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Extracción y Cuantificación de Proteínas PDF
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OBJETIVO
FUNDAMENTO TEÓRICO
Las proteínas son las más variadas de todas las macromoléculas, y cada célula contiene varios
miles de proteínas diferentes. Las funciones de las proteínas incluyen servir como
componentes estructurales de células y tejidos (p.ej., colágeno) , actuar en el transporte y
almacenamiento de pequeñas moléculas (p.ej., en el transporte de oxigeno por la
hemoglobina), transmitir información entre células ( p.ej., hormonas proteicas), proporcionar
una defensa frente a la infección (p.ej., anticuerpos), actuar como elementos esenciales en
sistemas motiles y contráctiles (p.ej., actina), almacenar aminoácidos como elemento nutritivo
(p.ej., caseína). Sin embargo su principal función es la de actuar como catalizadores biológicos,
denominados enzimas, las cuales participan en la mayoría de las reacciones químicas en los
sistemas biológicos.
Las proteínas están constituidas por la concatenación de unas sustancias químicas
denominadas aminoácidos (unidades monoméricas). Por hidrolisis de proteínas se han
identificado 20 aminoácidos distintos. Cada aminoácido consiste en un átomo de carbono
(llamado carbono α) ligado a un grupo carboxilo (COO-), un grupo amino (NH+3), un átomo de
hidrogeno y una cadena lateral característica cuya propiedades físicas y químicas determinan
los papeles de cada aminoácido en la estructura y función proteica. Los aminoácidos se
clasifican basándose en la polaridad de su cadena lateral. Dentro del conjunto de todos los
aminoácidos naturales existen unos que pueden ser sintetizados por las células del organismo
humano a partir de materiales sencillos que contengan
C, O, H y N, pero otros tienen adquirirse
necesariamente con la dieta. Estos últimos se
denominan aminoácidos esenciales para la especie α α
humana y son: valina, leucina, isoleucina, treonina,
metionina, fenilalanina, triptófano, lisina e histidina
(solo para lactantes).
Todos los aminoácidos a excepción de la glicina, poseen
átomos de carbono asimétricos y en consecuencia
presentan actividad óptica, es decir, presentan estero
isomería (enantiomeros D y L). En las proteínas solo se
encuentran aminoácidos de la seria L.
El valor de pH al cual el aminoácido no tiene carga neta
se llama punto isoeléctrico (pI), a valores de pH < pI la
molécula tendrá carga positiva mientras que la carga
será negativa si pH > pI. La forma neutra se debe a la
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formación de una sal interna llamada Zwitterion, esto ocurre porque el protón del grupo
carboxilo es abstraído por el grupo amino NH2 que está en posición alfa y quedando este
como grupo amonio NH3+.
El punto isoeléctrico de las proteínas está influenciado por las cadenas laterales, ya que los
grupos aminos y ácidos principales participan en el enlace peptídico.
Los aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos entre el grupo α amino de un aminoácido
y el grupo α carboxilo del siguiente. La propiedad fundamental del
Enlace peptídico es que todos los átomos que lo forman han de estar en un mismo plano, por
lo que la cadena proteica solo puede girar por sus Cα pero nunca por el enlace peptídico. La
unión de miles de aminoácidos forman lo que se conoce como cadena poli peptídica, la cual
contiene dos extremos distintivos, uno llamado N terminal y otro C terminal. Los poli péptidos
se sintetizan desde el extremo amino al carboxilo terminal, y la secuencia de aminoácidos en
un poli péptido se escribe (por convención) en el mismo orden.
Cada proteína consiste en una secuencia específica de aminoácidos, determinada por el orden
de los nucleótidos en un gen. Esta secuencia permite interacciones entre aminoácidos
constituyentes que darán origen a configuraciones tridimensionales características, cruciales
para la función proteica.
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Desnaturalización
Es la modificación que ocurre en la estructura nativa de una proteína, alterando así sus
propiedades. Envuelve alteraciones de la estructura 2°,3° y 4° de las proteínas. La estructura 1°
se mantiene. Las alteraciones que se observan son disminución de la solubilidad y/o pérdida
de la actividad biológica. La disminución de la solubilidad puede ser explicada por la exposición
de radicales hidrofóbicos que perjudican la interacción proteína-agua y favorecen la
interacción proteína-proteína. La floculación y la coagulación son manifestaciones visibles de la
alteración estructural causada por agentes desnaturalizantes.
Agentes desnaturalizante:
Calor: la agitación térmica afecta las interacciones que estabilizan la estructura
tridimensional de las proteínas (puentes H, interacción hidrofóbica)
Ácidos: se combinan con proteínas con carga + formando complejos insolubles.
Sales de metales pesados: se combinan con proteínas de carga formando proteinatos
insolubles.
Solventes orgánicos: presentan corriente dieléctrica inferior al agua entonces la
atracción entre cargas opuestas es alta.(precipitación)
Caracterización de aminoácidos
Debido a la presencia de diferentes aminoácidos en las uniones peptídicas las proteínas
reaccionan con una variedad de compuestos formando productos coloreados. Existen
reacciones de coloración que son específicas para aminoácidos y son importantes, tanto para
la detección como para el dosaje de aminoácidos y proteínas. Existen también reacciones
generales porque sirven para caracterizar grupos comunes a todas las proteínas como grupos
amino o uniones peptídicas (ninhidrina y biuret)
Reacción Xantoproteica: Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado
de color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La
prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de
grupos bencénicos, tirosina, fenilalanina, triptófano. Una vez realizada la prueba se
neutraliza con un álcali y vira a un color anaranjado.
Reacción de aminoácidos azufrados: Se pone de manifiesto por la formación de un
precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación
mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una
solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo.
Determinación cuantitativa de proteínas mediante el método de Biuret: Se basa en la
formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces
peptídicos en medio básico. 1 Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración
es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la
reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La
sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de
proteínas en preparados muy concentrados. Este método es sencillo y su sensibilidad
está dentro de un rango de concentración del orden de miligramos.
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina
básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se
quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de
enfermedades, así como para otros muchos propósitos. Existen diferentes métodos para la
cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca
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de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la
capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. En la Tabla I se recogen los
métodos más usados así como sus respectivas sensibilidades. Cada uno de estos métodos
tiene sus ventajas e inconvenientes, las principales se recogen en la Tabla II.
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PARTE EXPERIMENTAL
Incubar 30 minutos a t ambiente y leer a 540 nm, llevando a 0 con el tubo blanco.
Calcular la concentración del problema en g % de proteínas solubles.
Calcular el % p/p en cada material biológico.
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SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA
Tipos de electroforesis
Electroforesis de zona
En esta técnica, la muestra está obligada a desplazarse sobre un soporte sólido de papel,
celulosa o gel. La pequeña cantidad necesaria de muestra permite que las moléculas migren en
discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de biomoléculas cargadas, generalmente se
lleva a cabo en una disolución estabilizada con un medio que sirve de soporte.
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Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel : Electroforesis en gel en una
dimensión (continuo o discontinuo) o PAGE-nativa o SDS-PAGE o Isoelectroenfoque. Según las
aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en una práctica o experimento, se
utilizará un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles discontinuos mejoran la resolución de
la electroforesis pues se consigue agudizar las bandas en gran medida por el uso de esta
técnica conocida como electroforesis a pH discontinuo que precisa de dos geles y dos
tampones diferentes. La PAGE-nativa se utiliza para separar proteínas en condiciones no
desnaturalizantes, por tanto, en función de la carga intrínseca de las mismas. La SDS-PAGE es
muy útil para calcular el peso molecular de una proteína concreta ya que separa las proteínas
según su tamaño. El isoelectroenfoque es un tipo de PAGE en una dimensión que se basa en la
separación de moléculas de acuerdo a sus diferentes puntos isoeléctricos.
Electroforesis en gel en dos dimensiones, combina el isoelectroenfoque (primera dimensión)
con la SDS-PAGE (segunda dimensión). Es una técnica muy resolutiva, y el mejor método
analítico para separar proteínas que existe hoy en día.
Electroforesis capilar
Aunque la electroforesis en gel en sus diversas formas resulta un método común y efectivo
para la separación de moléculas, el proceso de separación puede durar varias horas, siendo
difícil de cuantificar y automatizar.
La técnica aquí presentada se lleva a cabo en el interior de tubos capilares (1– 10 µm de
diámetro). Estos capilares disipan el calor rápidamente permitiendo la aplicación de campos
eléctricos elevados, reduciendo así los tiempos de separación.
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PARTE EXPERIMENTAL
La muestra biológica que se utiliza es suero sanguíneo humano, los pI de las proteínas del
suero van desde 4,9 (albúmina) hasta 7,4 (gama globulinas) por lo que se utiliza una solución
tampón Veronal sódico (dietilbarbiturato de sodio 40 mM pH 8,5)
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1. Acondicionamiento de la tira:
Las tiras de acetato de celulosa se conservan en metanol al 40%, por esto es necesario lavarlas
primero con abundante agua y luego sumergirlas en la cuba con el buffer de electroforesis
Veronal sódico por 10 minutos. Escurrir el exceso de buffer y colocar la tira sobre el soporte de
la cuba, con la superficie opaca hacia arriba, debiendo quedar bien fija y plana.
2. Siembra:
Mezclar la muestra biológica con el colorante (azul de bromo fenol) sobre una placa de vidrio.
Sembrar la muestra en la zona cátodo y aplicar 2 mA por siembra. Observar el frente de la
corrida.
3. Revelado:
Una vez finalizada la corrida, que dura aproximadamente 40 minutos, se sumerge la tira 5
minutos en el colorante, que puede ser Amidoschwartz (0,5% en metanol, agua, ácido acético
4,5: 4,5: 1) o Ponceau S (rojo Ponceau 0,5% en ácido tricloroacético, agua 5:95). Las tiras luego
se decoloran en solución decolorante (metanol, agua, ácido acético 47,5: 47,5: 5), de tal
manera que finalmente sólo retienen el color las bandas de proteínas. Observar la tira, graficar
y reconocer las bandas proteicas.
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siendo en general, la cantidad de SDS unido proporcional, al peso molecular del polipéptido e
independiente de su secuencia. La unión es aproximadamente de una molécula de SDS cada
dos aminoácidos, cubriendo en exceso toda carga neta (al pH en que se está trabajando),
siendo entonces la relación carga/masa similar para todas las proteínas, pudiéndose separar
estas por su masa molecular (y no por su densidad de carga) por acción de los poros del gel.
También se agrega un colorante que permite observar el frente de la corrida. La relación carga
/ masa es similar en todas las proteínas de la mezcla. Aquí como la densidad de carga es
uniforme las proteínas se separaran por su tamaño.
La electroforesis SDS-PAGE es un sistema de corrida discontinuo formado por dos geles con
tamaño de poro distinto, en un primer gel (de siembra o compactador) de poro mayor y menor
pH, y un segundo gel donde ocurre la separación. Luego de transcurrida la corrida se deben
revelar los geles empleando distintas sustancias, radiación o luz uv.
Así, los complejos SDS- proteína formados se someten a electroforesis sobre gel de poliacrilamida.
La dirección de la corrida es vertical descendente. Las bandas se visualizan cuando se tiñen con
colorante. Las proteínas pequeñas se desplazan rápidamente y las proteínas grandes permanecen
arriba cerca del punto de aplicación. El desplazamiento es proporcional al logaritmo de su masa
pudiendo realizarse una curva de calibración de pesos moleculares.
Utilizando proteínas de peso molecular conocido, y midiendo las distancias de corrida, podemos
graficar log pM /distancia recorrida, lo que da una recta. Si medimos la distancia recorrida por una
muestra incógnita podremos determinar el pM (llamado aparente) de la proteína. Para esto las
proteínas deberán poder verse, para lo cual primero serán coloreadas, siendo el colorante más
usado el Coomassie Brilliant Blue R250, con posterior decoloración en un sistema de solventes.
a- Haga un diagrama del gel indicando la posición de las distintas proteínas. Indique en el diagrama el
punto de siembra de la muestra y la posición del ánodo y cátodo.
b- Calcule el PM de la proteína X.
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pepsina 1,0 11
BSA 4,9 3
6- Esquematizar las bandas obtenidas luego de la corrida electroforética en SDS-PAGE de una mezcla
de las diferentes proteínas:
Proteína Mw
Citocromo C 13 kDa
Lisozima 14 kDa
BSA 68 kDa
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Bibliografía
Rivera J. M., Pertierra A. Fundamentos de Bioquímica estructural. Alfaomega S. A.
México. 2005. Pág.: 51-80.
Baynes J., Dominiczak . Bioquímica Médica. 4° Ed. Elseiver España. 2015 . Pág.: 6-20.
Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72:
248-254.
Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985): Measurement of protein using
bicinchoninic acid. Anal Biochem 150: 76-85.
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OBJETIVO
-Extraer ácidos nucleicos de tejido vegetal.
-Reconocer los componentes estructurales del ARN y ADN.
FUNDAMENTO TEÓRICO
Los ácidos nucleicos son compuestos nitrogenados de elevado peso molecular que se pueden
encontrar en las células asociados a proteínas formando complejos llamados núcleo-proteínas.
Estas proteínas tienen carácter básico mientras que los ácidos nucleicos son ácidos. Se
conocen dos grupos de ácidos nucleicos: ARN (ácido ribonucleico) y el ADN (ácido
desoxirribonucleico). La hidrólisis controlada de ARN y ADN produce nucleótidos. Si la hidrólisis
continúa se producen nucleósidos y finalmente fosfatos, azúcares y bases púricas y
pirimidínicas.
La función biológica de los ácidos nucleicos es fundamental:
El ADN está asociado con el material genético de las células, pudiendo encontrarse
como una sola cadena en algunos microorganismos o formando parte de núcleo-
proteínas de los cromosomas en organismos superiores. Almacena información
genética y sirve de molde para la síntesis de proteínas. Se encuentra
mayoritariamente en el núcleo y en muy poca cantidad en mitocondria y cloroplastos.
Contiene dos purinas (adenina y guanina) y dos pirimidinas ( citosina y timina). El
azúcar presente en sus estructuras es una desoxirribosa
El ARN participa en la síntesis de proteínas y se distribuye en toda la célula,
mayormente en citoplasma en forma soluble o formando parte de los ribosomas.
Contiene dos purina (adenina y guanina) y dos pirimidinas (citosina y uracilo). El
azúcar presente en su estructura es una ribosa.
La polimerización de nucleótidos para formar ácidos nucleicos implica la formación de enlaces
fosfodiester entre el 5´fosfato de un nucleótido y el 3´hidroxio de otro. Los oligonucleótidos
son pequeños polímeros que contienen solo unos pocos nucleótidos; los poli nucleótidos
mayores que componen el ARN y ADN celular pueden contener miles o millones de
nucleótidos. Una cadena polinucleotidica tiene un sentido, con un extremo de la cadena
terminando en un grupo 5´fosfato y el otro en un grupo 3´OH. Los poli nucleótidos siempre se
sintetizan en la dirección 5´a 3´, añadiéndose un nucleótido libre al grupo de 3´OH de la
cadena en formación.
Los nucleótidos no solo son importantes como ladrillos de construcción de los ácidos
nucleicos; también desempeñan papeles vitales en otros procesos celulares por ejemplo: el
adenosin 5´trifosfato (ATP) que representa la principal forma de energía química dentro de la
célula.
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La pentosa del ADN y ARN puede evidenciarse por la reacción con orcinol. El ácido sulfúrico
hidroliza las uniones fosfodiester y N-glicosídicas, liberando ribosa, bases púricas, pirimidínicas
y ácido fosfórico.
La pentosa en medio ácido se deshidrata originando furfural que reacciona con el orcinol
dando un producto verde que demuestra la presencia de DNA y RNA.
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El grupo fosfato se identifica por la reacción para fósforo inorgánico, en medio ácido, con el
molibdato (reactivo 1) da fosfomolibdato, color amarillo, que es reducido luego por el ácido
ascórbico (reactivo 2) a azul de molibdeno, color azul verdoso. El reactivo 3 (arsenito/citrato)
se combina con el exceso de molibdato impidiendo su reacción posterior con otros fosfatos.
PARTE EXPERIMENTAL:
Reactivos
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Agua destilada 1 ml -
Extracto - 1 ml
Rvo difenilamina 2 ml 2 ml
Agua destilada 1 ml -
Extracto - 1 ml
Rvo orcinol 2 ml 2 ml
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Bibliografía
Morrison, Boyd. Química Orgánica. Fondo Educativo Interamericano. S.A. México.
1996.
Cooper, G., La célula. Marban libros. España. 2007. Pág.: 48-49.
Rivera J. M., Pertierra A. Fundamentos de Bioquímica estructural.
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