Micropropagación In Vitro de Opuntia ficus-indica en el sur de

Marruecos

A. El Finti, R. El Boullani, M. Belayadi, N. Ait Aabd and A. El Mousadik

Laboratory of Biotechnologies and Natural Resources Valorization, Science Faculty B.P. 8106,
Agadir

Morocco

Keywords: prickly pear, Opuntia ficus-indica, in vitro micropropagation, auxins,

micropropagated plantlets

Resumen
Con el objetivo de una gran producción de material vegetal, se desarrolló un método
de micropropagación rápida de nopal (Opuntia ficus-indica). Los explantes de cladodios
jóvenes que contenían una areola se cultivaron en medio Murashige y Skoog (1962) (MS)
con sulfato de adenina (40 mg/L), fosfato monosódico (50 mg/L), sacarosa (50 g/L), phytagel
(0.3%) y benciladenina (BA) a 22,2 µM. Las mejores tasas de multiplicación se obtuvieron
con BA a 0.5 mg/L que la cinetina. Para inducir el enraizamiento, los brotes proliferados se
transfirieron a un medio que contenía la mitad de MS, sacarosa (3%), phytagel (0,3%) y 0,5
mg/L de diferentes auxinas. En estas condiciones de cultivo, se obtuvo el 100% de las
plántulas enraizadas y el mayor número de raíces (21.05 y 16.2) respectivamente con ácido
indol-3-butírico (IBA) y ácido indol-3-acético (IAA). Los brotes enraizados se aclimataron
fácilmente y se transfirieron al suelo.

INTRODUCTION
La tuna (Opuntia ficus-indica Mill.) También conocida como tuna es la especie vegetal
más importante de la familia Cactaceae. Se le conoce como una planta multipropósito, ya que
puede usarse para la alimentación humana (frutas y verduras), forraje, plantas medicinales y
plantas ornamentales (Russell y Felker, 1987; Bravo-Hollis y Sanchez-Mejorada, 1991; Pimienta-
Barrios y Muñoz-Urias, 1995; Rodríguez-Félix, 2002).

Opuntia ficus-indica es una planta xerófita, espinosa suculenta o sin espinas, CAM
(metabolismo del ácido crasuláceo). La tuna es el cultivo de cactus comestible más cultivado en
el mundo y está ampliamente distribuido en México y el continente sudamericano. También se
cultiva en muchas otras regiones del mundo, como África, el área mediterránea, Australia y el
suroeste de los Estados Unidos (Mohamed-Yasseen et al., 1995; Nobel, 1995; Mizrahi et al.,
1997; Inglese et al., 2002; Piga, 2004).

En Marruecos, las tunas se han cultivado durante muchos años, especialmente en zonas
áridas. Las plantas Opuntia se cultivan no solo para la producción de fruta sino también como
setos defensivos o para el control de la erosión en áreas recuperadas. En los últimos años, la
producción de frutos de tuna aumentó como resultado de un aumento en el área de producción
(Boujghagh y Chajia, 2001).

En general, las especies de nopal pueden propagarse sexual y asexualmente. La

propagación de semillas presenta tres problemas principales: segregación genética, una etapa
juvenil larga y el lento crecimiento de las plántulas en comparación con el material propagado
asexualmente (Mohamed Yasseen et al., 1995). Solo se utiliza para investigación científica (Rojas-
Aréchiga y Vásquez-Yanes, 2000). La propagación vegetativa, que se usa ampliamente, se puede
realizar mediante el enraizamiento de cladodios simples o múltiples, pequeñas porciones de
cladodios maduros que comprenden dos o más areolas, o mediante el uso de frutas como
propágulos (Estrada-Luna et al., 2008). Todas estas metodologías requieren grandes espacios de
propagación y presentan una baja tasa de propagación. Por lo tanto, la micropropagación es una
opción alternativa factible para la rápida multiplicación y mantenimiento del germoplasma, ya
que proporciona altas tasas de propagación, menores requisitos de espacio, la producción de
plantas sanas y libres de patógenos (Johnson y Emino, 1979; Smith et al., 1991).

Se han publicado varios informes que describen la micropropagación de la tuna (Johnson

y Emino, 1979; Mauseth, 1979; Escobar et al., 1986; Clayton et al., 1990; Hubstenberger et al.,
1992; García-Saucedo et al., 2005). Sin embargo, no hay información sobre la micropropagación
de cultivares marroquíes. Como las concentraciones y combinaciones óptimas del regulador del
crecimiento para la proliferación de brotes in vitro y el enraizamiento de la tuna pueden variar,
los protocolos sugeridos en la literatura pueden no ser adecuados para cada cultivar. Por lo
tanto, el objetivo principal de este estudio fue desarrollar un protocolo eficiente para la
propagación in vitro de cultivares marroquíes mediante el cultivo in vitro de areolas. Los
objetivos de esta investigación fueron: a) determinar la composición media y la concentración
del regulador de crecimiento capaz de inducir el brote; y b) evaluar los efectos de diferentes
auxinas en el enraizamiento de la planta.

Proc. 7th International Congress on Cactus Pear and Cochineal

Eds.: A. Nefzaoui et al.

Acta Hort. 995, ISHS 2013

MATERIALS AND METHODS

Material vegetal e iniciación del cultivo
Las plantas de cactus se recolectaron de árboles de diferentes áreas de Marruecos y se
cultivaron en la parcela del departamento de biología de la Facultad de Ciencias de la
Universidad Ibn Zohr, Agadir, Marruecos, durante junio de 2009. Los estudios de
micropropagación se realizaron con cladodios jóvenes obtenidos de esta parcela.

Los cladodios de cactus jóvenes (Fig. 1A) (de unos 5-8 cm de longitud) se cortaron en
pedazos (Fig. 1B) y la superficie se desinfectó lavando con agua corriente y blanqueador
(hipoclorito de sodio) durante 20 min. Bajo campana de flujo laminar en condiciones estériles,
los cladodios se sumergieron en etanol al 70% durante 5 minutos, seguido de inmersión en
sodium hypochlorite plus al 2% durante 25 minutos, y luego se enjuagaron cinco veces con agua
destilada estéril. Finalmente, los explantes desinfectados se cortaron en trozos de 1 cm2 cada
uno con una areola y se cultivaron en un medio MS (Murashige y Skoog, 1962), suplementado
con 50 g/L de sacarosa, 50 mg/L de fosfato monosódico, 40 mg/L de sulfato de adenina y 0.3%
de phytagel. Este medio se complementó con BA a 22,2 µM para iniciar el cultivo y obtuvo los
brotes para la fase de proliferación. El pH de este medio se ajustó a 5,7 antes de la esterilización
a 121 °C durante 20 min. Se plantaron cuatro explantes por frasco de cultivo. Los cultivos se
mantuvieron durante 6 semanas bajo luz fluorescente continua (54 µmol 𝑚−2 𝑠 −1 ) a 25 ± 1 °C.
Estas mismas condiciones de incubación se usaron en todos los experimentos posteriores.
Disparar la multiplicación
Los brotes desarrollados en la fase de iniciación (2 cm de longitud) se separaron y se
cultivaron en el medio de proliferación que contenía sales de MS suplementadas con diferentes
concentraciones de BA (0.1, 0.5, 1 o 5 mg/L) o cinetina (0.1, 0.5, 1 o 5 mg/L) o en combinación
con NAA a 0.5 mg/L. Estos tratamientos se seleccionaron de acuerdo con las referencias
consultadas y los resultados de experimentos anteriores (Martínez-Váquez y Rubluo, 1989;
Infante, 1992; De Medeiros et al., 2006; Khalafalla et al., 2007). Utilizamos 20 explantes de cada
tipo por tratamiento (n = 20) y después de 6 semanas de cultivo, se determinó el número de
brotes producidos en cada explante. Estos experimentos se realizaron dos o tres veces
independientes para cada tratamiento.

Enraizamiento de brotes
Para estimular el desarrollo de la raíz, se separaron los brotes alargados (de 2 a 6 cm) y
se cultivaron en los medios de enraizamiento. La técnica de enraizamiento consistió en exponer
esos brotes a diferentes tratamientos: (1) MS/2, 30 g/L de sacarosa, 0.3% de phytagel, sin
reguladores de crecimiento; (2) MS/2, 30 g/L de sacarosa, 0.3% de phytagel, con 0.5 mg/L de IBA;
(3) MS/2, 30 g/L de sacarosa, 0.3% de phytagel, con 0.5 mg/L de IAA; (4) MS/2, 30 g/L de
sacarosa, 0.3% de phytagel, con 0.5 mg/L de NAA. Estos cuatro experimentos se repitieron tres
veces para confirmar los resultados. Para este experimento de enraizamiento, se usaron 20
brotes por tratamiento y se evaluó el número de raíces desarrolladas por explante en cada
tratamiento 4 semanas después de iniciar el experimento.

Aclimatación de plantas
Las plántulas enraizadas se transfirieron al suelo en autoclave y se aclimataron con
cubiertas de plástico durante 4 semanas para evitar la desecación y permitir la aclimatación, y
luego se transfirieron al invernadero. Los porcentajes de supervivencia se determinaron 12
semanas después del trasplante.

Análisis estadístico
El análisis de varianza (ANOVA) se realizó para evaluar la importancia de la diferencia entre los
tratamientos. Cuando se encontraron diferencias significativas (P≤0.05), se calculó una prueba
de comparación múltiple de medias (prueba de Duncan).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los efectos de las concentraciones de cinetina, BA y NAA en la multiplicación de brotes
se presentan en la Tabla 1. El mayor número de brotes por explante se obtuvo con BA, con 1 y 5
mg / L, o combinado con 0.5 mg / L de NAA. La interacción de las concentraciones de BA y NAA
no fue significativa en la proliferación de brotes. Esto es consistente con los hallazgos de
Khalafalla et al. (2007), quienes informaron que NAA a 0.5 mg / L en combinación con diferentes
concentraciones de BA no afectó significativamente el número de brotes por explante en tuna.
Aunque, el número de brotes por explantes aumentó con la concentración de BA, esto también
resultó en un aumento del tamaño de los brotes producidos.

Se han adoptado varias citoquininas tanto para el inicio del cultivo como para la
proliferación de brotes de la tuna (Mohamed-Yasseen et al., 1995; Llamoca-Zarate et al., 1999;
Juárez y Passera, 2002; Khalafalla et al., 2007). Estos resultados son consistentes con los de De
Medeiros et al. (2006), Khalafalla et al. (2007) y Estrada-Luna et al. (2008), quienes encontraron
que el BA era más efectivo que la cinetina y el 2iP (6-dimetilaminopurina) para inducir la
multiplicación de brotes del cultivo in vitro de areolas de la tuna.

Formación de la raíz
Para la formación de raíces, los brotes alargados se transfirieron a diferentes medios de
enraizamiento. La Tabla 2 muestra el efecto de diferentes auxinas en el número de raíces. En
este estudio, el 100% de los brotes regenerados se enraizaron después de 4 semanas de cultivo
en diferentes tratamientos (Fig. 1C). Esto se confirma en varias publicaciones: i) Khalafalla et al.
(2007) obtuvieron el mayor porcentaje de raíz utilizando IAA a 0.5 mg / L; ii) con 0.5 mg / L IBA o
0.5 mg / L IAA 21 especies de cactus mexicanos fueron enraizadas (Pérez-Molphe-Balch et al.,
1998); iii) se produjo un enraizamiento satisfactorio para tres genotipos de Opuntia tratados con
0.5 mg / L de IBA (García-Saucedo et al., 2005). Según la literatura, se favorece el enraizamiento
de varias especies de Opuntia en presencia (Hartmann et al., 1997) o ausencia de auxinas en los
medios de cultivo. Se obtuvo el mayor número (21.05) de raíces por plántula enraizada usando
IBA a 0.5 mg / L (Escobar-Araya et al., 1986; Estrada-Luna, 1988; Mohamed-Yasseen et al., 1995;
García-Saucedo et al., 2005)

Aclimatación de plantas regeneradas in vitro

En el presente estudio, las plantas enraizadas in vitro se transfirieron a una mezcla para
macetas y se aclimataron inicialmente durante 4 semanas en la sala de cultivo y luego en
invernadero durante 8 semanas (Fig. 1D). La frecuencia de supervivencia se mejoró al 100% y las
plántulas mostraron un crecimiento saludable y activo. Este resultado es similar a los informes
de otras especies de nopal micropropagado (Ault y Blackmon, 1987; Estrada-Luna, 1988; Clayton
et al., 1990; Mohamed-Yasseen et al., 1995; Juárez y Passera, 2002). Hartmann y col. (1997)
sugieren que después de la micropropagación, este grupo de plantas tiene raíces funcionales,
cutícula adecuada y la capacidad de controlar el funcionamiento de los estomas que reduce el
shock del trasplante producido por la pérdida excesiva de agua durante la aclimatación, que es
importante para mantener un crecimiento continuo.

CONCLUSIÓN
En conclusión, la metodología descrita en el presente estudio es muy adecuada para la
micropropagación de cactus. Los protocolos existentes para esta especie no se llevaron a cabo
en cultivares marroquíes. Se desarrolló un sistema eficiente de proliferación de brotes in vitro a
partir de areolas de cultivar marroquí de cactus. Los resultados obtenidos muestran que se
obtuvo una proliferación óptima de brotes cuando los explantes se cultivaron en medio MS
suplementado con 5 mg / L de BA. Se obtuvo una tasa de proliferación de 15 brotes por explante
de brote cada 6 semanas. El 100% de estos micro brotes regeneraron raíces después de 4
semanas. Las plantas micropropagadas están siendo evaluadas por su fidelidad clonal y su
comportamiento agronómico.

Literature Cited
Ault, J.R. and Blackmon, W.J. 1987. In vitro propagation of Ferocactus acanthodes
(Cactaceae). HortScience 22:126-127.
Boujghagh, M. and Chajia, L. 2001. Le cactus: outil de gestion de la sécheresse dans le sud
ouest marocain. Terre et vie. N° 52. Nov. Déc. 2001, 1-7.

Bravo-Hollis, H. and Sanchez-Mejorada, H. 1991. Las Cactaceas de Mexico. Vol. 3.

Universidad Nacional Autonoma de Mkxico, 643p.

Clayton, P.W., Hubstenberger, J.F. and Phillips, G.C. 1990. Micropropagation of members of
the Cactaceae subtribe Cactinae. Journal of the American Society for Horticultural Science
115(2):337-343.

De Medeiros, L.A., De Ribeiro, R.C.S., Gallo, L.A., De Oliveira, E.T. and Dematte M.E.S.P. 2006.
In vitro propagation of Notocactus magnificus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 84:165-
169.

Escobar-Araya, H.A., Villalobos, A.V.M. and Villegas, M.A. 1986. Opuntia micropropagation by
axillary proliferation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 7:269-277.

Estrada-Luna, A.A. 1988. Producción de brotes e injertación in vitro de seis especies de nopal
(Opuntia spp.) originarias del Altiplano Potosino-Zacatecano. Tesis de MC.

Colegio de Postgraduados, Montecillo, Edo, De México, México, 160p.

Estrada-Luna, A.A., Martínez-Hernández, J.J., Esthela Torres-Torres, M. and ChabléMoreno, F.
2008. In vitro micropropagation of the ornamental prickly pear cactus Opuntia lanigera
Salm-Dyck and effects of sprayed GA3 after transplantation to ex vitro conditions. Scientia
Horticulturae 117:378-385.

García-Saucedo, P., Valdez-Morales, M., Valverde, M.E., Cruz-Hernández, A. and Paredes-

López, O. 2005. Plant regeneration of three Opuntia genotypes used as human food. Plant
Cell, Tissue and Organ Culture 80:215-219.

Hartmann, H.T., Kester, D.E., Davies Jr., F.T. and Geneve, R.L. 1997. Plant
PropagationPrinciples and Practices, 6th ed. Prentice-Hall, Englewood Cliffs, NJ, USA.

Hubstenberger, J.F., Clayton, P.W. and Phillips, G.C. 1992. Micropropagation of cacti
(Cactaceae). In: Biotechnology in Agriculture and Forestry. High tech and micropropagation
IV. Vol. 20. Y.P.S. Bajaj (ed.), Springer-Verlag, Berlin International Horticultural Congress.
p.49-68.

Infante, R. 1992. In vitro axillary shoot proliferation and somatic embryogenesis of yellow
pitaya Mediocactus coccineus (Salm-Dyck). Plant Cell Tissue Organ Cult. 31:155-159.

Inglese, P., Basile, F. and Schirra, M. 2002. Cactus pear fruit production. p.163-183. In: P.S.
Nobel (ed.), Cacti: Biology and Uses, University of California Press, California, USA.

Johnson, J.L. and Emino, E.R. 1979. Tissue culture propagation in the cactaceae. Cactus &
Succulent Journal (US) 51:275-277.

Juárez, M.A. and Passera, C.B. 2002. In vitro propagation of Opuntia ellisiana Griff. and
acclimatization to field conditions. Biocell. 26(3):319-324.

Khalafalla, M.M., Abdellatef, E., Mohameed Ahmed, M.M. and Osman, M.G. 2007.
Micropropagation of cactus (Opuntia ficus-indica) as strategic tool to combat desertification
in arid and semi arid regions. Int. J. Sustain. Crop Prod. 2(4):1-8.
 Llamoca-Zárate, R.M., Aguiar, L.F., Landsmann, J. and Campos, F.A.P. 1999. Whole plant
regeneration from the shoot apical meristem of Opuntia ficus-indica Mill. (Cactaceae).
Journal of Applied Botany 73:83-85.

Martínez-Váquez, O. and Rubluo, A. 1989. In vitro mass propagation of the near extinct
Mammillaria san-angelensis Sanchez-Mejorada. J. Hortic. Sci. 64:99-105.
Mauseth, J.D. 1979. A new method for the propagation of cacti: sterile culture of axillary
buds. Cactus & Succulent Journal (US) 51:186-187.

Mizrahi, Y., Nerd, A. and Nobel, P.S. 1997. Cacti as crops. Hort. Rev. 18:291-319.
Mohamed-Yasseen, Y., Barringer, S.A., Splittstoesser, W.E. and Schnell, J. 1995. Rapid
propagation of tuna (Opuntia ficus-indica) and plant establishment in soil. Plant Cell, Tissue
and Organ Culture 42:117-119.

Pérez-Molphe-Balch, E., Pérez-Reyes, M.E., Villalobos-Amador, E., Meza-Rangel, E., Morones-

Ruiz, L.R. and Lizalde-Viramontes, H. 1998. Micropropagation of 21 species of Mexican cacti
by axillary proliferation. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 34:131-135.

Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco cultures. Physiology Plantarum 15:473-497.

Nobel, J.L. 1995. Changes in water potential and its component during shoot formation in
cacti callus. Physiol. Plant. 45:92-97.

Piga, A. 2004. Cactus pear: a fruits of nutraceutical and functional importance. Journal of the
Professional Association for Cactus Development 6:9-22.

Pimienta-Barrios, E. and Munoz-Urias, A. 1995. Domestication of Opuntia and cultivated

varieties. p.58-63. In: G. Barbera, P. Inglese and E. Pimienta-Barrios (eds.), Agroecology,
cultivation and uses of cactus pear. FAO International Technical Cooperation Network on
Cactus Pear.

Rodriguez-Felix, A. 2002. Postharvest physiology and technology of cactus pear fruits and
cactus leaves. Acta Hort. 581:191-199.

Rojas-Aréchiga, M. and Vásquez-Yanes, C. 2000. Cactus seed germination: a review. Journal

of Arid Environments 44:85-104.

Russell, C.E. and Felker, P. 1987. The prickly-pears (Opuntia spp., Cactaceae): a source of
human and animal food in semiarid regions. Economic Botany 41(3):433-445.

Smith, R.H., Burdick, J.P., Anthony, J. and Reilley, A.A. 1991. In vitro propagation of
Coryphantha macromeris. HortScience 26(3):315.

Tablas

Tabla 1. Efectos de la benciladenina (BA) y la cinetina (Kin) solos o en combinación con ácido
1-naftalenacético (NAA) sobre el número y la duración de los brotes durante los subcultivos
de proliferación de Opuntia ficus-indica en medio MS después de 6 semanas de cultivo.

Regulador de crecimiento Número de brotes Largo de los

(mg/L) por explante brotes (mm)
BA Kin NAA
 0.1 0 0 2.7a 9.39e
0.5 0 0 3.65ab 5.02c
1 0 0 6.05ef 4.21b
5 0 0 15.25j 4.1b
0 0.1 0 3.65ab 6.37d
0 0.5 0 4.9cd 5.07c
0 1 0 8.25h 3.97b
0 5 0 3.2ab 4.89c
0.1 0 0.5 3ab 8.87e
0.5 0 0.5 4.1bc 5.84d
1 0 0.5 6.5fg 3.98b
5 0 0.5 13.5i 3.29a
0 0.1 0.5 3.9bc 6.2d
0 0.5 0.5 5.35de 4.91c
0 1 0.5 7.25g 3.38a
0 5 0.5 3.1ab 4.01b
Las medias con la misma letra (s) en la misma columna no son significativamente diferentes de acuerdo
con la Prueba de Duncan (P = 0.05).

Tabla 2. Efecto de las auxinas en el enraizamiento de brotes in vitro derivados de Opuntia ficus-
indica después de seis semanas de cultivo en medio MS.

Tratamiento % de enraizamiento Número de raíces por brote

Free hormone 100.0 4.95a
IBA 0.5 mg/L 100.0 21.05d
IAA 0.5 mg/L 100.0 16.2c
NAA 0.5 mg/L 100.0 9.3b
Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes según la prueba de Duncan (P
= 0.05).
Figuras

Fig. 1. Micropropagación in vitro de cactus (Opuntia ficus-indica) (A-D). A: Cladodio de cactus

joven. B: explantes de Cladodios que contienen una areola. C: inducción de la raíz en la MS
suplementada con IBA a 0,5 mg/L. D: aclimatación de la planta en la cámara de crecimiento.