**La coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la

conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes
tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene
Staphylococcus aureus. Esta proteína también es producida por Yersinia pestis.

Prueba de la coagulasa
La prueba de la coagulasa se usa para diferenciar el Staphylococcus aureus de los Staphylococcus
coagulasa negativos. S.aureus produce 2 formas de coagulasa (por ejemplo, coagulasa ligada y
coagulasa libre). La coagulasa ligada también conocida como "factor de Clumping " se puede
detectar mediante la realización de una prueba de portaobjetos y la coagulasa libre con una
prueba de coagulasa de tubo.
Prueba de portaobjetos
Prueba del portaobjetos se hace conjuntamente con un control negativo para descartar auto
aglutinación. Se ponen 2 gotas de solución salina en un portaobjetos rotulado con el número de
muestra, Test (T) y control (C). Las 2 gotas son emulsionadas con el organismo de prueba
mediante el uso de un cable de lazo, cable recto, o un aplicador de madera. Se pone una gota
de plasma (plasma de conejo con anticoagulante (EDTA)1) en la gota de solución salina inoculada
correspondiente a la prueba y se mezcla bien con un aplicador de madera. Agitar el portaobjeto
con cuidado unos 10 segundos.
Si es positivo: Se podrá observar aglutinación macroscópica en el plasma en los 10 segundos,
mientras que no se observará aglutinación en la gota de solución salina.
Si es negativo: No se observará aglutinación.
NOTA: Si la prueba de la coagulasa de portaobjetos fuera negativa, deberìa hacerse una prueba
de tubo como confirmación. El aglutinamiento en las dos gotas es un indicativo de auto
aglutinación y por lo tanto debemos descartar la prueba de tubo.

Prueba del tubo de ensayo

La prueba se utiliza plasma que ha sido inoculado con una colonia de staphylococcal (por
ejemplo, con un coco gram positivo catalasa positivo). Luego el tubo se incuba a 37 grados
Celsius en 1½ horas. Si es negativo entonces continuamos la incubación por unas 18 horas.
Si sale positivo (por ejemplo, la colonia problema es S. aureus), el suero coagulará,2 dando como
resultado un coágulo (a veces el coágulo esta tan desarrollado que el líquido se solidifica
completamente).
Si sale negativo, el plasma permanece líquido. Un resultado negativo podría indicar que se
podría tratar de S. epidermidis pero solo con unas pruebas más precisas se puede confirmar este
hecho, como por ejemplo el API o métodos de BBL CRYSTAL.
Lista de staphylococci coagulasa positivo : Staphylococcus aureus subsp. anaerobius,
Staphylococcus aureus subsp. aureus, Staphylococcus delphini, Staphylococcus hyicus,
Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lutrae, Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans.
Lista de' 'staphylococci coagulasa negativo de relevancia clínica: S.saprophyticus, S.cohnii subsp.
cohnii, S.cohnii subsp. urealyticum, S.captitus subsp. captitus, S.warneri, S.hominis,
S.epidermidis, S.caprae.
Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos
El término Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas
que secretan una enzima que provoca coagulación del fibrinógeno sanguíneo,
utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos
de defensa del huésped. Esta reacción se utiliza in vitro para la identificación de cepas
de Staphylococcus productoras de toxinas, mediante el uso de plasma.
FUNDAMENTO
La presente técnica para la detección de Staphylococcus aureus, consiste en los
siguientes pasos:
1. Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo sólido, el cual inhibe el desarrollo
de géneros diferentes al Staphylococcus, pero además permite reconocer el
desarrollo característico del microorganismo buscado.
2. Recuperación de la cepa, este paso permite restaurar las células dañadas de
Staphylococcus aureus.
3. Identificación bioquímica, en este punto se identifica el género y especie de
Staphylococcus aureus enterotoxigénico.
Estas pruebas bioquímicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima
coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. La caracterización bioquímica de
Staphylococcus aureus toxigénico en estas pruebas es la siguiente:
Presencia de coagulasa -positiva
Presencia de termonucleasa – positiva

Prueba de la presencia de la enzima coagulasa.

1. Con una pipeta estéril de 1 mL, tomar 0.2 mL de la suspensión del microorganismo que
desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón, adicionar 0.2 mL de plasma de conejo. Dicho
plasma previamente diluido volumen a volumen con solución salina estéril.
2. Incubar en baño María o en incubadora, entre 35 y 37º C y observar durante 6 h. en intervalos
de 1 hora; en caso de no presentarse formación de coágulo, prolongar el período de observación
hasta por 24 h.
3. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo, tomar 0.5 mL de plasma reconstituido
y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm, posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio
al 5%; se debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos.
NOTA
Analizar la consistencia del coágulo y registrar ésta, de acuerdo con los valores del cuadro 2.
Considerar la prueba positiva solamente si hay formación de coágulo con un valor
igual o superior a 2 cruces.
CUADRO 2. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa
VALOR CARACTERÍSTICA
negativa No se observa formación de coágulo.
1+ (positiva) Formación de coágulos pequeños desorganizados.
2+ (positiva) Formación de coágulo pequeño organizado
3+ (positiva) Formación de un gran coágulo organizado
4+ (positiva) Todo el contenido del tubo está coagulado. Al invertir el tubo este coágulo se
mantiene en el fondo del mismo.
Prueba de la enzima termonucleasa.
1. Calentar 0.3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión cerebro
corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo.
2. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensión bacteriana, del
punto anterior, con ayuda de una pipeta Pasteur estéril. Es recomendable incluir testigos tanto
positivos (S. aureus ATCC 6538), como negativos (S. epidermidis ATCC 12228).
3. Incubar a 35 2 C en cámara húmeda, durante 4 a 24 h.
4. Después de incubar, adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M a los orificios hechos
en el agar DNA. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de orto-toluidina).
5. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro alrededor del
orificio, en donde se inoculó, indicará que el microorganismo posee la enzima termonucleasa.
6. En el caso de no contar con orto toluidina, se puede utilizar HCl 1.0N como indicador. De
encontrarse esta enzima, se observa un halo transparente alrededor de la colonia, seguido de
un precipitado blanco.
NOTA
Si se utiliza el medio de cultivo comercial, generalmente ya tiene el indicador de orto toluidina,
por lo que después de la incubación se podrá observar la coloración rosa en donde se inoculó,
en caso de encontrarse dicha enzima. Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas
bioquímicas: la fermentación de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia
de la enzima catalasa; cuando ambas pruebas son positivas, quiere decir que el microorganismo
fermenta el manitol y produce ácido en condiciones anaeróbicas y además contiene la enzima
catalasa.
Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis (opcional, no lo exige la norma).
1. Inocular 2 asadas en caldo manitol, de la suspensión del microorganismo que desarrollado en
el medio infusión cerebro corazón.
2. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado, entre 0.3 y 0.5 mL de parafina
o aceite mineral estéril.
3. Incubar a 35C 2 C por 24 h. y observar los resultados.
4. Considerar la prueba como positiva, si se presenta desarrollo y vira el indicador. Si el medio
contiene como indicador el rojo de fenol, el medio debe virar a color amarillo por la producción
de acidez.
Prueba de la catalasa (opcional, no lo exige la norma).
1. Con una asa bacteriológica, tomar un inóculo del caldo infusión cerebro corazón después de
su incubación, y colocarlo sobre un portaobjetos,
2. Adicionar una o dos gotas de peróxido de hidrógeno al 30%, mezclar perfectamente bien y
observar los resultados.
3. Si se presenta formación de burbujas, se considera positiva la prueba, esto es que sí contiene
la enzima catalasa. En caso de no formarse burbujas la prueba se interpretará como ausencia de
esta enzima.

Discos de Optoquina
USO
Diferenciación de Streptococcus pneumoniae de otras especies deestreptococos alfa
hemolíticos (por ejemplo Streptococcus grupo viridans).
FUNDAMENTO
Streptococcus pneumoniae y Streptococcus grupo viridans son cocos Gram positivos que
presentan colonias alfa hemolíticas cuando crecen en medios sólidos suplementados con 5-10
% de sangre de carnero. Se pueden diferenciar mediante la realización de pruebas bioquímicas
como ser la prueba de sensibilidad a la optoquina y la prueba de solubilidad en bilis.
La optoquina inhibe el desarrollo de Streptococcus pneumoniae mientras que otros
estreptococos no son inhibidos o presentan una zona pequeña de inhibición alrededor del disco.
La correlación entre la sensibilidad a la optoquina y la prueba de solubilidad en bilis ha sido
demostrada por varios autores.
CONTENIDO Y COMPOSICIÓN
Código B1240227: envase x 50 discos.
Discos impregnados con optoquina (clorhidrato de etilhidrocupreína) 5 ug.
PROCEDIMIENTO
Siembra
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, utilizando un hisopo o un ansa de
inoculación estéril, inocular una placa de Agar Sangre ( ) en las cuatro direcciones para cubrir
toda la superficie del medio de cultivo. Luego colocar un disco de Optoquina sobre la superficie
del agar.
Incubación
En atmósfera 5-10% de CO2, a 35-37 ºC durante 18 - 24 horas.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Examinar la placa y medir el diámetro de la zona de inhibición del Discos de Optoquina B1240227
desarrollo microbiano alrededor del disco de Optoquina.
Sensible: halo de inhibición del desarrollo microbiano, de diámetro mayor o igual a 14 mm es
presuntivo para Streptococcus pneumoniae. Las zonas de inhibición inferiores a 14 mm de
diámetro son cuestionables para Streptococcus pneumoniae y deben ser confirmadas
por pruebas adicionales, como ser la prueba de solubilidad en bilis.
Resistente: crecimiento no inhibido alrededor del disco o menor a 14 mm.
Discos de Bacitracina
Uso
Para la diferenciación de estreptococos beta hemolíticos del grupo A de otros estreptococos
beta hemolíticos.
Fundamento
La bacitracina es un antibiótico que inhibe la síntesis de pared celular bacteriana, y a la
concentración que se encuentra en los discos (0,04 U) inhibe el crecimiento de los estreptococos
beta hemolíticos del grupo A de Lancefield pero no inhibe el desarrollo de otros estreptococos
beta hemolíticos.
Los micrococcus y los estomatococcus también son inhibidos por la bacitracina, mientras que
los estafilococos coagulasa negativa son resistentes.
Un resultado sensible a la bacitracina 0,04 U es presuntivo de la presencia de estreptococo grupo
A, y se puede incrementar además el valor diagnóstico y facilitar la identificación de la cepa
bacteriana en cuestión mediante la utilización de los discos de PYR-A Enterococos
Interpretación de los resultados
Observar si existe zona de inhibición del desarrollo microbiano alrededor del disco de Bacitracina
0,04 U.
Sensible: presencia de halo de inhibición (independientemente del diámetro) del desarrollo
alrededor del disco.
Informar: estreptococo beta hemolítico presuntivamente del grupo A por la prueba de
bacitracina.
Resistente: ausencia de halo de inhibición del desarrollo alrededor del disco.
Informar: estreptococo beta hemolítico que presuntivamente no pertenece al grupo A por la
prueba de bacitracina.

AGAR SANGRE
Preparación
Cada casa comercial trae al reverso del envase las indicaciones para preparar un litro de medio
de cultivo. Se pueden hacer los cálculos correspondientes para preparar la cantidad deseada,
según el agar base seleccionado.
Pesar y disolver
El agar base viene deshidratado (en polvo), por tanto debe disolverse en agua destilada ajustada
a pH 7,3.
Se pesa la cantidad que indique el agar base escogido y se disuelve en la cantidad de agua
correspondiente en una fiola, luego se calienta a fuego moderado y se mezcla con movimientos
rotativos hasta disolver todo el polvo.

Esterilizar
Una vez disuelto, esterilizar en autoclave a 121°C por 20 minutos.
Agregado de la sangre
Al salir del autoclave se dejar enfriar la fiola hasta que la temperatura oscile entre 40 a 50 °C; es
una temperatura que la piel humana soporta y a la vez el agar aun no se ha solidificado.
Para ello, se toca la fiola con la mano y si el calor es tolerable, es la temperatura ideal para
agregar la cantidad de sangre desfibrinada correspondiente (50 ml por cada litro de agar).
Mezclar suavemente para homogeneizar.
El paso del agregado de la sangre es crucial, pues si se realiza cuando el medio está muy caliente
los glóbulos rojos se romperán y el medio no servirá para observar hemólisis.
Si se agrega demasiado frío, se formarán grumos y la superficie del medio no quedará lisa para
poder hacer el estriado adecuadamente.
Verter en las placas de Petri
Servir en placas de Petri estériles inmediatamente después de homogeneizar la sangre. En cada
placa de Petri se vierte aproximadamente 20 ml. Este procedimiento se realiza en una campana
de flujo laminar o cerca del mechero
Al momento de servir el agar sangre en las placas de Petri no deben quedar burbujas de aire en
la superficie de la placa. Si esto sucede se pasa la llama del mechero de Bunsen rápidamente
sobre la placa para eliminarlas.
Las placas se dejan solidificar y se guardan en nevera (2-8°C) de forma invertida hasta su uso.
Antes de usar las placas de agar sangre se deben atemperar (dejar que tomen temperatura
ambiente) para poder ser sembradas.