Guía Lab. 4 BC1

Departamento de Bioanálisis Clínico
Guía de laboratorio Nº 4
Asignatura: Bioquímica Clínica I

Tema: Determinación del perfil lipídico y riesgo coronario
Objetivos:
1. Aplicar los métodos de diagnóstico en el estudio clínico y seguimiento de trastornos
relacionados con el perfil lipídico.
2. Interpretar los resultados del perfil lipídico con base a los valores de referencia y del
método utilizado.
3. Establecer la correlación de los valores del resultado del perfil lipídico con otras pruebas
diagnósticas como parte del control de calidad.
I. INTRODUCCIÓN
Los trastornos de las lipoproteínas son algunas de las enfermedades metabólicas más
frecuentes observadas en la práctica clínica. Pueden presentarse con sus distintas
consecuencias, entre estas están las siguientes:
- Enfermedad cardíaca coronaria (ECC)
- Pancreatitis aguda
- Desarrollo insuficiente y debilidad
- Cataratas
Los signos físicos de las hiperlipidemias no son específicos de ninguna enfermedad en

concreto y en ocasiones aparecen en pacientes normolipidémicos; un ejemplo es el arco senil.
No obstante, su presencia es muy indicativa de aumento de lípidos. Los xantomas tendinosos
se asocian particularmente con la hipercolesterolemia familiar.
La medición exacta de los distintos parámetros de lípidos y lipoproteínas es crítica en el

diagnóstico y tratamiento de pacientes con dislipidemia.
II. DESARROLLO
• ACTIVIDADES
1. Formar grupos de trabajo.
2. Organizar los materiales a utilizar (gradillas, tubos, pipetas, sueros controles,
muestras).
3. Encender el espectrofotómetro.
4. Llevar a cabo todas las medidas de bioseguridad establecidas para un laboratorio
clínico.
5. Realizar las determinaciones en orden y con disciplina siguiendo exactamente los
procedimientos para cada una, realizando una corrida analítica con una muestra.
6. Al finalizar, dejar el área de trabajo limpia y en orden.
MSc. Nadiezda Cisneros, docente dpto. Bioanálisis Clínico, POLISAL, UNAN-Managua 2023 Página 1 de 11
• DETERMINACIONES
➢ Colesterol Total
El colesterol es un componente importante de la membrana celular y de obligada necesidad
en la síntesis de hormonas esteroideas y sales biliares. Su síntesis se realiza a nivel hepático,
siendo luego transportado en sangre constituyendo grandes complejos moleculares
denominados lipoproteínas. El mayor porcentaje del colesterol se encuentra repartido en la
forma LDL y HDL de estas lipoproteínas. Es conocida la importancia de este elemento
dentro de las enfermedades cardiovasculares y numerosos estudios han probado la relación
directa entre cardiopatía y elevación de este componente. Como parte de las actividades
preventivas y de diagnóstico en este grupo de enfermedades, el laboratorio juega un rol
importante, brindando información y permitiendo el estudio de valores referenciales en este
componente y sus fracciones.
Principio del método

El colesterol se encuentra en sangre en forma de éster de colesterol y en forma libre. Para la
reacción citada, los ésteres de colesterol son hidrolizados por la enzima colesterol esterasa.
El colesterol libre obtenido de esta reacción es luego oxidado por el colesterol oxidasa,
formando una cetona que libera peróxido de hidrógeno. Posteriormente, este peróxido de
hidrógeno se desdobla en agua y oxígeno, siendo este último capturado por la 4-
aminofenazona (en algunos kits comerciales la 4aminoantipirina) que en presencia de fenol
forma una quinoneimina coloreada de rosado.
Tipo de muestra
Suero o plasma con heparina o EDTA. Condición importante: Ayuno de 12 horas.
Muestras lipémicas usualmente producen turbidez cuando se mezcla la muestra con el

reactivo generando resultados elevados falsos. La prueba de Colesterol liquicolor evita estos
resultados elevados falsos por medio del factor aclarante de lípidos (LCF). El LCF aclara
totalmente la turbidez causada por las muestras lipémicas.
La prueba no es influenciada por valores de hemoglobina de hasta 200 mg/dl o por valores
de bilirrubina de hasta 5 mg/dl. Sin embargo, sí interfieren valores de hemoglobina (> 0.5
g/dl), triglicéridos (> 1,000 mg/dl), bilirrubina (> 10 mg/dl) y ácido ascórbico (> 10 mg/dl),
provocando todos ellos falsos aumentos.
Preparación del reactivo de trabajo

RGT y STD están listos para usar
Procedimiento:
1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: 500 nm, Hg 546 nm
2. Cubeta: 1 cm paso de luz
3. Temperatura: 20-25°C o 37ºC
4. Medición: Frente a un blanco de reactivo. Sólo se requiere un blanco de reactivo por
serie.
5. Esquema de pipeteo:
6. Cálculo
a. Con factor
b. Con estándar
Características de la prueba
La prueba es lineal hasta concentraciones de colesterol de 750 mg/dl o 19,3 mmol/l. Diluir
las muestras con concentraciones más altas de colesterol 1 + 2 con solución salina fisiológica
(NaCl 0,9%) y repetir la determinación. Multiplicar el resultado por 3.
Valores de referencia
Sospechoso: sobre 220 mg/dl o 5,7 mmol/l
Elevado: sobre 260 mg/dl o 6,7 mmol/l
La Sociedad Europea de Aterosclerosis recomienda disminuir los niveles de colesterol a

aproximadamente 180 mg/dl para adultos menores de 30 años y a 200 mg/dl para adultos
mayores de 30 años.
Control de calidad
Pueden emplearse todos los sueros controles con valores de colesterol determinados por este
método.
➢ Colesterol HDL
Las lipoproteínas constituyen macromoléculas de forma esférica con una capa externa de
proteínas, fosfolípidos y colesterol libre en diversa proporción. La parte central de la esfera
contiene básicamente colesterol esterificado y triglicéridos, cuya concentración difiere según
el tipo de lipoproteína. La función principal de estas moléculas es transportar adecuadamente
los lípidos dentro de un medio acuoso como es el torrente sanguíneo. Las HDL cumplen
importante función vía el mecanismo reverso, retornando colesterol periférico desde los
tejidos hacia el hígado. Esto permite afirmar que su actividad es cardioprotectiva, razón por
la cual son sus disminuciones las que tienen un efecto contrario en la enfermedad
cardiovascular.

Las lipoproteínas HDL se separan precipitando los quilomicrones, las VLDL y LDL gracias
al agregado de Ácido Fosfotúngstico e iones magnesio en forma de cloruro de magnesio.
Luego de un determinado tiempo de reposo entre reactivo y muestra, se procede a un
centrifugado de esta reacción capturando una porción del sobrenadante, la cual, se procesa
con el reactivo de determinación de colesterol.
Tipo de Muestra
Suero o plasma con EDTA o heparina. Condición importante: Ayuno de 12 horas.
Altas concentraciones de ácido ascórbico (> 2,5 mg/dl) producen valores disminuidos.
Valores de hemoglobina mayores de 100 mg/dl y niveles de bilirrubina más altos que 10
mg/dl interfieren con esta prueba provocando todos ellos falsos aumentos. Es discutible la
interferencia de los triglicéridos en cuanto a cifras, pero es aconsejable considerar esta acción
a cifras superiores a 1000 mg/dl.
Preparación del reactivo

- Precipitante para ensayo semimicro
Diluir el contenido de un frasco de PREC con 20 ml de agua destilada o diluir 4 partes del
contenido del frasco PREC con 1 parte de agua destilada (4 + 1).
El estándar está listo para su uso y puede emplearse directamente en la prueba. No precipitar
anteriormente. El factor de dilución ya se tomó en cuenta para el cálculo.
Procedimiento
1. Precipitación
Pipetear en tubos de centrífuga Semi-micro
Muestra 200 ul
PRECb 500 ul
Mezclar bien, incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar por 2 minutos
a 10000 g o 10 minutos a 4000 g
Después de centrifugar, separar el sobrenadante claro del precipitado antes de 1 hora y

determinar la concentración del colesterol usando el reactivo de human de colesterol
liquicolor.
Si el sobrenadante no está claro (altos niveles de triglicéridos), diluir la muestra antes de la

precipitación 1:1 con solución salina (NaCl al 0,9%) y multiplique el resultado por 2.
Cálculo de la concentración de HDL colesterol cuando se aplica dilución a la muestra.
Cálculo de la concentración de LDL colesterol

La concentración de colesterol LDL (LDL-C) se calcula de la concentración de colesterol
total (COL-T), la concentración de HDL colesterol (HDL-C) y la concentración de los
triglicéridos (TG) de acuerdo a la fórmula de Fridewald et al:
Los datos típicos de la ejecución de la prueba pueden ser encontrados en el informe de
verificación, accesible vía
www.human.de/data/gb/vr/su-hdl.pdf o www.human-de.com/data/gb/vr/su-hdl.pdf
Control de calidad
Pueden emplearse todos los sueros controles con valores de HDL determinados por este
método.
➢ Colesterol LDL
Con una carga de 50 % de colesterol transportado, básicamente de naturaleza endógena, la
lipoproteína LDL se convierte en factor clave en la patogenia de la enfermedad cardíaca
coronaria. Su función es precisamente transportar este colesterol al interior de las células,
convirtiéndose por lo tanto en un elemento comprometido en la formación de la placa
ateromatosa. Numerosos estudios le han asignado el papel negativo en este proceso y sus
cifras debieran vigilarse ante alguna evidencia clínica, incluso con cifras normales de
colesterol total. Por otro lado, el aumento de esta lipoproteína puede sobrepasar largamente
el efecto de las HDL, las cuales sólo tienen un papel protector hasta cierto límite.

Se emplea un primer paso para solubilizar el colesterol de HDL, VLDL y Quilomicrones,
logrando consumir este compuesto vía enzimas, sin desarrollo de color. Esto se logra vía un
primer agente tensioactivo. Aplicando otra concentración de agente tensioactivo, se logra en
un segundo paso solubilizar la LDL restante y, esta vez, someter su colesterol a una
cuantificación directa.
CHE: colinesterasa
CHOD: colesterol oxidasa
POD = PAP: peroxidasa
Tipo de Muestra
Suero. Sólo en algunos kits se condiciona el uso de plasma bajo recolección con EDTA ó
heparina y con metodología directa. Condición importante: Ayuno de 12 horas.
Si alguna muestra presenta precipitados, centrifugarla antes de usarla. No congelar las

muestras.
El ensayo no se ve afectado por muestras ictéricas. No interfieren concentraciones de ácido

ascórbico hasta 50 mg/dl, hemoglobina hasta 0,5 g/dl, bilirrubina hasta 30 mg/dl, factores
reumatoides hasta 1000 UI/ml y muestras lipémicas hasta 1200 mg/dl de triglicéridos.
Muestras lipémicas con concentración de triglicéridos mayor a 1200 mg/dl, se deben diluir
1/10 con NaCl 9 g/L y multiplicar el resultado final por 10.

R1 y R2 están listos para usar.
HDL-C/LDL-C CAL: Reconstituir el contenido de un vial con 1 ml de agua destilada.
Tapar el vial y mezclar suavemente hasta disolver su contenido. Una vez reconstituido es
estable 30 horas a 20-25°C, 2 semanas a 2-8°C o 3 meses a -20°C. No usar fuera de la
fecha indicada.
Procedimiento
1. Condiciones del ensayo: Longitud de onda: 600 (590-700) nm
3. Temperatura: 37ºC
serie.
Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C.

Añadir
Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C y leer la absorbancia (A) frente al blanco de reactivo.
Rango de medida: desde el límite de detección 17 mg/dl hasta el límite de linealidad 976
mg/dl. Si la concentración de la muestra es superior al límite de linealidad, diluir ½ con
NaCl 9 g/L y multiplicar el resultado final por 2.
Óptimo: < 100 mg/dl
Bueno: 100-129 mg/dl
Moderadamente alto: 130-160 mg/dl
Alto: > 160 mg/dl
Control de calidad
Pueden emplearse todos los sueros controles con valores de LDL-C determinados por este
método.
➢ Triglicéridos
Los triglicéridos son ésteres formados gracias a la unión de glicerol y ácidos grasos
provenientes de dos fuentes: exógena (dieta) y endógena, por síntesis interna a partir de
carbohidratos y principalmente en el hígado. Son transportados al igual que otros lípidos en
complejos moleculares denominados lipoproteínas hacia el tejido adiposo, músculo y otros,
teniendo como función principal el aportar energía a nivel celular. Sus elevaciones se han
reportado en diversas hiperlipidemias primarias, de origen genético, así como
secundariamente a patologías de fondo como la diabetes mellitus. Hoy en día se considera la
hipertrigliceridemia como un factor de riesgo de enfermedad coronaria arterial en forma
independiente.

Los triglicéridos presentes en la muestra, sufren una escisión inicial, dando lugar a la
separación del glicerol y los ácidos grasos. Luego, el glicerol es unido a adenosina trifosfato
(ATP) que, en presencia de glicerolquinasa, cede un fósforo al glicerol, convirtiéndolo en
glicerol 3-P. Este, unido al oxígeno y bajo la acción de la Glicerol Fosfato oxidasa forma una
cetona y peróxido de hidrógeno. Finalmente, el Peróxido de hidrógeno, ante la presencia de
la Peroxidasa, cede oxígeno, el cual es capturado por la 4-aminofenazona en presencia de
clorofenol, terminando en un compuesto coloreado o quinonimina roja. Este último
componente es medido fotométricamente, estando en relación directa a las concentraciones
previas de triglicéridos.
Tipo de Muestra
Suero o plasma heparinizado o EDTA. Condición importante: Ayuno de 12 horas.
Muestras lipémicas usualmente producen turbidez cuando se mezcla la muestra con el

reactivo generando resultados elevados falsos. La prueba de Triglicéridos liquicolor evita
estos resultados elevados falsos por medio del factor aclarante de lípidos (LCF). El LCF
aclara totalmente la turbidez causada por las muestras lipémicas.
No interfieren en la prueba valores de hemoglobina hasta 150 mg/dl o de bilirrubina hasta 40

mg/dl. Ascorbato ˃ 4 mg/dl puede dar resultados falsamente bajos.

RGT y STD están listos para usar
Procedimiento:
Condiciones del ensayo:
1. Longitud de onda: 500 nm, Hg 546 nm
3. Temperatura: 20-25°C o 37ºC
serie.
6. Cálculo:
Para corregir el glicerol libre, reste 10 mg/dl (0,11 mmol/l) del valor de triglicéridos
calculado.
La prueba es lineal hasta concentraciones de triglicéridos de 1000 mg/dl o 11,4 mmol/l.
muestras con concentraciones superiores deben ser diluidas 1 + 4 con solución salina (0,9%)
y repetirse. Multiplique los resultados por 5.
Interpretación clínica para riesgo ateroesclerótico

Sospechoso: sobre 150 mg/dl o 1,71 mmol/l
Elevado: sobre 200 mg/dl o 2,28 mmol/l
Control de calidad
Pueden emplearse todos los sueros controles con valores de triglicéridos determinados por
este método.
➢ VLDL
El hígado produce VLDL, y contiene apo B-100, apo E y apo Cs; como los quilomicrones,
las lipoproteínas de muy baja densidad también son ricas en triglicéridos. Son las portadoras
principales de triglicéridos endógenos (derivados hepáticos) y transfieren triglicéridos del
hígado al tejido periférico. Al igual que los quilomicrones reflejan la luz con facilidad y
explican la mayor turbidez observada en muestras de plasma hiperlipidémico de ayuno,
aunque no forman una capa superior cremosa como los quilomicrones porque son más
densas. La ingestión en exceso de carbohidratos, ácidos grasos saturados y ácidos grasos
trans en la dieta incrementa la síntesis hepática de triglicéridos que, a su vez, aumenta la
producción de VLDL.
El colesterol VLDL se estima como triglicéridos divididos entre 5 (cuando se emplean

unidades de mg/dl), una aproximación que funciona bastante bien en la mayor parte de las
muestras normolipémicas. La presencia de concentraciones altas de triglicéridos (400 mg/dl
es el límite aceptado), quilomicrones y β-VLDL característica de la hiperlipoproteinemia tipo
III rara imposibilita esta estimación.
Cálculo: VLDL = 𝑇𝑟𝑖𝑔𝑙𝑖𝑐é𝑟𝑖𝑑𝑜𝑠 ÷ 5
2 - 30 mg/dL (0.1 - 1.7 mmol/l)
III. BIBLIOGRAFIA
1. Bishop M. Química clínia. Principios, procedimientos y correlaciones. Quinta edición.
Ed. Mc Graw Hill.
2. Colesterol total. Inserto, Human.
3. Colesterol HDL. Inserto, Human.
4. Colesterol LDL. Inserto, Spinreact.
5. Ministerio de Salud. (Julio, 2003). Manual de procedimientos de laboratorio en el
diagnostico bioquímico. Lima, Perú.
6. Triglicéridos. Inserto, Human.

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