PRACTICA 3

PURIFICACIÓN, IDENTIFICACION DE DNA Y RNA

El RNA es el ácido nucleico más abundante en la célula, y puede purificarse fácilmente. Una
célula típica contiene 10 veces más RNA que DNA. El azúcar presente en el RNA es la ribosa, que
posee un grupo hidroxilo (OH) libre en la posición 2'. Este grupo participa en la formación de un
intermediario en el mecanismo de hidrólisis y determina que el RNA sea químicamente inestable, y
se hidrolice fácilmente en una solución acuosa alcalina.
En la mayor parte de los casos, el RNA es un polímero monocatenario (ssRNA), pero las
secuencias nucleotídicas de estas moléculas poseen, en mayor o menor medida, regiones
complementarias que determinan tramos de apareamientos intracatenarios (estructura secundaria
en forma de dsRNA).
Las RNAsas utilizan el mismo mecanismo que se observa en la catálisis alcalina, pero la
mayoría de estas enzimas atacan exclusiva- o preferentemente la ssRNA.
Resulta de mucha importancia la obtención de preparaciones de RNA limpias y que
contengan moléculas intactas. El RNA proveniente de cualquier célula puede ser copiado a
moléculas de DNA de doble hebra y estas resultan en la producción de bibliotecas de cDNA
específicas del tipo celular en cuestión.
La mayor dificultad para obtener RNAs íntegro son las RNAsas, estas son enzimas muy
estables y activas no requiriendo cofactores para su funcionamiento. Una pequeña cantidad de las
mismas que permanezca como contaminante en nuestra preparación puede constituir un verdadero
problema.

Existen tres pasos fundamentales en la extracción de un ácido nucleico (DNA o RNA):

1) Homogeneización de la muestra: Permite la disgregación de la estructura tisular y celular

para facilitar la salida de los ácidos nucleicos.
2) Separación y Purificación: Permite la eliminación progresiva de proteínas y otros
contaminantes celulares y la obtención de un material genético cada vez más limpio, el
cloroformo permite la separación de las fases durante la centrifugación, además de también
ser desnaturalizante de proteínas y disolvente de lípidos.
3) Precipitación: Permite la obtención del ácido nucleico listo para ser almacenado o diluido a
la concentración deseada para su utilización. Este paso se realiza mediante el agregado de 1
volumen de isopropanol o 2 a 3 volúmenes de etanol.

Se pueden mencionar muchas metodologías para la extracción de DNA y RNA de las células en
función del tipo de muestra (células procariotas o eucariotas, vegetales, animales, etc) y del grado
de pureza que se quiera obtener condicionado por las técnicas posteriores de análisis.
OBJETIVOS
1. Determinación de pureza de Ácidos Nucléicos.
2. Cuantificar la cantidad de ácidos Nucléicos obtenida
3. Identificación de DNA, a través de la determinación de
desoxirribosa.
4. Identificación de RNA, a través de la determinación de
ribosa
5. Identificación de ácidos nucleicos mediante la
determinación de fosfato inorgánico.
6. Determinación de la Hipercromia de Ácidos Nucléicos
7. Determinación del Tm

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

DIA 3 Purificación de ACIDOS NUCLEICOS

1. Se toma una alícuota de 0.5ml de la solución solución salina de NaCI 0,015M - citrato 0,0015M,
que contiene los ácidos nucleicos y se le diluye a 1 ml, para luego medir la longitud de onda a
260nm.
2. Si la concentración es demasiado alta, se decide allí, el grado de dilución.
3. Se adiciona 1 volumen de etanol o isopropanol a cada sistema.
4. Proceder a Incubar ON (OverNight) a 4ºC.

DIA 4 Purificación de ACIDOS NUCLEICOS

1. Centrifugar por 15 minutos, de ser posible a 4°C.
2. Trasvasar 1ml del sobrenadante a un tubo estéril nuevo (reservar)
3. Lavar el pellet resultante con etanol al 70%. Para ello agregar 500 ul de etanol al 70%, luego
centrifugar a 10,000rpm por 5 minutos.
4. Descartar el sobrenadante (eliminar los restos de etanol tomándolos con una pipeta P-200).
5. Dejar aproximadamente por 5 minutos.
6. Resuspender en agua bidestilada esteril, en el volumen calculado para dilución.
7. Realizar una segunda lectura a 260 y 280 nm

CUANTIFICACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS:

Para la cuantificación de los ácidos nucleicos aislados se realiza la medida de absorbancia de la
muestra a 260nm y 280nm en un espectrofotómetro. Se sabe empíricamente que la densidad óptica
a 260nm de una solución de DNA puro de doble cadena de 50ug/ml es igual a 1. Con esta relación
puede calcularse la concentración de DNA de nuestra muestra. Para estimar la pureza de la muestra
medimos la absorbancia a 280nm y calculamos la relación A260/ A280. Un DNA sin contaminantes
tiene una relación de 1.8 a 2.0. Valores menores indican contaminación con proteínas mientras que
valores mayores se deben a contaminación con sales.
Para el caso del RNA la relación es de 40ug/ml para una unidad de absorbancia a 260 nm. La
estimación de la pureza se realiza también utilizando la relación A260/ A280.

TAREA:
1 A TRAVÉS DE CALCULOS DEMUESTRE EL GRADO DE PUREZA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
OBTENIDOS.
2 QUE CANTIDAD SE LOGRO OBTENER DEL DE LOS ACIDOS NUCLEICOS, REALICE LOS
CALCULOS.

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Posteriormente a la extracción del ácido nucleico de interés es necesario evaluar la cantidad y

calidad del mismo. Con una electroforesis en gel de agarosa se determina la calidad de la muestra.
Si el DNA no ha sufrido roturas veremos una única banda de alto peso molecular, mientras que en el
caso de las muestras de RNA la corrida electroforética de preparaciones de buena calidad mostrará
claramente los diferentes RNAs ribosomales y de transferencia.

PROTOCOLO:

1 10 ul de las muestras obtenidas en cada grupo, son cargadas en los posos del gel de agarosa al
1% en tampón TAE (TRIS-Acetato 0,04 M, pH 8.0, EDTA 1mM) y SYBR GREEN.
2 Se procede a realizar la electroforesis a 100 V por 40 min.
3 Luego se observa las bandas en un transiluminador de luz ultravioleta y se fotografía con una
cámara Kodak.

RESULTADOS:

GRUPO DE PRACTICA
1 2 3 4 M M 5 6 7 8 9 10

ADN
Muestras de RNAs corridas en gel de agarosa 1%
teñidas con Sybr Green

M = Marcador de peso molecular

CUANTIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS

rRNA
mRNAs
rRNA
 Muestras de RNAs corridas en gel de agarosa 1% teñidas con Sybr Green.

RECOMENDACIONES:

1. El material de vidrio debe ser muy bien lavado y secado en estufa.

2. Debe tomarse las máximas precauciones para evitar contaminaciones con RNAsas,
3. Debe usarse guantes a lo largo de todo el proceso ya que las manos son la mayor fuente de RNAsas.
4. Intentar trabajar lo más rápido posible, con el fin de evitar la degradación de ácidos nucléicos durante la
manipulación.
5. Con el fin de obtener los mejores rendimientos, deben usarse muestras frescas como material de partida.
Si es necesario acumular muestras antes de comenzar a procesarlas.

IDENTIFICACIÓN DE DESOXIRRIBOSA: REACCIÓN DE DISCHE

Fundamento:

La hidrólisis ácida del ADN, remueve todas las bases púricas (hidrólisis de uniones N-
glicosídicas) sin afectar las uniones fosfodiester del esqueleto nucleotídico, generando ácidos
nucleicos apurínicos.
Las desoxipentosas debido a la hidrólisis ácida sufren deshidratación produciendo aldehídos
δ-hidroxi-levulínicos, estos reaccionan con difenilamina (cromógeno), dando un producto de color
azul.

PROCEDIMIENTO

1. Se preparan los siguientes sistemas:

SISTEMA ETANOL ISOPROPANOL ESTÁNDAR BLANCO

Et Is St Bl
Extracto de ácido nucléico 1ml
precipitado con ETANOL
 Extracto de ácido nucléico 1ml
precipitado con
ISOPROPANOL
Solución de Deoxi-D- 1ml
Ribosa
1 mg/ml
Ácido clorhídrico 1ml

Reactivo difenilamina en 2 ml 2 ml 2ml 2 ml

solución ácida

2. Mezclar el contenido de cada tubo, colocarlos en baño hirviente durante 10 min.

3. Enfriar en baño de agua corriente por unos minutos. La presencia de desoxirribosa se revela por
la aparición de un color azul, realice un barrido fotocolorimetrico, determine la longitud de mayor
absorbancia y realice la lectura.

IDENTIFICACIÓN DE RIBOSA: REACCIÓN DE BIAL

Fundamento:
Las aldopentosas al reaccionar con ácido clorhídrico, pierden agua, y se convierten en
furfural. El furfural de RIBOSA, puede reaccionar en medio ácido con el orcinol. Si en esas
condiciones se agrega una pequeña cantidad de cloruro férrico, se formará un complejo de
color verde. Las cetopentosas no dan esta reacción si no que dan un complejo de color rojo.
Las cetohexosas y las metilpentosas dan un color naranja, y al reposar producen un
precipitado de color verde oscuro. Las triosas y los ácidos 5-cetoaldonicos dan positova la
reacción, as como los ácidos urónicos, por lo que hay que tener cuidado de contaminantes en
la mezcla de reacción.
La presencia de hexosas no interfiere con la reacción siempre que no halla calentamiento
prolongado, en cuyo caso las hexosas interferirán con la producción de un precipitado rojo.
      A través de esta reacción identificamos la presencia de ácido ribonucleico, de las muestras
obtenidas en el grupo de prácticas.

PROCEDIMIENTO

Se preparan los siguientes sistemas:

SISTEMA ETANOL ISOPROPANOL ESTÁNDAR BLANCO

Et Is St Bl
Extracto de ácido nucléico 1ml
precipitado con ETANOL
Extracto de ácido nucléico 1ml
 precipitado con
ISOPROPANOL
Solución de D-Ribosa 1ml
1 mg/ml
Etanol grado molecular 1 ml
Ácido sulfúrico conc 1 ml 1ml 1ml 2ml

Reactivo Orcinol en 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

solución ácida

1. Mezclar el contenido de cada tubo, colocarlos en baño hirviente durante 10 min.

2. Enfriar en baño de agua corriente por unos minutos. La presencia de desoxirribosa se revela por
la aparición de un color verde esmeralda.

HIPERCROMICIDAD DEL DNA

Diversos agentes externos, como el calentamiento, la disminución de la

constante dieléctrica del medio, pHs extremos menores de 4 y superiores de 11,
reactivos como la urea y la formamida pueden debilitar dichas fuerzas y rompen
los puentes de hidrógeno lo que origina que las dos cadenas se desenrollen y se
separen proceso conocido como desnaturalización del DNA.
La desnaturalización del ADN, incrementa la absorbancia UV (densidad óptica),
cuando dos cadenas simples de ADN, son separadas, el efecto es denominado
hipercromicidad.

El Tm que expresa la temperatura media de transicion (Tm), es la temperatura a

la cual la absorbancia de luz UV es el 50%, considerada entre el pico máximo y
mínimo de absorción, en el Tm el 50% del DNA de una muestra es
desnaturalizado. La desnaturalizacion inespecífica del ADN se da por efecto del
calor, a partir de 80°C.

References

 Laboratory of Ross Hardison, Article

 Structures of Nucleic Acids

Esquema para explicar el proceso de desnaturalización del DNA

Gráfico del concepto de Tm

Procedimiento
1. Medir en un tubo 1 ml de la solución del DNA obtenida en la práctica.
Medir la absorbancia a 260nm.
2. Si la solución del DNA desnaturalizada es muy concentrada, diluirla con
solución salina citrato y determinar nuevamente la absorbancia.
3. Colocar el tubo en baño hirviente durante 2 min. Sin enfriar. Medir la
absorbancia de la muestra en el espectrofotómetro a 260 nm.
4. Comparar la absorbancia obtenida, con la absorbancia de la solución del
DNA (nativo) obtenida en la práctica.
5. Realizar las lecturas, esta vez empleando una solución de ácidos nucleicos
tratada con formamida y otra a pH mayor de 11 o menor a 4.
6. Realizando los pasos señalados anteriormente, en una práctica similar a la
presente, y realizando un barrido desde 230nm a 320 nm, se obtuvieron
los siguientes resultados, en las condiciones DNA nativo y DNA
desnaturalizado por calor:

Longitud de onda Absorbancia del Absorbancia del

en nm DNA nativo
DNA
desnaturalizado

320 0,005 0,020

310 0,019 0,026

300 0,025 0,038

290 0,062 0,125

280 0,135 0,335

270 0,205 0,520

260 0,283 0,650

250 0,235 0,600

 240 0,175 0,420

230 0,140 0,350

TAREA

Grafique los resultados logrados, muestre el gráfico con la leyenda y su

interpretación. Podría usted calcular el Tm de esta estructura? Qué
experimento realizaría para hallar el Tm?

IDENTIFICACIÓN DE FOSFATO

Fundamento:

Método de Fiske. Bötcher, et al. 1961. Anal. Chim. Acta 24, 203-204.

Se emplea el método de Fiske modificado, que permite cuantificar el fosfato que proviene de los
ácidos nucleicos, después de hidrolizarlos con ácido (perclórico 7.5 M, tricloroacético al 10%, o
clorhídrico concentrado, etc.). Con la formación del complejo fosfomolibdato de amonio, el cual es
convertido al color azul de molibdeno con el reductor ácio 1-amino-2-naftolsulfonico (puede
emplearse ácido ascórbico, sulfitos, etc.). La absorbancia del azul de molibdeno es medida a 830nm
con el reactivo reductor ácio 1-amino-2-naftolsulfonico (con ác. Ascórbico absorbe a 660 nm).
Reactivos:
Estándar KH2PO4 0.4mM o al 0.5mg/ml (PM 136.1)
HClO4 7.5M
Reactivo de Molibdato: 2.2 g (NH4)6Mo7O24-4H2O + 14.3ml H2SO4 conc., por litro de
disolución.
Ácido ascórbico al 10%.

CURVA DE CALIBRACION

Preparar los sistemas para hacer la recta de calibrado:

TUBO Pi 0.4 mM nmoles H2O
( ul) Pi (ul)
1 0 0 0
2 50 20 350
3 100 40 300
4 150 60 250
5 200 80 200
6 250 100 150
7 400 160 0

Agregar 0.5ml de Reactivo de Molibdato y 0.5 ml del reactivo reductor, completar con agua
hasta 4 ml, dejar en reposo 5 min en completa oscuridad y rápidamente realizar la lectura a
660nm.
PROCEDIMIENTO
HIDROLISIS CON ACIDO PERCLORICO

El añadido de perclórico libera la mayor parte de los grupos esteres

fosfatos del DNA como fosfato inorgánico.

1. En el fondo de un tubo especial que se debe sellar en el momento

oportuno, se colocan 7 a 8 mg del ácido nucleico aislado y se seca en
estufa a 40°C.
2. Con una pipeta limpia introducir lo más al fondo posible del tubo 0.1 ml de
HClO4 7.5 N.
3. Sellar el tubo para calentarlo por 1 hora en baño maría hirviente. Se
pueden colocar canicas de vidrio.
4. Terminado el tiempo, el tubo es enfriado y abierto, el contenido se diluye
con 0,5 ml de agua destilada.
5. La muestra es centrifugada y separado el sobrenadante.

DETERMINACION DE FOSFATO

Protocolo
1. Con una pipeta serológica transferir muestras duplicadas de 0.03 ml
del fluido sobrenadante al tubo de prueba marcado y determinar el
Pi por el método de Witmore Toe
2. Añadir sobre la muestra de fluido sobrenadante 0.5 ml de la
solución de molibdato de amonio
3. Adicionar 0.5 ml de la solución de ácido ascórbico
4. Agregar 2.97 ml de agua destilada.
5. Dejar en reposo 5’ en la oscuridad y leer en el fotocolorímetro con
filtro rojo (660nm).
6. Determine en la Curva de Calibración la concentración de P

PREGUNTAS

1. ¿Qué opina de la importancia que tiene la estructura del DNA, para

mantener intacta la información genética?
2. ¿De qué muestras biológicas se suele aislar DNA y con que propósitos?
3. ¿Cuál es la participación del Puente de hidrógeno en la estructura del
ADN?
4. ¿Cuál es la participación del grupo fosfato en la estructura de los ácidos
nucléicos?
5. ¿Qué función tiene el agregado de sal en el proceso de extracción?
6. ¿Qué agentes desnaturalizan el ADN?
7. ¿En qué se relaciona la hipercromía con la hibridización?
8. ¿Qué es la hibridización “in situ” y nombre algunas aplicaciones?
9. ¿Qué relación tiene el Tm con la estructura del DNA?
10.Averigüe el Tm para las siguientes secuencias:
 GEN Referencia: Am. J. Pathol. 157, 771, 2000
GATGCTGAGGACCAGGAAACCGC: Forward primer (5’-3’)
ratCYP 1A1 CAGGAGGCTGGACGAGAATGC Reverse primer (5’-3’)

11.¿Cómo podemos aseguramos que tenemos un DNA “puro” excluido de

proteína?
12.¿Qué diferencias encuentra usted en la solubilidad de ácidos nucleicos y
de proteínas en soluciones salinas, que se tomaron en cuenta para el
aislamiento de ácidos nucleicos?
13.¿Qué ventajas tiene el timo para extraer el DNA?
14.¿Qué variaciones realizaría si tiene que extraer DNA de vegetales o
bacterias?
15.Indique las medidas que se han empleado para detener la actividad de la
DNAasa II.
16.¿Cuál es el fundamento de la reacción de Bial?

Terminología:
DNA: Ácido desoxirribonucleico
RNA: Ácido ribonucleico
EDTA: Etilen diamino tetra-acético, quelante de iones divalentes.
SDS: Dodecíl sulfato de sodio (Lauril sulfato de sodio), detergente aniónico.
DNasa: Nucleasa especifica en la hidrólisis de DNA

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