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Mecanismo cinético y catálisis de la enzima dihidroorotato de deshidrogenasa de Trypanosoma

cruzi evaluada por calorimetría de titulación isotérmica.

Resumen
La dihidroorotato deshidrogenasa de Trypanosoma cruzi (TcDHODH) cataliza la oxidación del L-
dihidroorotato para orotar con la reducción concomitante de fumarato a succinato en la vía
biosintética de pirimidina de novo. Basado en la importante necesidad de caracterizar el
mecanismo catalítico de TcDHODH, hemos adaptado un protocolo para medir los parámetros
cinéticos de TcDHODH basados en la calorimetría de titulación isotérmica.
Los ensayos enzimáticos conducen a las curvas de Michaelis-Menten que permiten la constante de
Michaelis (KM) y la velocidad máxima (Vmax) para ambos sustratos de TcDHODH: dihidroorotato
(KM = 8.6 ± 2.6 lM y Vmax = 4.1 ± 0.7 lM s – 1) y fumarato (KM = 120 ± 9 lM y Vmax = 6.71 ± 0.15
lM s – 1). La actividad de TcDHODH se investigó utilizando dimetilsulfóxido (10%, v / v) y Triton X-
100 (0,5%, v / v), que parecen facilitar el proceso de unión del sustrato con una pequeña
disminución en KM. El análisis de la trama de Arrhenius permitió la determinación de los
parámetros termodinámicos de activación de sustratos y dio algunas ideas sobre el mecanismo de
la enzima. La entropía de activación fue el principal contribuyente a la energía libre de Gibbs en la
formación de estado de transición. Un factor que podría contribuir a la entropía desfavorable es el
acceso obstaculizado de los substratos al sitio activo de TcDHODH, donde un bucle en su entrada
regula el canal abierto-cerrado para el acceso a los substratos.

La enfermedad de Chagas o la tripanosomiasis americana, causada por el parásito protozoario

flagelado Trypanosoma cruzi, se ha considerado una de las enfermedades más olvidadas del
mundo. La estrategia de control disponible no ha ayudado completamente a reducir la carga de la
enfermedad. A pesar de los esfuerzos de Brasil para controlar esta enfermedad, un gran segmento
de la población aún sufre sus efectos [1]. Los datos estimados más recientes del Proyecto de
Prioridades de Control de Enfermedades de los Institutos Nacionales de Salud y el Banco Mundial
indican un número total de 9.8 millones de personas infectadas con T. cruzi [2].

La progresión de esta enfermedad puede conducir a síntomas como miocardiopatía inflamatoria,

trastornos neuronales y lesiones digestivas.

Un gran porcentaje de pacientes con Chagas no reciben terapia antiparasitaria específica debido a
la ineficacia y toxicidad de los agentes farmacológicos en uso (nifurtimox y benznidazol).

Por lo tanto, se deben desarrollar mejores agentes terapéuticos y nuevos objetivos

farmacológicos, pero al centrarse en los desafíos que enfrenta el medicamento selección y
caracterización de objetivos, se debe tener cuidado antes.

La búsqueda de compuestos activos puede comenzar. Esto significa que debemos, por ejemplo,
describir el mecanismo bioquímico de los objetivos para lograr la complementariedad del sitio
activo (estérico, electrostático e hidrofóbico).
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La dihidroorotato deshidrogenasa de Trypanosoma cruzi (TcDHODH, 1 EC 1.3.99.11) cataliza una

reacción redox acoplada en la que el dihidroorotato (DHO) se oxida para orotar y el fumarato se
reduce a succinato. Este es el cuarto paso enzimático en la vía biosintética de pirimidina de novo
[3]. Aunque la función enzimática de las dihidrohidrato de deshidrogenasas (DHOD) se conserva en
todos los organismos, las enzimas en los organismos procariotas y eucariotas son bastante
diferentes [4].

Según la identidad de secuencia de aminoácidos, los DHOD se han clasificado en dos familias
denominadas familia 1 y familia 2. Los DHOD de la familia 1 son enzimas citoplasmáticas
subdivididas en las familias 1A y 1B.

El TcDHODH pertenece a las enzimas homodiméricas 1ª familia que tiene fumarato como sustrato
reducido, mientras que las enzimas 1B son heterotetramers que usan nicotinamida adenina
dinucleótido (NAD +) como agente oxidante. Los DHOD de la familia 2 son enzimas ancladas a la
membrana que existen como monómeros y usan quinonas como agentes oxidantes [5].

Varios fármacos antitumorales e inmunosupresores actúan sobre el DHOD humano. Los dos
fármacos más prometedores son brequinar (antitumoral e inmunosupresor) y leflunomida
(inmunosupresor). Este último ha sido aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos para
su uso en la artritis reumatoide (Arava, Hoechst Marion Roussel). La inhibición de los DHOD
provoca una disminución de las reservas intracelulares de las bases de nucleótidos uracilo, citosina
y timina, lo que hace que los DHOD sean objetivos farmacológicos atractivos. En los estudios de
eliminación de DHOD, T. cruzi no expresó la proteína enzimática y no pudo sobrevivir incluso en
presencia de nucleósidos de pirimidina, lo que confirma su dependencia de la biosíntesis de
denovo [6]. Debido a que TcDHODH es un objetivo válido, es de suma importancia dilucidar su
mecanismo catalítico y caracterizar su actividad [7], lo que permite el desarrollo de un método
rápido y sensible para medir la actividad inhibitoria de los compuestos.

La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se ha utilizado en ensayos cinéticos enzimáticos para

dilucidar los mecanismos catalíticos enzimáticos y determinar los parámetros cinéticos de
Michaelis-Menten [8].

El principio general del ITC es la medición del flujo de calor a temperatura constante. La velocidad
a la que se produce o absorbe calor puede estar relacionada con la velocidad de conversión que
tiene lugar en una reacción enzimática. La actividad enzimática se controla en tiempo real sin
necesidad de ninguna sonda [9]. Aunque el ITC se usa para estudiar las propiedades
termodinámicas de los sistemas biológicos, esta técnica no se ha explorado en profundidad como
un medio para investigar la inhibición enzimática. El ITC tiene una ventaja sobre los métodos de
ensayo comúnmente utilizados debido a su capacidad para detectar cambios de calor durante la
conversión enzimática en condiciones tales como la poca transparencia de la solución sin
necesidad de ligandos cromogénicos, fluorogénicos o enriquecidos con radioisótopos (marcados).
Los cambios de calor son fundamentales durante los eventos de unión y las reacciones
bioquímicas; así, el ITC es un método ideal para la caracterización de reacciones enzimáticas [10].
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En este artículo, describimos por primera vez la determinación de Parámetros cinéticos de la

enzima TcDHODH por ITC. También medimos la constante de inhibición y dilucidamos el
mecanismo de acción del producto de reacción, orotato, para establecer un patrón de respuesta
de TcDHODH cuando se usa para detectar sustancias químicas. Además, se realizaron
experimentos cinéticos en presencia del codisolvente dimetil sulfóxido (DMSO) [11], un disolvente
común que mejoraba la solubilidad de los compuestos químicos en agua, y Triton X-100, un
tensioactivo no iónico utilizado para prevenir la agregación molecular que con frecuencia conduce
a falsos positivos durante los ensayos de detección. También es importante medir la energía libre,
la entalpía y la entropía de activación (DG #, DH # y DS #, respectivamente) de la reacción
enzimática para revelar la importancia relativa de las contribuciones entálpicas y entrópicas del
sustrato a la catálisis. Una descripción del estado de transición enzimática puede ser útil en el
diseño de análogos del estado de transición y en la búsqueda de inhibidores con alta afinidad por
la enzima TcDHODH.

Materiales y métodos

Materiales: reactivos necesarios para la clonación, expresión y purificación de TcDHODH.

El isopropil b-D-tiogalactosido (IPTG) se obtuvo de Invitrogen Life Technologies (São Paulo, Brasil).
Níquel-nitrilotriacético se obtuvo resina de afinidad ácida (Ni-NTA) de Qiagen (Hilden, Alemania), y
se obtuvo antibiótico de kanamicina de Calbiochem (La Jolla, CA, EE. UU.). Los patrones de
proteínas utilizados como marcadores de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-
poliacrilamida (SDS-PAGE) se obtuvieron de Sigma Chemical (St. Louis, MO, EE. UU.).

Los reactivos químicos necesarios para el ensayo cinético enzimático DHO, ácido orótico (orotato),
ácido fumárico (fumarato), base de Trizma y fosfato de sodio dibásico y monobásico se
adquirieron de Sigma-Aldrich. El cloruro de sodio se obtuvo de Fluka.

Preparación de la enzima

El TcDHODH recombinante se expresó y purificó como descrito en otra parte [12]. Brevemente, la
purificación de la enzima amarilla TcDHODH (masa molecular de 34 kDa para la proteína dimérica)
encontrada en la fracción soluble se cargó en una columna de 2 ml de resina de Ni-NTA
equilibrada con tampón de lisis (fosfato de sodio 50 mM [pH 8.0 ] y NaCl 300 mM). La columna se
lavó luego con un gradiente escalonado de imidazol de 0 a 100 mM en tampón de lisis más
imidazol. Los lavados consistieron en 40 ml de tampón de lisis sin imidazol seguido de 50 ml de
tampón de lisis más imidazol 25 mM y luego 10 ml de tampón de lisis más imidazol 50 mM.

El TcDHODH recombinante se eluyó con aproximadamente 20 ml de tampón de lisis en presencia

de imidazol 100 mM, y se comprobó la pureza en geles electroforéticos SDS-PAGE al 12%. La
absorbancia ultravioleta (UV) a 280 nm, basada en los coeficientes de extinción molar de
triptófano y residuos de tirosina, se utilizó para estimar la concentración de proteínas [13]. El
coeficiente de extinción calculado para el TcDHODH recombinante fue de 15.840 M – 1 cm – 1. Las
fracciones activas se dializaron a 4ºC contra solución salina tamponada con fosfato (fosfato sódico
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50 mM y NaCl 150 mM [pH 8,0]) y solución salina tamponada con Tris (Tris 20 mM y NaCl 150 mM
[pH 8,0]). La enzima se concentró con 10 kDa Amicon (Millipore) en solución salina tamponada con
Tris.

Determinación de la aparente entalpía de reacción.

El ITC determinó la entalpía molar aparente (DHapp) de la conversión de DHO para orotar por
TcDHODH como sigue. La celda de muestra del calorímetro, con 1,43 ml, se cargó con solución
salina tamponada con Tris (pH 8,0) que contenía fumarato 1,6 mM y TcDHODH 300 nM.

y se tituló mediante una inyección única de 10 lL de una jeringa cargada con DHO 3,0 mM en el
mismo tampón. Después de un período de equilibrio preliminar, cuando el instrumento alcanzó la
temperatura de 298 K, se permitió un período de retraso adicional de 60 s para generar la línea
base. Después de este retraso, la reacción se inició automáticamente mediante la inyección de
DHO con una referencia de calor a 25 lcal s – 1.

El agotamiento completo de DHO y el final de la reacción se indicaron mediante el retorno de la

potencia térmica instrumental a la línea de base.

La velocidad de agitación de la jeringa de inyección se ajustó a 307 rpm. El flujo de calor

(microcalorías por segundo) se registró en función del tiempo.

El calor generado por la dilución del sustrato se determinó en las mismas condiciones
experimentales, excepto por la ausencia de enzima [14]. La entalpía molar aparente se determinó
restando el calor de dilución del calor total generado durante la reacción y dividiendo por el
número de moles de DHO inyectados en la celda de muestra. El calor involucrado en el ensayo se
encontró integrando el área bajo la curva de flujo de calor. El calor de la ionización del tampón se
verificó realizando el experimento de entalpía aparente en las mismas condiciones pero con un
tampón diferente, a saber, solución salina tamponada con fosfato (pH 8,0).

Cinética enzimática por el ITC

Los experimentos de valoración se llevaron a cabo con un calorímetro VP-ITC (MicroCal,

Northampton, MA, EE. UU.) [15]. Las soluciones se desgasificaron por medio de un desgasificador
de vacío (ThermoVac, MicroCal) y se termostataron durante 5 minutos antes de cualquier
ejecución experimental. Se usó una referencia de calentamiento de 25 lcal s – 1 en todos los
experimentos. Se midió el flujo de calor liberado durante la reacción catalizada por enzimas y se
encontró que era directamente proporcional a la velocidad de la reacción (V).

Las relaciones que se muestran en las ecuaciones. (1) - (3) a continuación permiten que los
parámetros cinéticos, velocidad máxima, constante catalítica aparente y constante de Michaelis
(Vmax, k app cat y KM, respectivamente) se determinen a partir de un solo experimento de ITC.
Aunque el calorímetro VP-ITC empleado en este trabajo no está destinado a ser utilizado en la
detección de alto rendimiento (HTS), los resultados descritos aquí serán útiles para aquellos que
trabajan en esta importante área de inhibición enzimática. Para los resultados de HTS utilizados
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para identificar candidatos principales para el desarrollo de fármacos, recientemente se presentó

un algoritmo de optimización basado en información entálpica y entrópica generada por el ITC
[16]. Por otro lado, es digno de mención que con el nuevo ITC200, un rendimiento de hasta 75
muestras por día con una capacidad para ejecutar 384 muestras sin supervisión ya está a la mano.

Ecuación (1).

Donde [P] t es la concentración instantánea del producto, V0 es el volumen constante de la celda

de muestra (1,43 ml) y dQ / dt es la tasa de flujo de calor medida durante el experimento. La
entalpía molar aparente (DHapp) de la conversión del sustrato en producto se determina
experimentalmente (ver arriba).

La concentración de sustrato [S] t se calcula en cualquier momento utilizando la expresión.

Ecuación (2).

Donde [S] 0 es la concentración inicial del sustrato.

Los parámetros cinéticos Vmáx y KM se obtuvieron ajustando los datos calorimétricos a la

ecuación de Michaelis-Menten [17] (ecuación (3)) usando un análisis de regresión de mínimos
cuadrados no lineal:

Ecuación (3).

Debido a que la catálisis enzimática de TcDHODH depende de los dos sustratos, DHO y fumarato,
los ensayos se realizaron en condiciones de pseudo primer orden utilizando un exceso de un
sustrato y titulando el otro. Para seguir el comportamiento cinético de DHO, se llenó una jeringa
con solución salina tamponada con Tris (pH 8,0) que contenía DHO 3,0 mM y la celda de muestra
se llenó con el mismo tampón que contenía fumarato 1,6 mM y enzima TcDHODH 50 nM. El DHO
se tituló mediante 20 inyecciones de 1,0 l. Para analizar el segundo sustrato, se valoraron 15
inyecciones de 3,0 l de fumarato (16 mM en solución tamponada) en la celda de muestra llena de
TcDHODH 300 nM y DHO 4 mM en la misma solución salina tamponada con Tris. Estos
experimentos se llevaron a cabo a 298 K y una velocidad de agitación de 307 rpm.

Método espectrofotométrico para la determinación de la reacción de TcDHODH La reacción de

TcDHODH se ensayó convencionalmente en el espectrofotómetro en paralelo al método ITC con
TcDHODH 50 nM, variando el DHO del sustrato de 10 a 50 lM y el fumarato en exceso (1.6 mM). Se
realizó un segundo ensayo con fumarato a diversas concentraciones que varían de 100 a 400 lM,
DHO a 4 mM y TcDHODH a 300 nM. La reacción se inició inyectando enzima en la mezcla de
reacción en solución salina tamponada con Tris (pH 8,0) a 25 ° C (pH 8,0). Los datos cinéticos se
obtuvieron midiendo la formación del producto orotato. El coeficiente de extinción molar para
orotato a 300 nm utilizado fue 2650 M – 1 cm – 1.

Parámetros cinéticos y entalpía aparente en presencia de tensioactivos cosolventes y no iónicos.

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La actividad de la enzima TcDHODH se investigó en presencia del codisolvente orgánico DMSO y el

tensioactivo no iónico Triton X-100. Los experimentos de titulación isotérmica se llevaron a cabo
con fumarato 16 mM en la jeringa y TcDHODH 300 nM y DHO 4,0 mM en la celda de muestra.
Todas las soluciones se prepararon en solución salina tamponada con Tris (pH 8,0). El sustrato se
tituló mediante 15 inyecciones de 3,0 lL en la celda de muestra en presencia de DMSO (10%, v / v)
o Triton X-100 (0,5%, v / v) con un intervalo de 120 s entre inyecciones a 298 K. La potencia de
referencia fue de 25 lcal s – 1, y la velocidad de agitación fue de 307 rpm. La entalpía aparente
molar (DHapp) de reacción se determinó llenando la celda de muestra con fumarato 1,6 mM y
TcDHODH 300 nM y llenando la jeringa con DHO 3,0 mM. La reacción se tamponó en Tris 20 mM y
NaCl 150 mM (pH 8.0) a una temperatura de 298 K y se tituló mediante una inyección de 10 ll en
presencia de DMSO (10%, v / v) o Triton X-100 ( 0,5%, v / v) (referencia de calor: 25 lcal s – 1). Los
experimentos de control se llevaron a cabo en ausencia de cualquier codisolvente.

Inhibición enzimática por orotato

En el ensayo de inhibición calorimétrica de TcDHODH, la jeringa se llenó con fumarato 16mM y la

celda de muestra se llenó con DHO 4,0 mM y TcDHODH 300 nM, preparándose todas las
soluciones en solución salina tamponada con Tris (pH 8,0). El fumarato se tituló mediante 15
inyecciones de 3,0 lL a intervalos de 120 s a una temperatura de 298 K, una potencia de referencia
de 25 lcal s-1 y una velocidad de agitación de 307 rpm. Se realizó un experimento de control en
ausencia de orotato. Para llevar a cabo la evaluación de inhibición enzimática por orotato, se
añadió a la célula de muestra a concentraciones variadas de 50, 100, 200 y 300 lM.

Determinación de los parámetros de reacción termodinámica de activación.

Los parámetros termodinámicos de activación se llevaron a cabo mediante múltiples valoraciones

de inyección de cada sustrato en un exceso del otro en presencia de TcDHODH a 293, 298, 303 y
310 K. La célula de muestra de ITC se llenó con fumarato 1,6 mM y 50 nM. La enzima TcDHODH y
20 inyecciones de 1,0 l de solución de DHO (3,0 mM) se añadieron a la solución de proteína en la
célula ITC con un intervalo de monitorización de 60 sy una velocidad de agitación de 307 rpm.

Luego se investigó el comportamiento cinético del fumarato llenando la jeringa con la solución
tampón que contenía fumarato 16 mM. La celda de muestra se llenó con la solución tamponada
de DHO 4,0 mM y TcDHODH 300 nM. Los experimentos se llevaron a cabo titulando el fumarato
mediante 15 inyecciones de 3.0 lL con un intervalo entre inyecciones de 120 s, una velocidad de
agitación de 307 rpm y temperaturas a 293, 298, 303 y 310 K. Un período de retraso inicial de 60 s.
permitió generar la línea de base utilizada en los análisis de datos posteriores. El flujo de calor (lcal
s-1) se registró en función del tiempo. Para deducir la dependencia de la temperatura de la
reacción, se analizaron los parámetros cinéticos haciendo gráficos de Arrhenius para temperaturas
que oscilan entre 293 y 310 K. La energía de activación (Ea) se calculó a partir de la pendiente (Ea /
R) del gráfico de Arrhenius, y luego en las siguientes ecuaciones [18] estimaron los parámetros de
activación termodinámica, entalpía (DH #), entropía (DS #) y energía libre de Gibbs (DG #) de
activación.
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Ecuación (4, 5, 6)

Donde los valores de energía están en kJ mol – 1, con kcat en s – 1, para ajustarse a las unidades
de las constantes de Boltzmann (1.3805 10–23 JK – 1) y Planck (6.6256 10–34 J s – 1) y R es la
constante de gas (8.314 J mol – 1 K – 1).

Análisis de los datos

Los análisis de datos brutos del ITC de la entalpía de reacción se realizaron con el programa de
análisis gráfico Origin 7.0, y los datos que representan los efectos de dilución por calor, debido a la
dilución del sustrato en el tampón y la mezcla, se restaron de los datos de flujo de calor en bruto
[19].

Los parámetros cinéticos se analizaron y calcularon en el modo de ensayo enzimático del

programa SigmaPlot 10.0.

Resultados

Entalpía aparente de la reacción de TcDHODH.

En los experimentos de reacción de ITC, la cantidad de calor intercambiado es proporcional a la

entalpía molar aparente (DHapp). En este experimento, se colocó una gran cantidad de enzima en
la celda de muestra para asegurar que todo el sustrato se convirtiera en producto. El sustrato DHO
se eligió como el reactivo limitante. La inyección de 10 lL condujo a una dilución del DHO de 3.0
mM (jeringa) a 21 lM (celda de muestra), mientras que el fumarato permaneció a una
concentración constante de 1.6 mM en la celda de muestra (Fig. 1).

La figura 1 muestra una traza calorimétrica típica (flujo de calor frente al tiempo).

La señal de salida adopta valores negativos porque representa la variación en la retroalimentación

actual en la celda de referencia requerida para compensar el calor liberado por la reacción en la
celda de muestra. La reacción se completa, lo que permite determinar DHapp integrando el área
de pico total en la traza del calorímetro. DHapp se calculó con la ecuación. (7):

Ecuación (7) y gráfico.

Fig. 1. Flujo de calor en función del tiempo (lcal s – 1) para que la oxidación de DHO se orotee y la
reducción de fumarato a succinato. La flecha corresponde a la inyección del sustrato y al inicio de
la reacción. La temperatura se ajustó a 298 K y la potencia térmica del instrumento se controló
hasta que la línea base regresó al valor inicial. Se tituló DHO (3,0 mM) en la jeringa en una única
inyección de 10 ll en la celda de muestra que contenía fumarato 1,6 mM y TcDHODH 300 nM.
Tampón: Tris 20 mM y NaCl 150 mM (pH 8.0). La curva azul es el calor de la dilución del sustrato
en las mismas condiciones en ausencia de TcDHODH. El calor de reacción se sustrajo del evento de
dilución. (Para la interpretación de la referencia al color en esta leyenda de la figura, se remite al
lector a la versión web de este artículo).
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La DHapp obtenida fue –11,64 ± 1,78 kcal mol – 1 (de tres mediciones independientes). Este valor
de DHapp se usó para calcular la velocidad de reacción (ecuación (1)) como se describe a
continuación.

Determinación calorimétrica de la actividad enzimática de TcDHODH

La velocidad de reacción depende de las concentraciones de fumarato y DHO, pero se puede

describir en términos de cinética de pseudo primer orden cuando uno de ellos se mantiene en
exceso [14]. La actividad enzimática se controló para ambos sustratos en experimentos separados
a diferentes concentraciones. Inicialmente, las concentraciones óptimas de la enzima y el sustrato
se determinaron controlando la conversión de fumarato a succinato por TcDHODH a través de ITC.
Un requisito para que una enzima funcione a través del mecanismo de Michaelis-Menten se
cumple cuando alcanza la condición de estado estable, donde la concentración del complejo
enzima-sustrato [ES] permanece constante a una concentración de sustrato dada. La figura 2
muestra datos sin procesar para la potencia térmica representada frente al tiempo en los ensayos
de inyección múltiple.

Las condiciones de estado estacionario se verificaron de dos maneras diferentes.

La primera forma era analizar las mesetas establecidas entre inyecciones, donde la concentración
de intermedio [ES] permanece constante, cuando las tasas de formación y descomposición del
complejo fueron iguales. Como resultado, se observó una meseta bien definida, como se muestra
en el recuadro de la Fig. 2. La segunda forma fue diseñar un experimento en el que la cantidad de
sustrato se alteró durante el transcurso de la reacción mediante la inyección de diferentes
volúmenes de sustrato (Fig. 3). Si la reacción continúa en condiciones de estado estable, los
parámetros cinéticos no cambian. Los parámetros cinéticos se resumen en la Tabla 1.

La figura 4A muestra la dependencia de la velocidad de reacción de la concentración de DHO, y la

figura 4B muestra la dependencia de la velocidad de reacción de la concentración de fumarato.

La cinética de la reacción enzimática catalizada por DHOD fue explorada tanto por
espectrofotometría UV-visible como por ITC. Los dos experimentos se llevaron a cabo con las
mismas soluciones y alícuotas enzimáticas para minimizar las diferencias debidas a errores
operativos y variaciones en la actividad enzimática. Los parámetros cinéticos determinados son del
mismo orden de magnitud que los informados para la familia DHOD (Tabla 2).

Gráfico.

Fig. 2. Datos brutos del ITC para el cambio en la potencia térmica a lo largo del tiempo en el
ensayo de inyección múltiple. Como se puede ver, dQ1 / dt (flujo de calor) es proporcional al calor
liberado en la celda de muestra. En las condiciones utilizadas, se alcanza un estado estable cuando
la velocidad (potencia) de la enzima permanece constante. La flecha corresponde a la primera
inyección de sustrato en la celda de muestra. El experimento se realizó a 298 K en solución salina
tamponada con Tris, con 15 inyecciones de 3,0 lL de fumarato 16 mM en la celda de muestra llena
de TcDHODH 300 nM y DHO 4,0 mM.
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Gráfica.

Fig. 3. Verificación experimental del estado estacionario en datos de velocidad de reacción. Curva
roja: diferentes volúmenes de sustrato inyectados (5 inyecciones de 3 ll y 3 inyecciones cada una
de 5, 7 y 10 lL de fumarato 16 mM titulado en la celda de muestra llena de TcDHODH 300 nM y
DHO 4 mM en solución salina tamponada con Tris (pH 8.0) a 298 K. Referencia: 15 inyecciones de 3
lL de fumarato 16 mM titulado en la celda de muestra llena con TcDHODH 300 nM y DHO 4 mM en
solución tamponada con Tris (pH 8.0). La velocidad se ajustó a una ecuación de Michaelis Menten.
Para la interpretación de la referencia al color en esta leyenda de la figura, se remite al lector a la
versión web de este artículo).

Tabla 1. Grafico A y B.

Fig. 4. Análisis de mínimos cuadrados no lineales de los datos experimentales a la ecuación de

Michaelis Menten para determinar los parámetros cinéticos. El panel de recuadro muestra datos
brutos del ITC para la tasa de flujo de calor representada frente al tiempo en las titulaciones de
inyección múltiple. (A) Total de 20 inyecciones de 1.0 lL de DHO 4.0 mM en la celda de muestra
que contiene fumarato 16 mM y TcDHODH 50 nM (pH 8.0) a 298 K. KM = 8.56 ± 2.6 lM. (B) Total
de 15 inyecciones de 3,0 lL de fumarato 16 mM tituladas en la celda de muestra llena de TcDHODH
300 nM y DHO 4,0 mM. En estas condiciones, se evitó completamente la inhibición del producto.
KM = 120 ± 9.0 lM.

Tabla 2.

Nota. ND, no determinado. a La producción de orotato se midió espectrofotométricamente a 300

nm (e = 2.65 mM – 1 cm – 1) en una mezcla de reacción que contenía Tris 50 mM (pH 8.0) y KCl
150 mM con los sustratos DHO y fumarato en un volumen total de 1.0 mL a 25 C [20]. b Los
ensayos se realizaron en tampón (Hepes 50 mM [pH 8,0], NaCl 150 mM y glicerol al 10%) a 25 ° C
en presencia de fumarato 500 mM, y la actividad dependiente de fumarato se ensayó en presencia
de DHO 250 mM [ 21]. c Determinado a partir de la producción de orotato midiendo la absorción a
varias longitudes de onda en fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,5) a 37 ° C [22]. d 1.0 mM DHO como
sustrato y 1.0 mM fumarato en 50 mM Tris-HCl, 150 mM KCl y 0.1% (v / v) Triton X-100 (pH 8.0) a
30 C monitoreando el aumento en la absorción UV del producto orotar [23].

Determinación de la actividad enzimática en presencia de DMSO y Triton X-100

La actividad de TcDHODH se observó en presencia de DMSO y el tensioactivo Triton X-100. La

Tabla 3 resume la entalpía molar (DHapp), la constante de Michaelis-Menten (KM), la velocidad
máxima (Vmax) y la eficiencia catalítica (k app cat / KM) con fumarato que controla la reacción
bioquímica.

Efecto de orotato en la reacción de TcDHODH

El efecto de la concentración del producto sobre el medio de reacción fue como:

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Analizado determinando la constante de inhibición aparente (Kappi) de la Fig. 5A. La velocidad de

reacción (V) se midió a diversas concentraciones de orotato en la celda de muestra. El gráfico
recíproco doble Lineweaver – Burk se muestra en la Fig. 5B. El (Kappi obtenido por regresión de
mínimos cuadrados no lineales ajustó los datos experimentales al modelo de inhibición
competitiva, ecuación (8), utilizando el software SigmaPlot 10.0:

Ecuación 8.

donde [I] es la concentración de inhibidor.

El valor de Vmax es constante en todas las concentraciones de inhibidor, pero el valor aparente de
KM (tomado como (1 + [I] / Ki)) aumenta con la concentración de inhibidor. Los efectos son más
evidentes en el gráfico recíproco doble (Fig. 5B), donde la intersección 1 / Vmax es constante para
todas las líneas pero sus pendientes (KM / Vmax) y la intersección x (–1 / KM) varían con la
concentración del inhibidor.

Tabla 3. Grafico A y B. tabla.

Fig. 5. Ensayo calorimétrico de TcDHODH en presencia de orotato. (A) Experimento de control:

fumarato 16 mM en la jeringa, DHO 4.0 mM y TcDHODH 300 nM en la celda de muestra. Todas las
soluciones se prepararon en solución tamponada con Tris (pH 8,0), con titulación de fumarato
mediante 11 inyecciones de 3,0 lL a intervalos de 120 sy 298 K. La potencia de referencia fue de 25
lcal s – 1, y la velocidad de agitación fue de 307 rpm. . Experimento de inhibición: en la celda de
muestra, orotato 50 lM. (B) Gráficos recíprocos dobles obtenidos a varias concentraciones de
orotato: 0 (control), 50, 100, 200 y 300 lM. Se ajustó un modelo competitivo no lineal a los datos
en el programa SigmaPlot con (Kappi = 110 ± 6.6 lM (de dos mediciones independientes). El (ajuste
dimérico Kappi se realiza considerando la concentración de proteína total obtenida por el método
del coeficiente de extinción molar.

Determinación de parámetros termodinámicos de activación.

Las energías de activación de las reacciones TcDHODH se calcularon determinando la pendiente (–

Ea / R) de las gráficas de Arrhenius, y los parámetros de activación termodinámica a 298 K se
estimaron a partir de las ecuaciones. (4) - (6) y se resumen en la Tabla 4.

Modus operandi y control

La reacción comenzó después de la inyección del sustrato, y la línea de base de ITC luego registró
una desviación negativa (Fig. 1), típica de una reacción exotérmica. Se realizó un experimento de
control bajo las mismas condiciones de reacción pero en ausencia de enzima para permitir

Tabla 4.

La determinación del calor de dilución del sustrato inyectado se muestra en la curva azul. El área
sobre el pico de la línea negra corresponde al calor total (QT) liberado en la reacción. Las
soluciones en la jeringa y en la celda de muestra se prepararon en el mismo tampón, pH y
TRADUCCION

concentración de sal para minimizar el calor asociado con la dilución, difusión y mezcla de
soluciones.

La reacción alcanzó una liberación de calor máxima a unos 120 s, después de lo cual la señal volvió
gradualmente a la línea de base.

El agotamiento total del sustrato limitante tuvo lugar a aproximadamente 250 s, lo que indica el
final de la reacción. El calor de reacción se sustrajo del evento de dilución (curva azul) y produjo
DHapp = –11,64 ± 1,78 kcal mol – 1 (tres mediciones independientes). El calor de intercambio de
protones del tampón se verificó realizando las mismas mediciones en tampón de fosfato de sodio
50 mM, y no se observaron cambios en la DHapp (datos no mostrados), lo que sugiere, como era
de esperar, que no hubo intercambio de protones con el tampón.

Un requisito para que una enzima funcione a través de un mecanismo de Michaelis Menten es que
se debe alcanzar la condición de estado estable, donde la concentración del complejo enzima-
sustrato [ES] permanece constante a una concentración de sustrato dada. Después de la primera
inyección de fumarato, comienza la reacción (la Fig. 2 muestra los datos en bruto) y la línea base
disminuye desde el nivel inicial a una meseta inferior que corresponde al flujo de calor de acuerdo
con la velocidad de reacción. La diferencia entre las dos mesetas está relacionada con la velocidad
a una concentración de sustrato dada (dQ / dt) [19].

Cada inyección aumenta la cantidad de sustrato limitante en la celda de muestra, de modo que la
velocidad de reacción aumenta y la línea base suma una nueva meseta a un nivel inferior hasta
que se produce la saturación de enzimas y la velocidad de reacción alcanza su máximo.

Discusión

Como se puede ver en la Fig. 3, la reacción catalizada por la enzima TcDHODH está en estado
estacionario. Las inyecciones múltiples de varios volúmenes y, en consecuencia, las diferentes
concentraciones de sustrato inyectadas en la célula de muestra, no alteraron los parámetros
cinéticos determinados. Se observó un comportamiento de la reacción de TcDHODH con 3 l de
fumarato inyectado en la célula de muestra (Tabla 1 y Fig. 3).

En la Fig. 4A, para garantizar una curva de reacción de pseudo primer orden en relación con el
sustrato DHO, el fumarato estaba presente en exceso, mientras que en la Fig. 4B, la curva de
reacción es de pseudo primer orden en relación con el fumarato de sustrato. El DHO y el fumarato
tenían sus constantes de Michaelis calculadas ajustando la velocidad experimental en la ecuación
de Michaelis Menten, y sus valores de KM eran 8,6 ± 2,6 y 120 ± 9,0 lM, respectivamente. Por lo
tanto, DHO se une efectivamente al sitio activo de la enzima en un concentración mucho menor
que el fumarato, de acuerdo con su pequeño valor de KM. Las velocidades máximas (Vmax) se
calcularon en 4.1 ± 0.7 lM s – 1 para DHO y 6.7 ± 0.1 lM s – 1 para fumarato, pero DHO requiere
una concentración 14 veces menor que el fumarato para alcanzar el Vmax.

Los datos en la Tabla 2 son consistentes con los intentos previos de comparar el ITC y los ensayos
espectroscópicos establecidos [25]. Analizando los métodos UV e ITC para determinar la constante
TRADUCCION

de Michaelis Menten, observamos relaciones de 1.51 para el sustrato DHO y 1.23 para el sustrato
fumarato. En este caso, los parámetros cinéticos por ITC y espectroscopía visible UV coinciden
bien. Sin embargo, cuando se produce una diferencia, podemos inferir que ITC puede revelar
reacciones paralelas no detectadas por ensayos convencionales [18].

El valor de KM depende del sustrato y del medio ambiente condiciones tales como pH,
temperatura, fuerza iónica y polaridad, y proporciona una medida de la concentración de sustrato
requerida para que ocurra una catálisis significativa.

Las comparaciones entre los métodos y los parámetros cinéticos de la familia 1A de DHOD deben
hacerse con cuidado porque las condiciones experimentales difieren ampliamente en términos de
pH, tampón, concentración de sustrato y temperatura [26]. El ITC obtiene datos cinéticos de alta
calidad porque la velocidad de reacción se detecta directamente y se realizan múltiples
inyecciones de sustrato automáticamente; Además, las mediciones de ITC no dependen de
métodos ópticos.

Los parámetros cinéticos medidos por microcalorimetría son precisos y precisos. En este estudio,
también expusimos la enzima TcDHODH a DMSO (10%, v / v) y Triton X-100 (0.5%, v / v) (Tabla 3),
y como se esperaba, no afectaron las entalpías de reacción. Sin embargo, las velocidades máximas
que usan estas concentraciones junto con todas las concentraciones definidas descritas en
Materiales y métodos disminuyeron al 80% en DMSO y al 66% en Triton X-100 en comparación con
los experimentos de control. Ambos aumentan la hidrofobicidad de la solución, y esto parece
facilitar el proceso de unión del sustrato; Por otro lado, la eficiencia catalítica disminuye. A valores
de KM más bajos, la enzima TcDHODH es más fácilmente saturable y, por lo tanto, tiene un Vmax
bajo.

Después del establecimiento de un protocolo para estudiar la cinética enzimática por el método
ITC, el producto de la reacción TcDHODH, un inhibidor conocido de la enzima, fue investigado por
un nuevo modus operandi. La curva de actividad enzimática completa permitió la determinación
de la constante de inhibición aparente (Kappi = 110 lM ± 6.6), así como el mecanismo de inhibición
en relación con el fumarato de sustrato, que son esenciales en los estudios de las relaciones de
actividad de la estructura. Se usó el método Lineweaver-Burk para derivar la constante de
inhibición para orotar. La curva mostró el mejor ajuste a los datos en el modelo de inhibición
competitiva (R2 = 0.97).

Por lo tanto, orotato compite por el mismo sitio activo en la enzima que los sustratos DHO y
fumarato, y es posible la formación de un complejo inhibidor de la enzima. Por lo tanto, el orotato
se puede usar como un inhibidor estándar de control durante la selección de nuevos compuestos
contra TcDHODH.

El conocimiento de la estructura de transición del sustrato enzimático proporciona información

fundamental sobre las interacciones que ocurren en la reacción y proporciona un plan para el
diseño de inhibidores basados en la estructura del estado de transición [27].
TRADUCCION

En la Fig. 6, mostramos una breve descripción de la estructura del estado de transición basada en
la información de la literatura, donde el mononucleótido flavina (FMN) es el grupo protésico
[28,29].

El residuo catalítico Cys130 extrae un protón de DHO mientras se transfiere un hidruro a FMN. En
este paso, el DHO se oxida para orotar y el FMNox se reduce a FMNred. El orotato se libera del
sitio activo y el fumarato ocupa su lugar.

FMN transfiere el hidruro a fumarato, convirtiéndolo en succinato mientras que un protón se

extrae simultáneamente del grupo catalítico Cys130, restableciendo la enzima para un nuevo ciclo
catalítico.

Figura 6.

Fig. 6. Mecanismo catalítico ilustrado para la enzima TcDHODH. Primera mitad de reacción:
oxidación de DHO mediante un solo estado de transición en el que el sitio activo tiene un Cys y un
protón se transfiere al cofactor de flavina. Segunda semirreacción: reducción de fumarato.

Los parámetros termodinámicos de este proceso se midieron a fondo en este estudio. Están
relacionadas con las diferencias entre el estado fundamental (ES) y el complejo enzima-sustrato
activado (ES #) para un equilibrio hipotético, donde los reactivos solo siguen este estado. Es
importante recordar que la teoría del estado de transición contiene varias simplificaciones al
describir un fenómeno complejo, como una reacción enzimática, pero los parámetros
termodinámicos derivados de esta descripción son útiles para diseccionar las relaciones de
reactividad de la estructura en la búsqueda de análogos de inhibidores del estado de transición.

Figura A.

Los valores de DG # representan la barrera energética requerida para reacciones a ocurrir. El valor
DDG # (Tabla 4) revela la diferencia de k app cat entre los catalizadores de fumarato y DHO de
pseudo primer orden de TcDHODH. DG # es mayor para la reducción de fumarato que para la
oxidación de DHO en 0,40 kcal mol-1, lo que implica que la reducción de fumarato es el paso
limitante de la reacción catalizada por TcDHODH.

En el rango de temperaturas estudiadas, no se observaron variaciones significativas en DG #, lo

que sugiere un proceso general similar en la formación del complejo activo entre enzima y
sustratos. DH # es del mismo orden de magnitud que la mayoría de los valores informados [30], y
DS # tiene la mayor contribución al DG # para ambos sustratos. La entalpía de activación es 1.8 y
5.3 veces menos efectiva que las barreras de energía entrópica de fumarato y DHO,
respectivamente; el último (> 10 kcal mol – 1) contribuye desfavorablemente al estado de
transición.

Figura B.
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Fig. 7. Mapa de interacciones entre el sitio activo de la enzima TcDHODH y los sustratos DHO y
fumarato. Patrones de hidrógeno del donante / receptor de acuerdo con los resultados
calorimétricos: el complejo enzima-DHO (A) tiene 10, mientras que el complejo enzima-fumarato
(B) tiene 6. Las cifras se toman del banco de datos PDB Sum con los códigos 2e68 y 2e6d (http:
//www.ebi.ac.uk/pdbsum/2e68 y http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/2e6d, respectivamente).

Para comprender el parámetro de entalpía, se puede hacer un análisis del proceso en dos pasos
diferentes.

El primer paso es el evento de unión entre el sustrato y la enzima, que es favorable y tiene una
entalpía negativa (Tabla 3), y el segundo paso es la formación del estado de transición. Los análisis
comparativos de las estructuras de cocristales para los dos sustratos (códigos PDB: 2e68 y 2e6d)
muestran más interacciones complementarias en el complejo DHO-enzima que en el complejo
fumarato-enzima (Fig. 7).

El hecho de que el fumarato y el DHO se dirijan al mismo sitio activo permite que las dos
estructuras complejas se comparen y correlacionen con los parámetros de activación
termodinámica determinados por el ITC. El fumarato tiene una entalpía de activación más
desfavorable que el DHO (DDH # = 3.1 kcal mol – 1), y esta diferencia puede atribuirse al menor
número de enlaces de hidrógeno encontrados; el complejo enzimático DHO tiene 10, mientras que
el complejo enzima fumarato tiene 6 (Fig. 7). A saber, el aumento de la rigidez del patrón de
enlace de hidrógeno favorece la estabilización del complejo enzima-DHO más que el complejo
enzima fumarato, y nuestros datos energéticos capturan esto correctamente. Según el análisis
termodinámico basado en la estructura, la mayoría de las interacciones entalpicamente favorables
se deben a interacciones polares establecidas por Lys, Asn y Ser. El mayor número de
interacciones de hidrógeno se refleja favorablemente en la contribución entalpica de unión para la
formación del complejo activo en comparación con la formación del complejo enzimático
fumarato.

La entropía desfavorable podría estar asociada con una disminución en la flexibilidad del sistema,
pérdida de rotación y traducción de la molécula del sustrato en el complejo activo. Otro factor que
podría contribuir a la gran entropía desfavorable es la accesibilidad de cada sustrato al sitio activo
de TcDHODH; Hay un bucle en la entrada del sitio activo ubicado sobre el cofactor FMN en el
extremo C-terminal del barril b que abre y cierra el canal de acceso del sustrato al sitio activo [28].
Durante el proceso de unión de la formación del complejo activo DHO-enzima, hay una pérdida
significativamente mayor de flexibilidad de la cadena de aminoácidos en relación con la formación
de la enzima y el complejo activo de la enzima fumarato, lo que refleja el valor entrópico más
desfavorable.

Las conformaciones enzimáticas están relacionadas con cada molécula para ocupar un conjunto de
estados de conformación. Un cambio en la temperatura altera el número de estados de
conformación ocupados por las enzimas, lo que interfiere directamente en los eventos de unión
(sustrato-enzima).
TRADUCCION

El aumento de la temperatura, y en consecuencia el número de estados de conformación

ocupados por las enzimas, parece conducir a una disminución en la afinidad del sustrato.

Un aumento de temperatura permite un aumento en el número de estados conformacionales

disponibles para la enzima TcDHODH. Una mayor movilidad de conformación enzimática conducirá
a una gran proporción de moléculas enzimáticas que no se unirán al sustrato o se unirán mal; en
consecuencia, conduce a un aumento en los valores de KM. Este análisis está de acuerdo con la
alta contribución entrópica desfavorable para DG # [31].

Conclusiones

Se ha empleado un protocolo de ensayo bioquímico personalizado basado en ITC para la

caracterización cinética de la reacción enzimática TcDHODH. Estos experimentos demostraron que
el ITC puede usarse de manera confiable para monitorear reacciones de este tipo de manera
rutinaria, fácil y precisa con sustratos e inhibidores que no poseen ninguna sonda espectroscópica.
Otras características atractivas del método son la facilidad y la velocidad de los experimentos. Los
ensayos de enzimas son a menudo laboriosos y requieren mucho tiempo. El método ITC detecta
claramente el fenómeno de saturación del sustrato y puede registrar fácilmente la actividad
enzimática en estado estacionario. Si los falsos positivos son un problema en los bioensayos, se
puede usar DMSO cosolvente y surfactante no iónico Triton X-100 para aumentar la solubilidad de
los ligandos de moléculas pequeñas y evitar la agregación de moléculas. El método descrito en
este artículo puede permitir la detección de compuestos como posibles inhibidores de DHOD de T.
cruzi que podrían usarse en la quimioterapia de la enfermedad de Chagas. Se descubrió que el
producto de la reacción, orotato, inhibía la enzima TcDHODH a altas concentraciones en el rango
micromolar medio y puede definirse como un inhibidor estándar para bioensayos.

Este estudio demostró que los parámetros termodinámicos mejoran nuestra comprensión de los
mecanismos enzimáticos. Además de esto, el modelo de estado de transición dilucidado por la
determinación calorimétrica de los datos termodinámicos que se presentan aquí puede ayudarnos
a evaluar el estado de transición de la reacción catalizada por TcDHODH, y esto puede orientar
futuras investigaciones sobre el diseño de análogos de estado de transición.

Reconocimiento

Agradecemos a la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) y al Conselho

Nacional de Pesquisa (CNPq) por su apoyo financiero.