ESTABLECIMIENTO in vitro de Rhodophiala bagnoldii (Myostemma gilliesiana) y

Rhodophiala montana (Myostemma montana (Phil.) Rav), a partir de escamas de bulbos*

Jara G., Seemann P. y Muñoz, M.

Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Producción y Sanidad Vegetal, Universidad Austral de

Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile, Teléfono: (56-2) 221232, Fax: (56-2) 221233.

RESUMEN

Se realizó la incorporación de escamas gemelas de bulbos, desinfectadas y tratadas con los

agentes antioxidantes ácido cítrico, ácido ascórbico, polivinil pirrolidona y carbón activado,
Además se determinó el efecto del medio de cultivo MS adicionado con las citoquininas
2-isopentiladenina (2-iP), Kinetina (K) y Tidiazurón (TDZ), en concentraciones de 0 - 2,0 mg/L
en combinación con 0 - 0,8 mg/L de ácido naftalen acético (ANA), de tal forma de definir las
mejores condiciones para el establecimiento aséptico e inducción de microbulbillos, mantenidos
en cámara de luz artificial con un flujo de fotones fotosinteticamente activos de 50 μmol/m2s1, 16
horas luz y 23ºC, durante 30 días. Se determinó que a pesar de que la fenolización de las
escamas comienza tempranamente y que se presentan pérdidas debido a la contaminación por
microorganismos, la sobrevivencia alcanzó valores entre 16,7- 87,0% para R. bagnoldi y de
50-90% para R. montana. Se manifiesta además en ambas especies una hipertrofia o
hinchamiento de las escamas independiente de la concentración de auxinas/citoquininas, sin
embargo, esta respuesta no refleja necesariamente una mayor eficiencia en la capacidad de
regeneración de microbulbillos ya que esta variable arrojó valores promedios no mayor del
20%, independientemente del tipo y concentración de reguladores de crecimiento utilizados.

Palabras claves: Amaryllidaceae, Rhodophiala, escamas gemelas, antioxidantes, organogénesis

in vitro

* Financiado mediante Proyecto FIA- BIOT-01-A-071.

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INTRODUCCION

El género Rhodophiala pertenece a la familia Amaryllidaceae, se encuentra en Chile con

aproximadamente 28-29 especies (Hoffman et. al. 1998). Entre estas especies destacan
Rhodophiala bagnoldii la cual se distribuye entre la III y IV región y R. montana localizada
principalmente en la VII región, ambas en suelos arenosos. Su floración ocurre en primavera y
verano respectivamente, en donde forman flores amarillas, amarilla/anaranjadas, lo cual les
otorga características apropiadas como planta ornamental.
Son plantas geófitas que presentan una propagación natural poco eficiente, con lo cual se ha
tenido que recurrir a métodos de propagación vegetativa artificiales (Peñailillo y Schiappacasse,
1999). Sin embargo, como estos métodos no han sido efectivos, se ha tenido que utilizar
herramientas biotecnológicas, mediante el cultivo de tejidos, el cual comúnmente se ha
realizado a partir de órganos subterráneos como bulbos, con la desventaja de que por ser
estructuras subterráneas, los porcentajes de sobrevivencia no superan valores entre el 20-30%,
como en el caso de escamas de Scilla natalensis (Duong et. al. 2001), mientras que en otras
especies se ha obtenido hasta un 90% de sobrevivencia, como en Crinum “Ellen Bosaquent”
(Ulrich et. al. 1999), estando el establecimiento aséptico en dependencia de la técnica de
desinfección utilizada.
Otro de las causas de perdida de material es la liberación de fenoles, el cual ha sido
solucionado en parte mediante la aplicación de compuestos que modifican el potencial oxido
reducción, como el ácido cítrico y ácido ascórbico, o los que actúan por adsorción, como el
carbón activado y polivinil pirrolidona, reportándose resultados positivos en el establecimiento
de secciones de tallo en Lilium longiflorum en medios adicionados con carbón activado y libre
de reguladores de crecimiento (Mc. Cartan y van Staden, 1998) o mediante la aplicación de 5 g/l
de carbón activado, el cual además promovió un mayor número de brotes en dos especies de
Cyrtanthus sp. a partir de escamas gemelas de bulbos (Morán, et. al. 2003).
La regeneración in vitro a partir de escamas gemelas o triples en presencia de la placa basal,
ha sido aplicada exitosamente en la mayoría de las geófitas ornamentales producidas
comercialmente, posibilitando con ello altos coeficientes de multiplicación y una mayor
estabilidad genética en las plantas producidas (Fenell y van Staden, 2004). Además de ser
considerado especie y genotipo dependiente, se encuentra influenciado por una serie de
factores, tales como el tipo y concentración de reguladores de crecimiento, carbohidratos y
condiciones de incubación, como luminosidad y periodo de incubación, los cuales pueden
provocar diferentes tipos de respuestas en la tasa de multiplicación, con valores que pueden
fluctuar entre 1-11,0 yemas/explante, en especies tales como; Narcissus bulbocodium,
Narcissus tazetta, Crinum sp. “Ellen Bosanquet”, Nerine sarniensis, Eucrosia radiata, y
Cyrthantus (Santos et. al. 1998, Ulrich et. al 1999, Ziv y Kipnis, 2000, Morán et. al. 2003,
Vishnevetsky et al., 2003). El efecto estimulante de los carbohidratos sobre la regeneración y
crecimiento de órganos de almacenamiento, ha sido estudiado en muchas especies,
Teniendo en cuenta estos antecedentes, la presente investigación pretende establecer una
metodología para el establecimiento in vitro de Rhodophiala bagnoldii y R. montana
determinando algunos factores que afectan su capacidad organogénica, tales como la
aplicación de agentes antioxidantes y reguladores de crecimiento a partir de tejido
meristemático de escamas gemelas con placa basal.

2
2.- MATERIAL Y METODOS

2.1 Material Vegetal

Se utilizaron bulbos de Rhodophiala bagnoldii recolectados en el Valle del Huasco (IV Región) y
de Rhodophiala montana, del sector de la Laguna del Maule (VII Región), los cuales se lavaron,
eliminaron los catáfilos externos y desinfectaron con una solución de fungicida en polvo
(Captan) y una solución bactericida (Agrept), durante 30 minutos en agitación constante.
Bajo condiciones estériles, los bulbos fueron cortados longitudinalmente, obteniéndose ocho
secciones de escamas, de las cuales se aislaron explantes individuales formados por catáfilas
gemelas con placa basal, las que fueron desinfectadas con una solución de etanol (70%)
durante 5 segundos y una solución de hipoclorito de sodio (1% c.a) durante 10 minutos,
realizando tres enjuagues con agua destilada estéril, para sembrarse en frascos con 10 ml de
medio de cultivo estéril de acuerdo a los diferentes ensayos.

2.2 Establecimiento de un cultivo aséptico

2.2.1 Prevención del pardeamiento de los explantes

Se diseñó un ensayo para determinar el efecto de diferentes agentes antioxidantes en escamas

desinfectadas de R. bagnoldii y R. montana, remojadas con una solución de 0,25 g/L de ácido
cítrico y ácido ascórbico (AC/AA), y otra de 1,0 g/L de Polivinil Pirrolidona (PVP), además de un
testigo con agua destilada durante 30 minutos. Una vez transcurrido el periodo de inmersión en
las respectivas soluciones, las escamas fueron sembradas directamente en medio de cultivo
MS en forma completa, y con la concentración de las macrosales reducida al 75%, ambos
adicionados con 0,1 mg/L ANA, 1,0 mg/L 2 iP y 5 g/L de carbón activado (C.A), además de un
medio testigo de igual composición iónica, pero sin carbón activado. De esta forma se diseño un
ensayo factorial completamente al azar, utilizando 10 repeticiones por tratamiento, en el cual
cada repetición está constituida por una unidad experimental. Al cabo de cuatro semanas de
incubación en cámara de luz artificial con un flujo de fotones fotosinteticamente activos de 50
μmol/m2s1, fotoperiodo de 16 horas luz y una temperatura de 24ºC, se evaluó el número de
escamas que presentaron síntomas de oxidación, expresado como porcentaje de pardeamiento
por tratamiento y la sobrevivencia en base a la sanidad del material vegetal, y oxidación mayor
del 50% de la escama.

2.3 Organogénesis de segmentos de bulbos in vitro

2.3.1 Efecto de diferentes tipos y concentraciones de reguladores de crecimiento:

escamas gemelas de R. montana desinfectadas mediante el tratamiento descrito anteriormente,
fueron sembradas en frascos con 10 ml del medio de cultivo MS, el cual fue suplementado con
las citoquininas 2-isopentiladenina (2-iP), Kinetina (K) y Tidiazurón (TDZ), en concentraciones
de 0.25, 0.5, 1.0 y 2,0 mg/L en combinación con 0.1, 0.2, 0.4 y 0.8 mg/L de ácido naftalen
acético (ANA), además del testigo, sin reguladores de crecimiento, de tal forma de diseñar un
ensayo completamente al azar con 15 repeticiones cada uno, constituida cada repetición por
una unidad experimental.

2.3.2 Efecto de diferentes tipos y concentraciones de carbohidratos: escamas gemelas

desinfectadas de R. montana fueron sembradas individualmente en frascos con 10 ml de medio
de cultivo MS, sin reguladores de crecimiento, el cual fue adicionado con los carbohidratos
sacarosa, glucosa y fructosa en forma individual o con las combinaciones sacarosa/glucosa,

3
sacarosa/fructosa, en concentraciones de 20, 60 y 90 g/L, de tal forma de diseñar un ensayo
factorial completamente al azar con 20 repeticiones por tratamiento. La sacarosa fue adicionada
directamente al medio de cultivo antes de autoclavar, en cambio la glucosa y fructosa fue
adicionada mediante una solución concentrada, luego que el medio fue esterilizado por
filtración, con filtros de 0,2 µm de tamaño de poro.

En todos los ensayos se utilizaron frascos de 80 x 25 mm, con 10 ml de medio de cultivo

compuesto por las sales y vitaminas de Murashige y Skoog (1962), adicionado cuando
corresponda con 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, pH 5,6 ajustado con una solución de KCl
0,5 N. La esterilización se realizó a 121ºC, 1,5 psi durante 20 minutos.
Cada frasco con un explante constituye una repetición, de tal forma que cada tratamiento
presentaba entre 10-20 repeticiones, dependiendo del ensayo. Los cultivos se mantuvieron en
condiciones de incubación similares a las anteriormente expuestas, evaluándose además en los
ensayos de organogenesis, el porcentaje de hipertrofia de las escamas y brotación.

3.0 RESULTADOS Y DISCUSION

3.1 Prevención del pardeamiento in vitro

El pardeamiento de los explantes comienza tempranamente, a partir de la primera semana,

manifestándose por una coloración café-rojiza en la zona de corte, para posteriormente a
medida que transcurre el tiempo, difundir a la escama completa y al medio de cultivo. En
general, se observó que las escamas sembradas en el medio de cultivo adicionado con carbón
activado presentaron un menor porcentaje de pardeamiento (Tabla 1 y 2), con una respuesta
uniforme para R. bagnoldii, bajo las diferentes soluciones antioxidantes; mientras que para R.
montana, la respuesta fue mas heterogénea, sin determinar en forma clara la efectividad de los
agentes antioxidantes en la prevención del pardeamiento (Tabla 3).
En relación a la sobrevivencia de las escamas se obtuvieron valores que fluctuaron entre un
30-100%, aportados mayormente por la viabilidad de las escamas libre de microorganismos
(Tabla 1 y 2). En base a estos resultados se logró el establecimiento de un porcentaje alto de
escamas viables y libres de microorganismos, potencialmente capaces de regenerar brotes, no
obstante, esta positiva respuesta no se encuentra relacionada con el potencial regenerativo del
explante, ya que la formación de brotes a las cuatro semanas de incubación, no superó el 20%,
siendo necesario considerar un periodo de incubación mas extenso, como se ha realizado en la
mayor parte de las especies de Amaryllidaceae, en el cual la regeneración de brotes para
Narcissus confusus y Narcissus bulbocodium ha sido evaluada a las 6 y 8 semanas (Sellés, et.
al. 1997; Santos, et. al. 1998), 16 semanas en Crinum sp. (Ulrich, et. al. 1999) y 12 semanas
para dos especies de Cirtanthus sp. (Morán et. al., 2003)

4
 Tabla 1: Efecto de la aplicación de agentes antioxidantes en solución sobre el
establecimiento in vitro de escamas de bulbos de Rhodophiala bagnoldii, sembradas en
diferentes medios de cultivo, evaluadas a las cuatro semanas de incubación.

Tratamientos Pardeamiento Contaminación Sobrevivencia

(%) (%) (%)
Agua 60 0 50
AC/AA MS 100% 30 20 40
PVP 50 10 50
Agua 10 0 60
AC/AA MS 100 % + C.A 20 10 90
PVP 20 20 30
Agua 80 40 50
AC/AA MS 75% 50 0 70
PVP 60 20 60
Agua 20 0 70
AC/AA MS 75% +C.A 0 0 40
PVP 10 10 50
AC/AA: ácido cítrico/ ácido ascórbico; PVP: polivinil pirrolidona; CA: carbón activado; MS 75%: Medio Murashigue y
Skoog con macrosales reducidas al 75%.

Tabla 2: Efecto de la aplicación de agentes antioxidantes en solución sobre el

establecimiento in vitro de escamas de bulbos de Rhodophiala montana, sembradas en
diferentes medios de cultivo a las 4 semanas de incubación.

Tratamientos Pardeamiento Contaminanción Sobrevivencia

(%) (%) (%)
Agua 0 20 80
AC/AA MS 100% 50 0 100
PVP 60 0 100
Agua 10 10 80
AC/AA MS 100 % + C.A 0 60 50
PVP 0 0 90
Agua 10 0 100
AC/AA MS 75% 0 20 80
PVP 20 30 60
Agua 30 10 60
AC/AA MS 75% +C.A 40 20 70
PVP 10 30 70
AC/AA: ácido cítrico/ ácido ascórbico; PVP: polivinil pirrolidona; CA: carbón activado; MS 75%: Medio Murashigue y
Skoog con macrosales reducidas al 75%.

5
3.3 Organogénesis de segmentos de bulbos in vitro

3.3.1 Efecto de diferentes tipos y concentraciones de reguladores de crecimiento

Debido a la baja respuesta organogénica obtenida bajo estas condiciones, se realizó un ensayo
en R. montana, para determinar el efecto de diferentes tipos y concentraciones de citoquininas,
mediante el cultivo de escamas dobles con placa basal. El establecimiento presentó resultados
similares a los obtenidos en el ensayo anterior, ya que se obtuvo sobre un 70% de escamas
sanas y libres de microorganismos. En cuanto a la respuesta organogénica, esta comenzó
inicialmente por un hinchamiento de las escamas o hipertrofia, lo cual se observó en todos los
tratamientos, independientemente del tipo y concentración de citoquininas o de la ausencia o
presencia de ANA (Tabla 4). Esta característica de hipertrofia no implica necesariamente una
mayor eficiencia en la capacidad de regeneración de brotes, ya que el porcentaje máximo de
brotación fue de un 20%, lo cual concuerda con la baja capacidad regenerativa de las escamas
de R. montana obtenidas en el ensayo anterior. El hinchamiento de las escamas también ha
sido observada en escamas triples de Crinum spp. principalmente en medios de cultivo
adicionados con ANA, afectando negativamente la capacidad organogénica y sobrevivencia de
ellas (Ulrich et. al. 1999).

Tabla 4: Efecto de reguladores de crecimiento sobre algunos parámetros en la

organogénesis de escamas de bulbos de Rhodophiala montana

Concentración (mg/L) Hichamiento Pardeamiento Brotación Sobrevivencia

de escamas (%) (%) (%)
(%)
Testigo 86,0 0 0 93,3
2iP ANA
0.25 0.1 73,3 6,6 0 93,3
0.5 0.2 66,6 20,0 0 73,3
1.0 0.4 66,6 13,3 0 80,0
2.0 0.8 80,0 6,6 0 80,0
TDZ ANA
0.25 0.1 66,6 13,3 6,6 100
0.5 0.2 80,0 13,3 20,0 80,0
1.0 0.4 80,0 13,3 6,6 86,6
2.0 0.8 66,6 6,6 6.6 90,6
Kin ANA
0.25 0.1 80,0 13,3 13.3 93,3
0.5 0.2 73,3 6,6 13,3 80,0
1.0 0.4 53,3 20,0 0 77,7
2.0 0.8 66,6 40,0 6,6 82,2
a
Datos representan un promedio de 15 escamas gemelas.

6
3.3.2 Efecto de diferentes tipos y concentraciones de carbohidratos.

Tabla 5: Efecto de carbohidratos sobre algunos parámetros en la organogénesis de

escamas de bulbos de Rhodophiala montana

Hichamiento Brotación Sobrevivencia

de escamas (%) (%)
(%)
Concentración (g/L)
Sacarosa Glucosa Fructosa
20 0 0 80 5
60 0 0 85 0
90 0 0 90 15
0 20 0 70 0
0 60 0 75 0
0 90 0 85 0
0 0 20 85 0
0 0 60 100 0
0 0 90 90 5
10 10 0 95 5
30 30 0 100 0
45 45 0 95 0
10 0 10 75 0
30 0 30 90 10
45 0 45 90 5
a
Datos representan un promedio de 20 escamas gemelas.

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Figura. 1. Establecimiento de Rhodophiala sp. (A) Bulbo madre donador de escamas. (B)
Escamas gemelas con placa basal. (C) Hipertrofia de escama gemela sin formación de brotes.
(D) Escama oxidada. (E) Diferentes estados en la formación de brotes a los 30 días de
incubación.

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