Herramientas

 básicas  para  la  

síntesis  de  ADN  recombinante  

1  
Enzimas  básicas  en  la  tecnología  del  ADN  
recombinante:  
•  Nucleasas  
•  Ligasas  
•  Enzimas  modificadoras  de  extremos  
•  Polimerasas  
 

2  
Nucleasas:  
  Las  nucleasas  son  enzimas  capaces  de  hidrolizar  los  enlaces  fosfodiester  que  se  dan  
entre  los  nucleóEdos  de  los  ácidos  nucleicos.  

3  
Exonucleasas:  

4  
Endonucleasas:  

•  Endonucleasas  inespecíficas:    
Ø  RNAasa  A  
Ø  DNAasa  I  

•  Endonucleasas  que  cortan  en  siEos  

específicos:  endonucleasas  de  restricción.  

5  
 Endonucleasas  de  Restricción.  

•  Enzimas  nucleolíEcas  que  catalizan  la  hidrólisis  de  

enlaces  fosfodiéster  internos  en  las  dos  hebras  de  
una  molécula  de  dsDNA  de  forma  específica.  
 
•  En  la  naturaleza  forman  parte  del  sistema  de  
restricción-­‐modificación  bacteriano  (abreviadamente  
sistema  R-­‐M),  que  sirven  a  las  bacterias  para  
reconocer  y  destruir  material  exógeno.  

6  
7  
Papel  Biológico  Sistema  R-­‐M    

8  
MeElación   Restricción  

9  
•  Existen  varios  sistemas  de  R-­‐M,  los  de  Epo  II,  son  los  
más  comunes  en  el  mundo  bacteriano.    
Ø  Tienen  las  acEvidades  meElasa  y  endonuclesa  
separadas.  
Ø  Son  los  más  uElizados  en  biología  molecular:  
o  Gran  especificidad.  
o  Estructuralmente  sencillas,  lo  que  facilita  su  
aislamiento,  conservación  y  manejo.  

•  Existen  más  de  un  millar  caracterizadas.  

•  Pueden  conocer  una  secuencia  específica.  
•  Pueden  reconocer  varias  secuencias.  
10  
Nomenclatura  ER:  
Eco  RI  
E      =  género    Escherichia.  
Co    =  especie:  coli  
R  =  esErpe,  cepa  RV  13.  
I    =  primera  endonucleasa  aislada  de  esta  cepa.  

11  
Diana:  
•  Longitud  variable.  
•  Cuanto  más  pequeña,  más  probable  es  que  apareza.  
•  La  probabilidad  de  que  en  una  secuencia  de  ADN  
generada  al  azar  se  encuentre  una  determina  
secuencia  de  6  pares  de  bases  es  de  (1/4)6=  1/4096  
   8  pares  de  bases  es  de  (1/4)8=  1/65536  
(en  realidad,  las  secuencias  no  son  al  azar,  y  difieren  de  estos  
valores,  pero  siempre  hay  que  tenerlos  en  cuenta).    
•  Salvo  excepciones  se  tratan  de  estructuras  
palindrómicas  (simetría  rotacional).  
 
 
12  
Secuencia  palindrómica  

13  
 Puntos  de  Rotura  de  la  diana:  

•  Los  puntos  de  rotura  son  dos  enlaces  fosfoester  localizados  uno  
P1: SBT
en  cada  CUUS128/Nicholl
09780521850063c04 hebra,  que  978se  
0 521 encuentran  
85006 3 dispuestos  simétricamente  March 13, 2008 17

según  el  mismo  eje  que  marca  la  simetría  de  secuencia  de  las  
54
hebras   en  la  diana.  
THE BASIS OF GENETIC ENGINEERING
•  Las  enzimas  pueden  generar  extremos:  
•  Fig.3’  4.2protuberantes  
Types of ends generated  
•  by(a)5’  
Thep rotuberantes  
different restriction enzymes.
enzymes are listed, with
5′-GGCC-3′ 5′-CTGCAG-3′ 5′-GAATTC-3′
•  andRomos  
their (b) recognition sequences
(c) cutting sites, respectively.
GGCC CTGCAG GAATTC
(d) A schematic representation of CCGG GACGTC CTTAAG
the types of ends generated is also
shown.

may be produced: (1) blunt ends (sometimes known as flush-ended 14  

fragments), (2) fragments with protruding 3′ ends, and (3) fragments
Nomenclatura  diana:  
Nomenclatura  
simplificada  

G’GATCC  

A’GATCT  

Romos  
3’  protuberantes  

5’  protuberantes  

15  
 Diana:  especificidad  relajada  
La  especificad  relajada  implica  que  en  alguna  posición  de  
la  diana  el  enzima  de  restricción  puede  aceptar  más  de  un  
nucleóEdo  diferente:  
 
AvaI  C’YCGRG              
SecI    CC’NNGG            
StyI    C’CWWGG    
     
Algunas  dianas  con  especificad  relajada  pueden  reconocer  a  
secuencias  que  no  sean  perfectamente  palindrómicas.  

AvaI   C’TCGAG    C’TCGGG    C’CCGAG    C’CCGGG  

N=  A,T,C,G        W=  Ao  T      Y=T  o  C                R=  A  o  G  

16  
 
 Isosquizómeros  

•  Enzimas  que  reconocen  la  misma  secuencia  diana.  

•  Algunos  ClaI  y  BanIII  reconocen  la  misma  diana  y  

cortan  en  siEos  idénEcos.    

ClaI  y  BanIII    5’  AT’CGAT  3’  

•  Algunos  como  SmaI  y  XmaI  reconocen  la  misma  diana  

pero  cortan  en  siEos  diferentes  
 SmaI        5’  CCC’GGG  3’  
 XmaI        5’    C’CCGGG  3’  
   
17  
     
 Extremos  compaHbles  
Los  extremos  romos  son  siempre  compaEbles  para  volver  a  pegarse.  
Algunas  enzimas  dejan  extremos  compaEbles  que  pueden  volver  a  unirse  una  
vez  se  cortan.  
 
XbaI   NheI  

Frecuentemente  al  ligar  extremos  compaEbles  provenientes  de  enzimas  

diferentes  se  pierden  las  dianas  
 
TCTAGC
AGATCG
Tras  ligar  extremos  XbaI,  NheI  se  pierden  ambas  dianas  

 
18  
   
AcHvidad  Estrella  
En  ciertas  condiciones  alejadas  de  las  ópEmas,  
algunas  endonucleasas  de  restricción  pueden  cortar  
un  DNA  por  siEos  algo  disEntos  a  sus  dianas  
específicas,  y  pierde  especificad.  

EcoRI  AcEvidad  normal    G’ATTTC  

EcoRI  AcEvidad  estrella    N’AATTN  

 
19  
   
Protocolo  digesHón  enzimáHca  

 
20  
   
 Comercialización  de  enzimas  

•  Diversas  compañías  venden  mulEtud  de  enzimas  de  

restricción,  actualmente  se  ha  alcanzado  el  millar  de  
enzimas  (NEB,  Promega,  Fermentas,  etc).  

•  Aunque  se  aislaron  de  bacterias  diferentes,  para  su  

generación  se  han  clonado  y  producen  en  E.  Coli,  esto  
ha  conseguido  disminuir  el  precio  de  las  enzimas.  

 
21  
   
One  unit  is  defined  as  the  amount  of  enzyme  
required  to  digest  1  µg  of  λ  DNA  in  1  hour  at  
37°C  in  a  total  reacEon  volume  of  50  µl.  

x1  

El  precio  de  las  

enzimas  es  muy  
variable  

x40  

 
22  
   
 Diferentes  enzimas  pueden  combinarse  
en  búferes  similares  para  realizar  
digesEones  dobles.  

•  Algunas  enzimas  de  restricción  pueden  inacEvarse  mediante  calor,  otras  

se  deben  eliminar  mediante  purificación.  
•  Algunas  enzimas  son  más  rápido  que  otras:  BamHI  es  capaz  de  digerir  1ug  
de  ADN  en  10  minutos.  
 
23  
   
 DigesHón  Parcial  
Si  el  ADN  no  corta  el  100%  de  las  moléculas  (no  hay  suficiente  
enzima,  se  incuba  poco  Eempo,  o  las  condiciones  son  subópEmas)  
se  crea  una  digesEón  parcial  que  complica  la  interpretación  de  los  
resultados.  

Sin  digerir   Total              Parcial  

3000  
2500  
1   500   2500              3000   2000  
 
 
500  
 

 
24  
   
  
25  
   
 Aplicaciones  ER  

•  I)  Creación  de  ADN  recombinante  y  clonación  

molecular  de  ADN  (estudiado  más  adelante).  

•  II)  Mapas  de  restricción.  

•  III)  GenoEpado:  determinación  de  secuencia  genómica  

de  polimorfismos.    
 PCR-­‐RFLP  
 RFLP  =  restricEon  fragment  length  polymorphism.  

 
26  
   
I)  Creación  de  ADN  
recombinante  
Aplicaciones y  clonación  
de
enzimas de
molecular   de  ADN  
restricción:
formación de
(Estudiado  en  detalle  más  adelante)  
moléculas de
DNA
recombinantes

OJO:  ADN  recombinante,  no  debe  confundirse  

con  recombinación  genéEca.  

 
27  
   
II)  Mapas  de  restricción.  
*  Para  “mapear”  o  “comparar”  secuencias  de  ADN  en  base  al  patrón  de  
bandas  generado  cuando  la  digesEón  se  resuelve  en  un  gel  de  agarosa.  
CCCGGG  
GGGCCC  

CCCGGG  
GGGCCC  
A   B   CCCGGG  
GGGCCC  

Marcador      DigesEón  A    DigesEón  B  

 
 

 
    28  
III)  RFLP  =  restricHon  fragment  length  polymorphism.

•  RFLP   (del   inglés   RestricEon   Fragment   Length   Polymorphism)  

técnica   que   se   uEliza   para   diferenciar   secuencias   de   ADN   en  
virtud   de   que   tengan   cortes   diferenciales   con   enzimas   de  
restricción.    

•  Suele  combinarse  con  PCR  o  Southerblot.  

•  Ha   perdido   importancia   debido   a   la   secuenciación,   que   es  

mucho  más  informaEva,  pero  llegó  a  ser  de  los  primeros  en  el  
genoEpado  masivo  de  muestras.  

 
    29  
Aplicaciones:  ¿Reparan  igual  las  diferentes  formas  de  proteínas  reparadoras  del  
ADN?  ¿Se  asocian  algunas  de  estas  variaciones  polimórficas  con  el  cáncer?  

 
    30  
Diseño
experimental   Polimorfismo  243M/M  para  gen  XRCC3  
GTGTGTGAATAAGAAGGTCCCCGTACTGCTGTCTCGGGGCATGGCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCGGTGGCAGCCCCATTCCGCTGTGAATTTGAC
AGCCAGGCCTCCGCCCCCAGGGCCAGGCATCTGCAGTCCCTGGGGGCCATGCTGCGTGAGCTGAGCAGTGCCTTCCAGAGCCCTGTGCTGTG
CATCAACCAG GTGAGCACCA AGGCAGGGTT GCACCCCTGAGCTCGTATTT TTAGCCAGGA TGCG  

PCR  
GTGTGTGAATAAGAAGGTCCCCGTACTGCTGTCTCGGGGCATGGCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCGGTGGCAGCCCCATTCCGCTGTGAATTTGAC
AGCCAGGCCTCCGCCCCCAGGGCCAGGCATCTGCAGTCCCTGGGGGCCATGCTGCGTGAGCTGAGCAGTGCCTTCCAGAGCCCTGTGCTGTG
CATCAACCAG GTGAGCACCA AGGCAGGGTT GCACCCCTGAGCTCGTATTT TTAGCCAGGA TGCG  

Hsp92  II    

43pb   GTGTGTGAATAAGAAGGTCCCCGTACTGCTGTCTCGGGGCATG

105pb   GCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCGGTGGCAGCCCCATTCCGCTGTGAATTTGACAGCCAGGCCTCCGCCCCCAGGGCCAGGCATCTGCAGTCCCTGGGGGCCATG
CTGCGTGAGCTGAGCAGTGCCTTCCAGAGCCCTGTGCTGTG CATCAACCAG GTGAGCACCA AGGCAGGGTT GCACCCCTGAGCTCGTATTT TTAGCCAGGA TGCG
105pb  

Gel  Agarosa  2%  

MM  
31  
 Polimorfismo  243T/T  para  gen  XRCC3  

GTGTGTGAATAAGAAGGTCCCCGTACTGCTGTCTCGGGGCATGGCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCGGTGGCAGCCCCATTCCGCTGTGAATTTGAC
AGCCAGGCCTCCGCCCCCAGGGCCAGGCATCTGCAGTCCCTGGGGGCCACGCTGCGTGAGCTGAGCAGTGCCTTCCAGAGCCCTGTGCTGTG
CATCAACCAG GTGAGCACCA AGGCAGGGTT GCACCCCTGAGCTCGTATTT TTAGCCAGGA TGCG  

Hsp92  II    

45pb   GTGTGTGAATAAGAAGGTCCCCGTACTGCTGTCTCGGGGCATG
210pb   GCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCGGTGGCAGCCCCATTCCGCTGTGAATTTGACAGCCAGGCCTCCGCCCCCAGGGCCAGGCATCTGCAGTCCCTGGGGG
CCACGCTGCGTGAGCTGAGCAGTGCCTTCCAGAGCCCTGTGCTGTG CATCAACCAG GTGAGCACCA AGGCAGGGTT GCACCCCTGAGCTCGTATTT
TTAGCCAGGA TGCG

TT  
GenoHpado  de  XRCC3  para  la  posición  243  de  la  
cadena  polipepXdica  

210bp  

105pb    
+    105pb    

43bp  

 MM      TT    
 TM      MM      TT    
33  
 BRCA1  

NBS1  

XRCC3  

 
    34  
 Ligasas  
•  Enzima  que  se  uEliza  para  ligar  covalentemente  fragmentos  de  ADN.    
•  Catalizan  la  formación  de  un  enlace  fosfodiéster  entre  el  5’  fosfato  de  
una  hebra  de  ADN  y  el  3’  hidroxilo  de  otra  hebra.    
 ADN  Ligasas  
Humanas:  
•  ADN  Ligasa  I:  Liga  los  fragmentos  de  okazaki  de  la  hebra  de  retrasada.  
•  ADN  Ligasa  II:  forma  alternaEva  de  la  ADN  Ligasa  III  encontrada  en  células  
que  no  se  dividen.  
•  ADN  Ligasa  III:  parEcipa  en  los  procesos  de  reparación  por  excisiíon  de  
nucleóEdos  
•  ADN  Ligasa  IV:  parEcipa  en  los  procesos  de  reparación  de  doble  de  ADN  
cadena  por  unión  de  extremos  sin  homología.  

UHlizadas  en  Biología  Molecular:  

•  ADN  Ligasa  del  fago  T4.  
•  ADN  Ligasa  del  fago  T7.  
•  ADN  Ligasa  del  E.coli.  
 Estas  enzimas  requieren  
incorporar  AMP,  que  lo  toman  
de  diferentes  cofactores.  

•  Las  de  Fagos  y  humanas  uElizan  como  cofactor  ATP  y  Mg++.  

•  Las  de  E.  coli  y  la  mayoría  de  las  bacterianasuElizan  como  cofactor  NAD  
(nicoEnamide  adenine  dinucleoEde)    
 La  ligasa  T4  es  la  más  
polivalente  ya  que  es  capaz  
de  unir  extremos  romos  (ni  
la  T7  ni  l  de  E.  Coli  pueden  
hacerlo.)  

•  Los  extremos  romos  se  ligan  mucho  menos  eficientemente,  requieren  más  
enzima  y  sustrato  y  se  suele  añadir  polieElien  glicol  (PEG)  que  secuestra  
molecular  de  agua  concentrando  los  sustratos.