Efecto de los reguladores de

crecimiento vegetal y
carbohidratos en la induccin de
callos y la proliferacin de la hoja
de explante de Lippia multiflora
Moldenke ( verbenacea )

Introduccin

Lippia multiflora Moldenke, comnmente conocida como t de la sabana es una

planta utilizada en la medicina tradicional africana para tratar diversas enfermedades
como la hipertermia, presin arterial y malaria.

Diversos estudios demuestran que el aceite esencial de esta planta tiene propiedades
farmacolgicas, pesticidas y cosmticas.

Ms de 42 compuestos voltiles han sido caracterizados en el aceite esencial de esta

planta, los que se encuentran en mayor proporcin estn: limoneno (16%), cariofileno (5.3%), trans--farneseno (16%), xido de cariofileno (22%) y farnesol
(16.95%)

Problemtica

Para la produccin de este aceite esencial se necesita de mucho

material vegetal variando el rendimiento entre los meses de enero y
junio de 0.9 a 1.57 %.

La disponibilidad de este material vegetal se ve amenazado por

diferentes factores como incendios forestales, sequas y la explotacin
del campo, adems de que la recoleccin tradicional de esta planta
daa los tallos y ramas.

Propuesta de solucin

Las alternativas a la produccin de los metabolitos secundarios de esta

planta puede ser de manera qumica o aplicando las tcnicas de
biotecnologa vegetal.

Diferentes plantas del gnero Lippia han sido cultivados in vitro de

manera exitosa. Sin embargo no existe ningn trabajo que haga
referencia a L. multiflora.

El fin de este trabajo es establecer un protocolo para la induccin de

callo en esta planta.

MATERIALES Y MTODOS
PREPARACION DE MEDIO DE
CULTIVO
DESINFECCIN SUPERFICIAL DE LAS
SEMILLAS Y GERMINACION IN VITRO
INDUCCIN DE CALLO

EVALUACIN DE LA INDUCCION DE
CALLO Y PROLIFERACIN

ANLISIS ESTADSTICO DE LOS

DATOS

Preparacin del medio de cultivo

Preparacin de las sales MS

Adicin de vitamina B5 y sacarosa al 3%
Ajuste de pH a 5.8 con HCL o NaOH (10-3 M).

Adicin de Gelrite (2,5g/l) y MgCl2 (0,75g/l) como

agentes solidificantes.

Esterilizacin en autoclave: 30 min, 121C, presin 1

bar.

Desinfeccin superficial de las semillas y

germinacin in vitro
Desinfeccin por remojado rpido en cido sulfrico (96%)
Enjuagado de las semillas en agua destilada estril. Luego
se sumergen en hipoclorito de sodio (3,6 cloro activo) por
20 minutos
Enjuagado de las semillas (3 veces) en agua estril.
Almacenamiento en agua destilada estril por 24 horas en
condiciones de oscuridad
. Semillas hinchadas son transferidas al medio para su
germinacin

.Despus de 3 semanas se obtuvieron plntulas que son

utilizadas como fuentes de explantes.

Induccin de callo
10 mm2 de hoja son cortados y utilizados como explantes en los diferentes medios.
Preparacin del
expalnte

Evaluacin de
las auxinas

Evaluacin de
las citocininas

cido 2,4-diclorofenoxiactico (4D), cido 1-naftalenactico (ANA) y Picloram (PIC) son las auxinas
utilizadas y probadas a diferentes concentraciones: 0; 0.5; 2.5; 5 and 10 M. El tipo y concentracin de
auxina con la ms rpida respuesta es seleccionado para provar su efecto con las 3 citocininas en el
siguiente experimento.

Bencilaminopurina (BAP), Kinina (KIN) y Zeatina (ZEA) son las auxinas utilizadas junto con la mejor auxina,
en las siguientes proporciones: 0.1: 1; y 5:10. El control es el medio con la mejor auxina obtenida del
experimento anterior. La mejor combinacin auxina citocinina ser utilizada en el experimento siguiente.

Los azucares empleados fueron glucosa, fructosa, maltosa y sacarosa a 30g/l. despus de 8 semanas de
Evaluacin de la cultivo la produccin de callo es registrada y el azcar con mayor respuesta es evaluada a 10,20,30,40 y
fuente de
50 g/L.
carbono

Condicones generales de los

experimentos.

Para todos los experimentos, cinco explantes se colocaron en el medio y

se replicaron tres veces por tratamiento.

El tamao de un experimento independiente se constituy con 15

explantes para un total de 45 explantes por tratamiento.

Todos los cultivos se transfieren en una sala de cultivo bajo un ciclo

fotoperidico de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad y una
temperatura de 25 2 C. La luz es proporcionada por lmparas
fluorescentes con una intensidad de 3000 lux.

EVALUACIN DE LA INDUCCION DE CALLO Y

PROLIFERACIN

Despus de ocho semanas de cultivo , las respuestas a callognesis se registraron en

trminos de tasa de induccin de callos y el peso fresco y seco de callo primario producido.

Para el registro del peso fresco y seco:

El callo se retir cuidadosamente alrededor y parte superior de los explantes y se pes para obtener
el peso fresco del callo (FW) . La muestra se coloca entonces en una placa de Petri y se incub en un
horno a 60 C hasta un peso constante correspondiente al peso seco de callo (DW).

ANLISIS ESTADSTICO DE LOS

DATOS

Los diferentes cultivos se incubaron en una cmara de crecimiento

segn un diseo completamente al azar. Se utiliz el anlisis de
varianza (ANOVA) para determinar las diferencias entre los tratamientos.
Cuando se observ una diferencia, se realiz la prueba de rango
mltiple de Newman-Keuls al 5 % a los medios de tratamiento
separados. Las pruebas estadsticas se realizaron utilizando el software
STATISTICA versin 7.0.

Resultados
Efecto del tipo y concentracin de las auxinas en
la callognesis

Efecto de la combinacin de Picloram (PIC) con

la citocinina en la induccin de la callognesis

Efecto del tipo carbohidratos en la

induccin del callo

Efecto de la concentracin de
fructosa en la induccin de callo

10

20

30

40 50

Conclusin

A partir de esta investigacin, un protocolo estndar eficaz y reproducible para

la produccin de callos utilizando explantes de hoja de Lippia multiflora Mold. se
ha definido.

En el medio basal MS suplementado con PIC ( 5M ) + KIN ( 25 M) a una

concentracin de fructosa 3 % se encontr la mejor interaccin para expresar
mxima proliferacin de callo .

Los cultivos de callo, desarrollados en este estudio pueden ser utilizados para
detectar, aislar y caracterizar diversas metabolitos secundarios de L. multiflora
para futuras aplicaciones en los productos farmacuticos.

Adems de explantes de hoja; tallo y segmentos de raz tambin se utilizarn

como explantes para la iniciacin de callo .

Los subcultivos que a continuacin, se llevan a cabo son para conseguir

suficientes callos para el desarrollo de los cultivos en suspensin de clulas .