ANÁLISIS DE ADN PARA IDENTIFICACIÓN DEL GEN

APOE

Presentado por Nicole Quintero, Luis Narváez, Camilo

Marino, José Lanza, Isabella Santodomingo
del Programa de Medicina de la Universidad del Norte

en la asignatura Biología Molecular

a la profesora Alma Polo

Barranquilla, 16 de mayo de 2019

ANÁLISIS DEL ADN PARA IDENTIFICACIÓN DEL GEN APOE

Nicole Quintero, Luis Narváez, Camilo Marino, Jose Lanza, Isabella Santodomingo
 Análisis de ADN para identificación del gen apoE

Resumen
El desarrollo de las prácticas de laboratorio llevadas a cabo en la Universidad del
Norte por los estudiantes de segundo semestre de Medicina, tuvieron como finalidad
analizar el gen polimórfico conocido como apoE, el cual está presente en el genoma
humano, para verificar la relación de este con la enfermedad del Alzheimer. Se
conoce como genoma humano al conjunto de pares de bases que están presentes
en el ADN del ser humano, el cual está constituido aproximadamente por 19000
genes. Dentro de los genes que lo constituyen está presente el gen de la
Apolipoproteína E (apoE), la cual es una glicoproteína sintetizada principalmente en
hígado y cerebro. Este gen, el cual está ubicado en el cromosoma 19, es
considerado polimórfico debido a que presenta múltiples alelos por alteraciones en
las secuencias de los nucleótidos que constituyen el determinado gen. Los alelos
presentes son E2, E3 y E4, de los cuales E4 está estrechamente ligado con la
enfermedad del Alzheimer, debido a que se ha identificado que las personas que
presentan este alelo tienen una predisposición alta para padecer de esta
enfermedad a futuro. El proceso para identificar la presencia de este gen fue llevado
a cabo a partir de la extracción de sangre humana (la cual fue donada por los
propios estudiantes) y simultáneamente se llevó a cabo el control negativo mediante
el uso de ADN plasmidial y bacteriano. Para esto, fue necesario implementar
metodologías claves como Cuantificación y Pureza del ADN, PCR en diagnóstico
clínico, Sistemas de Restricción y Electroforesis en gel de agarosa. Finalmente, se
pudo concluir que en el análisis del gen apoE no se hicieron visibles las bandas
debido a que las bandas en el método electroforético debido a una posible ausencia
de ADN en las muestras.

Introducción
El ADN es la molécula que contiene la información genética que ha permitido que
los seres vivos que habitan en la tierra se perpetúen y evolucionen hasta el día de
hoy. La base de este ácido desoxirribonucleico son los nucleótidos que lo
conforman, la composición de estos “peldaños de ADN” es un grupo fosfato, una
azúcar, que en este caso es una ribosa carente de un grupo hidroxilo en el carbono
3’ y por último una base nitrogenada que puede ser Adenina, Guanina, Citosina o
 Análisis de ADN para identificación del gen apoE

Timina. El apareamiento de estas bases va a determinar cómo será el código

genético que permitirá la síntesis de proteínas.

Teniendo en cuenta el objetivo de este laboratorio, identificar el polimorfismo del gen

apoE, hay que tener claro que es un polimorfismo. El polimorfismo, es un cambio o
una variación que se presenta en un gen del ADN por cambios en nucleótidos
causando la alteración del código genético. Por lo que cuando se vaya a obtener la
proteína al traducir el código genético, no se obtendrá la proteína esperada sino que
será ahora una proteína disfuncional o con una diferente función en el organismo.
Esto tiende a confundirse con las mutaciones, pero lo que las diferencia una de otra
es que un polimorfismo se presenta en el 1% de una población, por lo que sería una
variación algo común y que no conlleva a un afección patológica directa sino que lo
hace más susceptible a ciertas patologías. Los diferentes tipos de polimorfismo son,
las causadas por un cambio en un solo nucleótido (SNP); secuencias repetidas en
tándem (VNTR) y por último el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción
(RFLP). Referente al gen apoE, este se ubica en el brazo largo del cromosoma 19
(19q13.2), además presenta 3 alelos diferente que codifican para apoE2, apoE3 y
apoE4 que son isoformas, es decir, que son proteínas codificadas por un mismo gen
pero con modificaciones post traduccionales, la apoE 3 resulta será la más común.

La función de este gen apoE es codificar Apolipoproteínas que fungen como

transportador de lípidos ya sean HDL (alta densidad) o LDL (baja densidad) en el
plasma, por otro lado también funcionan como reguladores del metabolismo
hepático al ser moléculas activadoras en el hígado de cascadas de señalización que
permitan el catabolismo de estos.

Una de las forma para identificar el polimorfismo del gen apoE en el laboratorio es
mediante la técnicas PCR que tiene como objetivo la amplificación de fragmentos
del ADN humano por lo que permite ampliar secuencias del ADN humano extraído
que contengan las variaciones, es decir, el cambio de nucleótido en el alelo E2 y en
el alelo E4. Este procedimiento se logra con la incorporación de un primer, la taq
polimerasa que gracias al cebador puede comenzar a añadir nucleótidos a la
cadena novo, el buffer de amplificación y desoxirribonucleótidos libres. Por otro lado,
 Análisis de ADN para identificación del gen apoE

con el tratamiento de enzimas de restricción RFLPs se pudo obtener la secuencia

fraccionada.

Para finalizar, Se han encontrado las relaciones patológicas del Alzheimer con las
isoformas apoE, se considera que el apoE2 colabora con la disminución de la
susceptibilidad de padecer Alzheimer aunque todavía no está totalmente
comprobado, mientras que presentar apoE4 aumenta las probabilidades de padecer
de Alzheimer por lo que incrementa el factor de riesgo. Por lo que esto puede servir
de gran ventaja en el diagnóstico médico o incluso un pronóstico en un paciente que
todavía no presente la enfermedad pero podría llegar desarrollarla

Materiales y Metodología
1. Extracción de ADN a partir de sangre total humana
En este primer procedimiento se realizó la extracción del ADN genómico humano
con el fin de analizar el gen apoE. De las muestras de sangre se utilizaron los
leucocitos para la extracción del material genético debido a sus núcleos de gran
tamaño. Cabe decir que los eritrocitos al no poseer núcleo, ni ADN, no fueron de
utilidad para la técnica. Para obtener los núcleos se usaron sales, soluciones
tampón y detergentes, los cuales permitieron la lisis celular. Como paso inicial se
agregó un detergente y una solución hipotónica a la muestra con el fin de lisar la
membrana plasmática de dichos leucocitos. Se hizo la respectiva centrifugación
para separar los componentes celulares de los núcleos. Posteriormente se añadió
otro detergente a la muestra para solubilizar las membranas nucleares y así
alcanzar el ADN. Se usaron ARNasas para eliminar los pequeños fragmentos de
ARN en la muestra. Y como último paso se lavó el ADN obtenido y se guardó.
Extracción de ADN genómico bacteriano
En este procedimiento se extrajo el material genético bacteriano con el fin de tener
un control negativo para nuestro análisis del gen apoE, ya que estos
microorganismos no poseen este gen. La extracción se realizó mediante una técnica
enzimática y la utilización de cloroformo. La técnica consistió en agregar una enzima
(Lisozima A) capaz de romper los enlaces que forman la pared celular de las
bacterias, para después separar los componentes celulares bacterianos del ADN
libre y así poder extraerlo fácilmente. Esto se hizo con la ayuda de una mezcla de
 Análisis de ADN para identificación del gen apoE

cloroformo y alcohol isoamílico. Por último se lavó el ADN obtenido y se almacenó.

2. Cuantificación y pureza del ADN

Después de obtener el ADN genómico humano a partir de muestras sanguíneas, se
cuantificó y se valoró la pureza del mismo en el laboratorio. Para esto se
implementó un espectrofotómetro que se usa para medir la absorbancia de luz de
una muestra. Recordemos que el ADN absorbe determinado rango de luz debido a
su composición físico-química. Además se aplicó la ecuación de Lambert-Beer, la
cual te permite encontrar matemáticamente la concentración de ADN presente en
una muestra. De esta manera se determinó que tan “limpio” estaba el ADN extraído,
ya que la “suciedad” (proteínas, ARN, sales y cloroformo) le restan validez y
precisión al momento de analizarlo o amplificarlo.
3. Reacción en cadena de la polimerasa
La PCR se realizó a partir del ADN genómico humano, anteriormente extraído, con
la adición de cebadores específicos para la región polimórfica del gen apoE con el
fin de determinar su genotipo. En esta técnica se usó una enzima tipo ADN
polimerasa-ADN dependiente para amplificar regiones no muy grandes del
fragmento genómico extraído. Se usaron también diferentes materiales y equipos,
como la solución Master Mix (contiene los componentes para que la enzima pueda
polimerizar), termocicladores y gradillas refrigeradas. Para que el proceso se lleve a
cabo, el ADN humano bicatenario tiene que desnaturalizarse para que se generen
cadenas de ADN monocatenario, esto permite que los cebadores puedan unirse por
complementariedad a estos fragmentos y así la polimerasa logre hacer su trabajo.
4. Enzimas de restricción y RFLP
Este método de enzimas de restricción permitió analizar el gen apoE del ADN
amplificado. La enzima tipo endonucleasa, comúnmente llamada restrictasa, es
capaz de reconocer una secuencia específica de nucleótidos dentro del ADN y
cortar, al mismo tiempo, ese punto específico. Esto permite detectar la presencia de
polimorfismos en el ADN, lo cual es nuestro objetivo. Entre los materiales y equipos
utilizados se destacan las enzimas de restricción e incubadoras. El proceso se inició
con la realización de los cálculos correspondientes a los elementos que se aplicaran
en nuestro sistema de restricción. Cabe decir que había varias enzimas de
restricción, cada una proveniente de una casa comercial distinta, por lo tanto era
importante conocer las características y requerimientos de la enzima que se
 Análisis de ADN para identificación del gen apoE

escogió. Se preparó los volúmenes y reactivos, previamente calculados, en los

tubos eppendorf y se añadió la enzima como último paso. Se incubó la muestra a
37℃, aproximadamente durante una hora, y se detuvo la reacción enzimática. Se
agregó el tampón de carga para electroforesis y así finaliza la técnica.
5. Electroforesis en gel de agarosa
Esta fue la técnica más determinante de todo el informe, ya que finalmente nos
permitió identificar el polimorfismo del gen apoE. Esta técnica consistió en separar
las diferentes muestras de ADN según su masa y carga eléctrica. Para esto se usó
una cámara electroforética con dos campos eléctricos diferentes a cada lado, en un
extremo un cátodo (-) y en el otro extremo un ánodo (+). El medio en donde se
desplazaron las moléculas fue un gel de agarosa, el cual contiene diminutos poros
por donde difunden las moléculas a separar. Como el ADN tiene carga negativa, es
de esperarse que este se desplace hasta el extremo positivo del gel. Además, se
utilizaron diferentes materiales y reactivos como un transiluminador y un agente
intercalante llamado bromuro de etidio comúnmente usado en este tipo de técnicas.
Cabe decir que este reactivo es sumamente peligroso debido a su gran afinidad por
el ADN, por lo tanto se tomaron las medidas de seguridad necesarias para su
manipulación. Una vez obtenidas las bandas electroforéticas se compararon con el
marcador de peso molecular. De esta manera concluyó la práctica.

Resultados
Extracción de ADN a partir de sangre total humana
La finalidad de esta técnica fue extraer ADN humano, con la intención de analizarlo
para búsqueda de la isoforma apoE4. Siguiendo rigurosamente los pasos
establecidos en las guías de trabajo, se logró obtener ADN humano proveniente de
células sanguíneas.

Cuantificación y pureza del ADN

Con esta técnica se buscaba cuantificar la cantidad de material genético obtenido y
evidentemente su calidad, es decir, el estado de pureza en el que se encontraba la
muestra. Utilizando la fórmula de pureza del ADN (A320 – A260)/ (A320-A280) los
resultados fueron los siguientes:
 Análisis de ADN para identificación del gen apoE

Tabla 1. Resultados de cuantificación y pureza del ADN. Mesa #4

MEDICIÓN ADN HUMANO ADN ADN
BACTERIANO PLASMIDIAL
Absorbancia a 0.010 0 0.002
260 nm
Absorbancia a 0.006 0 0
280 nm
Relación 1.666 0 2
A260/A280
Concentración 50 mg/ul 0 10 mg/ul
Absorbancia de 0 0 0
agua Mili Q
Para el ADN humano obtuvimos una cantidad de 50 mg/ul y una pureza de 1.666 lo
que significa que tiene residuos de proteínas y sales, esto se podría purificar con
dos lavados de etanol al 70% pero probablemente dañaría el ADN.
Para el ADN plasmidial obtuvimos una cantidad de 10 mg/ml y una pureza de 2, lo
que significa que estaba limpio.
Para el ADN bacteriano no tuvimos resultado en las dos ocasiones en las que
repetimos la extracción desde el tubo Eppendorf.
Tabla 2. Resultados de cuantificación y pureza del ADN. Mesa #3
MEDICIÓN ADN HUMANO ADN ADN
BACTERIANO PLASMIDIAL
Absorbancia a 0.007 0.010 0.061
260 nm
Absorbancia a 0.006 0.010 0.056
280 nm
Relación 1.166 1 1.08
A260/A280
Concentración 35 mg/ml 50 305 mg/ml
Absorbancia de 0 0 0
agua Mili Q

La mesa 03 obtuvo buenas cantidades tanto de ADN genómico humano, ADN

bacteriano, como ADN plasmidial, especialmente plasmidial fue el de mayor
obtención. Todas las muestras obtenidas tienen una relación y es que tienen
 Análisis de ADN para identificación del gen apoE

presencia de sales y proteínas, podría hacerse un lavado con etanol al 70% pero
como se mencionó anteriormente, se podría dañar el ADN.
Reacción en cadena de la polimerasa
Con esta técnica buscábamos amplificar una secuencia equivalente a
aproximadamente 270 pares de bases, que hacían referencia al gen apoE, se
aplicaron los pasos descritos secuencialmente en la guía y se esperó el tiempo
prudente hasta el día de la práctica correspondiente a la electroforesis de ácidos
nucleicos. Finalmente realizando el corrido electroforético del PCR es probable que
haya habido una falla en la implementación de la técnica, específicamente en el
tamaño de los pozos del gel de agarosa, ya que solo permitían insertar un volumen
muy pequeño de muestra, por lo cual en el momento que se realizó el corrido, no
hubo visualización de bandas al momento de ponerlo en el transiluminador, por lo
que no se puede dar un diagnóstico certero.
Enzimas de restricción y RFLP
Con esta técnica se buscó la realización de una de las aplicaciones clínicas que
ofrecen las enzimas de restricción y es la identificación de polimorfismos, siguiendo
los pasos de la guía, se procedió a cortar la secuencia del gen apoE o de alguno de
sus polimorfismos, que posteriormente fueron estudiados en la técnica de
electroforesis. El ADN bacteriano y plasmidial fueron utilizados como muestra de
control, dado que ellos no tienen apoE.

Electroforesis en gel de agarosa

Con esta técnica de laboratorio se buscaba conocer los resultados de las diferentes
prácticas anteriores en las que se esperaba extraer ADN en busca del polimorfismo
apoE4, los resultados fueron los siguientes:
En el carril correspondiente al ADN bacteriano, se puede observar que hay una Buena
cantidad de ADN por las bandas que se muestran, además de ADN, se puede ver ARN en
la parte terminal de la banda, dado que no se agregaron ARNasas.
En el carril correspondiente de ADN humano se
pueden observar una Buena cantidad de ADN para
las dos mesas, pero en ciertas partes está
fracturado debido al sometimiento a estrés en
alguna de las prácticas en las que se trabajó con
esa muestra.
 Análisis de ADN para identificación del gen apoE

En el ADN plasmidial no se observan bandas, por lo que podemos deducir que pudo haber
un error en el momento de extracción, dado que en la técnica de cuantificación de ADN, el
material genético fue obtenido en una muy mínima cantidad en ambas mesas de
laboratorio.
El ADN genómico humano fue obtenido en una muy buena cantidad en ambas mesas, pero
algunas zonas están fragmentadas por someterse a estrés no previsto a la muestra en
alguna de las técnicas en las que se utilizó.
En la técnica de enzimas de restricción solo la mesa 4 consiguió corrimiento, hay muy poco
ADN repartido en muchas bandas casi imperceptibles para el ojo inexperto.
En la técnica de PCR no se observaron bandas de ADN en ninguna de las dos muestras
tras colocar la muestra en el transiluminador.

Conclusiones
El alelo E4 es conocido como un importante factor genético de susceptibilidad para
el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer de tipo tardío, el cual en interacción con
otros factores biológicos, genéticos y ambientales pueden determinar su aparición y
desarrollo3,el análisis de alelos de importancia clínica como apoE proporciona
información valiosa para la comprensión del desarrollo de esta patología en una
determinada población.
En este estudio no se pudo realizar una interpretación del genotipo para el gen
apoE de la muestra ya que la banda no se hizo visible en el gel de agarosa al 2%,
después de haber aplicado una técnica electroforética, esto se debe a que no había
ADN en la muestra; una posible explicación son los errores en algunos de los pasos
de manipulación ya sea en la separación o purificación del mismo.

En cuanto al método de extracción que usamos, fue  adaptado por la profesora

Alma Polo Barrios de la desarrollada por Ian Garner y se caracteriza por ser  un
método de fácil aplicación, no muy extenso y con la utilización de reactivos
inocuos(solo el SDS es clasificado como un compuesto moderadamente tóxico en
concentraciones superiores a 1000 mg/Kg ) . En la mayoría de  estudios donde se
detectan los polimorfismos genéticos del ADN se utiliza fundamentalmente los
métodos de extracción de ADN del fenol-cloroformo y del acetato de potasio. El
método que utilizamos aquí ofrece ventajas sobre el método del fenol-cloroformo, la
principal desventaja de este último es la cantidad de pasos que lleva, lo que implica
mayor manipulación y muy largo el tiempo del proceso y resulta tedioso cuando se
 Análisis de ADN para identificación del gen apoE

analiza un gran número de muestras. En contraste con los métodos del acetato de
potasio y el método del CTAB, se disminuye la cantidad de pasos y el tiempo total
del proceso, minimizando las posibles contaminaciones accidentales de las
muestras durante la extracción, con el cual se obtiene mayor concentración y
rendimiento. La diferencia fundamental entre los métodos del acetato de potasio, lo
constituye la utilización de un macerado inicial con nitrógeno líquido y el uso de la
proteinasa K, por lo que la combinación de estos pasos al protocolo son los
responsables de los mejores resultados obtenidos 4

En síntesis, pese a que no se logró el objetivo principal de analizar el gen

polimórfico apoE ;obtuvimos un aprendizaje exhaustivo de la molécula de ADN y en
cada práctica se evidenció la importancia de cada técnica en lo relativo a su
aplicación, por otro lado teniendo en cuenta que no había ADN en la muestra
podemos aseverar que independientemente del método de extracción que se
utilice, lo importante es realizar cada paso con cuidado para obtener ADN íntegro y
puro que permita llevar a cabo las técnicas posteriores.

Bibliografía

http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0213-91112005000400011

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/014067369391705Q

http://www.scielo.org.co/pdf/rcca/v10n4/10n4a3.pdf
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0375-07602004000300010