Acerca del sistema CRISPR Cas9 y su aplicación para editar

genes
Por Nicolás Jouve, Dr. en Biología, Catedrático Emérito de Genética.

Presidente de CiViCa. Temas de formación sobre Bioética desarrollados en pocas

palabras. Publicado en CiViCa el 3 de Febrero de 2016. Se adjunta en PDF.

Antes de explicar en qué consiste esta nueva tecnología y sus potenciales aplicaciones
conviene enmarcar su campo de actuación. En una primera aproximación diríamos que
se trata de una metodología destinada a modificar el ADN. De este modo, se vincula a
la “ingeniería genética”, una tecnología que se empezó a desarrollar en los años
setenta del siglo pasado, tras los descubrimientos sucesivos de la estructura del ADN
(1953), la expresión de los genes (1961), el conocimiento del código genético universal
(1961-64) y el aislamiento del primer gen (1969). Esta serie de descubrimientos
abrieron las puertas a la manipulación del ADN. En 1980, Paul Berg, Frederik Sanger y
Walter Gilbert tras establecer las bases de la Ingeniería Genética recibieron el Premio
Nobel de Química. La idea de modificar genes tiene que ver naturalmente con la
posibilidad de cambiar las características genéticas de sus portadores y ahí, en la
vertiente aplicada es donde se ha abierto un enorme abanico de beneficios,
dependiendo de las especies en los que se realice con fines de mejoramiento agrícola
o ganadero, industriales o clínicos. El sistema CRISPR Cas9, como veremos a
continuación es un nuevo método que se añade a otras tecnologías para la obtención
de “organismos modificados
genéticamente” o “transgénicos”.

El sistema CRISPR

El sistema CRISPR forma parte de un

mecanismo natural de inmunidad que
actúa en las bacterias y Archaeas, para
degradar y eliminar secuencias de ADN
invasoras (virus, plásmidos…). Se trata
de un sistema inmune adaptable que es
utilizado por numerosas bacterias para
defenderse degradando cualquier tipo
de ADN extraño que se introduzca en
su interior procedente del medio en el
que viven. Esto es una necesidad pues
en el medio natural de las bacterias hay
restos de ADN que podrían introducirse
en su interior y transformarlas o
degradar su propio genoma, o como
ocurre con los llamados bacteriófagos,
apoderarse del aparato bioquímico de
las bacterias para su propia
reproducción. Para que esto no ocurra,
las bacterias han desarrollado un

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sistema de defensa que es el CRISPR Cas9 (Fig.1).

La denominación CRISPR obedece a unas regiones del ADN del genoma de las
bacterias consistentes en agrupaciones cortas de bases nucleotídicas repetidas
palindrómicas regularmente interespaciadas. Es decir, pequeñas secuencias de ADN
repetidas y “capicúas”, con unos espacios intercalares. Lo interesante es que estos
espacios intercalares son ocupados por fragmentos del ADN extraño que, tras una
invasión al interior de la bacteria, se troceó y se unió al ADN entre las secuencias
CRSPR de la bacteria. Dicho de otro modo, la primera vez que un ADN extraño invade
a una bacteria se trocea y los pequeños trocitos de ADN del agente invasor se integran
en el genoma de la bacteria, justo entre las secuencias repetidas del sistema CRISPR.
Estas pequeñas secuencias de ADN invasor se denominan "protoespaciadores" y
serán utilizadas para defenderse de una ulterior entrada de ADN del mismo agente
invasor.

La denominación Cas 9 se refiere a una enzima, una nucleasa, es decir una proteína
que puede cortar el ADN, que es la que se encarga de romper y degradar en ADN
extraño. Para ejercer su tarea, esta enzima se asocia a una cadena de ARN en el
momento en que se produce la nueva invasión de ADN extraño. La molécula de ARN a
la que se asocia Cas9 es precisamente una molécula que se sintetiza utilizando los
protoespaciadores intercalados entre las secuencias de la región CRISPR.

De este modo, cuando se produce el segundo ataque o posteriores de ADN extraño, la

bacteria expresa la región CRISPR dando lugar a la molécula de ARN que contiene las
secuencias previamente integradas (protoespaciadores). Esta molécula será procesada
para dar lugar a varios ARN más pequeños denominados crARN (CRISPR ARN) cada
uno de los cuales llevará un protoespaciador distinto y una parte de las secuencias
repetidas.

Lo que va a ocurrir a
continuación, es que
cada crARN se unirá
a otro ARN del
sistema denominado
transactivador y juntos
forman un complejo
con la nucleasa Cas9.
El protoespaciador
presente en cada
complejo dirige al
conjunto hacia las
secuencias del ADN
invasor, reconoce las bases homólogas presentes en él, hibrida con ellas y promueve
su degradación por medio de la enzima Cas9 (Fig.2).

Una condición más es que, para que se produzca el reconocimiento e hibridación del
ARN unido al complejo con el ADN invasor, es necesario que la secuencia de éste se
encuentre situada al lado de una secuencia corta denominada motivo adyacente al
protoespaciador (PAM). Esto es fácil que ocurra pues el motivo PAM consiste en la
secuencia de tres bases nucleotídicas, que habitualmente son NGG (donde N puede

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ser cualquier nucleótido), lo que prácticamente permitiría encontrar dianas en todos los
genes de un organismo.

Aplicación para editar genes de otras especies

Este sistema, siendo natural en las bacterias, ha sido adaptado para inducir roturas de
ADN en sitios específicos con fines de ingeniería genética en otras especies. Es decir,
se trataría de que en las condiciones que desee el investigador se produzca la invasión
de la región del genoma o el gen que se desea "editar", con una secuencia de ADN
homóloga, para que tras localizarlo sen el genoma se produzca el corte, para después
restarurarla (“editar”). Naturalmente para hacerlo hay que conocer previamente las
secuencias de los genes del organismo en el que se desea aplicar. Esto sería
potencialmente posible en el genoma humano, por ejemplo, cuyo genoma completo se
conoce desde 2003.

Para utilizarlo con fines de editar un gen, se introducen en la célula u organismo cuyo
ADN se quiere modificar únicamente dos de los componentes del sistema inmune para
que se expresen, el gen de la nucleasa Cas9 y un ARN guía. Este consiste en un ARN
portador del equivalente al protoespaciador, que sería una secuencia corta de unas 20
bases nucleotídicas, que se podrían sintetizar in vitro y que actuaría para reconocer la
región homóloga del ADN diana. Este protoespaciador estaría situado en un extremo
del ARN guía, que va a dirigir al complejo hacia la secuencia diana siguiendo las reglas
de apareamiento estándar entre ARN y ADN.

Finalmente, para que el sistema funcione, la secuencia diana debe de encontrarse justo
en el extremo 5’ del motivo PAM (NGG). Por ello, con este sistema se pueden producir
roturas en cualquier secuencia del genoma que presente la forma N 20-NGG
simplemente cambiando los primeros 20 nucleótidos del ARN guía para que se
correspondan con la secuencia diana.

Debido a la facilidad de este sistema para inducir cortes en el genoma su uso se ha

extendido rápidamente apareciendo en un corto espacio de tiempo un gran número de
publicaciones que muestran la utilidad de la técnica para “editar”, es decir “cortar” y
“restaurar” un gen específico en cualquier tipo de organismos. Naturalmente, siempre
que se conozca bien la secuencia del gen a editar.