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Que es la fluorescencia?
SEGUNDA ETAPA
Microscopio de
inmunofluorescencia
Fuente de luz (lámpara de mercurio)
Filtros
Espejo dicroico
Excitación - Emisión
Tipos de filtros
Fluorocromos
Sustancias que emiten un fotón cuando
son excitados por un fotón incidente.
Formen uniones con las proteínas (Ac)
pero sin afectar los grupos de
combinación específica del anticuerpo.
La reacción de unión ocurre entre los
grupos amino y carboxilo de la
proteína y los grupos tiocianato o
cloruro de sulfonilo de los colorantes
El pH afecta la fluorescencia y por
esta razón se debe trabajar a pH
estable y adecuado dependiendo del
colorante : fluoresceína (pH 8),
rodamina (pH 7),
DANS (pH 1.6-14)
PARÁMETROS DE FLUORESCENCIA
Afinidad
Selectividad
Especificidad
Intensidad (brillo)
Estabilidad
Competitividad
Ventajas y desventajas
VENTAJAS
- Se pueden obtener resultados rápidos.
-No es necesario realizar cultivos.
-Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto.
-Determina la identidad de un organismo muerto. Es sensible.
DESVENTAJAS
-Costos en reactivo y equipo
-Debe ser realizado por personal muy especializado.
-Los resultados no son 100% específicos
Photobleaching
Es la disminución de la intensidad de emisión de
la muestra debido a la descomposición
irreversible de la fluorescencia de las
moléculas.
Este fenómeno esta directamente relacionado
con la intensidad de excitación y y con el tiempo
durante el cual estamos excitando la muestra.
Para reducir este efecto podemos utilizar “anti
fading” (glicerina) en la preparación de la
muestra.
Detección de Anticuerpos Anti-
Cándidas por Inmunofluorescencia
1 -Colocar 10 µl de una suspensión de 106 cándidas en cada wells
de un portaobjeto de 7 wells. Dejar secar.
Las células
fluorescentes
representan células
infectadas con el virus
dengue. Infección
evidenciada con
anticuerpos
monoclonales para
cada serotipo.
Biopsias renales :