Obtención de callos del girasol (Helianthus annuus L.

Jacome Garrido Nadin Sabina 1 & Pérez Navarrete Blanca Isabel 2

nsjacome@espe.edu.ec 1 & biperez1@espe.edu.ec 2
Universidad de las Fuerzas Armadas, Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura,
Cultivo de tejidos vegetales
Entregado el 25 de Noviembre del 2021

Resumen
El girasol (Helianthus annuus L.) es una de las plantas de gran importancia debido a su semilla
oleaginosa, por lo que son codiciadas para su desarrollo in-vitro. Este trabajo se planteó como
objetivo obtener callos in vitro de Helianthus annuus L a partir de semillas., para ello se trabajó
con la variedad Caburé-15 del girasol, se utilizaron como explantes el ápice, secciones de
hipocótilo, epicótilo y hojas de las plántulas y se les agregó reguladores de crecimiento como
BAP, 2,4-D y AIA. Los datos obtenidos se analizaron mediante un análisis de diseño factorial
con el programa INFOSTAT. Dando como resultado el crecimiento de callos con los
reguladores BAP y la ramificación y ápices con el regulador AIA.

Palabras Clave: Helianthus annuus L, in vitro, BAP, 2,4-D y AIA.

Introducción obtención de material vegetal en cualquier

Helianthus Annuus (Girasol), es una planta
perteneciente a la familia de las asteráceas,
originaria de América del norte y Europa,
es de gran importancia económica al ser la
principal semilla oleaginosa usada en
Europa (Perror et al, 2019). Tiene gran
tolerancia al estrés hídrico adaptándose a
climas húmedos y áridos (Debaeke et al,
2017). Se desarrolla a temperaturas entre 10
y 30°C, siendo los 25°C su temperatura
óptima de crecimiento (Ecco et al, 2017).
El cultivo de tejidos es una técnica que
consiste en aislar una porción de planta,
conocido como explante, y proporcionar
artificialmente las condiciones físicas y
químicas necesarias para que las células se
desarrollen en distintos tipos de tejidos
(Roca & Mroginski, 2008).
La importancia del cultivo in vitro viene de
sus posibles aplicaciones, por ejemplo el
desarrollo de tratamientos contra plagas,
época del años, procesamiento de mayor
número de muestras en menor tiempo y
menos espacio, propagación de plantas de
interés o en peligro de extinción, clonación
de germoplasma valioso, generación de
bancos de germoplasma, producción de
metabolitos secundarios, mejoramiento
genético de cultivos, entre otros (Castillo,
2017).
Las técnicas biotecnológicas, como el
cultivo de tejidos y los sistemas de
transferencia de genes están limitadas
principalmente por la respuesta del cultivo
de tejidos (Oziyigit et al., 2007). Diferentes
partes de la planta han sido utilizados como
explantes para técnicas de cultivo de
tejidos, tales como embriones inmaduros,
maduros, ejes embrionarios, hojas,
meristemos, yemas, brotes hipocótilos,
pecíolos, raíces y tallos (Inoka &
Dahanayake, 2015).,
 Estos métodos biotecnológicos permiten Tabla 1: Análisis estadístico de Tukey
acelerar y apoyar el mejoramiento genético Protocolos Supervivencia Eficacia
(%) (%)
convencional en muchos cultivos, sin
PD1 80.00 82.00
embargo, la escasez de recursos genéticos
PD2 91.00 89.10
adecuados en las variedades del girasol, ha PD3 97.00 97.00
frenado la regeneración de plantas PD4 18.50 8.90
completas, puesto que depende de la PD5 100.00 98.70
naturaleza del explante, el contenido PD6 78.00 79.00
hormonal del medio y del genotipo por lo PD7 31.00 21.00
que el desarrollo de dichas características,
ha sido limitado considerablemente (Pola &
100
Santiz, 2019).
80
60
Por esta razón la callogénesis es una fuente
40
de material celular desdiferenciado para su
20
uso en diferentes aplicaciones, desde el
0
mejoramiento genético hasta la producción PD1 PD2 PD3 PD4 PD5 PD6 PD7
de metabolitos secundarios de interés a
Supervivencia % Eficacia %
nivel in vitro (Rodríguez et al, 2014).
Figura 1: Análisis estadístico de Tukey
En el cultivo in vitro de tejidos de girasol
generalmente se usan plántulas y ápices de Tabla 2: Análisis de similitud de Tukey
brotes (Robinson y Everett, 1990). Las Protocolos Promedio de
contaminación
plantas maduras cultivadas en el campo (%)
pueden utilizarse para la propagación de PD5 0.1 a
girasol (Sujatha y Prabakaran, 1997). PD3 1.4 ab
PD2 7.4 b
Materiales y Métodos PD1 8.01 b
Selección de protocolo de desinfección PD4 62.2 c
Se usaron los 7 protocolos establecidos de PD6 20.04 d
la tabla N°4 (anexos), donde se utilizó PD7 48.5 e
como unidad experimental un explante, en
este caso usamos semillas maduras del
Helianthus annuus L (girasol) por frasco Metodología del cultivo in vitro
utilizado. Se realizaron 10 repeticiones por Se usaron semillas maduras de diferentes
tratamiento y se estudio por una prueba de variedades de girasol, estas fueron
Tukey la eficacia y la supervivencia por desinfectadas con alcohol al 70% durante 2
tratamiento realizado como lo podemos ver minutos, después se aplicó bicloruro de
en la tabla N°1. Además, logramos mercurio 0,1% durante 5 minutos. Para la
identificar la similitud de cada tratamiento germinación se usó el medio de cultivo
mediante una prueba de similitud de Tukey, Murashige y Skoog, 1962 (MS) sin
demostrando que los protocolos 5 y 3 son hormonas, el pH de estos se ajustó a 5,7-5,8
los más parecidos en desinfección (Fig. 1). y se añadió 7 g/L de agar. Se esterilizó en
autoclave a una presión de 1,2 atm durante
20 minutos y a 120°C. Los cultivos se S.C G. C.M D.E C.V
sometieron a un fotoperiodo de 14 horas luz L
y una temperatura de 25 ± 2°C. Después
del desarrollo de las plantas, se realizó el Medio 12,66 3 4,22 - -
experimento. *

Explan 3,85 3 1,28 - -

En el experimento se usaron como te *
explantes: el ápice, algunas secciones de
hipocótilo, epicótilo y la hoja del girasol MxE 3,40 9 0,38 - -
Caburé-15, que fueron colocados en cuatro *
medios de cultivo:
Error 11,27 112 0,10 0,32 70,3
● MS +1 mg/L de 6- %
bencilaminopurina (BAP).
● MS +5 mg/L de BAP Nota: Datos ficticios.
● MS +1 mg/L de ácido 2,4 -
diclorofenoxiacético (2,4 -D) De la interacción medio-explante del
● MS +1 mg/L de ácido indol acético primer experimento se observó que a los 30
(AIA). días el mayor crecimiento de los callos se
Para evaluar el crecimiento de los callos se dio en el medió que contenía 5 mg/L de
tomaron 8 réplicas por tratamiento a los 30 BAP para todos los explantes, esto se
días de cultivo, utilizando el peso fresco de detectó visualmente desde los doce días.
los mismos en gramos menos el peso inicial
del explante. También se determinó la
presencia de raíces adventicias, gracias al
porcentaje de explantes.

El experimento se analizó de forma

independiente, mediante un análisis de
varianza para un diseño factorial
empleando el programa estadístico
INFOSTAT. La metodología fue tomada de Fig. 2. Interacción medio-explante en el crecimiento
de los callos de girasol.
Rodríguez et al, 2002.

Resultados

Se encontraron diferencias significativas

entre los medios de cultivo y entre los
explantes, de igual manera en las
interacciones medio-explante de cada
experimento.
Fig. 3. Efecto del AIA en la formación de raíces
adventicias de girasol.

Tabla 3: Análisis de varianza del experimento 1

Al analizar el crecimiento tomando en
cuenta el tipo de explante usado se observó
que el hipocótilo mostró mayor valor sin
diferencias significativas con el epicótilo
(Fig. 2). Después de 12 días, en los
explantes procedentes de hipocótilos y
epicótilos se observaron raíces adventicias
en el medio que contenía AIA, pero no se
evaluó. A los 30 días se encontró raíces
adventicias en el hipocótilo, epicótilo y
hoja (Fig. 3).
En los ápices no se desarrollaron callos,
pero si crecimiento de plántulas donde se
apreció un 75% de enraizamiento (Fig. 3).
Discusión
En experimentos realizados (Pola & Santiz,
2019) han utilizado reguladores BAP y (2,4
D) donde reportan la obtención de callos de
girasol empleando concentraciones de
1.5mg/L de (2,4-D). Según Inoka y
Dahanayake (2015), lograron obtener
callos con 0.1 mg/L de BAP, también con
seis concentraciones diferentes de 6-
bencilaminopurina. Uno de los que menor
incremento se produjo fue Witrzens et al.
(1998) donde el AIA estimuló el
crecimiento de los callos, pero no se reflejó
en qué medida. Esto demuestra la
formación de callos en diferentes
porcentajes dependiendo de la
concentración de reguladores establecidos.
El mayor crecimiento que se observó de
callos fue al pasar los 30 días, resultados
similares obtuvieron Pola & Santiz (2019),
donde los resultados se registraron después
de cuatro semanas. En nuestros resultados
el mejor regulador para la estimulación de
callos fue el BAP mientras que Pola &
Santiz (2019) fue AIA mostrando ser el
mejor explante con 100% de callogénesis;
en explantes de hipocótilo a 0.5mg/L de
AIA no existió la formación de callos.
Con respecto al enraizamiento solo se
observaron raíces adventicias que solo
contenían el regulador AIA donde a los 12
días estaban formadas. Pola & Santiz
(2019), obtuvieron resultados similares
donde en los callos se formaron raíces
primarias y adventicias donde la
concentración de AIA fue de 0.1mg/L con
72% de formación mientras que la más baja
fue de 52% con concentración de 0.5 mg/L
(Rodríguez et,. al, 2020).
Conclusiones
● Existió un mayor crecimiento en los
callos cuyo medio contenía 5 mg/L
de BAP y el explante hipocótilo.
● Se dió un desarrollo de plántulas a
partir de ápices en medios que
contenían 1 mg/L de AIA.
● Se dió un comportamiento
diferencial entre genotipos en el
medio constituido por BAP 5 mg/L.
Recomendaciones
1. Verificar que las concentraciones de
hormonas añadidas sean adecuadas
para el explante.
2. Llevar a cabo el protocolo de
desinfección antes de la
introducción del explante.
3. Tomar nota del desarrollo y
características del callo a los 12 días
y 30 días.
4. Controlar las condiciones del medio
para evitar la necrosis del explante
o posible contaminación.
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p?pid=S0188- Anexos
62662020000100145&script=sci_a ➔ Tabla 4. Protocolos de desinfección
rttext ➔ Tabla 5. Protocolos repetidos
Tabla 4. Protocolos de desinfección
Título del artículo
1. Shoot Propagation From
Three Sunflower
(Helianthus annuus L.)
Genotype Callus Induction
in Vitro
2. Efecto del ácido indol-3-
acético y del tipo de
explante en la callogénesis
de girasol (Helianthus annus
L.)
3. Cultivo de anteras e
inducción de callo haploide
en germoplasma bc3 de
girasol (Helianthus annuus
L.)
4. REGENERATION
Autores
Ali yasir Hafed AlIssawi Hameedah
Abd Noor Abbood Taghreed Fakhir
Jaber
Wigdan Kamal Noor ; Dalal Abdul
Hussein Kadhim Salwa Hamza
Hussein
Suhair Abd alkareem Habeeb Inaam
Jawad Alabbasi
Enriquez Pola Sánchez
José A. Santiz Gómez
Eduardo Rodríguez Guzmán
Carlos Ramírez Serrano
María M. Güitrón López
Paola A. Palmeros Suárez
Alejandro Ángeles Espino
Clara R. Azzam
Protocolo de desinfección
Se usó NaOCl2 al 10% por 10 min. y
cloruro mercúrico al 0,01% durante 2
min. Para el meristemo apical se usó
NaOCl2 con concentraciones de 1,4 y
8% para 250 ml. Para todas las
concentraciones se añadió tween-20. Se
sumergieron los explantes en las
soluciones por 1,2 y 4 minutos. Todo el
proceso se llevó a cabo dentro de una
cámara de flujo laminar.
Las semillas fueron desinfectadas con la
inmersión en etanol al 70% durante 30 s
y lavadas tres veces con agua destilada
estéril para eliminar los residuos de
etanol. Posteriormente, las
semillas se sumergieron en hipoclorito
de sodio comercial
(5% p/v) diluida al 20% durante 2 min y
finalmente se
lavaron tres veces con agua destilada
estéril.
Las anteras se colocaron en alcohol
etílico al 70% por un minuto y luego se
sumergieron en solución de hipoclorito
de sodio al 6% diluido en agua destilada
esterilizada en volumen (1/1) durante
seis minutos y, posteriormente, se aplicó
triple enjuague con agua destilada
esterilizada.
La superficie de los explantes se lavó
Protocolo de introducción
Se disolvió 50 mg de BA en 1 ml de HCl
para 50 ml de agua destilada, se
distribuyó en el medio MS
concentraciones de 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5
mg/L en tubos con 30 ml de medio, cada
tubo con cinco plántulas por 6
repeticiones para cada concentración de
BA y cada genotipo. Se incubó en las
mismas condiciones que se encontraba
el explante y se tomó nota a los 10 días.
Los explantes obtenidos se colocaron en
frascos de cultivo de 100 mL que
contenían 25 mL de medio MS
suplementados
con 0.1, 0.5 y 1 mg/L de AIA. Los
recipientes de los diferentes tratamientos
se
mantuvieron en una cámara bioclimática
a 25±2 °C con
fotoperiodo de 16 h.
Se colocaron en cajas de Petri que
fueron previamente esterilizadas en
autoclave por 15 minutos a una presión
de 1.4 kg/cm2, a una temperatura de 121
°C.
Las yemas axilares se cortaron en cuatro
 ABILITY FROM I. M. Amer, A. A. con agua de grifo y luego mediante partes, se cultivaron para la inducción de
SUNFLOWER APICAL Hob Allah esterilización de la superficie callos en medio MS modificados con
MERISTEM AND R. Shabana variaciones de NAA y 6BAP. Se
AXILLARY BUD colocaron 10 yemas axiliares en cada
placa Petri con 25 ml de medio, los
CULTURES AS
explantes se cultivaron en oscuridad a
AFFECTED BY MEDIA
una temperatura de 25±1°C por 10 días.
COMPOSITIONS AND Despues se transfierieron a un medio
GENOTYPES fresco y se incubaron bajo luz
INTERACTION fluorescente blanca fría con 16 h de luz
diaria a una temperatura de 25±1°C.

5. Obtención de callos de
Helianthus annuus L.
Ana Julia Rodríguez Mansito Arlene
Rodríguez Manzan Arlene
Rodríguez Nodals
Reynaldo López Gutiérrez Dayamí
Pérez Hernández Odalys Pérez Díaz
Norma Marrero Granado
Semillas desinfectadas con alcohol al 70 Los cultivos se
% durante 2 min. y posteriormente con mantuvieron en un fotoperiodo de 1 4
bicloruro de mercurio 0,1 % durante 5 horas luz y 25 ± 2 0 C
min. La esterilización se realizó en una de temperatur
autoclave a una presión
de 1 ,2 atm. durante 20 min. y a 120 °C

6. Establishment of Tissue Nadia Binte Obaid Las semillas se lavaron en autoclave ddH2O Todas las semillas descascaradas se
Culture Protocol of Two durante 1 minuto dos veces, luego en etanol cortaron a 3 mm de sus regiones
al 70% durante 3 minutos. Posteriormente, se proximales y se inocularon, con la
Bangladeshi Sunflower lavaron nuevamente con ddH2O durante 1
Varieties (Helianthus porción cortada hacia arriba, en medio
minuto, dos veces, seguido de Cloro al 14%
MS suplementado con hormonas. Los
annuus L.) durante 20 minutos. A continuación, se
lavaron con agua destilada durante 1 minuto matraces se sellaron y se mantuvieron a
4-5 veces para eliminar cualquier Clorox, y 25 ° C con un fotoperiodo de 16 horas
luego se sumergieron en ddH2O y se de luz y 8 horas de oscuridad. Después
almacenaron durante la noche en una caja de 30 días, los cultivos se transfirieron a
para ayudar a la absorción de agua. Al día medios nuevos con la misma
siguiente, las semillas empapadas se lavaron composición hormonal.
tres veces, se descascarillan y se lavaron 5-6
veces más con ddH2O para eliminar la capa
cerosa blanca en la superficie de la
semilla.Cada paso se llevó a cabo dentro de
una cabina de flujo de aire laminar

7. Phytochemical Screening, Rajakannu Subashini Las semillas fueron clasificadas,

Antimicrobial Activity and Sritharan Umamaheswari Rakshitha limpiadas y secadas al aire a temperatura
 In Vitro Antioxidant ambiente durante 2 semanas
Investigation of Methanolic y luego en polvo para preparar el extracto. El
medio se esteriliza en autoclave durante 30
Extract of Seeds from min. y luego se deja enfriar, pero no
Helianthus annuus L. solidificar.
Nota: Obtenido de Hafed et al. (2017), Pola-Sánchez et al. (2019), Azzam et al. (2003), Binte (2018), Rodríguez et al. (2002), Guzmán et al. (2021), Rajakannu, Sritharan
(2012).

Tabla 5. Protocolos de desinfección repetidos

Título del artículo Autores Artículo de protocolo de
desinfección repetido

Evaluación de Thaís Dolfini Alexandrino Efecto del ácido indol-3-acético y

algunas bioactividades in vitro de
compuestos fenólicos de girasol
Marta Gomes da Silva del tipo de explante en la
Roseli Aparecida Ferrari callogénesis de girasol (Helianthus
Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz annus L.)
Renata Maria Teixeira Duarte
Fernando Moreira Simabuco
Rosângela Maria Neves Bezerra
María Teresa Bertoldo Pacheco

In Vitro Tissue Culture Studies in Dagustu N. Obtención de callos de Helianthus

Sunflower (Helianthus spp.) annuus L.
Nota: Obtenido de Dagustu N. (2017), Alexandrino et al. (2021).