INTRODUCCIN

El trmino inmovilizacin de clulas y enzimas se refiere a clulas y enzimas

fsicamente confinadas o localizadas en una cierta regin definida en el espacio
reteniendo sus propiedades y actividades catalticas. Asimismo, dependiendo del
tipo de inmovilizacin tanto las clulas como las enzimas pueden ser inmovilizadas
de forma permanente o temporal para ser utilizadas repetida y continuamente en
diversos
proceso
qumicos.
Por razones tcnicas y econmicas la mayora de los procesos qumicos catalizados
por enzimas o llevados a cabo por clulas requieren su reutilizacin o el continuo
uso de biocatalizadores durante largos periodos de tiempo. Bajo esta perspectiva, la
inmovilizacin debera ser definida como una tcnica capaz de reutilizar o dar uso
continuo de biocatalizadores y clulas. Por lo tanto, la sencillez y el bajo costo de los
mtodos de inmovilizacin juegan un papel fundamental en la seleccin de
protocolos de inmovilizacin. Es por ello que por medio de la inmovilizacin es
posible no solo controlar la ubicacin de las clulas o las enzimas sino tambin
modificar
sus
propiedades
selectivamente.
En este artculo
inmovilizacin de
inmovilizacin y
inmovilizadas. De
soportes
o

se presenta una breve revisin del estado del arte de la

clulas y enzimas, haciendo nfasis en los distintos mtodos de
cmo inciden en las propiedades de las enzimas y clulas
igual forma, se discuten aspectos relacionados con la seleccin de
matrices
durante
el
proceso
de
inmovilizacin.

1.
INMOVILIZACIN
DE
CLULAS
La investigacin sobre inmovilizacin de organismos unicelulares ha generado gran
inters en la comunidad cientfica, debido a sus grandes ventajas tcnicas y
econmicas respecto a la fermentacin tradicional. Entre las principales ventajas
que presentan los sistemas biotecnolgicos que utilizan clulas inmovilizadas se
encuentra su facilidad para el manejo de una mayor densidad celular comparado
con los procesos tradicionales, un mejor control en sistemas continuos y la posible
recuperacin de la biomasa para su posterior reutilizacin. En general, los
materiales para inmovilizar clulas deben cumplir importantes requisitos como: ser
grado alimenticio (segn sea el caso), bajo costo, disponibilidad, no degradables y
aptos para condiciones de pH y temperatura bajas (Bakoyianis et al., 1992 y 1996;
Bardi y Koutinas, 1994; Fumi et al., 1987; Shimobayashi y Tominaga, 1986). Los
mtodos de inmovilizacin de clulas ms usados son la autofloculacin (Verstrepen
y Klis, 2006; Stewart y Russel, 1986), la adsorcin sobre soportes (Bardi et al., 1996)
y
la
incorporacin
de
levaduras
en
matrices
slidas.
La floculacin es un proceso que muchas cepas sufren de manera natural (Stewart y
Russel, 1986). La adsorcin consiste en la adhesin de las levaduras a la superficie
externa de un soporte como es el caso del gluten (Stewart y Russel, 1986) o de la
DEAE-Celulosa (Lommi y Ahvenaimen, 1990). La incorporacin de clulas a matrices
slidas se realiza por el atrapamiento de las mismas en el seno de un material
polimrico. Las matrices ms adecuadas son polmeros naturales como el alginato,
el carragenato y el agar ya que polimerizan en condiciones muy suaves aunque
tambin se pueden usar matrices sintticas como poliacrilamida y poliuretano
(Groboillot
et
al.,
1994).
El atrapamiento de levaduras en matrices slidas puede realizarse por difusin de
las clulas en matrices slidas sintetizadas previamente (Baron y Willaert, 2004) o
por formacin de las matrices alrededor de las clulas (Ramakrishna y Pakasham,
1999). Este mtodo de inmovilizacin permite conseguir grandes concentraciones
de biomasa (Stewart y Russel, 1986) con el uso de reactores fluidizados (Verbelen et
al., 2006). Adems se pueden inmovilizar en matrices independientes clulas que
no podran coexistir en contacto directo debido al efecto killer(Prez e et al.,
2001). No obstante, al igual que los otros mtodos de inmovilizacin presenta

desventajas. Las ms importantes son los posibles problemas de difusin de

nutrientes y productos a travs de la matriz porosa y la pobre resistencia mecnica
de
los
soportes
slidos
(Verbelen
et
al.,
2006).
La inmovilizacin de levaduras en perlas de alginato y poliacrilamida se ha utilizado
con xito en la fermentacin de vino blanco y en la produccin de etanol (Cachon y
Divies, 2001). Debido a cambios en la composicin de las clulas por interaccin
con el soporte de alginato, estos catalizadores se vuelven ms activos y se observa
que la fermentacin ocurre a mayor velocidad respecto a los casos en los que se
emplean levaduras libres (Galazzo y Bailey, 1990). Otra ventaja importante de estos
sistemas inmovilizados es que el soporte protege la levadura de la accin de
inhibidores, metales pesados, fenoles y temperaturas extremas. Adems, a
diferencia de los flculos de biomasa, estos slidos al ser ms sencillos de manejar,
permiten un mejor control de la actividad cataltica en reactores de tipo lote y
continuos.
La implementacin de sistemas con levaduras inmovilizadas ha sido de especial
inters para el rea de los vinos espumosos. La forma tradicional de preparacin de
estos vinos implica el uso de levaduras libres y la posterior eliminacin de stas por
medio del dgorgement, esto es mediante congelacin (-25C) del cuello de la
botella donde las levaduras se acumulan por sedimentacin durante el remuage.
Este proceso lento y costoso puede ser sustituido mediante el uso de levaduras
inmovilizadas en perlas de alginato sin que la cintica del proceso se vea afectada
consiguindose las mismas propiedades organolpticas que los vinos producidos de
manera tradicional (Yokotsuka et al., 1997). En el ao 2001 el Institute
Oenologique des Vins de Champange (IOC) report la fabricacin de tres millones
de botellas mediante el uso de este tipo de tecnologa (Divies y Chacon, 2005).
Tambin se han reportado estudios en los que se usan estos dispositivos para la
produccin de sidra espumosa y vinos de pia (Divies y Deschamps, 1986).
Cabe destacar que combinando esta tecnologa con el uso de reactores de alta
presin y reactores de flujo continuo ha sido posible la produccin a gran escala de
vinos espumosos con composiciones y propiedades sensoriales similares a los
fabricados tradicionalmente en botellas con levaduras libres (Iconomopoulou et al.,
2002) En el campo de los vinos espumosos tambin se ha implementado el uso de
membranas acopladas al tapn de la botella que permiten el contacto entre el vino
y las levaduras durante la fermentacin final (Lemonnier, 1992). Esta tcnica alarga
los tiempos de fermentacin, pero ofrece la posibilidad de realizar el dgorgement
de
manera
ms
sencilla
sin
necesidad
de
enfriar
la
botella.
Otro proceso de inters en el que la inmovilizacin de clulas exhibe gran potencial
es en la fermentacin malolctica. Este proceso es esencial en la preparacin de
muchos vinos, ya que la transformacin de cido malolctico en cido lctico y
anhdrido carbnico reduce la acidez y mejora la calidad de los mostos. Esta
fermentacin es difcil de controlar mediante las tcnicas de fabricacin
tradicionales, ya que las bacterias que catalizan dicha fermentacin, principalmente
Oenococcus oeni, son especialmente sensibles a la temperatura, pH y
concentracin de SO2. En 1991, se report que el O. oeni inmovilizado en perlas de
alginato se puede adaptar fcilmente a procesos en continuo sin que se observe
prdida de actividad en procesos de fermentacin malolctica (Fleet et al., 1991).
Sin embargo, tambin se han reportado resultados en los que s se observa una
prdida importante de actividad en sistemas parecidos (Naouri et al., 1991).
Con base en lo presentado anteriormente es posible afirmar que la produccin de
vinos espumosos se ha beneficiado con el uso de tecnologas que involucran la
inmovilizacin de clulas. No obstante, es de esperar que con un mejor
entendimiento de los procesos de fermentacin y la fisiologa de los
microorganismos inmovilizados, sea posible implementar esta tecnologa a otros
procesos
de
produccin.

1.1

Problemas

con

la

inmovilizacin

de

clulas

Si bien, el uso de clulas inmovilizadas en matrices slidas ha permitido la

implementacin de procesos de fermentacin en sistemas de flujo continuo. Existen
numerosos problemas que se presentan a nivel industrial, los cuales se describen a
continuacin.
Los sistemas floculados presentan un difcil manejo debido a que la floculacin
depende de factores como el pH, la concentracin de Ca2+, temperatura y la
agitacin (Verstrepen et al., 2003; Sampermans et al., 2005). Adems, cada cepa de
levadura presenta un comportamiento diferente (Jin y Speers, 1999).
Otro caso, es el uso de membranas microporosas como filtros para retener las
levaduras en el reactor, lo cual resulta muy costoso cuando se emplean reactores
continuos. El mayor problema que presenta esta tcnica es el bloqueo que
eventualmente sufren los poros de la membrana debido a partculas o a las mismas
levaduras (Lebeau et al., 1998). Por otro lado, la inmovilizacin de clulas por
adsorcin sobre la superficie de materiales es fcil de conseguir, pero al ser la
adsorcin un fenmeno fundamentalmente electrosttico, durante los procesos en
continuo, especialmente por efecto de la agitacin, las clulas se liberan del
soporte. Adems, por este mtodo es difcil inmovilizar grandes cantidades de
biomasa
(Verbelen
et
al.,
2006).
1.2 Otros mtodos
fermentacin

de inmovilizacin de

clulas

para procesos

de

Si bien, existe una problemtica alrededor del uso de clulas inmovilizadas, hoy en
da se han enfocado esfuerzos en el desarrollo de rutas novedosas que permitan el
desarrollo de sistemas inmovilizados mediante el uso de materiales porosos
diferentes a los polmeros de origen natural que se han usado hasta ahora. Muchos
de estos slidos porosos podran encontrar un lugar importante en los procesos de
produccin
de
vinos
y
fermentaciones
alcohlicas
en
general.
Las zeolitas y los diferentes zeotipos son materiales microporosos muy usados en
diversos procesos catalticos, prueba de ello es su extensa aplicacin (Corma,
1995). Debido a su tamao de poro pequeo, no sera posible inmovilizar levaduras
dentro de sus cavidades. Sin embargo, el uso de membranas zeolticas s podra ser
de gran utilidad en procesos de fermentacin en los que se requiere eliminar el
etanol del reactor de forma selectiva (Bowen et al., 2003). Para tal aplicacin se
podran emplear materiales zeolticos hidrofbicos convencionales como la zeolita
beta (Camblor et al., 1996) o materiales hbridos orgnicos-inorgnicos como los
metilaluminofosfatos-alfa y metilaluminofosfatosbeta (Maeda et al., 1997). Cabe
mencionar que la produccin de membranas zeolticas compactas y con
propiedades mecnicas adecuadas no es sencilla y hoy en da sigue siendo un reto
para
muchos
grupos
de
investigacin.
Los materiales mesoporosos templados mediante aglomeraciones micelares
(Taguchi y Schuth, 2005), aunque siguen sin presentar el tamao de poro adecuado
para la inmovilizacin de levaduras, s permiten la inmovilizacin de enzimas (Yiu y
Wright, 2005). Esto hace que estos slidos tengan un inters especial en la industria
vincola ya que mediante el uso de enzimas podran modificarse la naturaleza de
algunas sustancias responsables de aromas y sabores caractersticos del vino
consiguindose productos con propiedades organolpticas diferentes. Los
materiales mesoporosos ms adecuados para la inmovilizacin de enzimas seran
los slidos del tipo SBA-15 debido a su gran tamao de poro (Zhao et al., 1998). La
inmovilizacin de las enzimas se conseguira por difusin de las mismas en los
poros del slido previamente funcionalizado con molculas que anclaran la
enzima a la pared del material (Hartmann, 2005). Slidos como los que se proponen
aqu podran usarse en procesos en continuo o en sistemas fluidizados.

La inmovilizacin de levaduras requiere de materiales macroporosos con radios del

orden de algunas micras. Estos materiales pueden sintetizarse mediante dos
tcnicas:
La primera hace uso de esferas sintetizadas por polimerizacin en microemulsin,
que posteriormente son usadas como moldes que se recubren con precursores de
xidos, metales u otros materiales (Grochowicz et al., 2008; Marrero-Lpez et al.,
2008). Por medio del proceso de calcinacin de las esferas es posible sintetizar
materiales macroporosos de cavidades esfricas regulares conectados por ventanas
de menor tamao. Mediante esta tcnica sera posible sintetizar bioslidos de gran
resistencia mecnica en los que no habra grandes problemas de difusin de
reactivos o productos. El paso ms complejo de sntesis sera la inoculacin de las
clulas en el interior del slido, ya que aunque los poros pueden ser muy grandes,
las levaduras deben difundir por las ventanas que comunican los poros. La
estructura 3D de canales que estos materiales exhiben podra resultar de inters
para la fabricacin de membranas para la retencin de levaduras en reactores en
continuo.
El segundo mtodo que posee gran potencial es el uso de materiales porosos
sintetizados por congelacin unidireccional y posterior liofilizacin (Choi et al.,
2009). Esta tcnica de preparacin de slidos macroporosos, al ser reciente, es la
menos explorada en el campo de la catlisis. Este mtodo implica la congelacin de
una solucin de partculas que pueden ser polimricas, silceas, metlicas etc. a
temperatura de nitrgeno lquido de manera unidireccional y a velocidad
controlada. El proceso que parece complejo, es en realidad un mtodo sencillo de
fabricacin de materiales macroporosos que, adems, permite la incorporacin de
especies biolgicas in-situ en la matriz durante la sntesis del material debido a que
no se requiere calcinacin de ningn molde orgnico. Parainmovilizar bacterias
dentro de una matriz polimrica Gutirrez et al. (2007), partieron de una suspensin
acuosa concentrada de bacterias E. coli protegidas con alginato de calcio y glucosa.
Las cuales incorporaron a la suspensin alcohol polivinlico y la mezcla se transfiri
a una jeringa de insulina. Esta se introdujo en un bao con nitrgeno lquido a
velocidad controlada (5.9 mm/min) y posteriormente se liofiliz. Durante el proceso
de congelacin unidireccional se producen frentes de congelacin perpendiculares a
la direccin de inmersin en los que los cristales de hielo apartan las impurezas,
que en este caso seran las bacterias y el alcohol polivinlico. Una vez eliminado el
hielo por liofilizacin se obtiene una matriz porosa de alcohol polivinlico en la que
quedan retenidas las bacterias. En este caso las bacterias se recubrieron con
alginato-glucosa para protegerlas durante el proceso de congelacin criognica.
Mtodos similares de proteccin deben usarse si se pretende inmovilizar sistemas
biolgicos sensibles al proceso de congelacin. Otra ventaja de este mtodo es que
se obtienen monolitos con la forma y geometra del recipiente que contiene la
suspensin que se congela, en lugar de los clsicos polvos que dan como resultado
los otros mtodos de inmovilizacin. Tambin es posible modular el tamao de poro
al jugar con la relacin masa suspendida/agua de la suspensin a congelar y con la
velocidad de inmersin. De ah que estos mtodos novedosos de inmovilizacin de
clulas abran un abanico de posibilidades empleando matrices slidas de diversa
naturaleza, y as de esta forma lograr disear sistemas de fermentacin que
trabajen en reactores continuos. Asimismo, existen otros mtodos modernos que no
requieren del uso de dispositivos inmovilizadores complejos. Uno de estos mtodos
es el uso de catalizadores artificiales inertes, como los nanotubos de carbono, que
inducen la floculacin de los micro-organismos. Utilizando nanotubos de carbono,
clulas de Saccharomyces cerevisiae han sido inmovilizadas exitosamente por el
mtodo de floculacin (T.A. Mamvura, 2010). Aunque esta tcnica aporta buenos
resultados con respecto a la inmovilizacin, la sntesis selectiva de nanotubos de
carbono
sigue
siendo
costosa.
Es comn que la inmovilizacin de levaduras y enzimas con los mtodos
mencionados anteriormente enfrenten problemas tcnicos y cientficos. No

obstante, es importante plasmar una visin sobre las expectativas y potencialidades

que tienen estos materiales en el proceso de fermentacin alcohlica. Por lo tanto,
surge la motivacin para realizar investigacin profunda y novedosa fundamentada
en el hecho de que los recientes avances en la sntesis de micro y nano materiales
porosos an no se han permeado al campo de la catlisis con levaduras. Por lo cual,
se abren nuevos horizontes en el rea de investigacin y aplicacin de estos
mtodos
de
inmovilizacin
de
clulas.
2.

INMOVILIZACIN

DE

ENZIMAS

En la actualidad, la industria requiere gran cantidad de enzimas con el fin de

obtener productos con mejores caractersticas y menor costo. Por ello, la
implementacin de procedimientos que aumenten la estabilidad de las enzimas y
permitan su reutilizacin ha sido por muchos aos el objetivo de diversos
laboratorios alrededor del mundo. La preparacin y estabilizacin de enzimas ha
sido un tema de estudio desde hace casi 50 aos (Piug- Muset, 1964) y es de
inters
tanto
cientfico
como
econmico.
La inmovilizacin combina la actividad elevada y especfica de las biomolculas
activas, como las enzimas o anticuerpos, con la estabilidad qumica y mecnica del
soporte. Consiste en mantener la biomolcula unida o atrapada en un soporte fsico,
conservando su actividad cataltica y permitiendo el flujo de sustratos y productos.
Las enzimas pueden ser inmovilizadas en sustratos naturales y/o sintticos por
medios qumicos (unindolas al sustrato mediante enlaces covalentes) o fsicos
(fuerzas electrostticas o membranas), y pueden adems ser encapsuladas
mecnicamente la adicin de agentes que formen una pelcula protectora alrededor
de la enzima inmovilizada, permitiendo el paso de reactivos y productos de
pequeo tamao, pero no de protenas (Heering et al., 2004; Wang y Caruso, 2005).
Las enzimas inmovilizadas presentan varias ventajas sobre su contraparte en
solucin. Permiten un uso continuo, reutilizacin y control de las concentraciones de
protena empleada. Asimismo, es viable mejorar la estabilidad y actividad de la
enzima en funcin del pH y la temperatura, adems, al ser inmovilizadas quedan
protegidas ante enzimas proteolticas, aumentando as la eficiencia del sistema. Sin
embargo, la inmovilizacin tambin puede presentar ciertas desventajas, por
ejemplo, la actividad de la enzima puede verse afectada por el proceso de
inmovilizacin, adems, la velocidad de reaccin puede estar limitada por la
velocidad de difusin de sustratos y productos hacia dentro y fuera del sistema.
2.1
Clasificacin
de
mtodos
de
inmovilizacin
Los mtodos de inmovilizacin de enzimas se clasifican en dos rubros: mtodos
reversibles
y
mtodos
irreversibles
(Gupta
y
Mattiasson,
1992).
2.1.1
Mtodos
de
Inmovilizacin
Irreversibles
El concepto de inmovilizacin irreversible implica el enlace del biocatalizador a un
soporte de manera permanente, por lo cual el biocatalizador no puede ser liberado
sin destruir o modificar su actividad biolgica o el soporte. Los procedimientos ms
comunes de inmovilizacin irreversible son el enlace covalente, enlace cruzado,
atrapamiento
y
micro
encapsulado.
a)
Formacin
de
enlaces
covalentes
La inmovilizacin de protenas por mtodos basados en la formacin de enlaces
covalentes estn entre los ms usados. La ventaja de estos mtodos estriba en la
naturaleza estable de los enlaces formados entre las enzimas y el soporte. De igual
manera, las enzimas en este mtodo no son liberadas en la solucin en uso. Sin
embargo, para lograr altos niveles de enlace, los residuos de aminocidos
esenciales para la actividad cataltica no deben involucrar un enlace covalente con
el soporte aunque esto puede resultar difcil de lograr en algunos casos. Los
mtodos covalentes de inmovilizacin son empleados cuando existe un

requerimiento

estricto

de

ausencia

de

enzimas

en

el

producto.

Los mtodos de acoplamiento en general pueden dividirse en 2 clases: 1) activacin

de la matriz o soporte por adicin de una funcin reactiva en un polmero y 2)
modificacin del polmero para producir un grupo activado. Los procesos de
activacin son comnmente diseados para generar grupos electroflicos en el
soporte, el cual durante el acoplamiento reaccionan con los fuertes nuclefilos en
las protenas. Los principios bsicos que controlan el acoplamiento covalente con
matrices son anlogos con las usadas en la modificacin qumica de protenas. Las
reacciones ms usadas involucran las siguientes cadenas de amino cidos: lisina
(grupo amino), cistena (grupo tiol), y cidos asprtico y glutmico (grupo
carboxilo).
En este mtodo se enlaza covalentemente la enzima con un soporte insoluble
natural o sinttico. El enlace se da entre algn grupo funcional reactivo de la
enzima (amino, Cis-tiol, Tir-hidroxil o His-imidazol) y el soporte previamente
activado, generalmente recubierto con grupos funcionales orgnicos en la superficie
(Monocapas tiol autoensambladas, oro, CNBr-Sepharosa, etc.) (Figura 1). El
seguimiento de la inmovilizacin se realiza cuantificando la concentracin de
protena libre (generalmente por el mtodo de Bradford), y de la protena unida
covalentemente al soporte (ej. cido bicinconnico). Las desventajas de este mtodo
radican en el sitio del enlace, ya que puede modificarse el sitio activo o pueden
ocurrir impedimentos estricos que reduzcan la actividad. Sin embargo, esto es
poco probable y puede verse reducido al dirigir el enlace a sitios especficos y/o con
una orientacin molecular definida (Wood et al., 1997; Heering et al., 2004).
Adems, la unin por enlace covalente confiere a la enzima una inmovilizacin ms
estable a cambios de pH y temperatura en el medio (Queiroz-Claret et al., 1997).

Figura 1. Enzimas inmovilizadas en un

soporte fsico por enlace covalente, las
enzimas se encuentran orientadas
espacialmente en el soporte
b)
Formacin
de
enlaces
cruzados
Con esta tcnica los soportes no son necesarios, ya que la inmovilizacin se da por
un enlace directo entre enzimas, que puede ser mediado o no por un agente de
unin. Generalmente se aade el agente de bajo peso molecular (ej. glutaraldehdo)
a la enzima en solucin, uniendo covalentemente los grupos funcionales de las
enzimas para formar agregados (Figura 2). Este mtodo tiene como ventaja su
sencillez, sin embargo, es susceptible a cambios pequeos de pH y temperatura en
las condiciones de operacin (Gdia-Casablancas, 2005).

Figura 2. Enzimas inmovilizadas por enlaces

cruzados (lneas negras).
c)
Atrapamiento
El mtodo de atrapamiento est basado en la oclusin de las enzimas dentro de una
red polimrica que permite al sustrato y a los productos pasar a travs de ellos y
retener las enzimas (ODriscoll, 1976). Este mtodo difiere de los mtodos de
acoplamiento covalente descritos anteriormente, ya que las enzimas no estn
enlazadas a la matriz o soporte. Existen diversos mtodos de atrapamiento de
enzimas como el de gel (Bernfeld y Wan, 1963) o atrapamiento por fibras (Dinelli et
al, 1976), microencapsulado (Wadiack y Carbonell, 1975) y por inclusin. El uso
prctico de estos mtodos es limitado debido a la baja transferencia de masa a
travs de las membranas o geles. Atrapamiento por inclusin. Con este mtodo la
enzima queda atrapada dentro de una matriz de gel que permite una fcil difusin
de productos. La matriz puede ser de origen natural o sinttico y de diversos
materiales (Slica gel, poliacrilamida, agarosa, carregnatos, entre otros), y pueden
clasificarse como geles hmedos, geles secos (xerogeles) o geles en aerosol
(aerogeles) (Figura 3). En este mtodo las enzimas son colocadas en una solucin
que posteriormente es gelificada (por temperatura o adicin de polimerizantes),
quedando atrapadas dentro de la matriz (Figura 3A). En algunos casos el gel es
sometido a un proceso de secado y molido, obteniendo as mayor rea de contacto
entre la enzima y la solucin que contiene el sustrato (Figura 3B), dando como
resultado esferas de 2 Sm con un tamao de poro de 35 7 (Mureseanu et al.,
2005). Tambin es posible incrementar la capacidad de inmovilizacin de los geles
al utilizar agentes estabilizadores (sorbitol, polietilenglicol, diferentes mono- o
disacridos) y surfactantes (lecitina, lactosa, 3-sn-fosfatidilclorina, bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTAB)) (Mureseanu et al., 2005), o al aadir agentes
policatinicos o polianinicos con carga contraria a la enzima o a regiones de la
superficie de la misma como el poli(1-vinilimidazol) (PVI) y la poli(etilamina) (PEI)
antes de la polimerizacin (Chen et al., 1998). La inclusin tiene la ventaja de
prevenir el acceso de proteasas y mantener intacta la estructura de la protena, por
lo que su actividad no se ve afectada. Sin embargo, el tamao de los poros no
puede ser controlado, es difcil de escalar y reutilizar ya que el gel puede disolverse
bajo ciertas condiciones o tras poco tiempo de uso, y un aumento en la cantidad de
enzima cargada ms all de cierto punto no implica necesariamente un aumento de
la actividad, debido a las limitantes de difusin que se podran presentar.

Figura 3. Enzimas inmovilizadas por inclusin

dentro de una matriz de gel.
A) gel hmedo. B) esferas del gel seco y
triturado.
Atrapamiento por micro-encapsulacin. El mtodo puede ser de dos tipos: por
microencapsulacin en soportes porosos (con un dimetro de 2-50 nm), que
posteriormente pueden ser recubiertos con un revestimiento nanocompuesto,
atrapan la enzima en su interior y permiten el paso de sustratos y productos (Figura
4A); por microemulsin o liposomas, combinando la enzima con agentes
emulsificantes y agitando para formar micelas que la protegen de medios
cidos/alcalinos, proteasas y durante los periodos de almacenamiento (Chen et al.,
1999;
Kuiper
et
al.,
2008)
(Figura
4B).
En la microencapsulacin las partculas porosas (esferas de slice con nanoporos,
micropartculas de CaCO3, etc.) son puestas en suspensin con la enzima por un
tiempo dado (aprox. 40 min), y la cantidad de enzima inmovilizada es monitoreada
por espectroscopa. La desventaja radica en la inclusin de la enzima en el interior
de la matriz, ya que generalmente queda atrapada en la superficie exterior y puede
desprenderse paulatinamente debido al tipo de interacciones presentes o tras
varios ciclos de uso (Volodkin et al., 2004). Sin embargo, esto se ve solucionado al
controlar el tamao de poros de las esferas y al dar un tratamiento con un agente
que encapsule la protena (ej. policloruro de dialilamonio, nanopartculas de slice,
polihidrocloruro de alilamina o poliestirensulfonato) evitando su fuga y
protegindola de proteasas, adems, este mtodo por su naturaleza de interaccin
suave, permite una alta actividad y resistencia a cambios de pH y temperatura
(Wang
y
Caruso,
2004;
2005).
La microemulsin tiene la ventaja de ser muy sencilla, suficientemente porosa para
permitir que la enzima funcione en un sistema en solucin, pero al mismo tiempo
protegida del ambiente degradante. Tambin puede llevarse a cabo repetidas veces
(emulsin mltiple), agregando agentes emulsificantes secundarios y espesantes
(ej. goma arbiga, Tween 80, polestireno40-b-poili(isocianoalanina(2-thiophen-3-iletil)amida)50, entre otros), para proporcionar una mayor proteccin. Adems, por la
naturaleza de los reactivos utilizados, puede tener uso farmacolgico en la
administracin oral de inmunoglobulinas. La desventaja de este mtodo radica en la
prdida de actividad ante la inmovilidad de la protena al quedar atrapada en la
interface agua/aceite, o al ser desnaturalizada por el esfuerzo de corte generado
durante la preparacin de las micelas (Chen et al., 1999; Kuiper et al., 2008). El
dimetro de las micelas puede variar de 100 a 250 nm, dependiendo de los

emulsificantes utilizados, de la fluidez del copolmero y de la habilidad de la enzima

para ser adsorbida en la membrana.

Figura 4. Enzimas inmovilizadas por

encapsulacin.
A) microencapsulacin dentro de esferas
porosas. B) Microemulsin en micelas.
2.1.2
Mtodos
de
Inmovilizacin
Reversible
En el mtodo de inmovilizacin reversible, las enzimas inmovilizadas pueden ser
desprendidas del soporte bajo condiciones no extremas. El uso de mtodos
reversibles para la inmovilizacin de enzimas es altamente atractivo,
principalmente por razones econmicas debido a que el soporte puede regenerarse
y recargarse con enzimas nuevas cuando la actividad enzimtica decae. Existen
distintos mtodo de inmovilizacin reversible, que a continuacin se describen:
Por
adsorcin
El mtodo de adsorcin emplea soportes orgnicos o inorgnicos que presentan un
adsorbente activo (monocapastiol auto ensambladas, oro, entre otros) en los cuales,
las enzimas son atradas y retenidas por medio de interacciones inicas o fuerzas
dbiles (puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals, interacciones
hidrofbicas) (Figura 5) (Wood et al., 1997). Este mtodo consiste en poner en
contacto la enzima en solucin acuosa con un soporte adsorbente por un lapso de
tiempo dado (2-48 h), para despus lavar el soporte y eliminar la enzima que no fue
inmovilizada. Presenta la ventaja de mantener intacta la actividad de la enzima, ya
que la unin es dbil y no afecta su conformacin, sin embargo, esta caracterstica
hace que al mismo tiempo la unin sea reversible y sensible a cambios de pH y
temperatura.

Figura 5. Enzimas inmovilizadas en un soporte

fsico. A) Por adsorcin, la regin positiva de la
protena interacta
con el soporte negativo.
Adsorcin no especfica. El mtodo de inmovilizacin reversible ms simple es la
adsorcin no especfica, el cual se basa en la adsorcin fsica o enlace inico
(Messing, 1976; Woodward, 1985). En la adsorcin fsica las enzimas son unidas a la
matriz a travs de puentes de hidrgeno, fuerzas de van der Waals, o interacciones
hidrofbicas; mientras que enlaces inicos de enzimas son producidos a travs de
uniones con sales. La naturaleza de las fuerzas involucradas en la inmovilizacin no
covalente resulta en un proceso que puede ser reversible cambiando las
condiciones que influyen en la resistencia de la interaccin (ej. pH, resistencia
inica, temperatura y polaridad del solvente). La inmovilizacin por adsorcin es
fcil de realizar y usualmente preserva la actividad cataltica de la enzima. Dichos
mtodos son, por lo tanto, atractivamente econmicos, pero pueden presentar
problemas como la liberacin de enzimas cuando las interacciones son
relativamente dbiles. De igual forma es difcil encontrar condiciones bajo la cuales
las
enzimas
permanecen
enlazadas
fuertemente
y
activas.
Adsorcin hidrofbica. Otro mtodo es el uso de interacciones hidrofbicas,
donde la adsorcin hidrofbica ha sido utilizada como un principio cromatogrfico
por ms de 3 dcadas. Consiste en variables experimentales conocidas como el pH,
concentracin de sales, y la temperatura (Porath, 1987). La resistencia de las
interacciones radica en la hidrofobicidad del adsorbedor y de la protena. La
hidrofobicidad del adsorbedor puede ser regulada por el grado de sustitucin del
soporte y por el tamao de la molcula ligante hidrofbica. El xito de la
inmovilizacin reversible de la -amilasa y amiloglucosidasa en soportes de
hexilagarosa ha sido reportada (Caldwell et al 1976; Caldwell et al, 1982). Muchos
otros ejemplos de enlace reversible con adsorbedores hidrofbicos ha sido tambin
mostrado en la literatura. (Cashion, 1982; Yon, 1974; Dixon, 1979).
Quelacin o enlace metlico. Sales de metales de transicin o hidrxidos
depositados en la superficie de soportes orgnicos han podido ser enlazados gracias
a la coordinacin de los grupos nucleoflicos en la matriz. Se utilizan principalmente
sales de titanio y circonio, siendo este mtodo conocido como inmovilizacin por
enlace metlico (Cabral, 1991; Cabral, 1986; Kennedy, 1985). La sal metlica o el
hidrxido es precipitado en el soporte (ej. celulosa, quitina, acido algnico y bases
de slice) por calentamiento o neutralizacin. Debido a los factores estricos es
posible para la matriz ocupar todas las posiciones de coordinacin del metal, por lo
tanto algunas de las posiciones permanecen libres para coordinarse con grupos de
enzimas.

La elusin de protenas enlazadas puede ser fcilmente lograda por competencia

con ligantes solubles o disminuyendo el pH. El soporte es subsecuentemente
regenerado
lavndolo
con
un
fuerte
quelante
como
el
cido
etilendiaminotetraactico (EDTA). Estos soportes metlicos han sido utilizados
ampliamente en cromatografa de protenas (Porath, 1992; Kagedal, 1998).
Formacin de enlaces disulfuro. Estos mtodos son nicos, porque aunque se
forma un enlace covalente estable entre la matriz y la enzima, es posible que se
rompan los enlaces por medio de una reaccin utilizando agentes apropiados como
el dithiotreitol (DTT) bajo suaves condiciones. Adems, debido a que la reactividad
de los grupos tiol pueden ser modulados mediante la alteracin del pH, la actividad
es alta para mtodos que usan enlaces disulfuro, con la condicin de que el
apropiado tiol adsorbente con alta especificad sea utilizado (Carlsson, 1998). Puntos
crticos. Cabe mencionar que aunque la inmovilizacin sea dirigida a un sitio y/o por
un mtodo especfico, los enlaces qumicos y las interacciones entre la enzima y el
soporte son complejos, y un mtodo de estabilizacin nico no asegura que las
interacciones sean 100% propias del mtodo (Wood et al., 1997). La estabilidad de
protenas globulares en una matriz generalmente depende de las interacciones
electrostticas, interacciones estricas, cambios en el estado de hidratacin y
reacomodos en la estructura de la protena (Volodkin et al., 2004), adems, dicha
estabilidad es determinada por la combinacin de fuerzas electrostticas globales e
interacciones locales especficas (Chen et al., 1998). Las fuerzas electrostticas
globales tienen efecto directo en la adsorcin de la enzima, y el pH del medio altera
el grado de influencia de estas fuerzas electrostticas, en especial la interaccin
protena-sustrato
(Volodkin
et
al.,
2004).
En lo que concierne a la mejora de la estabilidad de enzimas han surgido dos
conceptos fundamentales, el primero indica que al restringir el movimiento de los
segmentos en las cadenas de la protena se reduce la probabilidad de un cambio
estructural irreversible; el segundo, un cambio similar irreversible en la estructura
de la protena ocurre por el choque de los segmentos con la superficie en la que la
enzima
es
inmovilizada
o
adsorbida
(Chen
et
al.,
1998).
En algunos casos cuando se estabiliza una enzima por inmovilizacin, un cambio
estructural irreversible puede ser prevenido restringiendo el movimiento de los
segmentos al encerrar la enzima en cavidades estrechas (Chen et al., 1998). Un
tamao de poro similar al tamao de la enzima es ms apropiado para obtener una
buena actividad (Mureseanu et al., 2005). Un alto rendimiento en la estabilizacin
puede ser logrado al aadir azcares a la enzima en solucin, ya que estos pueden
contribuir a mantener la estructura tridimensional de la protena, lo que es crucial
para su actividad, adems, el tipo y la cantidad de azcar utilizado en la
estabilizacin es determinante para generar una alta actividad cataltica
(Mureseanu et al., 2005). A continuacin se indican algunas enzimas que han sido
inmovilizadas por distintos mtodos (Tabla 1).

2.2
Seleccin
de
soportes
Las caractersticas de las matrices o soportes son de gran importancia en la
determinacin de la eficiencia del sistema de inmovilizacin de enzimas. Las
propiedades ideales de un soporte incluyen la resistencia fsica a la compresin,
hidrofilicidad, inertes entre las enzimas y sus derivados, biocompatibilidad,
resistencia al ataque microbial y bajo costo (Trevan, 1980; Brodelius y Mosbach,
1987; Buchholz y Klein, 1987). Asimismo, los soportes pueden clasificarse en
inorgnicos y orgnicos en funcin de su composicin qumica. En donde los
soportes orgnicos pueden dividirse en polmeros naturales y sintticos (Cabral y
Kennedy,
1991).
Las caractersticas fsicas de los soportes (como el tamao medio de partcula,
resistencia mecnica a la compresin, etc.) son de gran importancia en el
comportamiento del sistema inmovilizador y determinar el tipo de reactor por usar
bajo condiciones tcnicas. En particular, el parmetro de poro y el tamao de
partcula establecern el total del rea superficial, por lo tanto la adecuada
seleccin incidir en la capacidad de enlace de las enzimas. Los soportes no
porosos muestran pocas limitaciones difusionales, pero presentan baja capacidad
de carga. Por lo tanto, los soportes porosos son generalmente preferidos por su alta
rea superficial que permite una alta carga de enzimas, as como porque las
enzimas inmovilizadas quedan aisladas del medio ambiente. Se debe controlar la
distribucin del tamao de poro en los soportes porosos para optimizar la capacidad
y las propiedades de flujo. A pesar de las muchas ventajas de los soportes
inorgnicos (ej. alta estabilidad ante degradacin fsica, qumica y microbial), la
mayora de las aplicaciones industriales se realizan con soportes orgnicos. El
carcter hidroflico es uno de los factores ms importantes que se utilizan para
determinar el nivel de actividad de las enzimas inmovilizadas (Gemeiner, 1992).
Una excelente matriz o soporte que ha sido utilizada es la agarosa. Adems de su
alta porosidad que influye en su elevada captacin de protenas, tambin presenta
un carcter hidroflico, fcil obtencin, ausencia de grupos con carga (el cual
previene la adsorcin no especfica del sustrato y los productos) y es de bajo costo.
Sin embargo, como la mayora de las enzimas son relativamente inestables, el costo
del aislamiento es todava alto, y es tcnicamente difcil recuperar un enzima activa
despus
de
una
reaccin.
CONCLUSIONES
En conclusin, la inmovilizacin de clulas y enzimas es un proceso prometedor en

la industria, con las ventajas y desventajas antes mencionadas, y bajo condiciones

que pueden ser optimizadas en el laboratorio, pero sobre todo con un enorme
campo de aplicacin. Este proceso puede ayudar a mejorar la produccin de
alimentos, frmacos, qumicos y bioproductos de inters cientfico y econmico.
REFERENCIAS

Captulo 5 Inmovilizacin y caracterizacin del biocatalizador 5.1. Objetivos

Los objetivos del presente captulo son: Describir la metodologa de
inmovilizacin de las clulas catalticas. Caracterizar el biocatalizador
inmovilizado obtenido. Contrastar el desempeo del biocatalizador con PAL
pura inmovilizada. 5.2. Fundamentos 5.2.1. Biocatalizadores inmovilizados
Como ya se mencion en el Captulo 2, la utilizacin de enzimas en la
industria ha proporcionado claras ventajas en comparacin con los
catalizadores qumicos, entre ellas alta especificidad, elevada actividad y
gran efectividad a presin y temperatura ambiente. A pesar de ello, el
empleo de muchas enzimas en la industria se ve limitado como
consecuencia de su labilidad en las condiciones normales de trabajo. Por
otra parte, debido a que son hidrosolubles, es difcil recuperarlas de la
mezcla de reaccin para utilizarla en un sucesivo proceso, al igual que
separarlas de los productos de reaccin. Con el advenimiento de la
inmovilizacin de las enzimas, se han podido superar estos ltimos
inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnolgico sea
econmicamente rentable [117]. De acuerdo a la European Federation of
Biotechnology (1983), se definen los biocatalizadores inmovilizados como:
enzimas, clulas u organelas (o combinacin de ellos) confinados o
localizados en una regin definida del espacio, con retencin de su actividad
cataltica y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de
modo repetido y continuo [11]. 140 | CAP T U L O 5 . I N M O V I L I Z A C I
N Y C A R A C T El trmino confinado y localizado implica el uso de
una fase insoluble y macroscpica que sea catalticamente activa y la cual
se encuentre dispersa en un medio lquido, libre del catalizador. El
transporte de reactivo hacia y desde el biocatalizador est gobernado por
difusin, producindose gradientes y haciendo que la concentracin vare en
el seno del lquido y dentro del catalizador. Por otro lado, el trmino
retencin de la actividad cataltica implica que la metodologa de
inmovilizacin debe asegurar al menos el 25% de la actividad original del
biocatalizador. Finalmente, cuando hace mencin al uso repetido y
continuo se refiere a que el biocatalizador debe poder separarse fcilmente
del seno de la solucin para poder reutilizarlo. 5.2.2. Ventajas y desventajas
de la inmovilizacin de enzimas El uso de biocatalizadores inmovilizados en
la industria de bioprocesos confiere una serie de ventajas respecto al uso
del biocatalizador libre [17, 22]. Las mismas se anuncian a continuacin:
Reutilizacin del biocatalizador: una de las ventajas ms importantes de los
biocatalizadores inmovilizados es la posibilidad de usarlo reiteradamente.
Esta propiedad se debe a que el aislamiento del biocatalizador en general es
muy sencillo, en contraste con el biocatalizador libre. Esto se ve reflejado en
un incrementando de la productividad por unidad de enzima. Dicha

productividad es un requisito esencial para el biocatalizador inmovilizado, ya

que de ello depende la rentabilidad del proceso. Mayor control sobre la
reaccin: esta caracterstica es importante cuando se debe detener la
reaccin por algn motivo en particular. Cuando el biocatalizador se
encuentra libre en solucin, la nica forma de detener una reaccin es
inactivando la enzima, mientras que el biocatalizador inmovilizado es
fcilmente removible de la mezcla de reaccin. Adaptacin a procesos
continuos: los biocatalizadores inmovilizados pueden ser empleados en
procesos continuos, por ejemplo en lechos estticos en una columna o bien
lechos fluidizados. Esto permite poder C A P T U L O 5 . I N M O V I L I Z A C
I N Y C A R A C T 141 automatizar el proceso con la consiguiente
reduccin de los costos laborales. Menor contaminacin de los productos:
mediante el uso de biocatalizadores inmovilizados, la recuperacin de los
productos de reaccin o del sustrato modificado, resulta ms sencilla. Esto
evita la contaminacin de ambas especies con el catalizador, y por ende, las
etapas de downstream necesarias para la purificacin del producto.
Estabilizacin del biocatalizador: el soporte de inmovilizacin puede proveer
un ambiente favorable que protege la enzima de las condiciones de
reaccin, brindndole estabilidad y aumentando, de este modo, la vida til
de la misma. Por otro lado, la utilizacin de enzimas tiene una serie de
desventajas, entre ellas: Prdida de actividad durante la inmovilizacin: es
posible que parte de la actividad del biocatalizador se pierda durante la
inmovilizacin. Esto depender en gran medida del mtodo escogido para
llevarla a cabo. Por un lado, las condiciones de inmovilizacin pueden ser
perjudiciales para el biocatalizador. Por otra parte, algunos mtodos de
inmovilizacin pueden modificar la conformacin de la estructura nativa de
las enzimas, pudiendo reducir considerablemente su actividad.
Heterogeneidad del sistema enzima-soporte: puede ocurrir que la cantidad
de enzima unida a un soporte difiera y con ello se pueden producir
variaciones entre batch y batch. Barrera difusional: la inmovilizacin
generalmente adiciona una barrera al libre flujo de sustratos y productos, lo
cual traduce en gradientes de concentracin a travs del soporte, limitando
en gran medida la velocidad de reaccin. Incremento del costo de
produccin del biocatalizador: la incorporacin de la inmovilizacin en la
produccin del biocatalizador implica, un costo adicional. Como
consecuencia, el catalizador inmovilizado siempre ser ms caro que el
biocatalizador libre. Sin embargo, la rentabilidad del proceso se puede
incrementar mediante las ventajas del uso de biocatalizadores
inmovilizados, por las razones anteriormente descriptas. 142 | CAP T U L O
5 . I N M O V I L I Z A C I N Y C A R A C T 5.2.3. Mtodos de
inmovilizacin En general, los mtodos de inmovilizacin se pueden
clasificar en dos grandes categoras [8]: Mtodos de retencin fsica: En
stos, la enzima queda retenida fsicamente en el soporte o carrier. Los
mtodos fsicos se pueden clasificar en: Atrapamiento y Retencin en
membranas (Figura 5.1). Mtodos de unin qumica: El biocatalizador se
mantiene unido al carrier, mediante enlaces qumicos. Los mtodos

qumicos se pueden clasificar en Enlaces covalentes, Adsorcin y

Entrecruzamiento (Figura 5.1). Figura 5.1. Mtodos de inmovilizacin de
biocatalizadores. Cada uno de los mtodos de inmovilizacin se describe
brevemente a continuacin [8, 14, 117]: Atrapamiento: Este mtodo
consiste en la retencin fsica de la enzima en las en las cavidades internas
de una matriz slida porosa. Entre los polmeros ms empleados se
encuentran poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato, etc. La
metodologa se basa en la adicin de la enzima a la solucin del monmero,
el cual luego se polimeriza por variaciones en la temperatura o bien por el
agregado de un reactivo qumico. El atrapamiento puede llevarse a cabo en
geles, donde la enzima Inmovilizacin Retencin fsica Atrapamiento
Inclusin en membranas Unin qumica Covalente Adsorcin
Entrecruzamiento C A P T U L O 5 . I N M O V I L I Z A C I N Y C A R A C T
143 queda retenida en el interior del gel, o bien en fibras, donde la
enzima queda ocluida a las microcavidades de dicha fibra. Algunas ventajas
de este mtodo es que no altera la estructura de la enzima, requiere poca
carga enzimtica por unidad funcional y en general es de fcil preparacin.
Sin embargo, es necesario controlar las condiciones de polimerizacin y
comprobar que no haya interaccin qumicas con los soportes, ya que
dichas interacciones pueden alterar la estructura y funcionalidad de la
enzima. Inclusin en membranas: En este mtodo las enzimas se incluyen
dentro de membranas semipermeables que permiten el paso de molculas
de sustratos y producto, pero retienen a la enzima. Un tipo especfico de
inclusin en membrana es la microencapsulacin, la cual se logra mediante
polimerizacin sobre la superficie de la enzima dentro de un solvente
compuesto por solventes orgnicos y agentes surfactantes. Se trata de un
mtodo sencillo, que no alterna la estructura y funcionalidad de la protena,
ya que la misma se encuentra libre dentro de la membrana. Adems, puede
adaptarse a sistemas continuos de produccin a gran escala. En
contraposicin, debido a que las enzimas se encuentran ms expuestas,
pueden sufrir prdida de actividad ms fcilmente que en otros sistemas.
Finalmente, dependiendo de las caractersticas de la membrana, pueden
incorporar una resistencia considerable a la difusin de sustrato y producto
a travs de ella. Enlace covalente a matrices solubles: Este mtodo se
basa en la activacin de grupos qumicos del soporte, para que reaccionen
con los nuclefilos de la protena. Los aminocidos cuyos residuos
reaccionan ms frecuentemente con el soporte son: lisina, cistena, tirosina
e histidina. Algunos de los soportes ms empleados son los polmeros de
acrilamida, polmeros basados en el estireno, polmeros metacrlicos, etc. Se
trata de una tecnologa flexible, que confiere elevada estabilidad a la
enzima antes condiciones desfavorables del entorno. Sin embargo, el
rendimiento de inmovilizacin es bajo y la cintica de la enzima puede ser
alterada. Adsorcin sobre matrices insolubles: La enzima se une al soporte
mediante interacciones inicas, de Van der Walls y puentes de hidrgeno,
dependiendo de la naturaleza del carrier. Algunos factores que influyen en
144 | CAP T U L O 5 . I N M O V I L I Z A C I N Y C A R A C T la adsorcin
de la enzima son: el pH del medio, la fuerza inica, el dimetro de poro, la

carga enzimtica, etc. Algunos carriers empleados son la almina,

carbonato de calcio, carbn, celulosas, colgenos, tierra de diatomea,
piedras de vidrio, etc. La adsorcin, como mtodo de inmovilizacin, tiene la
ventaja de ser fcil de preparar, tiene un bajo costo, y no produce cambios
de especificidad enzimtica. En contraposicin, son poco estables
mecnicamente y la unin al soporte es dbil, pudiendo perder fcilmente la
carga enzimtica. Entrecruzamiento: Esta metodologa emplea reactivos
bifuncionales de bajo peso molecular, los cuales se unen a la enzima
mediante uniones intermoleculares. Un ejemplo de reactivo bifuncional es el
glutaraldehdo. El entrecruzamiento entre la enzima y los compuestos
bifuncionales producen derivados insolubles, con lo cual no se requiere de
un carrier para que contenga la enzima. Este mtodo puede llevarse a cabo
en la superficie de la enzima soluble (CLE), sobre la enzima cristalizada
(CLEC), o bien sobre agregados de la enzima (CLEA). Este sistema tiene la
ventaja de que, al no requerir de un carrier, la actividad especfica del
catalizador es elevada. Tambin son resistentes a incrementos de pH y
temperatura. La eleccin de los mtodos de inmovilizacin a emplear
depender en gran medida del propsito de la bioproceso. Por ende, debe
considerarse el tipo de biocatalizador, el tipo de reaccin y los biorreactores
empleados para su aplicacin [11]. Los soportes o carriers de inmovilizacin,
a su vez, deben cumplir una serie de requisitos, entre ellos: Contener
grupos funcionales adecuados para inmovilizar el biocatalizador.
Resistencia mecnica. Estabilidad fsica, qumica y biolgica. No txicos.
Verstiles para su uso en diferentes biorreactores. Elevada disponibilidad
en el mercado. Econmicos, etc. C A P T U L O 5 . I N M O V I L I Z A C I
N Y C A R A C T 145 5.2.4. Tipos de biorreactores para biocatalizadores
inmovilizados Existen diversos tipos de biorreactores empleados para la
utilizacin del biocatalizador inmovilizado (Figura 5.2). Ms all de los
aspectos constructivos, existen dos formas de operacin: continua y
discontinua o batch. En los biorreactores operados de forma continua existe
un flujo constante de entrada de sustrato, as como tambin un flujo
constante de salida de producto. De esta forma, en el interior del biorreactor
se llega a un estado estacionario donde la concentracin en el interior del
seno del lquido es igual a la que sale del biorreactor. Por otro lado, en los
biorreactores que trabajan en forma discontinua o por batch, se introduce el
sustrato en el biorreactor junto con el catalizador y la reaccin sigue su
curso hasta que finaliza la conversin. Recin entonces se descarga el
biorreactor y se obtiene el producto de inters. Figura 5.2. Tipos de
biorreactores para biocatalizadores inmovilizado [117]. Los tanques agitados
son la configuracin ms simple de biorreactor. Los mismos constan de un
recipiente con agitacin, en el cual se incorpora el biocatalizador
inmovilizado y el sustrato. Pueden operar tanto de forma continua como
discontinua. Otra configuracin de biorreactor muy empleada es la 146 |
CAP T U L O 5 . I N M O V I L I Z A C I N Y C A R A C T columna. sta
generalmente se emplea en forma continua y puede tener diferentes
configuraciones. Por un lado hay columnas de lecho empaquetado, donde el
biocatalizador inmovilizado se empaca en la columna y la solucin de

sustrato para a travs de ella, producindose la bioconversin. Este tipo de

reaccin puede tener o no recirculacin de producto. Una variante de este
sistema es el lecho fluidizado, donde el biocatalizador en vez de encontrarse
empaquetado, tiene libertad de movimiento. En ste ltimo, la solucin
pasa a travs de la columna, a un flujo mayor a la velocidad mnima de
fluidizacin. Cada uno de estos biorreactores puede tener diferentes
variantes de acuerdo a su aplicacin. 5.2.5. Efectos de la inmovilizacin
sobre el biocatalizador El proceso de inmovilizacin puede afectar de
diferente manera al biocatalizador. Dichos efectos deben tenerse en cuenta
a la hora de elegir un mtodo de inmovilizacin y una forma de operacin.
Los efectos ms relevantes se resumen a continuacin [14, 117]: Efecto en
la estabilidad: se ha observado muchas veces un incremento en la
estabilidad del biocatalizador una vez inmovilizado. Esto puede deberse en
principio a la estabilizacin de la conformacin de la enzima por uniones
puntuales con el soporte. Como consecuencia de estas uniones, la
estructura terciaria de la enzima se vuelve ms rgida y resistentes a la
desnaturalizacin por temperatura o agentes qumicos. Otra causa de
estabilizacin puede ser la proteccin que confiere el soporte frente al
accionar de proteasas, ya que la unin de las proteasas con el soporte
disminuye su capacidad de protelisis. Finalmente, debido a la retencin de
la enzima en el soporte, la capacidad de agregacin se pierde, lo cual a su
vez tambin le confiere estabilidad. Efectos sobre la actividad enzimtica:
como consecuencia del proceso de inmovilizacin puede perderse parte o
totalidad de la enzima. Esto puede deberse a varios factores, aqu se
mencionarn slo algunos de ellos. Por un lado, puede existir un problema
de impedimento estrico que impide que el sustrato llegue al centro activo
de la enzima. Adicionalmente es posible que algunos grupos reactivos del
soporte reaccionen con un C A P T U L O 5 . I N M O V I L I Z A C I N Y C A
R A C T 147 aminocido que forme parte del sitio activo de la enzima, en
cuyo caso la reaccin se ver parcial o completamente impedida. Otra
posible causa puede ser la metodologa de inmovilizacin, la cual puede
ocasionar un cambio en la estructura nativa de la enzima, lo que deriva en
la prdida de su funcionalidad. Finalmente, las condiciones del entorno
durante la inmovilizacin, o bien, durante la reaccin pueden provocar la
desnaturalizacin proteica, en cuyo caso la enzima perder totalmente su
actividad. Efectos difusionales: como resultado de la inmovilizacin es
comn que se evidencien problemas difusionales que afecten la velocidad
de reaccin, ya sea por la resistencia a la entrada del sustrato o bien por la
resistencia a la salida del producto. Por un lado, tenemos resistencias
externas, las cuales son independiente del soporte. Dentro de las
resistencias externas se encuentra la resistencia a la transferencia de masa
desde el seno del lquido hasta la partcula. En las proximidades de la
partcula hay una resistencia externa adicional, la cual est constituida por
una pelcula lquida estacionaria denominada capa de Nernst. En general,
las concentraciones en la capa de Nernst son menores que en el seno del
lquido. Por otro lado, las resistencias difusionales internas se deben
exclusivamente a la naturaleza del soporte y, de ello depender, la facilidad

con la que el sustrato llegue al centro de la partcula (Figura 5.2). Las

barreras difusionales, tanto internas como externas, pueden sortearse por
ejemplo, disminuyendo el tamao del biocatalizador, incrementando la
agitacin, aumentando la concentracin de sustrato en el seno del lquido,
etc. Figura 5.3. Barreras difusionales del biocatalizador inmovilizado [14]. (1)
Resistencia externa en el seno del lquido, (2) Resistencia externa en la
pelcula estanca y (3) Resistencia interna del soporte.