PRACTICA Nº 7

EXTRACCIÓN DE DNA VEGETAL

Introducción

El DNA vegetal es más difícil de obtener de una forma que sea luego clonable o digerible, que el
proporcionado por células animales, debido principalmente a la presencia de metabolitos
secundarios y polisacáridos, los cuales interfieren con el procedimiento de extracción y se co-
purifican con el DNA. Algunos de estos problemas se pueden superar usando hojas sin expandir.
Los tejidos de plantas son robustos y por ello requieren pre-tratamientos intensivos, tales como
largas incubaciones enzimáticas, molido en nitrógeno líquido con polvo de albúmina seguida por
extracción con el tampón CTAB, etc.
El método aquí descrito proporciona cantidades relativamente puras de DNA genómico, que se
puede usar como molde de amplificación con fines de figer printing molecular (RAPDs,
microsatélites u otras metodologías) (Griffin y Griffin, 1994). Mediante el empleo de una
detergente catiónico como el CTAB, se puede precipitar ADN genómico con gran cantidad de
polisacáridos.

Materiales y métodos.

Materiales:

 Buffer CTAB/DNA compuesto por: 2% CTAB, 1.4 M NaCl, 20mM EDTA, 100mM
Tris-HCL pH 8:0, 1% PVP-40
 Buffer TE: 1mM EDTA, 10mM Tris-HCL
 Alcohol 70%
 Isopropanol Puro
 Baño Maria 65°C
 Centrifuga Refrigerada 4°C
 Morteros
 Nitrógeno Liquido
 Tubos Falcon 50 ml / Tubos ependorfs 2.0 ml
 Micropipetas/Punteras: 1000ul, 200ul, 100ul.
 Hielo
Métodos:

1. Se utiliza las hojas, catafilo y raíz de Allium cepa macerado en nitrógeno líquido con un a
posterior solubilizarían en 700 ul de tampón CTAB precalentado (Ctab 2%, pvp 1%, Tris-
HCl pH8 100 Mm, EDTA 2 m, NaCl 1.4 M, 0.2 2- mercaptoetanol)
2. Incubarlo por 30 minutos a 65° C, cada 10 minutos vortexear la muestras.
3. Adicionamos en seguida 600 ul de CIA (cloroformo- alcohol isoamilico a una proporción
24:1)
4. Seguidamente se centrifuga a 14000 g durante 15 minutos a 8°C.
5. Se extrae el sobrenadante y se desecha en sedimento, el sobrenadante se coloca en otro
tubo eppendorf adicionando 600 ul de CIA.
6. Se vuelve a centrifugar con las mismas condiciones anteriores.
7. Se vueve a extraer el sobrenadante y se le añaden 700 ul de isopropanol frio (-20°C).
8. Las muestras fueron precipitadas a -20°C alrededor de 30 minutos con un posterior
centrifugado a 7500 g por 5 min.
 9. El precipitado fue lavado con etanol 70% centrifugándolo a 7500 g por 5 minutos.
Descartandose el sobrenadante del precipitado resuspendido con TE (10 mM, Tris-HCl ,
1 mM EDTA- pH8.0) que contiene 10 ug/,l de RNAsa incubando en baño maria 37 °C por
30 a 120 min para eliminar contaminaciones como RNA

Resultados:

Como se puede observar se forma un ovillo de color blanquecino que representa la porción de
ADN extraído.

Discusión:

EL ADN fue extraído con éxito para los posteriores experimentos de cuantificación. El tratamiento
con CTAB ha sido utilizado ampliamente en el aislamiento de ADN cromosomico de bacterias
las cuales normalmente producen grandes cantidades de polisacáridos asi como también en la
obtención de ADN de alto peso molecular en plantas, en el presente experimento de la misma
forma fue eficiente al momento de usarlo, en un tiempo relativamente corto.