MICROPROPAGACIÓN A PARTIR DE EMBRIONES CIGÓTICOS DE LA PAPAYA

(Carica papaya L.) var. 'MARADOL ROJA'

Víctor R. Medero Vega*, Yanelis Bravo Corrales, Milagros Basail Pérez, Aymé Rayas
Cabrera, Jorge López Torres, Arletys Santos Pino, Sergio Rodríguez Morales, Marlenys
Torres Delgado, Carmen Pons Pérez, Wilfredo Caballero Álvarez y Jesús García Ruiz.

Instituto de Investigaciones de Viandas Tropicales (INIVIT).

*Autor para la correspondencia: vmedero@inivit.cu

INTRODUCCIÓN
En Cuba, los frutales constituyen cultivos de gran importancia y dentro de estos la papaya
(Carica papaya L.) es una de las especies de gran interés para la alimentación humana,
motivado por su alto contenido de proteínas y vitaminas en el fruto (Lima, 1991).
Según Roque y Ardisana (2006), en este cultivo existe una necesidad de un suministro
constante de semillas certificadas para mantener las plantaciones activas en condiciones de
campo, pero la poca homogeneidad de las plantas en cuanto a la producción de los frutos
elongata para la extracción de la semilla constituye el principal problema. Por lo que se hace
necesario buscar nuevas alternativas para la multiplicación de este cultivo que posibilite la
obtención de un método de propagación masiva in vitro para garantizar la multiplicación de
plantas plus hermafrodita.
Al respecto, el uso del cultivo de tejidos posibilita no sólo la propagación masiva de plantas a
partir de meristemos, sino que permite el rescate de los embriones cigóticos, lo cual constituye
una alternativa para la multiplicación de plantas hermafroditas elongatas y su propagación
masiva para la extracción de semillas y la comercialización.
Teniendo en cuenta lo anterior, se realizó el presente trabajo con el objetivo de desarrollar un
protocolo para la propagación in vitro a partir de embriones cigóticos de la variedad de papaya
‘Maradol Roja’ de frutos de tipo elongata de plantas plus.

MATERIALES Y MÉTODOS
La presente investigación se realizó con la variedad de papaya ‘Maradol Roja’. Como material
vegetal se emplearon embriones cigóticos inmaduros procedentes de frutos elongata de plantas
plus sembradas en las áreas experimentales del INIVIT.
Efecto del hipoclorito de sodio en la desinfección de los frutos
Se estudió el efecto de diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 y
2,5%) durante 10 minutos. Se utilizaron tres repeticiones por tratamiento y cada repetición
contenía 20 tubos de cultivo. A los 20 días de la implantación se cuantificó el porcentaje de
supervivencia.
Establecimiento in vitro de los embriones cigóticos
Para lograr el establecimiento in vitro se estudió el efecto de las concentraciones de las sales
del medio de cultivo “MS” (100 y 50%), así como la concentración del yoduro de potasio (KI)
(200 y 100%), según resultados obtenidos por Roque (2006), lo cual generó cuatro variantes de
medios de cultivo. Además, para determinar el tipo de explante, se estudió la influencia de la
forma en que se siembra el embrión cigótico en el medio de cultivo, donde se utilizaron siete
variantes (semilla entera sin sarcotesta, endospermo entero, endospermo cortado por detrás,
endospermo cortado por delante, embrión con cotiledones, embrión sin cotiledones y semilla
entera sin sarcotesta).
Se utilizaron tres repeticiones por tratamiento y cada repetición contenía 30 tubos de cultivo. A
los 30 días del subcultivo se evaluó el porcentaje de germinación en cada tratamiento.
Influencia de la combinación de reguladores del crecimiento sobre la multiplicación
Se utilizó el medio de cultivo “MS” y se estudió el efecto de diferentes concentraciones de las
hormonas 6-Bencilaminopurina (6-BAP) (0,22 mg.L-1), Ácido Naftalen Acético (ANA) (0,05 mg.L-
1
), Ácido Giberélico (AG3) (0,5 y 1,0 mg.L-1) y sus combinaciones.
Se utilizaron tres repeticiones por tratamiento y cada repetición contenía 24 tubos de cultivo. A
los 30 días del subcultivo se cuantificaron la presencia de callos basal, diámetro del callo,
longitud de la plántula, número de tallos y de explantes finales.
Efecto de la combinación de reguladores del crecimiento sobre la elongación
Teniendo en cuenta los resultados del experimento anterior, se estudió el efecto de otras
concentraciones de 6-BAP (0,1 mg.L-1), ANA (0,1 mg.L-1) y del AG3 (1,0 mg.L-1) y sus
combinaciones.
Se utilizaron tres repeticiones por tratamiento y cada repetición contenía 30 tubos de cultivo. A
los 30 días del subcultivo se evaluaron las variables siguientes: diámetro del callo y número de
explantes de más de 2 cm de longitud.
Efecto de la concentración de las sales del medio de cultivo sobre el enraizamiento
Con el objetivo de lograr el enraizamiento de las plantas producidas in vitro de papaya como
etapa esencial antes de la aclimatización ex vitro, se estudió el efecto de la concentración de las
sales “MS” (100, 75 y 50%) y 2,0 mg.L-1 de Ácido Indol Butírico (AIB).
Se utilizaron tres repeticiones por tratamiento y cada repetición contenía 30 tubos de cultivo. A
los 30 días del subcultivo se evaluó el porcentaje de formación de raíces.
Respuesta de las plantas obtenidas en la fase de aclimatización
En esta etapa se realizaron estudios sobre diferentes factores que influyen en la supervivencia
de las plantas producidas in vitro, se experimentó el empleo de cobertores durante los primeros
15 días de aclimatización, para esto se utilizó un cobertor forrado con nylon transparente que
permitió cubrir las bandejas recién plantadas. También se analizó el tamaño de las plantas
producidas in vitro, donde se establecieron tres categorías: inferior a 2,5 cm, entre 2,5 y 3,9 cm
e iguales o superiores a 4 cm.
Se utilizaron tres repeticiones por tratamiento y cada repetición contenía 70 plantas producidas
in vitro. A los 15 días de cultivo se evaluó el porcentaje de supervivencia.
Respuesta en campo de las plantas obtenidas in vitro
Las plantas aclimatizadas fueron identificadas con un número en las bolsas para su monitoreo
en campo y conocer su correspondencia con la copia dejada en el laboratorio. Las plántulas que
alcanzaron una altura entre 15 y 20 cm fueron plantadas sobre un suelo Pardo mullido
carbonatado (Hernández et al., 1999). Se le aplicaron las atenciones culturales recomendadas
por el Instructivo técnico de la papaya (MINAG, 2011) y a los 60 días de la plantación se evaluó
el número de plantas hermafroditas, teniendo en cuenta el tipo de flor.
Análisis estadístico
Se utilizó el paquete SPSS, versión 15.0. Para los modelos paramétricos se realizó un análisis
de varianza de clasificación simple y la comparación múltiple de medias según las dócimas de
Tukey o Dunnett´C. En los no paramétricos se empleó Kruskall-Wallis y Mann-Whitney para la
comparación de medias de rango.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto del hipoclorito de sodio en la desinfección de los frutos
Con el empleo de concentraciones de hipoclorito de sodio al 1% se alcanzaron los mayores
porcentajes de supervivencia de las semillas cigóticas extraídas, sin diferencias estadísticas
entre las concentraciones que variaron desde 1% hasta el 2,5%.
En este cultivo varios autores han empleado el hipoclorito de sodio para la desinfección de los
brotes o yemas de plántulas en invernadero o de plantas de campo, con porcentajes diferentes
en su utilización (Reuveni et al., 1990; Kataoka e Inove, 1991).
Establecimiento in vitro de los embriones cigóticos
Se encontraron diferencias altamente significativas entre las combinaciones estudiadas (tipo de
explante-medio de cultivo) en cuanto al porcentaje de germinación donde la mejor respuesta
(100% de germinación de los embriones cigóticos) se alcanzó con la variante (Embrión con
cotiledones - Medio de cultivo formado por el 50% de las sales y el doble de la concentración de
KI), así como la mejor respuesta cualitativa en cuanto al desarrollo de los embriones. Resulta
importante definir el medio de cultivo y su suplemento para las diferentes fases del protocolo
que permita la diferenciación de los meristemos (Alvarado, 1992 y Baca, 2002), quienes
emplearon el medio de cultivo basal Murashige y Skoog (1962) con diferentes concentraciones
de BAP, ANA, AIA, AG3 y adenina.
Influencia de la combinación de reguladores del crecimiento sobre la multiplicación
Un problema para la multiplicación in vitro de este cultivo lo constituye la formación de callos
basales y su diámetro. El mejor resultado se alcanzó con el medio “MS” suplementado con 0,22
mg.L-1 de 6-BAP y 0,5 mg.L-1, al presentar el menor diámetro basal del callo (0,42 cm2).
Además, al evaluar otras variables se encontró que el mayor valor (5,6 explantes por explante
inicial) se alcanzó con este mismo tratamiento (tabla 1).
Los resultados alcanzados desde el punto de vista cualitativo y cuantitativo coincidieron con la
misma combinación de reguladores del crecimiento para la multiplicación in vitro de esta
variedad. En otros trabajos realizados se plantea que con el suplemento de la riboflavina en los
medios de cultivo a concentraciones entre 1,1 y 1,3 mg.L-1 se logra evitar la formación de callos
en la base de las plantas in vitro (Gallardo et al., 2004).

Tabla 1. Efecto de las combinaciones de reguladores del crecimiento sobre la longitud de la

planta, número de tallos y número de explantes finales.
Variables
Tratamientos Longitud de la Explantes
No. de tallos
planta finales
6-BAP (0,22 mg.L-1), ANA (0,05 m g.L-1) 1,42 c 4,40 ab 4,40 b
6-BAP (0,22 mg.L-1) 1,68 bc 5,20 a 4,10 bc
ANA (0,05 mg.L-1) 1,50 c 1,80 c 1,20 d
6-BAP (0,22 mg.L-1), AG3 (0,5 mg.L-1), 1,53 c 5,00 ab 5,60 a
-1 -1
6-BAP (0,22 mg.L ), AG3 (1,0 mg.L ) 2,17 ab 3,60 b 4,90 ab
AG3 (1,0 mg.L-1) 2,30 a 1,60 c 3,10 c
ES ± 0,13* 0,37* 0,28*
CV (%) 14,10 12,98 12,90
Medias con letras desiguales dentro de columna difieren para p < 0,05, según dócima de Dunnett´C.

Efecto de la combinación de reguladores del crecimiento sobre la elongación

La papaya se multiplica bien in vitro y con coeficientes aceptables, pero con tallos pequeños y
de entrenudos cortos por lo que se requiere de una etapa o fase de elongación para
incrementar su longitud como antesala al enraizamiento y salida para la fase de aclimatización.
El diámetro de callo fue más alto (0,84 cm) en el tratamiento (T2) y con diferencias significativas
respecto a la media más baja (0 cm) para el tratamiento (T4), que no formó callos (tabla 2).
Además, el número de explantes de más de 2 cm de longitud fue mayor en los tratamientos (T3)
y (T4) sin diferencias estadísticas y sí respecto a los tratamientos (T1) y (T2) donde ningún
explante alcanzó más de 2,0 cm de longitud.
 Tabla 2. Efecto de la combinación de reguladores del crecimiento sobre el diámetro de callo y
número de explantes de más de 2 cm de longitud.
No. de Explantes
Diámetro del callo (cm) con más de 2 cm de
Tratamientos longitud
Media Media
Media Media
transformada transformada
T1: 6-BAP (0,1 mg.L-1), ANA (0,1 mg.L-1) 0,68 1,06 ab 0,00 0,71 b
T2: 6-BAP (0,1 mg.L-1) 0,84 1,15 a 0,00 0,71 b
T3: 6-BAP (0,1 mg.L-1), AG3 (1,0 mg.L-1) 0,14 0,78 bc 0,70 1,04 a
T4: AG3 (1,0 mg.L-1) 0,00 0,71 c 0,50 0,95 ab
ES ± 0,04* 0,07*
CV (%) 15,37 16,80
Medias con letras desiguales dentro de columna difieren para p < 0,05, según dócima de Dunnett´C.

En la Fig. 1 se puede observar la elongación de las vitroplantas y el poco callo basal formado.
Otros autores, han alcanzado la elongación de las plantas in vitro con el suplemento al medio
de cultivo de ácido giberélico (AG3) en concentraciones entre 1,0 – 5,0 mg.L-1 durante 15 días
de cultivo (Banerjee, 2002). También, se han obtenido plantas con un 92% de brotes alongados
y altura entre los 3,0 a 3,8 cm (Posada, 2005).

Figura 1. Elongación de las plantas producidas in vitro de papaya a los 30 días de cultivo.
Efecto de la concentración de las sales del medio de cultivo sobre el enraizamiento
En la tabla 3, se pueden apreciar los bajos porcentajes de enraizamiento que se obtienen con
las tres variantes de medios de cultivo estudiadas. Las variantes con el 100 y 75% de las sales
“MS” alcanzaron la mejor respuesta en el porcentaje de formación de raíces sin diferencias
estadísticas entre ellos, pero sí con el resultado obtenido con 50% de las sales “MS”.

Tabla 3. Efecto de la concentración de las sales del medio de cultivo de enraizamiento sobre el
porcentaje de formación de raíces.
Tratamientos Formación de raíces (%) Media de rangos
Sales “MS” (100%) 15,32 9,63 a
Sales “MS” (75%) 13,15 7,00 ab
Sales “MS” (50%) 11,00 2,88 b
KW = 7,17*
Otros autores, han encontrado que una concentración de 2,0 mg.L-1 de AIB induce las mejores
respuestas in vitro para la formación de raíces tanto en medios de cultivo en estado líquido o
gelificado (Roque et al., 2001; Posada et al., 2007).
Respuesta de las plantas obtenidas en la fase de aclimatización
Obtener un alto porcentaje de supervivencia es importante para reducir el costo de la
producción de las plantas producidas in vitro (Vento et al., 1996) y garantizar el éxito en la
aplicación del protocolo. Al respecto, con el empleo del cobertor (cámara húmeda) se
incrementan los porcentajes de supervivencia hasta el 42,2% con relación a un 7,1% cuando no
se aplicó el cobertor y con diferencias estadísticas significativas (tabla 4). Por lo tanto, en
papaya resulta fundamental mantener una alta humedad relativa durante los primeros siete a
diez días después del trasplante para lograr mayor éxito en la aclimatización.

Tabla 4. Influencia del cobertor en la supervivencia de las plantas producidas in vitro.

Tratamientos Supervivencia (%) Media de rangos
Con cobertor 42,20 14,00 a
Sin cobertor 7,10 5,00 b
U de Mann-Whitney = 0,00**
Para la respuesta combinada de calibre de las plantas producidas in vitro y el empleo del
cobertor (tabla 5), el resultado fue significativamente superior para todas las variantes con
cobertor y se logró hasta un 58,5% de supervivencia.

Tabla 5. Efecto de la combinación cobertor-calibre en la supervivencia de las plantas producidas

in vitro, en la fase de aclimatización.
Tratamientos Supervivencia (%) Media de rangos
Con cobertor- Calibre (1,5-2,4 cm) 24,70 11,00 a
Con cobertor- Calibre (2,5-3,9 cm) 58,50 17,00 a
Con cobertor- Calibre (Más de 4,0 cm) 43,30 14,00 a
Sin cobertor- Calibre (1,5-2,4 cm) 4,70 2,83 b
Sin cobertor- Calibre (2,5-3,9 cm) 10,43 8,00 b
Sin cobertor- Calibre (Más de 4,0 cm) 6,16 4,17 b
KW = 16,23**
Posada et al., (2007) obtuvieron resultados similares, cuando transfirieron a la fase de
aclimatización plantas con 3,0 cm de longitud, a los 60 días habían alcanzado una altura de 10-
12 cm y emitieron de 5-7 hojas, por lo que estaban listas para el transplante a condiciones de
campo. La longitud de la plantas producidas in vitro es particularmente importante cuando se
transfieren a la fase de aclimatización, ya que esta fase es considerada como la etapa más
crítica en el proceso de propagación in vitro de especies como Carica papaya.
Respuesta en campo de las plantas obtenidas in vitro
El 61% de las plantas micropropagadas presentaron flores hermafroditas y en los tres lotes
evaluados osciló este tipo de planta entre 56 y 68%. Esta respuesta coincide con la descrita
para esta variedad (Rodríguez y Rodríguez, 2000), ya que al caracterizar la variedad 'Maradol
Roja' desde el punto de vista sexual se plantea que debe presentar un 66,6% de plantas
hermafroditas, 33,4% de femeninas y que en una plantación procedente de semillas básicas no
deben aparecer plantas masculinas.
Estos resultados son de vital importancia porque permiten definir en condiciones de campo las
plantas que pueden producir los frutos aptos para la extracción de semillas y por lo tanto poder
tomar la decisión de que líneas de plantas in vitro se van a multiplicar de forma masiva para
producir un material de alta calidad fisiológica y fitosanitario porque estará libre de virus ya que
el mismo no se trasmite por semilla.
REFERENCIAS
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