Inducción de callos y regeneración de papa a partir del cultivo de puntas de brotes

Umme Zohora Laboney, Gokul Chandra Biswas, Mohammad Abdullah-Al-Shoeb and

Md.Abunasar Miah

Se realizaron dos experimentos de laboratorio con papa cv. Granula para investigar la
capacidad de inducción de callos y la capacidad de regeneración a partir de explantes de
brotes y para estudiar la influencia de BAP, IAA y GA 3 en la regeneración de plántulas a
partir de callos. En el primer experimento, se utilizó medio MS con 2,0 mg/l de 2,4-D para
identificar la mayor formación de callos (95,00 %) en un número mínimo de días (10,00),
número de callos/cultivo (4,75) y peso de callo (0,074 g). Sin embargo, el segundo
experimento se realizó tanto para la formación de brotes como de raíces. En caso de
regeneración de brotes, la combinación de 1,0 mg/l de BAP y 0,5 mg/l de GA 3 mostró el
mayor número de brotes por explante (4,67), inicio de brotes (93,33 %) en los días
requeridos (15,00), número de hojas por plántula ( 3,67) y brote más largo (5,33 cm). Por
otro lado, la combinación de 1,0 mg/l IAA y 1,0 mg/l GA3 mostró el mayor número de
raíces por brote (3,33) en un número mínimo de días (12,33) y raíz más larga (6,33 y 7,33
cm) después de 20 y 28 días, respectivamente. Por lo tanto, se concluyó que la
concentración hormonal para efectuar la formación y regeneración de callos. Se han
utilizado intentos adicionales para la producción de una variedad de patata libre de
enfermedades a partir de este estudio.

Palabras clave: Callo, medio de cultivo, in vitro, regeneración, apices

INTRODUCCIÓN
La papa (Solanum tuberosum L.) es el cuarto cultivo alimentario más cultivado después del
trigo, el arroz y el maíz (Moeinil et al., 2011). Es un nativo de América del Sur; en el siglo
XVI los exploradores españoles lo introdujeron en Europa y más tarde se convirtió en un
importante cultivo alimentario del mundo (Khoso, 1988). Es un cultivo vegetal
económicamente importante en Bangladesh. La papa es el cuarto cultivo más importante
por volumen de producción; es de alto rendimiento, tiene un alto valor nutritivo y da altos
rendimientos a los agricultores. Además, la papa se considera una buena fuente de
antioxidantes (Chen et al., 2007).
El mejoramiento tradicional de la papa es muy difícil debido a su capacidad de propagación
vegetativa, heterocigosidad y tetraploididad (Solmon-Blackburn y Baker, 2001). Por otro
lado la productividad de la papa es muy baja. Hay varias razones para esta baja
productividad, la principal es la falta de disponibilidad de semillas certificadas y libres de
enfermedades de variedades de papa de alto rendimiento resistentes a plagas y
enfermedades para diferentes zonas ecológicas. Las pérdidas de rendimiento son
directamente proporcionales a la intensidad de la infección por el virus. El rendimiento por
hectárea podría duplicarse fácilmente mediante el uso de semillas sanas y sanas (F.C.
Bawden y B. Kassanis, 1965). La biotecnología podría usarse para resolver este problema y
generar grandes beneficios para los productores de papa.
La regeneración de plantas a partir del cultivo de células y tejidos representa un
componente esencial de la biotecnología que se utiliza para mejorar no solo los cultivares
existentes, sino también para la generación de nuevas plantas en un tiempo
comparativamente más corto que el mejoramiento convencional (GAE, Khadiga, SM
Rasheid y MM Khalafalla ,2009). El cultivo de tejidos puede causar que la variación sea
problemática o útil para los horticultores y fitomejoradores, y la frecuencia de regeneración
de plantas adventicias o cultivo de callos a largo plazo es muy alta (Kaeppler, S. M., H. F.
Kaepler y Y. Rhee, 2000). Varios investigadores estudiaron el progreso que se ha hecho en
la inducción de callos y la regeneración de plantas de papa (GAE, Khadiga, SM Rasheid y
MM Khalafalla, 2009; Shirin, F., M. Hossain, MF Kabir, M. Roy y SR Sarker, 2007). ,
Khalafalla, M., GA Khadiga y SM Rasheid, 2010, Shahab-ud-din I., N. Sultan, MA Kakar,
A. Yousafzai, IF, A. Sattar, F. Ahmmad, M. Ibrahim, M. Hassanullah y B. Arif, 2011). Los
sistemas de cultivo de tejidos son capaces de crear variabilidad genética y producir plantas
con caracteres novedosos. Esto sugiere que la aplicación de cultivo de tejidos podría ser
una alternativa viable en el desarrollo de nuevos cultivares además de generar material de
plantación libre de virus y mejorar las segregaciones heterocigóticas. Los objetivos de este
estudio fueron investigar la eficiencia de la inducción de callos y la regeneración de plantas
de papa a partir del cultivo de puntas apicales y también detectar las diferentes
concentraciones hormonales en la inducción de callos (2, 4-D) así como la regeneración de
plantas (BAP, IAA y GA3) de callos embriogénicos.

MATERIALES Y MÉTODOS
El trabajo de investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología del
Departamento de Biotecnología de la Universidad Agrícola de Bangladesh, Mymensingh,
Bangladesh.
Materiales vegetales
Se recolectaron tubérculos de papa de la variedad Granula del Instituto de Investigación
Agrícola de Bangladesh (BARI), Joydebpur, Gazipur. Se brotaron tubérculos de papa libres
de enfermedades en condiciones de oscuridad a temperatura ambiente en el laboratorio. Los
tubérculos brotados luego se inocularon en medio MS para crecer como microplantas. Se
utilizaron microplantas cultivadas in vitro de un mes de edad como fuente de explantes. En
condiciones asépticas, se sacaron microplantas de un mes de edad del tubo de ensayo y se
colocaron en una placa de Petri esterilizada. Las puntas de los brotes se cortaron en trozos
pequeños y se esterilizaron cuidadosamente para liberar los microbios. En primer lugar, los
explantes se lavaron minuciosamente con agua destilada 3 veces. Luego, dentro del
gabinete de flujo de aire laminar, los explantes se lavaron con etanol al 70 % para la
esterilización de la superficie, seguido del tratamiento con HgCl 2 al 0,1 % además de unas
gotas de Tween-20 como surfactante para la esterilización de la superficie interna.
Finalmente, los explantes se lavaron con agua destilada estéril varias veces para eliminar
todos los agentes esterilizantes y luego, en la cabina de flujo de aire laminar, los explantes
de la punta de los brotes se cortaron en pequeños trozos de entre 0,1 y 1,0 mm con un
bisturí estéril. A continuación, los explantes se inocularon asépticamente en el medio.

Preparación de medios
La composición del medio MS (Murashige T y Skoog F, 1962) se ajustó mediante la
adición de soluciones madre que contienen macronutrientes, micronutrientes, suplementos
orgánicos y vitaminas. Se utilizaron diferentes concentraciones de 2, 4-D para la inducción
de callos. Para la regeneración de plántulas a partir de callos se utilizaron diferentes
concentraciones de BAP y GA3 para brotación así como IAA y GA3 para enraizamiento con
el medio MS. El pH se ajustó a 5,8–6,0 con 1 mol L-1 de NaOH o HCl para medios MS.
Para la solidificación de los medios, se añadió agar al 0,7 % (p/v) a los medios MS antes de
esterilizarlos en autoclave a 121 ºC durante 15 min.

Cultivo de explantes
Se han realizado intentos para la inducción de la organogénesis utilizando explantes de
puntas de brotes en medio MS suplementado con 2, 4-D (0,0, 0,2, 2,0 mg/l). Se inocularon
directamente de cuatro a cinco explantes a cada vial de vidrio que contenía 20 ml de medio
MS suplementado con diferentes concentraciones de hormonas según los tratamientos, los
viales se taparon y sellaron con corcho. Los cultivos preparados se mantuvieron en una sala
de crecimiento en los estantes. Todos los cultivos se mantuvieron a 25±2°C iluminados con
tubos fluorescentes de 1,83 m (4,83 ft C84 TDFL/Phillips). Estos tubos dieron un amplio
espectro de luz, especialmente en la longitud de onda roja. La habitación se iluminó 16 h
diarias con una intensidad de luz de 1500 lux.

Subcultivo del callo para regeneración de brotes

Para la iniciación de brotes, los callos de tamaño conveniente alcanzados 28 días después
de la inoculación de los explantes se colocaron para el subcultivo en placas de petri que
contenían medio MS suplementado con diferentes concentraciones de BAP (0,0, 0,5, 1,0 y
1,5 mg/l) y GA3 (0,0, 0,5, 1.0 y 1.5 mg/l) manteniendo condiciones esterilizadas en Cabina
de Flujo de Aire Laminar. A continuación, los viales subcultivados se incubaron a 22 ± 2
°C con un fotoperíodo de 16 h.

Subcultivo del brote de regeneración para la iniciación de raíces.

Los callos subcultivados contenían brotes proliferados y diferenciados. Cuando estos brotes
crecieron alrededor de 2-5 cm de largo, se rescataron asépticamente del vial de cultivo y se
separaron entre sí y se cultivaron en otros viales con medio de inducción de raíces recién
preparado con IAA (0.0, 1.0 y 2.0 mg/l) y GA3 (0.0 , 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 y 5,0 mg/l). Los
viales que contenían plántulas se incubaron bajo luz continua. Las observaciones previstas
día a día se registraron en respuesta.

Endurecimiento y Aclimatación
Cuando las plántulas regeneradas tenían 30 días de edad con brotes y raíces bien
desarrollados, se extrajeron del recipiente de cultivo con la ayuda de unas pinzas finas. El
medio adherido a las raíces se lavó cuidadosamente con agua del grifo. Las plántulas
regeneradas se establecieron con éxito ex vitro en una mezcla de arena, suelo y estiércol de
vaca (1:2:1). Para reducir el impacto repentino, las macetas se mantuvieron en un ambiente
controlado en el laboratorio. Cuando las plántulas parecían ser autosostenibles, se
transfirieron al campo.

RECOGIDA Y ANÁLISIS DE DATOS

El experimento se planteó en el Diseño Completamente Aleatorizado (CRD) con 4
repeticiones. Los datos registrados anteriormente se sometieron a análisis según el diseño
utilizado. Se realizó un análisis de varianza para los diferentes registros anteriores y se
compararon las medias mediante la prueba de rango múltiple de Duncan (DMRT). La
observación visual de los cultivos se realizó cada semana y los datos se registraron después
de 2 semanas. Se utilizaron tres repeticiones para todos los tratamientos. En la etapa final,
todos los datos se analizaron críticamente y se calculó la media aritmética de todos los
tratamientos para cada repetición para encontrar el mejor tratamiento:

Nº de explantes que formaroncallos

% de callo formado = x 100
Nº total de explantes inoculados

Nº de cultivoscallos que muestran brotess

% de formación de brotes  x 100
Nº total de callos inoculados

RESULTADOS
El experimento se llevó a cabo para evaluar el desempeño de la variedad de papa Granula
en la formación de callos in vitro con las características asociadas, y la formación de brotes
y raíces con las características fenotípicas.

Inducción y subcultivo de callos

Los callos profundos se obtuvieron del medio MS (láminas 1a y 1b) y se complementaron
con varias concentraciones de 2,4-D. El porcentaje de iniciación de callos había mostrado
diferencias significativas entre las diferentes concentraciones de 2,4-D utilizadas en los
medios de cultivo. No se produjo formación de callos en el tratamiento de control. La
concentración de 2,4-D 0,2 mg/l había tomado significativamente los días máximos (11,55)
mientras que en cambio 2,0 mg/l había tomado los días mínimos (10,00). El mayor número
de callos/cultivo (4.750) se observó en la concentración de 2,0 mg/l 2,4-D. El efecto de
diferentes concentraciones de 2,4-D sobre el peso de los callos mostró diferencias
significativas. 2,4-D a 2,0 mg/l tuvo el mayor peso de callo (0,074 g). El menor peso de
callo (0,049g) se encontró para 0,2 mg/l 2, 4-D (Cuadro 1).

Efecto de BAP y GA3 en la regeneración in vitro de brotes de papa

Los efectos combinados entre diferentes concentraciones de BAP y GA3 han mostrado
diferencias significativas en una cantidad de brotes/explantes, porcentaje de iniciación de
brotes, días requeridos para la iniciación de brotes, número de hojas/plántulas y longitud de
brotes.
El número máximo de brotes (4,67) se produjo con una concentración de 1,0 mg/l de BAP
y 0,5 mg/l de GA3, seguida de 1,0 mg/l de BAP y 1,0 mg/l de GA3 (4,33). En contraste, los
medios MS sin BAP y 0,5 mg/l de GA3 produjeron el número mínimo de brotes/explantes
(0,67) (Cuadro 2).
El mayor porcentaje de brotes (93,33%) se observó con la combinación de 1,0 mg/l BAP +
0,5 mg/l GA3 seguida de 1,0 mg/l BAP y 1,0 mg/l GA3 (86,67). En cambio, el porcentaje
más bajo (13,33%) se presentó sin BAP+0,5 mg/l de GA3 (tabla 2).
El máximo de días (21,00) requeridos para el inicio del brote se encontró para 0,0 mg/l
BAP + 0,5 mg/l GA3 seguido de 19 días para 0,0 mg/l BAP + 1,0 mg/lGA3 y 18,33 días
para 1,5 mg/l BAP + 1,5 mg/lGA3. Por el contrario, el número mínimo de días (15,00) que
se requirió para el inicio de los brotes fue de 1,0 mg/l de BAP + 0,0 mg/l de GA3 (Tabla 2
y Lámina 1c).

El mayor número de hojas/plántula (3,67) lo produjo la combinación de 1,0 mg/l BAP +0,5
mg/l GA3 seguido de 1,0 mg/l BAP +1,0 mg/l GA3 (3,33), mientras que el menor número
de hojas (1.667) se produjo con 0.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l GA3 (Cuadro 2 y Lámina 1d).
La mayor longitud de brote (5,33 cm) se produjo con la combinación de 1,0 mg/l BAP +
0,5 mg/l GA3 seguida de 1,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l GA3 (5,00 cm), mientras que la menor
longitud de brote (1,67 cm) se produjo con 0,0 mg/l de BAP + 0,5 mg/l de GA3 (Tabla 2 y
Láminas 1e y 1f).

Efecto de IAA y GA3 en la regeneración in vitro de raíces de papa

Los efectos combinados entre las diferentes concentraciones de IAA y GA3 mostraron
diferencias significativas en el número de raíces/vástago, los días necesarios para la
iniciación de la raíz y la longitud de la raíz después de 20 días.
El mayor número de raíces/vástago (3,33) se observó en 1,0 mg/lIAA+1,0 mg/l GA3
seguido de 0,0 mg/lIAA+3,0mg/l GA3 (2,33), mientras que el menor número de raíces
(0,67) se observó con la combinación de 0,0 mg/l IAA + 1,0 mg/l GA3 y 2,0 mg/l IAA +
5,0 mg/l GA3 (Tabla 3). El número máximo de días (18,67) se requirió para la iniciación de
raíces desde la punta del brote con la combinación de 2,0 mg/l IAA y 5,0 mg/l GA3,
seguida de 0,0 mg/lIAA+3,0 mg/l GA3 (18,33), mientras que el menor número de días
(12,33) fue con la combinación de tratamiento de 0,0 mg/lIAA+1,0 mg/l GA3 (Cuadro 3).
La mayor longitud (6,33 y 7,33 cm) de raíz se observó en los tratamientos con la
combinación de 1,0 mg/l IAA + 1,0 mg/l de GA3 a los 20 y 28 días después del inicio,
respectivamente. El más bajo (3,67 y 4,67 cm) se observó con la combinación de
tratamientos de 0,0 mg/l IAA + 1,0 mg/l GA3 después de 20 y 28 días desde el inicio
respectivamente (Tabla 3 y Placa 1g y 1h).

Placa 1 Inducción de callos y regeneración de papa a saber, (1a) callos después de 10 días
de cultivo a 2,0 mg/l de 2, 4-D, y (1b) callos después de 12 días de cultivo a 0,2 mg/l de
2,4- D, (1c) iniciación de brotes a 0,0 mg/l BAP + 0,5 GA 3 después de 21 días, (1d) mayor
número de hojas a 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l GA 3 después de 28 días, (1e) mayor longitud de
brotes a 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l GA3 después de 27 días, (1f) mayor número de hojas a
1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l GA3, (1g) mayor longitud de raíz (cm) a 0,0 mg/l l IAA + 1,0 mg/l
GA3 después de 20 días y (1h) la longitud máxima de la raíz (cm) a 1,0 mg/l IAA + 1,0
mg/l GA3 después de 28 días.

DISCUSIÓN
Para la inducción de callos, diferentes concentraciones de 2,4-D (0,2 mg/l y 2,0 mg/l)
habían mostrado un mejor porcentaje de callos (95,00%) en 2,0 mg/l 2,4-D en un número
mínimo de días (10,00) . Número máximo (4,75) de callos/cultivo en 2,0 mg/l2, 4-D. El
peso del callo también tiene un mejor rendimiento (0,074 g) en 2,0 mg/l2, 4-D. Entre todos
los parámetros no mostró ningún resultado en el tratamiento de control (sin 2, 4-D).
Muchos investigadores observaron 2, 4-D como la mejor auxina para la inducción de
callos, tan común como en monocotiledóneas e incluso en dicotiledóneas (V. S. Jaiswal y
P. Narayan, 1985). Este resultado es un acuerdo con (Sultana R. S., 2000) que utilizó 2, 4-D
para la inducción de callos del cultivar Diamante y la variedad de papa cardenal y obtuvo
un resultado similar. (N. Khatun, MA Bari, R. Islam, S. Huda, NA Siddque Rahman, MA y
MU Mullah, 2003) utilizaron 2,4-D solo para la inducción de callos, pero la concentración
de 2,4-D fue de 2,5 mg/ l
Para la regeneración, se observó el número máximo (3,75) de brotes/explantes y la mayor
iniciación de brotes (75,0%) en un número de días (15,50) en 1,0 mg/l de BAP. BAP a 1,0
mg/l también mostró el número máximo (2,92) de hojas/plántula y el brote más largo (4,42
cm). En el tratamiento control (sin BAP), tanto el mayor número (1,08) como el inicio
(21,67%) de brotes/explantes se encontraron en 14,42 días. El efecto principal de GA3
había mostrado un mejor rendimiento a 1,0 mg/l. El número (3,00) de brotes/explantes y el
inicio de brotes (60,00%) se mostraron en los días 16,50. Número máximo (2,00) de
brotes/explantes y el brote más largo (3,58 cm) también se encontraron en 1,0 mg/lGA3. En
el caso del efecto de interacción de BAP y GA3, todos los parámetros para la regeneración
de brotes mostraron diferencias significativas. Número máximo (4,67) de brotes/explantes,
el mayor porcentaje de brotes (93,33%), el mayor número (3,67) de hojas/plántula, el brote
más largo (5,33 cm) se observaron con 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l GA3 dentro de un número
mínimo de días (15.00 días) para el inicio del brote. Estos resultados son similares con
(Resende R. D. O. y Paiva M, 1986). Los días máximos (21,00) requeridos en 0,0 mg/l
BAP + 0,5 mg/lGA3. Se requirió un número mínimo de días (15,00) para la iniciación de
brotes en 1,0 mg/l BAP + 0,0 mg/lGA3. Este resultado es confirmado anteriormente por (A.
Martel y E. Carcia, 1992).
Por otro lado el enraizamiento se realizó por efecto de diferentes concentraciones de IAA.
Número máximo (2,22) de raíces/vástago en un número de días (14,78), la raíz más larga
(5,22 y 6,62 cm) se observó con 1,0 mg/l de IAA después de 20 y 28 DAI, respectivamente.
El principal efecto de GA3, número máximo de raíces/vástago (2,33) en un número de días
(14,89), la raíz más larga después de 20 DAI (5,33 cm) y después de 28 DAI (6,33 cm) se
observó con 1,0 mg/lGA3. El efecto combinado de IAA y GA3, número máximo (3,33) de
raíces/vástago en un número mínimo de días (12,33), la raíz más larga a los 20 DAI (6,33
cm) y a los 28 DAI (7,33 cm) se observó con 1,0 mg /l IAA + 1,0 mg/lGA3. El presente
estudio es similar con (J. M. Amezqueta, C. A. Mingo y E., 1989) quienes también
observaron que las plantas más regeneradas y las tasas de crecimiento más rápidas de los
explantes de punta de brote con IAA y GA3.

CONCLUSIÓN
De este estudio se puede concluir que el medio MS con 2,0 mg/l 2, 4-D es una buena
opción para estudiar la callogénesis en papa variedad Granula. Debido a la poliploidía, la
reproducción sexual en la papa es difícil y exige una alternativa para introducir variaciones
en los cultivares de papa existentes. El cultivo de callos es una de esas opciones. Del
resultado anterior, se puede concluir que la mejor combinación hormonal para explantes de
puntas apicales de la variedad Granula es 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l GA3 y 1,0 mg/l IAA +
1,0 mg/lGA3. El protocolo desarrollado a partir del presente experimento puede ser útil
para la producción a gran escala de materiales de siembra de patata sanos y libres de
enfermedades comercialmente. Además, los hallazgos del estudio pueden usarse para la
transformación genética para el mejoramiento de la papa utilizando un enfoque
biotecnológico.