PREPARACION DE EXTENDIDOS Y COLORACIONES

DIFERENCIALES
Moreno Luis Miguel1, Polanco C. Alejandro2, Ramirez R. Nayibe3
Escuela Ingeniería de Alimentos, Universidad del Valle
16 Diciembre 2015

RESUMEN

Se emplearon los diferentes métodos de coloración para distinguir de cada bacteria su

reacción frente a estas tinciones, para la E.Coli y la E.Aureus se usó la técnica de tinción de
Gram identificando en estas que son gram negativas y gram positivas respectivamente, a la
B.Cereus se le identifico su espora mediante la coloración necesaria posteriormente
mencionada, a la Proteus su motilidad, aunque no fue posible su observación debido a que
la bacteria se murió o y finalmente a la Klebsiella se le identifico su capsula por el método de
Anthony. Debido al pequeño tamaño de los microrganismos se dispuso de un microscopio
óptico para que le campo fuese más claro y poder identificar y observar estas bacterias.
Todos los resultados, a excepción de la prueba de motilidad, fueron los esperados.

Palabras claves

Escherichia Coli, Estafilococos Aureus, Bacillus Cereus, Proteus, Klebsiella Pneumoniae,

capsula, espora, tinción de Gram, coloración,

Abstract

Different staining methods were used to distinguish from each bacterium their reaction to
these dyes, for E.Coli and E.Aureus the Gram staining technique used in identifying these
are gram negative and gram positive respectively, the B. cereus spore was identified by his
later mentioned necessary coloration, the Proteus motility, although his remark was not
possible because the bacteria eventually died to Klebsiella his capsule was identified by the
method of Anthony. Due to the small size of the microorganisms were available for light
microscopy field will be clearer and to identify and observe these bacteria. All results,
except for the motility test, were as expected.

Keywords

Escherichia Coli, Estafilococos Aureus, Bacillus Cereus, Proteus, Klebsiella Pneumoniae,

capsule, spore, Gram stain, coloration.

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1. Luis.miguel.moreno@correounivalle.edu.co 1428106

2.Alejandro.polanco@correounivalle.edu.co 1423958
3.Nayibe.ramirez@correounivalle.edu.co 1429076
INTRODUCCIÓN

Las bacterias se caracterizan por ser microorganismos unicelulares que no poseen

membrana nuclear, en las cuales el material nuclear está organizado en una tira continua, a
veces circular, contenido en el citoplasma y presentan una actividad metabólica. Existen
bacterias en forma redondeada denominadas cocos, en forma cilíndrica, denominadas
bacilos y una tercera morfología como son las que tienen forma de espirales, denominadas
espirilos. (Evelyn, 2005).

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o

cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen
agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis
debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos
habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la
muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana
hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible
la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber. El
frotis se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superficie
transparente, en la cual se fijan y se tiñen los microorganismos. (Tortora et al, 2007).

La coloración de gram permite separar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram
positivos y Gram negativos, basados en que si retienen o no el colorante primario (cristal
violeta), luego del proceso de decoloración. Los organismos que retienen el cristal violeta
luego de la adición de agentes decolorantes como el alcohol, aparecen como azul oscuro o
violeta y se designan como Gram positivos: aquellos que pierden e cristal violeta y se tiñen
con el colorante secundario, la safranina, aparecen como rojos y se designan como Gram
negativos. (Gerard et al, 2005).

OBJETIVOS

 Aprender las técnicas de preparación del frotis, de fijación y coloración más

utilizadas en el estudio macroscópico de cultivos bacterianos, para poder así dar
pauta a la identificación de las principales formas bacterianas y comprender la
importancia de las tinciones y su adecuado uso.
 Identificar las técnicas de coloración más comunes utilizadas para identificar
morfología y estructuras de bacterias.

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 METODOS

Tabla 1 resultados observados de la tinción de gram de las bacterias E. Coli y E.Aureus

Escherichia Coli Estafilococos Aureus

FOTO
Ilustración 2 Coloración de la E. Aureus
Ilustración 1 Coloración de la E. Coli.

 Miden alrededor de 0.5u  Miden alrededor de 0.5 a

 Son circulares y cortas 1u
DESCRIPCIÓN DE  Elevación Convexas  Se distingue un patrón con
LO OBSERVADO  Borde liso forma de racimo de uvas
 No forman esporas  Borde ondulado
 Elevación convexa

COLORACIÓN DE La bacteria se tiño de color rosado La bacteria se tiño de color

LA BACTERIA morado
TEÑIDA
REACCIÓN A LA Según el color rosado la bacteria es Gram positivo
COLORACIÓN DE gram negativo
GRAM
Tabla 2 resultados observados de la bacteria Bacillus Cereus

Bacillus Cereus

FOTO

3
 Ilustración 3 Coloración de Bacillus Cereus.

 Redondeados
DESCRIPCIÓN  Forman cadenas
DE LO  Son gram positivos
OBSERVADO  presentan color verde en la parte externa (2)
 Presencia de color verde en la parte interna(endoesporas)(1)

Tabla 3 resultados observados de la prueba de motilidad de la bacteria Proteus

PROTEUS

FOTO

Ilustración 4 Prueba de motilidad de Proteus.

 Circulares y cortos
DESCRIPCIÓN  Borde ondulado y elevación convexa
DE LO  No se distinguieron los flagelos
OBSERVADO

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Coloración de Gram

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Las bacterias gram positiva y las gram negativas presentan una gran diferencia en su pared
celular, las paredes de las gram positivas están conformadas principalmente por
peptidoglicano, la cual se cree que es la responsable de retener el cristal violeta de la
tinción de gram debido a su gruesa capa, aunque estas células también presentan una gran
cantidad de ácido teicoico (polisacáridos que se unen al ácido N-acetilmurámico o a los
lípidos de la membrana plasmática.) este acido tiene una función de estabilizar la pared
celular. Además los ácidos teicoicos tienen un rol en la virulencia de estos
microorganismos, porque actúan como antígenos de superficie que se unen a receptores
específicos en las células del huésped. (Prescott et al, 1999).

Por otro lado la pared celular de la gram negativa está constituida de tres zonas, la
membrana plasmática, el espacio periplásmico que incluye una fina capa de peptidoglicano
y la membrana externa. Esta última, exclusiva de las bacterias gram negativas, es una
bicapa lipídica que difiere de otras membranas por su capa externa, que está constituida por
una molécula anfipática. Una de las funciones más importantes de la membrana externa es
servir como barrera protectora. Evita o disminuye la entrada de sales biliares, antibióticos y
otras sustancias tóxicas que podrían destruir o lesionar la bacteria. La membrana externa es
más permeable que la plasmática y permite el pasaje de pequeñas moléculas como glucosa
y otros monosacáridos. (Prescott et al, 1999).

Una vez clara la composición de las paredes celulares de las dos bacterias analizadas
(Escherichia Coli, Estafilococos Aureus) y de acuerdo a los resultados presentados en la
tabla 1. Es posible que la diferencia entre las bacterias gram positivas y negativa se deba a
su estructura conformada en la pared celular, el peptidoglicano no se tiñe por sí mismo, más
bien parece actuar como barrera de permeabilidad para evitar la pérdida de cristal violeta.
Durante el proceso de coloración las bacterias se tiñen primero con cristal violeta y luego se
tratan con yoduro para favorecer la retención del colorante. En la decoloración con etanol,
se cree que el alcohol contrae los poros de la capa gruesa de peptidoglicano y se retiene el
complejo colorante yoduro; así las bacterias adquieren color violeta. Por el contrario, la
capa de peptidoglicano de las bacterias gram negativas (Escherichia Coli) es muy fina, con
menos enlaces y con poros de mayor tamaño. Además, es posible que le tratamiento con
alcohol extraiga suficientes lípidos de la membrana externa como para aumentar su
porosidad. (Prescott et al, 1999). Por estos motivos el alcohol elimina más fácilmente el
complejo cristal violeta yoduro en las bacterias gram negativas

Coloración de capsula (Método de Anthony)

Para realizar el método de Anthony nos dieron la bacteria ( Klebseilla pneumoniae): este
método nos dio positivo ya que se pudieron observar dos tonalidades, primero se ve un aro incoloro
alrededor de la bacteria la cual está de un tono morado, se puede diferenciar la capsula ya que esta
no permite la adhesión de partículas, por lo que la bacteria está rodeada de esta escritura que le
ayuda a protegerse de la fagocitosis y la acumulación de alimento entre otras funciones. La capsula
puede englobar más de una bacteria, pero en la Klebseilla pneumoniae solo rodea una elemento

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bacteriano el cual es visible en la figura n o 3; la composición química de la capsula es de glucídica
la cual está conformada habitualmente de polisacáridos complejos, formadnos por una mezcla de
monosacáridos y ácido urónicos a los cuales se le asocian en ocasiones azúcares aminados y
acetilados. Contienen gran cantidad de agua (hasta el 90%). Los azúcares más habituales que
constituyen los polisacáridos son la D-galactosa, D-glucosa y D-manosa. (Pumarola, Rodriguez,
Garcia y Piedrola 1999).

CAPSULA BACTERIA

Ilustración 4 Observación de la capsula bacteriana (Klebsiella Pneumoniae) por método Anthony

Coloración de esporas

Algunas bacterias Gram positivas forman estructuras inactivas de gran resistencia

denominadas esporas o endoespora, se desarrollan dentro de las bacterias de los géneros
bacillus y clustridum entre otros. Estas estructuras son resistentes a situaciones vitales
estresantes como el calor, la desecación, la radiación ultravioleta, los ácidos y los
desinfectantes químicos.

Las esporas son impermeables a la mayoría de los colorantes, se observan como áreas
incoloras dentro de las células coloreadas. Existen además coloraciones especiales para
teñir las esporas, como el verde malaquita al 5% utilizado en la bacteria Bacillus Cereus.
La situación de la espora en la célula madre o esporangio, es característica para una especie
bacteriana determinada, siendo esto importante para la identificación de la bacteria. Para
esto se

Dentro de una célula vegetativa se produce una espora única, que se diferencia de la célula
madre en su morfología y composición, en el aumento de la resistencia a los ambientes
adversos y en la ausencia de actividad metabólica evidente. El proceso incluye la formación
de numerosas cubiertas y la captación de calcio con síntesis de ácido dipicolínico. Al final
de la esporulación queda una partícula deshidratada que contiene ADN genómico. Ese

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ADN se vuelve resistente a la desecación, al calor extremo, a la radiación y al ataque por la
mayoría de las enzimas y agentes químicos.

De acuerdo a lo mencionado anteriormente se pudo observar utilizando el microscopio en

la bacteria Bacillus Cereus, confirmando con los datos registrados en la Tabla 2.

Prueba de motilidad

De acuerdo a los resultados de la tabla 3, Los flagelos son filamentos proteicos,

helicoidales, delgados y rígidos, de longitud y diámetro uniforme, responsables de la
movilidad de la bacteria. Los flagelos son tan delgados que no pueden observarse
directamente con un microscopio de campo claro, deben teñirse con técnicas especiales
para aumentar su grosor. (Schaechter et al, 1993). Esta puede ser una de las razones por las
cuales no se distinguieron los flagelos en la prueba de motilidad.

Los flagelos no son necesarios para la vida bacteriana. Su síntesis está regulada por las
necesidades nutricionales o el estado energético y ocurre por la adición de monómeros de
flagelina al extremo distal de los flagelos en crecimiento. La síntesis del filamento es un
ejemplo excelente de auto ensamblaje, es decir que la información necesaria para construir
el filamento está en la propia estructura de la subunidad de flagelina; no colaboran enzimas
especiales u otros factores. (Schaechter et al, 1993).

ANEXOS

CUESTIONARIO

1 ¿Las esporas son más difíciles de colorear que las células vegetales por qué?

Rta// Las esporas son más difíciles de colorear que las células vegetales ya que estas
son impermeables a la mayoría de los colorantes habituales y se identifica como una
zona clara, redondeada u ovalada, que contrasta con el resto de la bacteria que
aparece coloreada existente, no obstante, medios de tinción especiales que permiten
reconocerlos.

2 ¿En su preparación se observaron esporas libres y en el interior de la células

vegetativas. Como puede incrementarse el contenido del material capsular?

Rta// Las células vegetativas de las bacterias formadoras de endosporas comienzan

el proceso de esporulación en el momento en que el nutriente esencial, como el
carbono o el nitrógeno se toma escaso o inaccesible. En el primer estadio
identificable de la esporulación se forma un nuevo cromosoma bacteriano, que es
separado junto con una pequeña fracción de citoplasma mediante una invaginación

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 de la membrana plasmática denominada tabique de la espora. Más tarde el tabique
de la espora se convierte en una membrana de doble capa que rodea al cromosoma y
al citoplasma. Esta estructura se localiza íntegramente en el interior de la célula
progenitora y se denomina preespora. Entre ambas capas de la membrana se
depositan capas espesas de peptidoglucano. Más tarde se forma una capa gruesa de
proteínas alrededor de la membrana externa llamada cubierta de la espora; esta capa
es responsable de la resistencia de las endosporas a numerosas sustancias químicas
agresivas. La degradación de la célula original determina la liberación de la
endospora.

3 ¿Los frotis de bacterias encapsulada no se lavan con agua ni se calientan. Porque?

Rta// los frotis bacterianos encapsulados no se lavan ni se calientan ya que la tinción

de la capsula es más difícil que otros tipos de procedimientos de tinción porque los
materiales capsulares son sensibles al calor, hidrosolubles y pueden desprenderse o
eliminarse durante los procesos rigurosos de lavado y la fijación. (Tortora, 2007)
Para localizar el lugar de la célula donde se encuentran estos componentes se
utilizan Métodos Citoquímicos, consistentes en utilizar medios que pongan de
manifiesto un compuesto concreto en el interior celular.

4 ¿Cómo se correlaciona la presencia de capsula de virulencia de una bacteria

patógena?

Rta// Patogenidad y virulencia bacteriana:

La adhesión, colonización y penetración Agresinas, Mecanismos de defensa del

huésped. Inmunidad Humoral y celular. La patogenicidad es la capacidad de un
microorganismo de producir enfermedad. La aparición de la enfermedad depende en
gran parte de las defensas inmunológicas del huésped. La virulencia se refiere al
grado de patogenicidad. Una determinada cepa bacteriana puede ser virulenta o
altamente virulenta. El grado de virulencia se relaciona con el número de
organismos requeridos para producir la enfermedad o el tiempo en que tarda en
manifestarse ésta. La patogenicidad microbiana puede expresarse sólo cuando se
produce la enfermedad en el huésped. Por el contrario, la resistencia del huésped a
una enfermedad infecciosa, se advierte sólo como una respuesta a la presencia del
microorganismo.

CONCLUSIÓN

 Para una correcta visualización de la motilidad de la bacteria Proteus se deben tener

cuidados estrictos para poder observarla, de lo contrario como sucedió en el
laboratorio no pudo ser posible su movimiento en el microscopio.

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  Dependiendo de la composición de la membrana de la bacteria, de si tiene mucho o
poco peptidoglucano, se puede dar que sea gram negativa o gram positiva.
 Por medio de la tinción con verde de malaquita, el cual requirió del calor para la
penetración; se pudo observar las endosporas aunque la estructura de la batería fuera
muy pequeña.
 Por medio de la tinción de cápsula se pudo observar y verificar la estructura de la
bacteria y su forma.

BIBLIOGRAFÍA

 Prescott, Harley, Klein. Microbiología. Mc Graw-Hill Interamericana de España. 4ª

ed. 1999.
 Schaechter M, Medoff G, Eisenstein BI, Guerra H. Microbiología. Mecanismos de
las enfermedades infecciosas. Ed Panamericana. 2ª ed. Buenos Aires 1993.
 Pumarola, A. (1987). Microbiología y parasitología médica.
 Evelyn Rodríguez Cavallini, Bacteriología General: Principios Y Prácticas de
Laboratorio 2005.
 Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2007). Introducción a la Microbiología.
Ed. Médica Panamericana.
 Gerard J. Tortora,Berdell R. Funke,Christine L. Case. Introducción a la
microbiología, 2005.