ENTENDER LOS CONCEPTOS BIOFÍSICOS PRINCIPALES DEL TENSIOACTIVO PULMONAR EN SALUD
Y ENFERMEDAD
RESUMEN
El surfactante pulmonar (PS) es un complejo lipídico-proteico
esencial para estabilizar la delicada estructura de los alvéolos
de los mamíferos junto con ciclos respiratorios de expansión-
compresión sucesivos. Para hacerlo, el surfactante reduce
dramáticamente la tensión superficial en la interfaz aire-
líquido,
una actividad que depende fundamentalmente de una
composición lipídica adecuada y de la presencia de algunas
proteínas surfactantes específicas. La falta o disfunción de
este sistema se asocia con patologías respiratorias graves,
que en algunos casos se tratan con suplementos con
materiales tensioactivos exógenos. La función biofísica y el
rendimiento de PS, en salud y enfermedad, están
directamente influenciados por su composición, estructura y
propiedades mecánicas. Esta revisión resume los principales
conceptos biofísicos detrás de los mecanismos que definen la
función del surfactante en un pulmón sano y en situaciones
patológicas. También revisa algunas de las técnicas biofísicas
más útiles que proporcionan información sobre los procesos
relacionados con el surfactante. Finalmente, la biofísica
traslacional será
ser invocado para ilustrar cómo los estudios biofísicos pueden
contribuir a comprender el papel del surfactante en la salud y
la enfermedad y para diseñar mejores enfoques terapéuticos
basados en el surfactante.
SURFACTANTE PULMONAR EN SALUD Y
ENFERMEDAD
El surfactante pulmonar (PS) es un sistema basado en
membrana compuesto por una mezcla de lípidos y proteínas.
Se sintetiza mediante neumocitos alveolares de tipo II y se
secreta en la capa delgada de líquido que cubre el epitelio
alveolar. La función principal de la PS está relacionada con la
estabilización de la estructura delicada de los alvéolos de los
mamíferos al producir una reducción dramática de la tensión
superficial en la interfaz aire-líquido respiratorio. En esta
interfaz, las moléculas de agua en contacto con el aire se unen
más fuertemente, ya que las interacciones con la fase de
volumen de agua no se compensan con las interacciones en el
lado del aire donde las moléculas de agua en fase de vapor
son escasas. Esto genera una fuerza de cohesión
intermolecular neta, que se define como la tensión superficial.
La apertura de una nueva superficie expuesta al aire, según se
requiera durante cada inspiración individual, requiere superar
esta fuerza superficial cohesiva, suministrando la energía
necesaria para romper las interacciones moleculares que las
nuevas moléculas necesitan para atravesar la interfaz gas-
líquido. Por lo tanto, a una tensión superficial alta, el trabajo de
la respiración, es decir, para abrir los pulmones entre 15 y 20
veces / min, consumiría una buena proporción de energía
metabólica e inevitablemente terminaría en un colapso
alveolar. Para evitar el colapso y reducir el trabajo respiratorio,
el PS forma espontáneamente una Película estable en la
interfaz aire-líquido, que desplaza las moléculas de agua de la
exposición al aire y, por lo tanto, reduce la tensión superficial
(figura 1A). Al mismo tiempo, diferentes componentes de PS
constituyen una primera barrera para el acceso de patógenos
al resto del organismo a través de la gran superficie
respiratoria.
Los componentes principales de la PS son los lípidos (~ 92%),
en su mayoría fosfatidilcolina saturada (DPPC) (~ 40%), que
es esencial para las propiedades de superficie activa de la PS.
La naturaleza saturada de las cadenas de acilo en la DPPC
permite una acumulación máxima en la reducción del área de
la superficie y, por lo tanto, la exclusión máxima de las
moléculas de agua y la reducción máxima de la tensión de la
superficie. La fosfatidilcolina (PC) insaturada, el
fosfatidilglicerol (PG) y el colesterol representan
aproximadamente el 25%, el ~ 10% y el ~ 5–8% de la masa
total del PS, respectivamente, mientras que las otras especies
de lípidos (lípidos neutros y otros fosfolípidos (PL))
corresponden al 8-10% residual (figura 1B) . La parte restante
de PS (~ 8%) está constituida por cuatro proteínas
específicas, que se pueden clasificar en dos familias: SP-B y
SP-C (hidrófobas) y SP -A y SP-D (hidrofílicos). SP-A, SP-B y
SP-C se asocian a membranas PS, principalmente se unen a
PL cargadas negativamente (SP-B, SP-C) y DPPC (SP-A), y
son esenciales para facilitar la formación de Película interfacial
PS, organiza y estabiliza la estructura y garantiza un reciclaje
correcto (figura 1B). Además, el SP-A y el SP-D pertenecen a
la familia de proteínas colectivas y participan en la defensa
inmune innata contra patógenos y alérgenos pulmonares.
La composición, estructura y propiedades mecánicas de las
capas de PS son directamente responsables de la función
biofísica y el rendimiento del sistema en un pulmón sano. La
falta, deficiencia o inactividad de la EP conduce a trastornos
respiratorios graves tanto en neonatos como en adultos, como
el síndrome de distrés respiratorio neonatal (SDR) y el
síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA).
El SDR se debe principalmente a la inmadurez pulmonar y la
falta de PS en los recién nacidos prematuros. La alta tensión
superficial resultante impide mantener los alvéolos abiertos
desde la primera respiración, lo que provoca una alta
mortalidad neonatal (figura 1C a la izquierda). A principios de
la década de 1990, la terapia de reemplazo de surfactante
(SRT) con una preparación de surfactante exógeno contribuyó a disminuir las tasas de mortalidad , ya que facilita la mecánica
respiratoria, lo

FIGURA 1 tensioactivo pulmonar (PS) en tejido pulmonar humano sano y enfermo. (A) esquema ilustrativo de la reducción de la tensión superficial
mediada por PL. Cuando se forma una capa de PLs en la interfaz aire-líquido, las moléculas anfipánicas PL desplazar las moléculas de agua y reducir
el aire-líquido Proximidad. (B) una representación esquemática de un alveolo normal, con la organización de las membranas PS en la interfaz aire-
líquido y la composición lipídica/proteica del tensioactivo pulmonar. (C) alveolo contraído en RDS debido a la inmadurez de la célula de ATII y los
alvéolos lesionados tanto en el SDRA como en el MAS. Se muestra la inhibición resultante de las membranas de PS causada por el exudado de
proteínas, sPLA2, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), el colesterol y los ácidos biliares. (D) una representación esquemática de (1)
alveolo IPF con una reducción en los niveles de ambos SP-C y PLs y (2) obstrucción de alveolo PAP debido al exceso de PS. aAM ya utilizado y no
degradado., los macrófagos activados; Soy, macrófagos alveolares; aPMN, células polimorfononucleadas activadas; SDRA, síndrome de dificultad
respiratoria aguda; ATI, neumocitos tipo I alveolar; ATII, neumocitos tipo alveolar II; BA, ácido biliar; CHOL, colesterol; DPPC,
dipalmitoylfosfatidilcolina saturado; FFA, ácidos grasos libres; imATII, inmaduros neumas tipo alveolar II; IPF, fibrosis pulmonar idiopática; MAS,
síndrome de aspiración de meconio; MFB, miofibroblastos; MO, monocitos; n-ATI, neulíticos alveolares de tipo I; NL, lípido neutro; OX-PLs,
fosfolípidos oxidados; OX-SP-B, oxidado SP-B; OX-SP-C, oxidado SP-C; PAP, proteinosis alveolar pulmonar; PG, fosfatidilglicerol; PL, fosfolípidos; RBC,
glóbulos rojos; RDS, síndrome de dificultad respiratoria; sPLA2 secretora fosfolipasa A2; unPC, fosfatidilcolina insaturada.

El SDRA es una insuficiencia respiratoria aguda provocada por

diversas afecciones, caracterizada por una inflamación
que estimula la autoproducción de PS en recién nacidos. Sin
embargo, la SRT no es efectiva cuando el SDR se debe a
trastornos genéticos graves (por ejemplo, deficiencia de SP-B
pulmonar extensa y una lesión alveolar difusa. El deterioro
debido a mutaciones en el gen SFTPB o alteraciones en el
resultante de la PS se debe principalmente a un aumento de
gen ABCA3) y es particularmente desafiante en patologías en
células inflamatorias infiltrantes, fracciones de células
las que el surfactante endógeno y terapéutico resulta
necróticas y exosomas. Sin embargo, niveles más altos de
inactivado por un daño directo o indirecto de las propiedades
fosfolipasa A2 secretora (sPLA2) también pueden contribuir a
de la superficie. Aun así, la SRT parece mostrar una eficiencia
hidrolizar las PL y nutrir la cascada inflamatoria.8 9 La
parcial en algunos casos de SDRA. La identificación de qué
liberación de liso-fosfolípidos (LPL) y ácidos grasos libres
pacientes con SDRA pueden beneficiarse más es un desafío
(FFA) de las membranas hidrolizadas, así como la presencia
importante en la investigación clínica.
de Las especies reactivas de oxígeno (ROS), las citoquinas y
otras proteínas del edema contribuyen a dañar directamente el
surfactante y / o proporcionan daños mediados por inflamación
(centro de la Figura 1C). Además, se ha encontrado que los

FIGURA 2 propiedades esenciales del tensioactivo pulmonar en la respiración sana. En la expiración: surfactante pulmonar (PS) organiza en
estructuras multicapa caracterizada por la presencia de DPPC en la interfaz aire-líquido con la consecuente reducción drástica de la tensión
superficial (< 2 mN/m); durante la inspiración: reextensión de las membranas de fosfolípidos (PL) junto con la adsorción inicial de los agregados de
PS en la interfaz aire-líquido, alcanzando la tensión superficial de equilibrio de 20 mN/m. Este proceso está mediado por SP-A y SP-B y facilitado por
PG, colesterol y PLs insaturados, colesterol; DPPC, dipalmitoylfosfatidilcolina saturado; PG, fosfatidilglicerol; unPC, fosfatidilcolina insaturada.

niveles de SP-A y SP-B son más bajos en pacientes que resolverse. Específicamente, se describió una reducción de la
sufren de SDRA, lo que aumenta la inactivación general de la SP-C como uno de los eventos desencadenantes y
PS. contribuyentes al proceso fibrótico de esta enfermedad
pulmonar. Además, la plasticidad de los macrófagos
Entre los diversos tipos posibles de SDRA neonatal, meconio
alveolares parece desempeñar un papel crítico en la
El síndrome de aspiración (MAS) es causado por la inhalación
patogénesis de la IPF que puede conducir, a su vez, a un
de meconio y puede tener una mortalidad relevante. El MAS
desequilibrio resultante entre la degradación del surfactante y
afecta la actividad del surfactante por medio de los mismos
el reciclaje (Figura 1D a la izquierda). La captación insuficiente
compuestos descritos anteriormente, que se pueden encontrar
y el catabolismo de la PS también podrían deberse a
en la mezcla de meconio. Además, la acción simultánea del
autoanticuerpos o mutaciones en los genes de los receptores
colesterol y los ácidos biliares aumenta considerablemente la
del factor estimulante de colonias de macrófagos (CSF2A,
fluidez del surfactante y contribuye aún más a su inactivación
CSF2RB). Esta es la causa de la proteinosis alveolar pulmonar
(Figura 1C derecha) . Más Los ácidos biliares actúan como un
congénita (PAP), que se asocia a una acumulación anormal de
cofactor de sPLA2, aumentando la actividad de la enzima y
surfactante antiguo y menos funcional en los alvéolos con una
contribuyendo a la lesión pulmonar.
disminución en la capacidad de difusión pulmonar (Figura 1D
Aunque menos relevante en un contexto pediátrico, algunos derecha).
informes sugieren que la disfunción de la PS también podría
estar detrás de la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), una lesión
epitelial crónica y progresiva que aún hoy en día sigue sin PROPIEDADES BIOFÍSICAS DE SURFACTANTE
Como se mencionó anteriormente, varias patologías están
asociadas al daño en la función de la EP y, hasta la fecha,
para la mayoría de ellas no existe una terapia efectiva en el
horizonte. La razón principal es la falta de evidencia sobre los
mecanismos patológicos clave y cómo impiden la actividad de
la EP. Para superar esta situación, es necesario comprender
los conceptos principales de la biofísica del surfactante, que
debería facilitar el desarrollo de nuevas aplicaciones clínicas.
Como se resume en la figura 2, la actividad de la superficie de
la PS se caracteriza por tres propiedades esenciales, que
tienen lugar en la respiración:
(1) movimiento rápido hacia la interfaz aire-líquido (adsorción)
y transferencia de nuevas especies de lípidos para cubrir el
área alveolar durante la inspiración; (2) empaquetamiento
adecuado de la película interfacial con una reorganización
impulsada por compresión en estructuras de membrana
multicapa asociadas a la superficie (compresibilidad) en la
expiración, produciendo una drástica reducción de la tensión
superficial; y 3) la redistribución lateral de los lípidos
compactados durante los períodos de expansión de la interfaz
aire-líquido (capacidad de recuperación) en la inspiración
subsiguiente y la re-extensión alveolar. Estos ciclos de
compresión y re-extensión de PS constituyen una reversión
parcial. Proceso en el que la interacción de los lípidos y
proteínas parece jugar un papel clave.
Para adsorber rápidamente, primero, el PS necesita generar
grandes agregados basados en bicapas, con el potencial de
transportar cooperativamente y transferir una gran masa de PL
de surfactante a la interfaz. Estos complejos de membranas de
surfactante, en muchos estudios conocidos como grandes
agregados de surfactante o agregados grandes, se difunden
hacia la interfaz aire-líquido, en un proceso facilitado por el
calcio y la proteína SP-A.1 Una vez que se alcanza la interfaz,
el PS se agrega Luego hay que fusionar dentro de la
superficie. Para que esto suceda, se ha propuesto que se
genere un intermedio estructural altamente curvo entre las
vesículas PS y la película interfacial. El SP-B tiene el papel
principal al facilitar el intercambio de lípidos y estabilizar esta
estructura transitoria, especialmente en presencia de PL
aniónicas (principalmente PG). De hecho, se ha determinado
que SP-B forma estructuras supramoleculares en la superficie
de complejos de surfactantes recién secretados, listos para
abrir conexiones que facilitan flujos rápidos de PLs al hacer
contacto con la interfaz. También parece que los PL
insaturados y el colesterol influyen en la inserción de especies
tensioactivas en la película interfacial. En general, la adsorción
de PS en la interfaz aire-líquido reduce la tensión superficial
de 70 mN / m (a 37 ° C) a valores de alrededor de 20 mN / m
(tensión superficial de equilibrio). Luego, al expirar, la tensión
superficial disminuye aún más, para alcanzar valores de
menos de 2mN / m (figura 2), como lo demuestran los estudios
in vitro e in vivo. Como se mencionó anteriormente, esta
reducción evita el colapso alveolar a través de Reorganización
selectiva del PS. La película de proteína lipídica se reorganiza
en una estructura tridimensional de múltiples capas
caracterizada por dominios altamente compactos en contacto
con el aire para evitar la proximidad aire-fluido. Un modelo
llamado "exprimido" sugiere que esta reorganización para
plegar parte de la película interfacial hacia la subfase
permitiría que la mayoría de las moléculas de DPPC
permanezcan en la superficie. Estas moléculas actúan como
un componente clave de los dominios de orden superior con
un empaquetamiento máximo y una reducción máxima de la
tensión superficial. La reorganización de la película excluye
selectivamente las PLs no saturadas y el colesterol por debajo
de la interfaz como parte de las regiones de películas más
fluidas y deformables.1 Sin embargo, varios estudios han
demostrado que algunas especies de mamíferos / marsupiales
pueden mantener una PL respirable adecuada para la
mecánica respiratoria mediante interacciones específicas de
lípidos y proteínas. Sin embargo, cuando las membranas
interfaciales están sobreexpresadas, SP-B todavía tiene un
papel importante en la promoción de la estabilidad de la
película contra las perturbaciones mecánicas, posiblemente al
proporcionar una alta cohesividad intermembrana al reservorio
de surfactante multilamelar asociado con la película interfacial.
En esta línea , SP-B, SP-C y colesterol son esenciales para
crear la estructura multicapa continua con una asociación
estable con la interfaz. Las dos proteínas también
desempeñan un papel crucial en la inspiración, facilitando la
recuperación de la PS y guiando la reinserción concertada de
las PL excluidas y nuevas en la superficie interfacial (figura 2) .
Las propiedades biofísicas de PS están relacionadas con la
naturaleza compleja del sistema, en la que varios
componentes están involucrados en diferentes roles
interconectados. En los alvéolos normales, este delicado
equilibrio se basa en una estrecha cooperación entre las
proteínas surfactantes y los lípidos, así como su catabolismo y
reciclaje simultáneos. Esto asegura que las proteínas y los
lípidos que están inactivados en la exposición al ambiente
altamente oxidante de los alvéolos son reemplazados por
complejos surfactantes de proteína/lípidos recién ensamblados
completamente activos. En el SDRA y el MAS, la lesión
inflamatoria modifica drásticamente el entorno alveolar,
perjudicando la balanza con los daños resultantes a la
mecánica respiratoria (Figura 1C). Los exudados de proteínas,
ROS, sPLA2 así como los elementos de meconio afectan a los
componentes de PS directa o indirectamente, lo que hace que
este complejo adsorción inestable y deteriorar, reextensión y la
generación de estructuras multicapa a altas tasas de
compresión. Por ejemplo, varias proteínas séricas (albúmina,
fibrinógeno, proteína C reactiva) compiten con PS en la
interfaz aire-líquido, creando una barrera estérica que impide
la adecuada absorción del material. Además, los ROS
generados por la respuesta inflamatoria modifican la estructura
química de ambos. Lípidos y proteínas surfactantes. Las
cargas positivas de SP-B se reducen, lo que afecta su unión a
las PL aniónicas, mientras que la pérdida de grupos palmitoilo
de SP-C conduce a la desestabilización de la conformación y
agregación de proteínas con la formación de amiloide. La
oxidación de las especies de lípidos insaturados y esteroles
también produce deterioro del surfactante y promueve un
ambiente proinflamatorio concurrente. Del mismo modo, la
actividad de algunos isotipos de sPLA2 degrada las
membranas PS, liberando LPL, FFA (incluido el ácido
araquidónico) que aumenta la inflamación general.
extensión del empaque logrado por los dominios de membrana
y película enriquecidos con DPPC. Por lo tanto, la formación
de membranas multicapa estables se ve comprometida, así
como la reducción de la tensión superficial en la expiración.

En cuanto a la composición lipídica, se notificó una

disminución de los niveles de PC y PG en el SDRA, incluida
una reducción significativa de la cantidad de DPPC. Este
evento, junto con una menor concentración de SP-A y SP-B,
también afecta a las propiedades de reducción de tensión
superficial de PS. 6 en cuanto a la MAS, un proceso adicional
de inactivación se produce por la inserción directa de
colesterol exógeno y ácidos biliares en capas surfactantes.
Las dos moléculas conducen a un efecto Fluidizador, que
inhibe las conversiones monofíacas-bicapa y reduce la

FIGURA 3 técnicas experimentales principales para el ensayo de la actividad del tensioactivo pulmonar (PS). Las metodologías que prueban la

variación en la tensión superficial de las muestras de surfactantes incluyen (A) la cubeta Wilhelmy (WT), (C) el surfactómetro de burbujas pulsante
(PBS), (D) el surfactómetro de burbujas cautivos (CBS) y (E) la gota sésil restringida (CSD)  surfactómetro. (B) la prueba de adsorción de surfactantes
de fluorescencia (SAT) analiza la acumulación de PS extra en la interfaz aire-líquido.  BB, negro brillante. 
FIGURA 4 métodos para estudiar la estructura de la película y la membrana del surfactante pulmonar (PS), la composición y la reorganización. (A)
un diagrama ilustrativo del canal Langmuir-Blodgett sometido a compresión lateral y la transferencia simultánea de una película interfacial DPPC-
REACH (previamente dopada con la sonda fluorescente BODIPY-PC). Se muestran varias imágenes de las microestructuras y nanoestructuras
formadas por DPPC en la interfaz. A altas presiones superficiales, los clusters DPPC excluyendo la sonda fluorescente voluminosa son visibles por
microscopía de epifluorescencia como dominios de starryshape negro contra un fondo verde (que representa la mezcla de DPPC y sonda sin
envasar). Alternativamente, AFM permite un análisis detallado de la distribución de los dominios a una escala submicroscópica con la topografía
simultánea de la superficie de la muestra. (B) transferencia de calor dentro de una calorimetría de barrido diferencial (DSC) y los termogramas
típicos de membranas DPPC con y sin colesterol. En condiciones normales con una temperatura cada vez mayor, DPPC sufre una pretransición (33.5
° c) en la que el tránsito de los fosfolípidos (PL) desde una "fase de gel" altamente ordenada y sólida hasta una ' fase de ondulación ' intermedia
antes de llegar a una ' fase fluida ' desordenada en una TM de alrededor de 41 ° c. Por el contrario, en presencia de altas cantidades de colesterol,
aparece una fase fluida única y la entalpía asociada (área bajo pico) se reduce fuertemente. AFM, microscopía de fuerza atómica;   CHOL,
colesterol;  CP, capacidad térmica diferencial; DPPC, dipalmitoylfosfatidilcolina saturado; TM, temperatura de fusión.

PRUEBA DE ACTIVIDAD DE PS técnicas biofísicas más empleadas se resumen en las

Las propiedades biofísicas de PS y los mecanismos
moleculares relacionados se han estudiado utilizando métodos
cuantitativos y cualitativos in vitro, que prueban mezclas de
lípidos-proteínas sintéticas, surfactantes terapéuticos, así
como muestras de PS humanas y animales. Algunas de las
secciones siguientes. 1 26 Además, la aplicación de estas
técnicas para estudiar la inactivación de la PS y las posibles
terapias eficaces se introducen en la última parte de este
examen.
WILHELMY
La vaguada Wilhelmy es un modelo simple que se utiliza
típicamente para estudiar las propiedades de adsorción y
propagación de materiales de superficie activa. Fue aplicada
por primera vez por la obra pionera de Clements27 a
mediados del siglo 20, cuando se probó la existencia de PS
como material de superficie activa en los pulmones. La Figura
3A describe los principios básicos de trabajo. Para probar la
adsorción de surfactantes, se inyecta una cantidad controlada
de material en la parte inferior de una pequeña cubeta
hidrófoba (típicamente hecha de teflón) que se llena con una
solución acuosa. Para evaluar las propiedades de dispersión,
el surfactante se distribuye directamente en la interfaz aire-
líquido. La posterior reducción en la tensión superficial se
suele detectar por una placa Wilhelmy, típicamente una
pequeña pieza de papel de filtro o una placa de platino,
la parte inferior se sumerge en la subfase acuosa y en
contacto con la interfaz aire-líquido (Figura 3A). Por lo tanto,
cuando el surfactante se acumula en la superficie acuosa, un
transductor de fuerza detecta el aumento de la presión
molecular lateral, que está relacionado con la reducción de la
tensión superficial.
PRUEBA DE ADSORCIÓN DE SURFACTANTE
La prueba de adsorción de surfactante (SAT) es un método
fluorescente rápido, sensible y de alto rendimiento para probar
tanto la adsorción como la acumulación de surfactante en la
interfaz aire-líquido (Figura 3B). el material de la superficie
activa está etiquetado con un PC fluorescente ( BODIPY-PC) a
una relación molar final del 1% (tinte/surfactante). Entonces,
algunos microgramos de esta mezcla se inyectan en la parte
inferior de una placa de microtitulación, los pozos de los
cuales contienen una solución de enfriamiento, es decir, negro
brillante. La lectura de la fluorescencia se inicia rápidamente y
continúa durante 2 horas cuando la placa se somete a ciclos
de agitación. Dado que el tinte se enmascara hasta que el
surfactante se adsorbe en la interfaz aire-líquido, el método
permite la detección de la adsorción y la acumulación de
muestras a lo largo del tiempo mediante el control del aumento
de la fluorescencia. SAT fue desarrollado por Ravasio et al
[28] en 2008. Sin embargo, los cambios en este protocolo se
propusieron más adelante para mejorar la sensibilidad del
ensayo (menor volumen y mayor relación de tinte
molar/surfactante) y para probar las muestras humanas de
diferentes orígenes, convertir SAT en una herramienta útil para
diseñar un método de punto de cuidado de la cabecera.
FIGURA 5 inactivación del tensioactivo pulmonar y administración de fármacos. (A) Ilustración esquemática de los mecanismos básicos que
conducen a la inactivación de la membrana del tensioactivo pulmonar (PS) por suero o meconio. (B) protocolos in vitro para estudiar la inhibición
por suero en la cubeta Wilhelmy y el surfactómetro de burbujas cautivos (CBS). (C) doble equilibrio de ajuste para recrear PS y PS/fármaco a lo largo
de la interfaz aire-líquido, imitando la distribución de surfactantes in vitro de las vías respiratorias superiores a las inferiores (modificadas desde)
SURFACTÓMETRO DE BURBUJA PULSANTE
El surfactómetro de burbujas pulsante (PBS) tiene un diseño
simple y es una técnica comercialmente disponible, que evalúa
las propiedades de compresión/reexpansión del surfactante
bajo condiciones quasifisiológicas. Este método, desarrollado
por Adams y Enhörning, recrea la geometría del alveolo,
permitiendo una simulación de respiración dentro del rango de
0.02 – 80 ciclos/min. Como se muestra en la Figura 3C, se
utiliza un pequeño capilar de plástico para crear una burbuja
de aire (0,8 – 1,1 mm), que está conectada a la atmósfera
hacia arriba y a la suspensión de surfactantes (contenida en
una cámara) cara abajo. Por lo tanto, el material activo de la
superficie se adsorbe en la interfaz aire-líquido, distribuyendo
toda la superficie de la burbuja. Esto se expande y comprime
periódicamente por un pulsador de pistón, modificando la
presión dentro del capilar. Los cambios resultantes en el radio
de la burbuja (de 0,4 a 0,55 mm) son monitoreados
continuamente por un microscopio y transformados en valores
de tensión superficial que definen la actividad del surfactante
ensayado. Sin embargo, se observan dos desventajas
principales: (1) la incapacidad para evaluar muestras de
surfactantes con una concentración por encima de un límite
determinado (máximo de 1 – 2 mg/mL) y (2) la fuga de
material hacia el capilar a altas tasas de compresión.
SURFACTÓMETRO DE BURBUJAS CAUTIVOS
El surfactómetro de burbujas cautivos (CBS) fue diseñado por
Schürch y sus colegas para eludir las limitaciones de PBS
(Figura 3D). Esta técnica se considera actualmente la
metodología más eficaz para estudiar cambios dinámicos en la
tensión superficial en condiciones de respiración (hasta 60
ciclos/min). La capacidad del surfactante para adsorbir,
reextenderse y comprimirse se evalúa en la interfaz aire-
líquido entre una burbuja de aire y una solución tampón,
contenida en una cámara de vidrio. La pequeña burbuja (2 – 7
mm) se crea y flota contra un techo de agarosa sin conexión a
la atmósfera, evitando la fuga de material. A temperatura
controlada, la suspensión de surfactantes se puede dispersar
dentro de la solución tampón o aplicarse localmente sobre la
superficie de la burbuja mediante el uso de un pequeño tubo
capilar (lo que permite aumentar las concentraciones de la
muestra). Luego, la cámara está sellada y la burbuja se
comprime y se expande periódicamente variando la presión
hidrostática con un pistón. Los cambios en la forma de la
burbuja se registran continuamente, lo que permite el cálculo
del volumen, área y tensión superficial en cualquier momento.
LA GOTA SÉSILES RESTRINGIDA
La gota sésiles restringida (CSD) es un método alternativo
para detectar variaciones en la tensión superficial en
condiciones de respiración simulada (figura 3E). Brevemente,
se crea una gota acuosa sésiles en la parte superior de un
pequeño pedestal de acero inoxidable, que está conectado a
una tienda líquida. La muestra se puede aplicar directamente
en la interfaz aire-líquido, ya sea desde el depósito de agua o
el aire de arriba, lo que permite el estudio de todas las
condiciones fisiológicas y terapéuticas. Una jeringa se utiliza
para modificar continuamente el volumen del líquido de
movimiento de gota hacia y desde la tienda, sometiendo la
muestra a ciclos de expansión de compresión. Los cambios
resultantes en la forma de gota se registran y se transforman
en valores de tensión superficial.
COMPRENSIÓN DE LOS MECANISMOS MOLECULARES
DE LA DISFUNCIÓN PS
Aparte de SAT, que mide la acumulación de PS en la interfaz
aire-líquido, todos los métodos descritos anteriormente
analizan la actividad biofísica de los surfactantes como
cambios en la tensión superficial con diferentes flexiones. Sin
embargo, la estructura molecular de PS, la composición y la
reorganización en condiciones ambientales particulares
también influyen en la función surfactante tanto en salud como
en enfermedades.
Langmuir-Blodgett a través del uso de Langmuir-Blodgett (lb)
valles permite el estudio de la estructura y las propiedades
dinámicas de PS (Figura 4a). Permite la compresión y
expansión de la película surfactante adsorbida/spread
moviendo la barrera horizontal que delimita un lado (o dos
lados, si se fijan dos barreras simétricas) de la cubeta. Al
mismo tiempo, la interfaz se puede transferir a un soporte
sólido (es decir, vidrio o mica) y las microestructuras y
nanoestructuras formadas por PS en la interfaz pueden
evaluarse a diferentes presiones superficiales, por ejemplo,
por epifluorescencia (que se puede aplicar in situ en la cubeta)
o microscopía de fuerza atómica. 1 esta innovación convierte
el canal LB en un método altamente versátil y eficaz, que
facilita la comprensión de los mecanismos moleculares del
surfactante y su organización estructural. Sin embargo, este
dispositivo exhibe varios inconvenientes para probar la
actividad de PS, a saber, la velocidad relativamente lenta de
los ciclos dinámicos en comparación con las tasas de
respiración fisiológicas, la gran cantidad de material necesario
para cada réplica y la posible fuga de muestra en la
intersección de la cubeta/barrera. Los problemas con las fugas
se reducen considerablemente mediante el uso de un
equilibrio, que está diseñado específicamente, con una barrera
de cinta de teflón continua especial que encierra toda la zona,
que se puede reducir o ampliar, y no tiene cruces.
CALORIMETRÍA DE BARRIDO DIFERENCIAL
Los PLs y las membranas de lípidos-proteínas, como las que
participan en los complejos de PS, pueden exhibir diferentes
organizaciones moleculares o fases en función de la
temperatura. Típicamente, las membranas y las películas
interfaciales tienen un alto grado de orden a baja temperatura,
con una difusión molecular limitada y traslacional. Por el
contrario, a temperaturas por encima de un umbral definido, la
llamada temperatura de fusión (TM), las moléculas lipídicas
ganan movilidad y se desordenan (Figura 4B). Esta transición
reversible y la energía relacionada con ella (entalpía del
sistema) dependen principalmente de los cambios en las
fuerzas de van der Waals que, a su vez, están determinados
por la longitud de las cadenas de acil y el grado de
insaturación, así como por las interacciones proteína-lípidos.
Además, los esteroles (como el colesterol) modulan la
organización del sistema, intercalando entre PLs en la fase de
gel, haciéndolos ganar movilidad y empaquetándolos más
apretados en la fase líquida.
Por lo tanto, los niveles suficientes de colesterol promueven la
organización de una fase intermedia única, la llamada fase '
líquida ordenada ' (Figura 4B). La composición de PS ha
evolucionado para sus membranas y películas para sostener
una coexistencia simultánea de fases de membrana
ordenadas y desordenadas a temperaturas cercanas a los
valores fisiológicos. La existencia de estas diferentes fases y
organizaciones de membranas y su interconversión en función
de la temperatura, la determinación de los valores TM que
rigen las transiciones de fase y la energía asociada (entalpía)
pueden caracterizarse por Calorimetría de barrido diferencial
(DSC). Los termogramas de DSC de las membranas
tensioactivas se pueden obtener en un microcalorímetro, que
mide el calor diferencial (CP) necesario para elevar la
temperatura de la muestra (surfactante) al mismo valor
alcanzado por una referencia (tampón) a lo largo de una
rampa de aumento (o disminución) de la temperatura. Como
se esquematiza en la Figura 4B, cuando la muestra se somete
a una reorganización molecular endotérmica, el CP aumenta,
revelando tanto la TM (temperatura pico en la que se produce
el CP) como la energía necesaria para completar la transición
de fase (área bajo pico).
BIOFÍSICA DE SURFACTANTE EN INVESTIGACIÓN
CLÍNICA
Se han propuesto protocolos alternativos de métodos clásicos
in vitro para crear y evaluar la aparición de inhibición de
surfactantes asociada a varias enfermedades pulmonares. El
diseño incluye la prueba de PS de fuentes animales (es decir,
tensioactivos de porcino), que se pueden recoger fácilmente,
para comprender mejor el proceso de inactivación de
surfactantes junto con posibles estrategias de reversión. En
este sentido, se deben considerar dos mecanismos clave de
inhibición: (1) la inserción directa de compuestos que perturbe
la membrana en capas surfactantes (esto ocurre para el
colesterol y los ácidos biliares presentes en la mezcla de
meconio), y (2) la competencia de moléculas de superficie
activa para llegar a la interfaz (este es el caso de las proteínas
séricas, especialmente la albúmina) (figura 5A). Para recrear
estas condiciones, se propusieron las siguientes estrategias
experimentales (figura 5B): preincubando muestras con
meconio (1 hora a 37 ° c, permitiendo la inserción de sus
componentes en membranas surfactantes) antes de probar la
actividad de surfactantes, o (2 ) inyectar suero humano/animal
en la burbuja (CBS) o en la interfaz aire-líquido (los valles
Wilhelmy y LB), esperando unos minutos para permitir la
adsorción proteica. Después de esto, la muestra de interés se
aplica sin tocar la interfaz. Esta sutileza evita las
perturbaciones a la barrera interfacial de las proteínas séricas.
Por lo tanto, la capacidad del surfactante para desplazar ' este
obstáculo ' durante la aproximación a la interfaz aire-líquido se
puede evaluar en detalle. En cuanto a CSD, el set-up también
puede ser modificado con un capilar adicional para introducir
moléculas inhibidoras en el depósito de agua.
Simultáneamente, las partículas de aerosol se pueden
introducir continuamente en la cámara, lo que aumenta la
versatilidad del dispositivo. Los modelos mencionados se
pueden aplicar fácilmente para estudiar la
sensibilidad/resistencia de los tensioactivos terapéuticos a la
inactivación por suero o meconio. Del mismo modo, la
prevención/reversión de la inhibición por varios compuestos
como el ácido hialurónico puede ser investigado junto con la
capacidad de los tensioactivos clínicos (ya sea natural o
sintético) para actuar como portadores para la administración
de fármacos. Con este objetivo, se diseñó un novedoso set-up
basado en el uso de los valles Wilhelmy, permitiendo la
recreación in vitro de las condiciones lo más cercanas posible
a la difusión del surfactante con o sin transportar fármacos,
alérgenos o partículas, sobre las vías respiratorias superficie
(figura 5C). Brevemente, un canal adicional y un segundo
sensor se añaden al dispositivo junto con un puente de papel
que conecta la interfaz de los dos valles. El surfactante se
puede inyectar en uno de los valles (el donante) que de alguna
manera imitaría las vías respiratorias superiores en el
momento de recibir una dosis de surfactante exógeno o una
combinación de surfactante/fármaco. Después de varios
minutos, la propagación del material puede evaluarse por un
aumento en la presión superficial también en el segundo canal
(el receptor), reflejando el viaje interfacial del surfactante hacia
los alvéolos distales. Como era de esperar, la posibilidad de
analizar muestras humanas puede abrir horizontes
interesantes, pero deben tenerse en cuenta diferentes
inconvenientes. El surfactante de los lavages broncoalveolares
humanos (BAL) generalmente se recoge de las vías
respiratorias superiores y sólo refleja parcialmente las
propiedades interfaciales de los pulmones enteros. El material
recogido ya se ha utilizado en la interfaz aire-líquido con una
menor actividad posterior en comparación con los materiales
obtenidos de modelos animales, donde el lavado pulmonar
completo es accesible. Además, aparte de PAP, la cantidad de
surfactante recuperado es bastante baja, por lo que es difícil
replicar experimentos, manipular muestras y aplicar ciertas
técnicas que exigen materiales. Una última ADVERTENCIA es
que la composición y concentración del entorno inhibitorio que
afecta al surfactante in vivo, incluyendo la posible presencia de
células inmunitarias infiltradas/inflamatorias y sus secreciones,
sólo puede recuperarse (para ser recreada ex vivo)
Parcialmente.
A pesar de las limitaciones descritas anteriormente, varias
confirmaciones ya han demostrado el enorme potencial de la
biofísica para buscar nuevas estrategias efectivas útiles en la
práctica clínica o para mejorar las actuales. Se han propuesto
diferentes pruebas biológicas para estimar el nivel de la
función surfactante en diferentes contextos fisiopatológicos
pulmonares. Determinación de la relación de
lecitina/esfingomielina o del nivel de PG, la prueba de
microburbuja o un conteo de cuerpo lamelar automatizado se
han empleado para detectar la insurgencia de RDS, pero estos
no son útiles para guiar el manejo clínico de los pacientes en
la entrega Habitación. Por el contrario, los resultados
preliminares han demostrado la confiabilidad del SAT para
predecir la necesidad de SRT en los bebés prematuros que
fallaron la presión positiva continua en las vías respiratorias. El
SAT es un ensayo rápido y preciso, que proporciona
resultados dentro de las primeras horas de vida. Además, se
puede emplear fácilmente para probar la calidad del material
interfacial tanto en las BALs como en los líquidos amnióticos.
Aunque no es viable en la cabecera, otras técnicas biofísicas
también se han aplicado en la investigación clínica mediante la
prueba de muestras humanas. La CBS y la PBS se han
utilizado para evaluar la disfunción de los surfactantes en una
variedad de condiciones tales como la SDRA neonatal y
adulta, fibrosis quística, PAP o asma. La CBS también fue
empleada para probar las BALs de neonatos asfixiados sin
enfermedad pulmonar, demostrando que la hipotermia del
cuerpo entero podría ser una opción terapéutica para mejorar
el rendimiento de los surfactantes. Estos datos prometedores
ponen de relieve la necesidad de colmar los conocimientos y
las brechas de experiencia entre las investigaciones biofísicas
y la práctica clínica.
CONCLUSIÓN
La investigación básica permite entender las condiciones
normales y de la enfermedad, pero rara vez traduce este
conocimiento en aplicaciones clínicas efectivas. Por esta
razón, la investigación traslacional es esencial para integrar
conceptos básicos con observaciones clínicas, hacia la
promoción de la conversión de "Banco a cabecera". En este
contexto, la comprensión de los principales conceptos
biofísicos de PS tanto en la salud como en la enfermedad es
cada vez más crítica para curar la brecha entre los médicos
pulmonares y los investigadores de ciencias básicas. Una
retroalimentación constante debe promover y motivar las
investigaciones en curso para la ciencia traslacional en áreas
transversales que han sido poco exploradas, como la biofísica.