de inmunoprecipitación de cromatina en las
que utilizan anticuerpos, aunque se necesita un único anticuerpo contra la
proteína Cas9 para purificaciones a gran escala (Abyntek,2022).

2.2.3 DNA / RNA DETECCIÓN

Se basan en otras enzimas Cas diferentes de Cas 9, son Cas13 y Cas12, el que
usa Cas13 se llama SHERLOCK compuesto además de ARN de guía única
dirigido a secuencias específicas de ARN e indicadores de ARN fluorescentes,
utilizado para detectar virus o bacterias patógenas. El que usa Cas 12 se llama
DETECTR, depende de la actividad colateral de Cas12 que luego de reconocer
el ARN diana degrada las moléculas de ADN adyacentes,dando como
resultado una señal fluorescente fuerte. Ambos métodos son sondas altamente
sensibles y específicas (Abyntek,2022).

2.2.4 SCREENING

Se nutre de bibliotecas con una gran cantidad de ARNs de guía única, utilizados
para identificar genes relacionados con un genotipo particular, aunque no solo
para genes funcionales y esenciales sino también para secuencias no
codificantes,En la actualidad se han construido bibliotecas de ARNs de guía
única que comprende todo el genoma humano y de ratón.(Abyntek,2022).

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 CONCLUSIONES

● Gracias a los microorganismos, se pudo descubrir el sistema CRISPR/Cas,

que ha dado grandes avances a la tecnología en diversos ámbitos.

● El mayor alcance de esta tecnología se da en cómo combatir las enfermedad

más eficientemente ya que las vacunas son temporales.

● El sistema Crispr Cas es una poderosa herramienta de edición

sencilla,eficiente y baja en costos del genoma en la mayoría de seres vivos
encaminada hacia miras con fines de mejorar la agricultura,industria y
medicina.

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 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

● Cox DBT, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Franklin B, Kellner MJ, Joung
J, Zhang F. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 2017 Nov
24;358(6366):1019-1027. doi: 10.1126/science.aaq0180. Epub 2017
Oct 25. PMID: 29070703; PMCID: PMC5793859.
● Gomez, O. (2019). Sistema CRISPR/Cas9.
http://bioinformatica.uab.cat/base/documents/genetica_gen/portfolio/La%20te
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● Lagunas, F. (2019). Sistema CRISPR/Cas. Novedades Científicas.
https://www.researchgate.net/publication/336592234_Sistema_CRISPRCas#f
ullTextFileContent
● Leon, I. (2019). CRISPR-CAS9: ¿QUÉ ES? ¿CÓMO FUNCIONA?¿QUÉ
APLICACIONES TIENE? Y¿POR QUÉ UNA TÉCNICA TAN
REVOLUCIONARIA Y CONTROVERSIAL A LA VEZ?.
https://www.e-allscience.com/blogs/articulos/crispr-cas-9#:~:text=Los%20siste
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● Melendez, J., Rueda, B., Garcia, A. & Maldonado, V. (2021). CRISPR-Cas: la
nueva herramienta para diagnosticar enfermedades infecciosas. Revista
Digital Universitaria(rdu),
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● Navas, A. (2019). Historia del desarrollo de la tecnología CRISPR-Cas.
https://fundacion-antama.org/historia-del-desarrollo-de-la-tecnologia-cripsr-ca
s/
● SINC. (2016). El origen de CRISPR-Cas contado por un microbiólogo y un
genetista.
https://www.agenciasinc.es/Noticias/El-origen-de-CRISPR-Cas-contado-por-u
n-microbiologo-y-un-genetista

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