Pasos de la inmunidad adaptativa CRISPR-Cas

Adaptación
El primer paso de la defensa mediada por CRISPR-Cas (Figura 1) se conoce como adaptación o
adquisición. En esta fase, el material genético del fago invasor se incorpora al sistema CRISPR-
Cas, proporcionando así al organismo una forma de reconocer y ajustar su respuesta a nuevas
invasiones de esa cepa de fago en particular. Cas1 y Cas2 son las proteínas clave que median el
paso de adaptación, y son ubicuas en los sistemas CRISPR-Cas, independientemente del tipo.
Ambas proteínas son necesarias para este paso ya que la expresión de Cas1 o Cas2 por sí solas
no potencian la adquisición del espaciador. Otros experimentos mostraron que las mutaciones en
los genes cas1 o cas2 en las secuencias CRISPR de E. coli imposibilitan la adquisición del
espaciador, mientras que la sobreexpresión tanto de Cas1 como de Cas2 mejora la incorporación
del espaciador, confirmando el papel crucial de ambas proteínas en la adquisición del espaciador.
Biogénesis del ARN CRISPR
En todos los tipos de sistemas CRISPR-Cas, el locus CRISPR se transcribe en un precursor de
ARNcr (pre-ARNcr), que posteriormente es escindido y procesado por proteínas Cas o
ribonucleasas celulares, dando lugar a unidades más pequeñas de ARNcr maduro. Este ARNcr
maduro presenta una única secuencia espaciadora flanqueada por fragmentos de la región de
repetición. En el tipo V y el tipo VI, Cas12 y Cas13, respectivamente, son las proteínas que
procesan el pre-ARNcr en un ARNcr maduro, sin necesidad de moléculas de traARNcr. Sin
embargo, en el subtipo VI-A el paso de procesamiento no es esencial, ya que las moléculas de
pre-ARNcr pueden ser utilizadas como guías para la escisión de la diana.
Interferencia
Tras la infección, las moléculas de ARNcr maduras dirigen la maquinaria de interferencia
específica del subtipo hacia los ácidos nucleicos invasores para permitir el silenciamiento del
material genético extraño.
El recientemente caracterizado tipo VI se define por la presencia de la proteína Cas13 (antes
C2c2). Esta proteína contiene dominios de unión a nucleótidos de eucariotas superiores y
procariotas (HEPN), que son ubicuos en las RNasas. Cas13 es única en relación con otros
sistemas de clase 2 debido a su capacidad de escindir moléculas de ARNs homólogas al ARNcr,
que se complementa con la escindida no específica de otros ARNs, similar a la enzima Csm6 de
los sistemas de tipo III. El corte se produce preferentemente antes de los residuos de uridina (U).
Un sitio de flanqueo de protospacer dependiente de la especie (PFS), análogo a los PAMs en las
dianas de ADN, es también relevante para la activación de las proteínas Cas13 [58]. La unión al
ARNcr induce cambios conformacionales en Cas13 que promueven el emparejamiento del ARNs.
Tras la unión a la diana, la actividad RNasa de Cas13 es impulsada por la aproximación de los
sitios catalíticos de ambos dominios HEPN.

Los esfuerzos genómicos y experimentales concertados para la caracterización exhaustiva de los

sistemas CRISPR-Cas de clase 2 han permitido identificar dos nuevos tipos y varios subtipos. Los
sistemas de tipo VI recientemente caracterizados son los primeros entre las variantes de CRISPR-
Cas que se dirigen exclusivamente al ARN. Inesperadamente, en algunos de los sistemas de
clase 2, la proteína efectora es además responsable del procesamiento del pre-ARNc. El análisis
comparativo de los complejos efectores indica que los sistemas de clase 2 evolucionaron a partir
de elementos genéticos móviles en múltiples e independientes ocasiones.
Cas es una forma de inmunidad programable que puede adaptarse para dirigirse a cualquier
secuencia y, por tanto, no está sometida a la presión de evolucionar una inmensa diversidad de
especificidades, como es el caso de las enzimas de modificación de la restricción, la forma más
abundante de inmunidad innata en procariotas [5]. Sin embargo, como cualquier sistema de
defensa, CRISPR-Cas está inmerso en una incesante carrera armamentística con los virus, lo que
se traduce en una rápida evolución de los genes cas [6] y en una notable diversidad de los
repertorios génicos y de las arquitecturas de los loci CRISPR-cas que se traduce en una
diversificación de los propios mecanismos de defensa. Más concretamente, es probable que la
diversificación de los sistemas CRISPR-Cas esté impulsada en parte por su coevolución
competitiva con las proteínas anti-CRISPR específicas codificadas por virus.
A pesar de esta amplia diversificación, un análisis comparativo exhaustivo ha revelado
importantes temas unificadores en la evolución de CRISPR-Cas. Estas tendencias comunes
incluyen múltiples contribuciones de elementos genéticos móviles a la aparición de la inmunidad
CRISPR-Cas y sus distintas variantes; una amplia duplicación de los genes cas que produce
complejos efectores funcionalmente versátiles; y una organización modular, con una amplia
recombinación de los módulos [4,8,13]. Los dos módulos principales de los sistemas CRISPR-Cas
consisten en conjuntos de genes que codifican proteínas implicadas en la adaptación (adquisición
del espaciador) y en las funciones efectoras, es decir, en el procesamiento del pre-ARNc y en el
reconocimiento y corte de la diana. El módulo de adaptación es ampliamente uniforme en toda la
diversidad de los sistemas CRISPR-Cas y consiste en la endonucleasa Cas1 y la subunidad
estructural Cas2 [14]. En cambio, los módulos efectores son muy variables entre los tipos y
subtipos de CRISPRCas. Varias proteínas implicadas en funciones auxiliares, como la regulación
de la respuesta CRISPR y otras funciones aún poco caracterizadas, pueden asignarse a un tercer
módulo accesorio.
La exploración de la diversidad de CRISPR y la clasificación en evolución de los sistemas
CRISPR-Cas
La rápida evolución y variabilidad de los sistemas CRISPR-Cas hace que su clasificación sea una
tarea de enormes proporciones. Dada la ausencia de genes cas universales y la frecuente
recombinación modular, un único criterio de clasificación es es impracticable. Por lo tanto, se ha
adoptado un enfoque múltiple para de CRISPR-Cas que tiene en cuenta los genes cas
característicos en cuenta la firma de los genes cas que son específicos para los tipos y subtipos
individuales de CRISPR-Cas, la similitud de la secuencia entre múltiples proteínas Cas
compartidas, la filogenia de Cas1 (la proteína Cas mejor conservada), la organización del gen en
los loci CRISPR-cas y la estructura de los propios CRISPR.
La aplicación combinada de estos criterios dio como resultado el esquema de clasificación
actualmente adoptado que divide los sistemas CRISPR-Cas en dos clases distintas caracterizadas
por diferentes principios del diseño del módulo efector (Figura 1).
Los módulos efectores de la clase 2 consisten en una sola proteína multidominio de gran tamaño
cada uno, de modo que los respectivos loci CRISPR-cas tienen una organización mucho más
simple y uniforme que los de la clase 1 (Figura 1). En el momento de la construcción de la actual
clasificación formal de CRISPR-Cas [8], la Clase 2 incluía 3 subtipos del tipo II, completamente
caracterizado, con la endonucleasa efectora Cas9, la enzima de edición del genoma ampliamente
utilizada, y el tipo V, con la proteína efectora predicha Cpf1. El tipo V se incluyó en el esquema de
clasificación por primera vez y permaneció sin caracterizar experimentalmente. La posterior
demostración de que Cpf1 era en realidad una endonucleasa activa guiada por ARN que, a
diferencia de Cas9, no requería el ARN transactivador CRISPR (tracr) adicional para la escisión
de la diana [29], suscitó el interés por la caracterización exhaustiva de la diversidad de los
sistemas CRISPR-Cas de clase 2 mediante la extracción de genomas y metagenomas.
requisitos mínimos para un locus CRISPR son la presencia de una matriz de repeticiones CRISPR
y una nucleasa efectora cercana.