Capitulo IX y X Del Texto de Enzimología 2015

Enzimología Iván Paz Aliaga
CAPITULO IX
CONTENIDO
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS MICROBIANAS

Las enzimas han sido empleadas en la industria desde hace muchos años;
hasta los años 60 del siglo pasado, las enzimas provenientes de plantas y
tejidos animales eran económicamente las de mayor importancia; la
década de los 70s se inicia con una revolución industrial en cuanto a la
producción de enzimas, pues se empiezan a producir enzimas de origen
microbiano en gran escala, gracias al desarrollo de la Microbiología,
Biología molecular e Ingeniería genética.
El explosivo desarrollo de las enzimas proteolíticas de origen bacteriano

empleadas en la fabricación de detergentes, invirtió más rápido de lo
esperado esta situación. Para 1969 las ventas de la empresa Novo
aumentaron 50 veces respecto a las de años anteriores en que solo
producían enzimas de origen eucariótico. Pero la tecnología del DNA
recombinante permitía ya la obtención de enzimas de organismos
superiores a partir de microorganismos.
EL MICROORGANISMO
El primer aspecto en considerar en el desarrollo de un sistema de
producción de enzimas es, desde luego, la selección del microorganismo
adecuado para el proceso. En este sentido se tienen muchos avances
recientes en Biotecnología. Consideremos primeramente las
características deseables de los microorganismos:
1. No debe ser patógeno ni producir toxinas. La reglamentación de la

FDA (Food and Drug Administraron), considera GRAS a una enzima

producida por un microorganismo GRAS (Generalmente reconocido
como seguro). De no ser así, la enzima es catalogada como aditivo y
se ve sujeta a largas y costosas pruebas para demostrar su inocuidad
lo que puede retrasar su aplicación unos 8 años. Por esta razón, un
gran número de enzimas comerciales son producidas por A. niger, A.
oryzae y R. oryzae, ver tabla 9.1.
2. Es preferible que la enzima sea producida extracelularmente ya que
los procedimientos de recuperación son más sencillos puesto que
además de enfrentarnos a una enzima más robusta, evitaríamos la
etapa adicional de ruptura celular, así como un extracto crudo que
contiene al menos 1500 proteínas contaminantes, mientras que un
extracto extracelular contiene solo unas cuantas.
3. La enzima debe ser producida con altos rendimientos, por lo que el
desarrollo del microorganismo implica algún tipo de mutación.
4. El costo de producción debe ser razonable, lo que implica que el
microorganismo pueda crecer rápidamente en sustratos grado
industrial, consumiéndolos totalmente y con pocos requerimientos
específicos. Por esta razón se prefiere a las enzimas constitutivas con
respecto a aquellas que necesitan de algún agente inductor en el
medio, máxime cuando el requisito sea algún ion que hiciese
imposible la aplicación de la enzima en alguna industria (un ejemplo
tenemos en los iones arsenato y molibdato en la obtención de glucosa
isomerasa por la industria alimentaria).
TABLA 9.1
ALGUNOS MICROORGANISMOS GRAS Y ENZIMAS QUE
PRODUCEN
Aspergillus Niger alfa amilasa, celulasa, glucoamilasa, lactasa,

pectinasa, catalasa, glucosa oxidasa, proteasa,
lipasa.
Aspergillus oryzae alfa amilasa, glucoamilasa, lactasa, lipasa
Rhizopus oryzae alfa amilasa, glucoamilasa, pectinasa
Bacillus subtilis alfa amilasa, proteasa
Rhizopus níveas Glucoamilasa
Saccharomyces cerevisiae Invertasa
Streptomyces rubiginosus glucosa isomerasa
Bacillus cereus Renina
Mucor mihei renina, lioasa, esterasa
5. La selección del organismo puede hacerse igualmente en términos de

las características deseadas para la enzima; como ejemplo tenemos la
selección de organismos termófilos para obtener enzimas
termoestables o bien la selección de una fuente de nitrógeno proteica
que obligue a la inducción de ciertas proteasas (como queratinasas).
HACIA QUE APUNTAN LAS INVESTIGACIONES ACTUALES
1. El uso eficiente de los nutrientes del medio de cultivo; en este sentido

el aprovechamiento de la celulosa y la lignina, representa una tarea de
gran impacto. Se han modificado levaduras de cervecería para
introducir genes que codifiquen para glucoamilasas; de esta forma, es
posible producir cervezas ligeras al ser degradadas las dextrinas
residuales que dan el sabor amargo.
2. Producción de enzimas microbianas de origen vegetal o animal, por

ejemplo el gen que codifica para la quimosina de ternera ha sido
clonado en E. coli y en S. cerevisiae, renina se obtiene de A. oryzae,
etc.
3. Producción de enzimas termoestables; por mutación dirigida ha sido

posible modificar un aminoácido de superficie, incrementando así la
termoestabilidad; por ejemplo la isoleucina 3 de la lisozima ha sido
cambiada por cisterna.
4. Sobreproducción de enzimas mediante el incremento del número de

genes que codifican para su síntesis.
5. Mayor tolerancia a los cambios de pH, modificación de la

especificidad de la enzima, mayor resistencia a la inhibición por
iones, modificación de la estructura de las enzimas para facilitar su
inmovilización.
MECANISMOS DE BIOSÍNTESIS
Para controlar la síntesis enzimática, las células microbianas cuentan con

mecanismos de inducción y represión; el conocimiento de estas formas
de regulación a permitido ha permitido desarrollar sistemas de alta
productividad, no solo a través de mutaciones, sino también mediante el
manejo del medio ambiente y de la ingeniería genética.
Enzimas inducibles
La mayor parte de las enzimas comerciales son inducibles, es decir,
requieren de una sustancia, generalmente el sustrato de la enzima, como
inductor. De acuerdo con el modelo de Jacob y Monod (1961), el
inductor permite la síntesis de la enzima al unirse con el represor que
bloquea al gen operador impidiendo su transcripción. Cuando el inductor
es de alto peso molecular y no puede atravesar la pared celular de la
bacteria, por ejemplo celulosa, el dímero celobiosa puede actuar como
inductor. En la tabla 9.2 se muestran algunos ejemplos de enzimas
inducibles.
TABLA 9.2
EJEMPLOS DE ENZIMAS INDUCIBLES
ENZIMA MICROORGANISMO INDUCTOR

Dextransacarasa Leuconostoc mesenteroides Sacarosa
Dextranasa Penicillium funiculosum Dextranas
Alfa amilasa Bacillus subtilis Almidón
Naringinasa Aspergillus niger Naringina
Pululanasa Klebsiella pneumonidae Maltosa
Invertasa Pullularia pullulans Monopalmitato de
Glucosa isomerasa Bacillus coagulans sacarosa
Tirosinasa Neurospora crassa Xilosa
Tirosina D o L
Mecanismos de represión
Es la inhibición en la síntesis de una enzima generalmente inducible, por
intermediarios producidos en el rápido catabolismo de la fuente de
carbono. Un ejemplo es la represión de lactasa por glucosa en E. coli. El
cAMP juega un rol clave en el mecanismo de represión, ya que su
concentración intracelular se ve disminuida hasta 1000 veces cuando el
microorganismo crece en glucosa y la represión puede ser revertida
mediante su reposición al medio. En la tabla 9.3 se muestran algunos
ejemplos de enzimas sujetas a este tipo de represión conocida como
represión catabólica.
Un mecanismo menos frecuente de inhibición lo constituye la

retrorrepresión, en el cual la síntesis de la enzima se ve reprimida por la
presencia de productos finales de biosíntesis. Un ejemplo lo constituye el
efecto de ciertos aminoácidos del medio de cultivo en la síntesis de
proteínas.
TABLA 9.3
ENZIMAS SUJETAS A REPRESIÓN CATABÓLICA
ENZIMA MICROORGANISMO REPRESOR

Invertasa Neurospora crassa Glucosa-fructosa
Lactasa Escherichia coli Glucosa
Dextransacarasa Leuconostoc mesenteroides Sacarosa
Celobiasa Trichoderma viride Celobiosa
Proteasas Bacillus subtilis Glucosa
Catalasa Rhodotorula mucilaginosa Glucosa
Alfa amilasa Bacillus estearthermophilus Fructosa
Mejoramiento genético
Una vez conocidos los mecanismos regulatorios de la producción de una

enzima, se podrá mejorar la productividad a través de procesos de
mutación y selección o bien mediante un adecuado manejo del medio
ambiente. En la tabla 9.4 se presentan algunas estrategias para la
obtención de mutantes.
TABLA 9.4
ESTRATEGIAS EN LA SOBREPRODUCCIÓN DE ENZIMAS
MICROBIANAS
ENZIMAS INDUCIBLES
Obtención de mutantes con necesidades reducidas o nulas de inductor
(cuando el inductor es caro)
ENZIMAS SUJETAS A RETRORREPRESIÓN
Evitar la presencia de productos finales en el medio de cultivo
Evitar la acumulación de productos finales mediante la adición de algún
inhibidor de la ruta metabólica
Limitar la disponibilidad de un factor de crecimiento a un mutante
auxótrofo
Eliminación de los productos finales (diálisis, ultrafiltración)
Obtención de mutantes no sujetos a represión por productos finales
ENZIMAS SUJETAS A REPRESIÓN CATABÓLICA
Evitar el uso de la fuente de carbono que ocasiona la represión,
sustituyéndola por otra de mas lenta asimilación
Limitar el crecimiento del microorganismo ya sea cultivo en quemostato
o fermentación retroalimentada
Obtención de mutantes resistentes a la represión catabólica
Medida de la actividad enzimática durante la producción
Una vez definidas las condiciones del ensayo, se selecciona la técnica

analítica más adecuada para determinar la concentración de producto
obtenido o bien la de sustrato y se procede a cuantificarlos durante los
primeros minutos de la reacción, se obtiene así la velocidad inicial de
reacción. Un problema muy común de las enzimas con aplicación en el
área de la industria alimentaria es la imposibilidad de aplicar las
Unidades de actividad enzimática, ya que los sustratos y su
transformación, no pueden expresarse en forma molar; por esta razón es
que se aplican definiciones arbitrarias, basadas en consecuencias
adicionales de la acción de las enzimas. Ver tabla 9.5
TABLA 9.5
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR
CARACTERÍSTICAS DISTINTAS A LAS CONVENCIONALES
ENZIMA METODOLOGÍA
Proteasas  Capacidad para coagular la leche
 Liberación de algún aminoácido específico soluble en
ácido tricloroacético
 Acción sobre películas fotográficas
Alfa  Pérdida de la capacidad de formar complejos coloreados
amilasas entre yodo y amilosa
 Disminución de la viscosidad inicial
 Incremento del poder reductor
Pectinasas  Capacidad para clarificar el jugo de manzana
 Incremento en el poder reductor
 Disminución del precipitado alcohólico del medio de
reacción
Celulasas  Solubilización de papel
 Incremento en el poder reductor
Para enzimas extracelulares, la actividad se determina por unidad de

volumen del medio de fermentación y después de determinar la
concentración de proteína total del medio, se expresa como actividad
específica. Para enzimas intracelulares existen diversas posibilidades:
- La enzima es activa a pesar de su ubicación; el sustrato y el producto

pueden atravesar libremente la pared celular por lo que la medición
puede hacerse directamente con una cantidad conocida de células; o bien
es necesario llevar a cabo un proceso de permeabilización de células para
evitar que la difusión a través de la membrana sea el paso limitante. Para
esto último se emplea tolueno, alcohol isoamílico, sales, etc. En ambos
casos la actividad medida puede referirse a la cantidad de células
empleadas en el ensayo.
- Es necesario romper las células para extraer la enzima pues de otra

forma la actividad no se expresa. Se procesa una cantidad conocida de
células, para poder posteriormente referir la actividad a una unidad de
biomasa.
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS PROCESOS DE

FERMENTACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS
MICROBIANAS
Técnicas de fermentación en cultivo semisólido
Existen dos formas de fermentación, en cultivo semisólido y en cultivo

sumergido; la primera se llama comúnmente fermentación sólida y la
segunda fermentación líquida.
El cultivo semisólido conocido también como sistema Koji, es la forma

más común de producción de enzimas extracelulares a partir de hongos
en el Japón. Este tipo de fermentación tiene la ventaja de tener una alta
productividad por unidad de volumen de fermentación (el medio de
cultivo no libera agua). Esta técnica requiere de bajos consumos
energéticos y muestra una baja contaminación por aguas residuales.
Las fermentaciones sólidas se llevan a cabo en charolas delgadas; las

metodologías empleadas no han desarrollado mucho a pesar del avance
tecnológico actual. En este sentido vale destacar los avances logrados por
la Universidad Autónoma Metropolitana de Iztapalapa en México y la
fundación CIEPE en Venezuela (dentro de América latina).
El cultivo semisólido tiene la desventaja de mostrar un difícil control de

las condiciones ambientales que influyen en la producción (pH,
temperatura, humedad, etc.); dificultades para la esterilización y es
frecuentemente limitada por fenómenos de transferencia de masa. Es
muy difícil regular el pH; es difícil también pensar en utilizar este

método para enzimas intracelulares. La tabla 9.6 muestra algunas
enzimas producidas por fermentación sólida y en la figura 9.1 se observa
la producción de celulasa por Trichoderma viride en cultivo semisólido.
TABLA 9.6
ALGUNAS ENZIMAS PRODUCIDAS POR CULTIVO
SEMISÓLIDO
ENZIMA MICROORGANISMO SUSTRATO

Amiloglucosidasas Rhizopus sp. Salvado de trigo
α amilasa Aspergillus oryzae Salvado de trigo
Aspergillus niger Arroz
Celulasas Trichoderma viride Salvado de trigo
Proteasas Aspergillus niger Salvado de trigo
Aspergillus oryzae
Pectinasas Aspergillus soyae Salvado de trigo
Figura 9.1.- Producción de celulasas utilizando el método de Koji. A.-

cultivo sumergido para inoculación de Trichoderma viride, B.-
compresor de aire, C.- filtro de aire, D.- Inoculación, E.- aire de salida,
F.- colector de muestra, G.- bomba de centrífuga, H.- cultivo de T. viride

sobre salvado de trigo, I.- aspersión de agua, I’.- Sulfato de amonio,
acetona, alcohol y agua, J.- transportador de cinta, J’.- transportador de
tornillo, K.- tolva, L.- columna de extracción, M.- tanque de
almacenamiento, Q.- columna de intercambio iónico, R.- concentrador de
membrana, S.- secador de pulverización, T.- filtro prensa, U.- secador
rotatorio, V.- mezclador.
El cultivo sumergido
La casi totalidad de enzimas producidas por el mundo occidental

provienen de procesos que usan cultivo sumergido. Su gran ventaja sobre
el cultivo sólido es la homogeneidad que es posible establecer en el
cultivo, de tal forma que no existen gradientes de temperatura, de pH, o
de concentración de nutrientes. Los factores que con más frecuencia
influyen en la producción de enzimas microbianas por cultivo sumergido
son:
Temperatura y pH:
Son reguladas a lo largo de todo el proceso de fermentación;
generalmente la temperatura y el pH óptimos de crecimiento del
microorganismo productor, coinciden con los de producción de la
enzima. Sin embargo en ciertos casos, la temperatura de máximo
crecimiento puede no ser la adecuada para la estabilidad de la enzima,
haciéndose necesaria una optimización con el objeto de encontrar la
temperatura de proceso adecuada para una máxima producción y
preservación de la enzima durante la fermentación.
Es frecuente entonces encontrar temperaturas de máxima producción de

la enzima, inferiores a la de máximo crecimiento del microorganismo;
por ejemplo, la alfa amilasa de Bacillus coagulans si se produce a 55ºC,
la enzima es 10 veces mas estable a la temperatura de 90ºC que si se
produce a 35ºC. Siempre al finalizar el proceso de producción la
temperatura debe ser disminuida rápidamente si la enzima es termolábil.
En cuanto al pH se distinguen 4 valores que no necesariamente

coinciden:
 El pH de máximo crecimiento del microorganismo productor

 El pH de máxima producción de la enzima
 El pH de máxima estabilidad de la enzima
 El pH de máxima actividad de la enzima

Estas diferencias son más notorias para las enzimas intracelulares; así por
ejemplo, la fenilalanina amonio liasa de Rhodotorula glutinis es
producida sin regulación del pH, a un valor inicial de 7,0 y al final del
proceso es extraída a pH de 8,0. La dextransacarasa de Leuconostoc
mesenteroides es secretada con máxima productividad a pH 6,5,
adecuado para el crecimiento del microorganismo, siendo el pH de
máxima actividad y estabilidad de 5,2. La subtilisina de Bacillus
licheniformis es estable entre 5 y 10, tiene óptima actividad entre 9 y 11 y
la máxima producción se obtiene entre 6,5 y 6,8.
Es evidente que en el caso de todas las enzimas proteolíticas, el pH de

máxima estabilidad no coincide con el de máxima actividad pues la
enzima se autodigeriría. Para la regulación del pH, así como para los
ajustes al inicio y al final del proceso, el ácido y la base deben
seleccionarse, después de asegurarse que no tengan efectos negativos
sobre la enzima. El hidróxido de sodio y el ácido ortofosfórico son los
más empleados.
Aunque no constituye un método de purificación en el sentido estricto del

término, muchas veces se emplean tratamientos de pH y/o temperatura al
final de un proceso de purificación para eliminar actividades enzimáticas
contaminantes menos estables que la de la enzima de interés; en ese
sentido, tratamientos térmicos destruyen la actividad transglucosidasa de
la glucoamilasa. El proceso de regulación del pH puede evitarse en
algunos casos, incrementando el poder amortiguador del medio de
cultivo en la zona de máxima productividad.
El medio de cultivo
Algunas enzimas requieren de ciertos iones en el medio para su

producción, estos cumplen roles importantes como cofactores o como
estabilizadores de la enzima, por ejemplo la síntesis de alfa amilasas
requiere la presencia de calcio y magnesio. Una vez determinados los
requerimientos para la producción de la enzima por parte del
microorganismo, los elementos restantes se basan en los requerimientos
para el crecimiento del propio microorganismo como la fuente de
carbono y la fuente de nitrógeno.
En la tabla 9.7 se presenta algunos ejemplos en los cuales la fuente de

carbono del medio es el substrato de la enzima que se desea producir,
desempeñando entonces varias funciones, fuente de carbono y de energía

para el microorganismo e inductor de la enzima.
Por otro lado, para la fuente de nitrógeno existen muchas alternativas, la

tabla 9.8 muestra las principales fuentes de nitrógeno disponibles para la
producción de enzimas microbianas, aunque por lo general se prefieren
las formas complejas por ser más económicas.
TABLA 9.7
MEDIOS DE CULTIVO DONDE LA FUENTE DE CARBONO ES
EL SUSTRATO DE LA ENZIMA
ENZIMA FUENTE DE MICROORGANISMO

CARBONO
α amilasa Almidón Bacillus subtilis
celulasas Celulosa Trichoderma viride
dextranasa Dextrana Penicillium funiculosum
glucoamilasa Almidón Aspergillus niger
dextransacarasa Sacarosa Leuconostoc mesenteroides
naringinasa Naringina Aspergillus niger
lactasa Lactosa Kluyveromyces lactis
levansacarasa Sacarosa Bacillus subtilis
glucosa oxidasa Glucosa Aspergillus niger
En ocasiones la relación carbono/nitrógeno es importante, por ejemplo en

Aspergillus sojae una alta relación favorece la producción de proteasas,
mientras que una baja relación, favorece la producción de amilasas.
TABLA 9.8
PRINCIPALES FUENTES DE NITRÓGENO EMPLEADAS EN
MEDIOS DE CULTIVO PARA LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS
MICROBIANAS
FUENTES INORGÁNICAS FUENTES ORGÁNICAS NO

Sulfato de amonio PROTEICAS
Nitratos (potasio, calcio…) Urea
Bases nitrogenadas
FUENTES PROTEICAS VEGETALES FUENTES PROTEICAS ANIMALES
Pasta de soya Caseína
Pasta de girasol Proteínas de suero de leche
Pasta de algodón Peptonas

Salvado de trigo Hidrolizado de pescado
Salvado de arroz Hidrolizado de carne
Agua de cocimiento de maíz
Diversos hidrolizados
Malta (cebada)
FUENTES PROTEICAS
MICROBIANAS
Extracto de levaduras
Vinazas
La adición de agentes surfactantes al medio de cultivo, específicamente

Tween 80 o triton aumenta la producción de un gran número de enzimas
extracelulares y aunque el mecanismo de acción es desconocido, se
piensa que modifican la permeabilidad de la membrana celular. En la
tabla 9.9 se puede ver esta aplicación.
TABLA 9.9
EFECTO DE LA ADICIÓN DE TWEEN 80 AL 0,1% EN LA
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS MICROBIANAS
EXTRACELULARES
ENZIMA MICROORGANISMO Relación de producción

MEDIO + TENSIOACTIVO
MEDIO SOLO
Celulasa Trichoderma viride 20
Invertasa Pullularia pullulans 16
Dextranasa Penicillum funiculosum 2
Alternansacarasa Leuconostoc
mesenteroides 2
Pululanasa Aerobacter aerogenes 1,5
Normalmente los estudios de laboratorio emplean medios de cultivo

sintéticos de alta pureza y alto costo; en el escalamiento del proceso se
sustituyen las materias primas por equivalentes de menor costo. Se debe
tener en cuenta que la menor pureza puede ocasionar variaciones en el
proceso, aunque algunas veces beneficiosas, por ejemplo un ión no
considerado. Las materias primas pueden llegar a comprender entre el 50
a 70% del costo de la producción, por lo que es importante esta
sustitución. Para enzimas que van a ser purificadas, el costo del medio de
fermentación se hace menos importante con respecto al costo de
producción, por lo que es posible emplear materias primas de alto costo,

pero de tal pureza que faciliten las etapas subsecuentes de purificación.
La aireación
Por los requerimientos de oxígeno los procesos fermentativos se dividen

en aerobios, microaerobios, anaerobios y anaerobios estrictos. El oxígeno
es siempre difícil de incorporar por su baja solubilidad en el medio, de
allí la necesidad de un sistema muy eficiente de inyección de oxígeno y
un sistema de mezcla apropiado, para la correcta distribución del mismo
en todo el medio de cultivo.
Existe una concentración óptima de oxígeno para cada enzima, así la L-

asparraginasa de E. coli creciendo en glucosa, en condiciones de
aerobiosis el rendimiento en células es elevado, pero se produce poca
enzima; mientras que en anaerobiosis, se producen pocas células pero
con un alto contenido de enzima.
Cinética de producción de enzimas
La producción de enzimas está asociada al crecimiento de los

microorganismos, así hay unas cuya síntesis se detiene al llegar a la
fase estacionaria; sin embargo, lo común es encontrar la producción
de enzimas en la fase post exponencial, sin ninguna relación con el
crecimiento.
A diferencia de lo que sucede para muchos metabolitos primarios, en el

caso de producción de enzimas no pueden establecerse relaciones
estequiométricas en la fermentación. El rendimiento en enzima es muy
variable, pero los sistemas industriales sobre todo los basados en
Aspergillus, llegan a producir más de 15 g/L de proteína útil secretada al
medio, mientras que por manipulación genética por ejemplo, se ha
llegado a que 25% de la proteína intracelular de un mutante sea solo una
enzima.
RECUPERACIÓN DE LA ENZIMA
La mayor parte de las enzimas microbianas son producidas en cultivo

sumergido, por lo tanto uno de los principales objetivos de la operación
de recuperación es eliminar el agua al menor costo posible. Cuando la
concentración de la enzima al inicio de la purificación es alta, su precio

de venta es menor; mientras menos concentrada esté al inicio (implica
una metodología de purificación mas costosa), su precio será cada vez
mayor. En este sentido se tiene algunos ejemplos: las amilasas
microbianas tienen una concentración en el extracto inicial de 500mg%
aproximadamente y se venden a un dólar el Kg; renina de origen
microbiano inicia su proceso de purificación a una concentración de 10
mg% y tiene un precio cercano a 1000 dólares el kg. Glicerofosfato
deshidrogenasa tiene una concentración inicial de alrededor de 0,5 mg%
y se vende aproximadamente a 100000 dólares el kilo y uroquinasa y la
mayoría de enzimas terapéuticas inician su purificación en el extracto
microbiano a una concentración de 0,001 mg% y cuestan luego del
proceso de purificación, alrededor de 100000 dólares el gramo.
El tamaño de la producción también está relacionado con el costo de la

misma, mientras menor sea la producción enzimática, mayor será el
precio de la enzima; para tener una idea, papaína se produce en lotes de
100000 kilos, costando el kg alrededor de 50 dólares; renina se produce
en cantidades de 10000000 de kilos, siendo el costo de la producción de
3 dólares el Kg; mientras que glucoamilasa y amilasa se produce en lotes
de 50000000 de kilos, con un costo por kilo de un dólar.
El grado de purificación de la enzima depende del área de aplicación

final: alimentos, farmacia, industria textil, industria curtidora, industria
papelera, etc., y de la forma en que va a ser aplicada, diagnóstico, aditivo
en alimentos, medicamento, catalizador en la industria, etc. Estos
criterios se aplican igualmente en la formulación del producto final; así
por ejemplo, los productos usados en detergentes biológicos contienen
hasta un 10% de enzimas, mientras que las preparaciones amilolíticas
empleadas como aditivos para harinas, contienen no mas de 0,1% de alfa
amilasa.
PRINCIPALES ETAPAS EN LA RECUPERACIÓN DE ENZIMAS

MICROBIANAS:
EXTRACCIÓN:
Si la enzima está ligada a la pared celular o a alguna membrana celular,

se usa solventes como el isobutanol, alcohol isoamílico y tolueno. Para
enzimas intracelulares ligadas, se emplean detergentes como el

deoxicolato, SDS, tween, triton, los cuales en condiciones de baja
fuerza iónica y a un pH adecuado, se combinan con las proteínas ligadas,
formando miscelas y de esta forma las solubilizan. Un ejemplo es la
extracción de uricasa de Candida utilis, la que se extrae con
mercaptoetanol y triton N-101.
Se puede tratar también enzimáticamente a los microorganismos:

lisozima, lipasas, fosfolipasas, proteasas, quitinasas o glucanasas se
agregan para degradar parcial o totalmente las paredes celulares. Para
bacterias grampositivas que tienen mureina, se emplea lisozima; las
gramnegativas requieren de tratamientos adicionales de lipasas y
fosfolipasas para eliminar la capa de lipopolisacárido.
Pueden emplearse también quitinasas para el tratamiento de pared

celular de hongos y glucanasas para levaduras. La presencia de
policationes favorece el proceso, de allí que se use quitosan, quitosan
hidroglutamato, polilisina y algunos antibióticos. El policatión
desestabiliza la pared celular.
RUPTURA CELULAR:
Existen muchas técnicas a nivel de laboratorio, pero sólo dos métodos

mecánicos som empleados a gran escala: el el homogenizador de alta
presión basado en el diseño de Manton Gaulin para leche (4 a 21 kg de
levadura seca por hora) y el molino de esferas de alta velocidad, el Dyno
mill (20 Kg de levadura seca por hora) tanto vertical como horizontal. A
nivel de laboratorio el método más usado es el ultrasonido.
Para ambos métodos, el fluido debe pasar varias veces por el equipo,
dependiendo de la dureza de la célula. La optimización consiste en
determinar el número mínimo de pasos por el equipo, la máxima
concentración de alimentación y las condiciones de ruptura (tiempo de
molido o presión) para obtener la máxima extracción, sin que la enzima
pierda actividad por calentamiento y sin reducir demasiado el tamaño de
las células, pues esto dificulta la separación posterior de los residuos.
Mas del 50% de los procesos industriales de obtención de enzimas

intracelulares emplean el homogenizador, alrededor del 10% emplean el
molino de alta velocidad y las demás, otras técnicas ya descritas
anteriormente. Por su dureza, las células microbianas se clasifican en

orden creciente en:
1.- Miscelio, 2.- bacilos gramnegativos y cocos, 3.- bacilos
grampositivos, 4.- levaduras, 5.- cocos gramnegativos y 6.- esporas.
En las bacterias grampositivas la gruesa capa de mureína puede llegar a

constituir el 90% del peso seco de la pared, de allí su dureza; en tanto que
en las bacterias gramnegativas es tan solo el 10%.
Algunos métodos adicionales de ruptura celular exclusivos para

microorganismos son: tratamiento alcalino, lisozima y EDTA para
bacterias grampositivas, tratamiento con detergentes, choque frio para
bacterias gramnegativas, choque osmótico, congelamiento y
descongelamiento, etc.
SEPARACIÓN DE SÓLIDOS:
La eliminación de células al final de la fermentación, la eliminación de

residuos celulares después de la ruptura y la recuperación o eliminación
de precipitados (proteínas y ácidos nucléicos), se efectúa por
centrifugación o por filtración. La selección del equipo mas adecuado
depende de varios factores dentro de los que podemos destacar, tamaño
de partícula, diferencia de densidades entre las fases a separar, viscocidad
del medio, la aglomeración y características pegajosas del precipitado. En
todos los procesos prácticamente es necesario el agregado de floculantes
(hidrocoloides o polielectrolitos) con el fin de aglomerar las partículas y
facilitar su separación.
La operación de separación mas empleada en la recuperación de enzimas

es la centrifugación; el tiempo y la velocidad deben ser cuidadosamente
seleccionadas en cada etapa en que se requiera. Otra operación
importante es la ultrafiltración; con el conocimiento del PM de la enzima
a procesar, se selecciona la membrana o la fibra con el tamaño de poro
adecuado para su retención, permitiendo al sistema concentrar la muestra
al eliminar agua, dializar y purificar parciálmente ya que las proteínas
pequeñas atravezarán el poro.
La ultrafiltración tiene la ventaja de no cambiar de fase a la enzima, de

poder operarse a bajas temperaturas, no se agregan sustancias ajenas al
sistema, tiene bajos requerimientos energéticos y es fácilmente operada.
Tiene la desventaja del mantenimiento y cuidado de las fibras o
membranas, que pueden bloquearse con facilidad. Muchas enzimas son

comercializdas en forma líquida sin mayor procesamiento que la
eliminación de células, la ultrafiltración y la formulación.
PRECIPITACIÓN, EXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO Y

CROMATOGRAFÍAS:
Ya hemos estudiado los métodos de precipitación, todos los cuales son

aplicados en la extracción de enzimas microbianas; la extracción líquido-
líquido utiliza polímeros como el polietilenglicol, dextranos o fosfatos
los cuales al ser agregados al medio, atrapan a la enzima, extrayéndola;
aunque como hemos visto, el polietilenglicol es usado también para
concentrar la muestra a través de una membrana semipermeable y como
agente precipitante y estabilizante de proteínas. En relación a las
cromatografías, también casi todas son aplicables para microorganismos.
SECUENCIA DE OPERACIONES:
Existe poca información disponible sobre que operaciones seleccionar y

en qué secuencia, al diseñar un proceso de purificación de enzimas
microbianas. De un análisis de 8 revistas periódicas efectuado en 1984,
en 100 publicaciones sobre purificación de enzimas, se encontró que la
operación mas usada es la cromatografía de intercambio iónico (75% de
los
procesos la empleaban, 75% de los cuales empleaban soportes con
derivados DEAE). En 57% de los casos se empleaba la precipitación y en
75% de estos se hacia con sulfato de amonio.
Sobre el orden en que aparecen las operaciones, la homogenización

prevalece como la primera (enzimas intracelulares), mientras que en el
40% de los casos, la precipitación es la segunda opción. El intercambio
iónico aparece desde el segundo hasta el séptimo lugar, aunque en un
40% de los casos es la cuarta operación del proceso. En promedio se
aplican 4 operaciones, con un rendimiento total del 28% y un factor final
de purificación promedio de 6380, lo que representa en promedio una
eficiencia por etapa del 74% y un factor de purificación por etapa de 8.
ESTABILIZACIÓN, SECADO Y FORMULACIÓN:

Las preparaciones enzimáticas comercializadas en forma sólida, son

secadas generálmente en secadores de espreas, mientras que cuando la
actividad es inestable, o no se preparan grandes volúmenes de muestra o
se requiere de un manejo estéril, la liofilización es la técnica más
apropiada.
En la formulación del producto es necesario tomar en cuenta varios

factores en relación con la dosis de enzima en la aplicación final para
facilitar su uso y evitar grandes diluciones. En este sentido las
formulaciones líquidas son de más fácil manejo, pero tiene el
inconveniente de una menor estabilidad.
Generalmente las preparaciones líquidas contienen agentes estabilizantes:

glicerol, sorbitol, polietilenglicol, etc., así como agentes
preservantes:benzoatos, sorbatos, etc. Por otro lado, el material inerte
consiste de azúcar (glucosa, lactosa, etc.) o de sólidos de almidón
(adicionados antes del secado tienen un efecto protector sobre la enzima),
sal (preparaciones de papaína para ablandamiento de carnes) o inclusive
talco. No existe una regla general sobre la formulación de productos.
COSTOS:
Se debe optimizar el proceso en cuanto a costos, sacrificando etapas de

purificación por su alto costo de reactivos o por su menor rendimiento en
relación a otras etapas. Un valor promedio de costos es, 200 dólares por
litro de capacidad del fermentador.
CAPITULO X
CONTENIDO
INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
La biotecnología en los últimos años ha experimentado grandes avances

así como sus aplicaciones industriales en la obtención de productos
químicos, en la industria alimentaria y farmacéutica. Los procesos
catalizados por enzimas en la industria son cada día más numerosos, ya
que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores
convencionales no biológicos: Presentan una gran actividad catalítica;
muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad
y regioespecificidad); son muy activos a temperatura ambiente y presión
atmosférica.
A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha

generalizado en los procesos químicos industriales debido a que la
mayoría de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo, por
otra parte al ser solubles en agua, su separación de los sustratos y
productos es difícil y por tanto, no se pueden reutilizar. Con la
inmovilización de las enzimas se han podido superar estos últimos
inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnológico sea
económicamente rentable.
GENERALIDADES SOBRE LA INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o

localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a
formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser
reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definición se ha ampliado

a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los
grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por
su unión a un soporte.
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:

1. El aumento de la estabilidad de la enzima.
2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes
del proceso.
3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y
control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada. Los
diferentes tipos de reactores enzimáticos aparecen en la Figura 10.1.
Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas
elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo.
Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de
productos con mayor pureza.
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son 4:

1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado
nativo.
2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden
existir distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente
número de uniones al soporte.
3. Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la
movilización.
4. El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.
Tanque agitado
Tanque agitado de
Alimentación contínua
Figura 1.- Reactores enzimáticos que emplean enzimas inmovilizadas.
En general, los métodos de inmovilización se suelen clasificar en dos

grandes categorías: Retención física y Unión química.
MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR RETENCIÓN

FÍSICA
Atrapamiento
Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de

una matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros
fotoentrucruzables o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno,
alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de
inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en
una solución del monómero. Seguidamente se inicia la polimerización
por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo
químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser
más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda
atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la
enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra
sintética.
El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental,

requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como
ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura.
De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las
condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la
naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la
proteína. Los geles de poliacrilamida son los más utilizados en el
atropamiento de enzimas, aunque se pueden usar geles que se forman a
partir de polímeros naturales como la gelatina, el k-carragenano, el
alginato, el agar, etc.
Figura 10.2.- Métodos de inmovilización mediante retención física.
El atrapamiento de las enzimas en las fibras sintéticas se realiza tras la

adición de un agente coagulante (como el tolueno o el eter de petróleo) a
una emulsión formada por una solución acuosa que contienen la enzima y
un disolvente inmiscible con el agua donde esta disuelto el polímero. Al
entrar en contacto, se producen los filamentos de fibra que contienen
microgotas de solución enzimática atrapadas en las microcavidades del
polímero (principalmente acetato de celulosa). El atropamiento en fibras
presenta como ventaja principal frente a los geles la elevada superficie de
unión a la enzima sobre todo si las fibras son finas. Por otra parte, las
fibras son resistentes a ácidos débiles y fuertes, a soluciones de fuerza
iónica elevada y algunos disolventes orgánicos. Según el tipo de
polímero, determinadas fibras pueden mostrar una gran resistencia al
ataque microbiano. Sin embargo, la posible desactivación enzimática por
parte del disolvente puede ser un serio inconveniente a tener en cuenta.
En la actualidad, la tecnología sol-gel se esta imponiendo como método

general para el atropamiento de enzimas, debido a su gran sencillez y
número de aplicaciones como la preparación de biosensores,
biocatalizadores e incluso órganos artificiales. En general, la hidrólisis
ácida de un precursor tetra-alcoxi-silano origina un gel tras la
neutralización del ácido y la eliminación del alcohol liberado. Con el fin
de que el gel posea poros o canales de un tamaño suficiente para que
difundan los sustratos y productos, se pueden añadir diferentes agentes
durante la encapsulación de las enzimas. Estos compuestos, como la
gluclosa o el sorbitol, son eliminados tras sucesivos lavados. Después de
una etapa de envejecimiento del gel (12-24 horas), este se puede secar
hasta alcanzar el estado de xerogel. En este último estado, la difusión de
los sustratos y productos no se ve alterada; en cambio la enzima no puede
atravesar los poros, ya que se encuentra totalmente atrapada en la
estructura de la sílice, ver figura 10.3.
Figura 10.3.- Inmovilización de enzimas mediante el método sol-gel
Inclusión en membranas: Dividida en dos tipos:
1. Microencapsulación: En esta técnica, las enzimas están rodeadas de

membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de
sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas
semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerización
interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, también
llamadas “micelas reversas”). Las microcápsulas obtenidas son de forma
esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100 m de diámetro.
Mediante este método se pueden encapsular simultáneamente una gran
variedad de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se lleven a
cabo determinadas reacciones que suceden en múltiples pasos. Ver figura

10.4
Los liposomas son miscelas formadas por una doble capa surfactante, de
tal manera que el disolvente exterior es acuoso, en vez de ser orgánico
como sucede con las miscelas reversas. Las enzimas incluidas en estos
microentornos permanecen activas y en algunos casos mejoran su
actividad y estabilidad térmica (figura 10.5).
Figura 10.4. Método de microencapsulación de enzimas por

polimerización interfacial
Figura 10.5. Enzimas incluidas en micelas reversas y liposomas

10.2.2. Reactores de membrana: El desarrollo de reactores o sistemas

que contengan enzimas atrapadas ha despertado gran interés en la
industria. Estos reactores emplean membranas permeables al producto
final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la
enzima. Mediante una bomba se establece un flujo líquido de sustrato
que atraviesa el reactor; en su interior sucede la reacción y el producto
formado difunde libremente por la membrana.
Este método esta principalmente indicado para sustratos de elevado peso

molecular y solubles en agua. El control selectivo de sustratos y
productos se realiza mediante el tamaño del poro de la membrana.
Existen algunos inconvenientes en este tipo de inmovilización como la
imposibilidad de trabajar con concentraciones bajas de sustrato, ya que
puede existir una posible adsorción del mismo a la membrana. También
la enzima puede sufrir desactivación a consecuencia de las fuerzas de
cizalla o de agitación, sobre todo aquellas incluidas en membranas de
ultrafiltración (o bolsas de diálisis) ver fig.10.6
Figura 10.6. Ejemplos de enzimas incluidas en membranas
En general, en esta metodología, se procede inicialmente a la adsorción

de la enzima sobre la membrana que formará el reactor. Estas membranas
sintéticas, disponibles comercialmente, tienen un tamaño de poro
definido (en un intervalo de 500 a 300.000 Da). La adsorción de
membrana se puede realizar de dos formas:
1. mediante el paso de una solución tamponada de enzima a través de la
membrana;
2. por contacto continuo de una solución de enzima con la membrana.
10.3.- MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR

UNIÓN QUÍMICA
10.3.1. Unión a soportes
Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se

dispone de una mayor información. La elección del soporte y del tipo de
enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del
biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización incremente la
afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplíe el intervalo de
pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además
el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de
operación del reactor y ser fácilmente separable del medio líquido para
que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de
materiales como soportes para la inmovilización de numerosas enzimas.
Estos materiales difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma,
aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas,
fibras y más corrientemente en forma de esferas.
Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:
Soportes inorgánicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad

de soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra
pómez, sílice, etc.) o materiales manufacturados (óxidos de metales y
vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio no poroso, alúmina,
cerámicas, gel de sílice, etc.). Los materiales inorgánicos tienen poca
superficie de unión.
Soportes orgánicos. Se pueden clasificar en:
Polímeros naturales: a su vez divididos en: polisacáridos (celulosa,

almidón, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc).
proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc).
Polímeros sintéticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno)
Polímeros acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.)
Otros tipos (alcohol polivinílico, poliamidas, etc).
Las enzimas se pueden unir a estos soportes mediante adsorción o por
unión covalente, ver figura 10.7).
Figura10.7. Métodos de inmovilización mediante unión química.
10.3.1.1. Adsorción
En este tipo de inmovilización, la enzima se une a un soporte sin

funcionalizar mediante adsorción de tres tipos: físico, iónico o por
quelación o unión a metales. La adsorción física es el método más
sencillo de inmovilización ya que sólo consiste en poner la solución de
enzima en contacto con el soporte al que se une electrostáticamente. La
adsorción iónica se efectúa al utilizar resinas de intercambio iónico
(como CM-celulosa, DEAE-celulosa, sephadex, amberlite, etc.), las
cuales contienen grupos funcionales por otros iones de la misma carga,
sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble.
Los principales factores que influyen en la inmovilización de enzimas por

adsorción, son:
1. El pH del medio: controla el número y la naturaleza de las cargas que
presenta la superficie de la proteína y del sólido.
2. La fuerza iónica: al aumentar la fuerza iónica se produce la desorción
de la enzima, ya que los iones inorgánicos se unen con más fuerza al
soporte que la proteína.
3. La permeabilidad y el área superficial: en la mayoría de los casos es
conveniente una gran área superficie (mayor a 100 m2/g) y un diámetro
de poro grande, aproximadamente dos veces el tamaño del eje mayor de
la enzima (mayor a 30 nm) para que la enzima y el sustrato puedan
penetrar fácilmente.
4. La presencia de iones que actúen como cofactores de la enzima, ya
que pueden incrementar la carga enzimática del derivado.
Como principales ventajas de este método destacan:

1. Su preparación sencilla.
2. Su bajo costo.
3. No hay cambios de especificidad enzimática.
4. Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en
agua.
Los inconvenientes de la adsorción son principalmente:

1. La optimización rigurosa de las variables que controlan la adsorción.
2. Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista
mecánico.
3. La unión al soporte es débil.
Una variante dentro de la técnica de la adsorción consiste en emplear

resinas de intercambio iónico, las cuales contienen grupos funcionales y
contraiones móviles. Estos contraiones se pueden intercambiar
reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan
cambios en la matriz insoluble.
10.3.2. Unión covalente
La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de

inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La
metodología de la unión covalente se basa en la activación de grupos
químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas
(ver tabla 10.1)
De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura

de las enzimas, los más empleados para la formación de enlaces con el
soporte son principalmente la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina,
y en menor medida la metionina, el triptófano, la arginina y el ácido
aspártico y glutámico. El resto de aminoácidos, debido a su carácter
hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie
proteica, y no pueden intervenir en la unión covalente. Este método
presenta las siguientes ventajas:
1. La manipulación de los derivados inmovilizados es sencilla;
2. La carga de enzima permanece constante después de la inmovilización;
3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo,
empaquetados, de lecho fluidizado o tanque agitado.
4. Una mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la
temperatura, de los disolventes orgánicos o del pH, al tener estabilizada
su estructura terciaria.
En cambio la inmovilización por enlace covalente también presenta una

serie de inconvenientes:
1. Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de

superficie, ya que condiciona el número de uniones enzima-soporte y su
geometría, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.
2. El proceso de inmovilización puede alterar la estructura del centro
activo. Para evitar esta posible alteración, se realiza la inmovilización en
presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo.
3. La inmovilización covalente no es aconsejable en aquellas enzimas
muy sensibles a cambios de pH, fuerza iónica, etc.
10.4. Reticulado
También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica

que ha sido ampliamente utilizada en la estabilización de muchas
enzimas. El método del reticulado consiste en uso de reactivos
bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las moléculas
de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehídos,
diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si
están activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas
con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones
extremas de pH y temperatura.
El co-reticulado, permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática

debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las
enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de
lisina (por ejemplo, la albúmina bovina). Un procedimiento mixto de
inmovilización muy común consiste en inmovilizar la enzima por
adsorción sobre una resina de intercambio iónico o un soporte polimérico
(con lo que se consigue una elevada carga enzimática) y posteriormente
añadir el reactivo bifuncional.
Figura 10.8. Microfotografías (250x) de unos cristales reticulados

(CLECs) de penicilina acilasa de E-. coli (A) y de lipasa de Pseudomonas
cepacia (B)
Actualmente el método más novedoso de cross-linking consiste en la

cristalización de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehído
(Cross-Linked Enzyme Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se
basa en la obtención de un entramado cristalino, donde las moléculas de
enzima están rodeadas exclusivamente por otras moléculas de proteína.
De esta manera la propia enzima actúa como soporte, y su estructura
terciaria está estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares. La
estructura cristalina posee canales microscópicos (20-50Å) que permiten
el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza
la reacción. Estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas y pH
extremos, así como la acción de las proteasas. Esta tecnología se ha
aplicado a enzimas muy diferentes, las cuales se han utilizado en la
obtención de compuestos enantioméricamente puros y en la síntesis de
péptidos.
10.5. EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN
A menudo, la inmovilización altera significativamente el

comportamiento de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en
su estabilidad. En segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema
heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen en el
proceso catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores,
activadores, etc.) se encuentran en interfase: en el medio de reacción y en
la fase constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la
actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional,
estérico y del microentorno.
10.5.1. Efecto de la inmovilización en la estabilidad de las enzimas
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas

después de su inmovilización, que se debe principalmente a las siguientes
razones:
1. Una estabilización conformacional de la enzima debido a la existencia

de uniones multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la
enzima adquiere una mayor rigidez y se hace más resistente a la
desactivación térmica o química. Este tipo de estabilización se obtiene
únicamente en aquellos métodos en los que intervienen enlaces de tipo
covalente, como el reticulado o la unión a soportes activados.
La inmovilización covalente multipuntual se puede combinar con la

adición de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura
de la enzima.
2. Una protección frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la

unión de proteasas a un soporte elimina su capacidad proteolítica, y evita
su autolisis.
3. Se evita la agregación intermolecular al mantener las moléculas de

enzima retenidas en una determinada región del espacio.
4. Existe una alteración del microentorno del enzima debida a la

interacción de la enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima
sensible al oxígeno (como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sitúa en
la superficie de un soporte cargado, la fuerza iónica efectiva en el
microentorno de la enzima será muy alta y, como consecuencia, la
concentración de oxígeno disuelto será mucho menor en esa zona que en
el medio de reacción. En otros casos el soporte tiene un efecto
tamponador de tal manera que mantiene el pH óptimo de la enzima en su
microentorno, aunque en la disolución se produzcan cambios importantes
de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas
inmovilizadas en presencia de disolventes orgánicos, la “acuofilia” del
soporte o su capacidad para retener agua, regula la actividad de la
enzima. Cuanto mayor es la acuofilia del soporte, más agua adsorbe y la
enzima poseerá la cantidad necesaria de agua en su microentorno para
mantener su conformación activa.
10.5.2. Efectos de la inmovilización sobre la actividad enzimática
Tras una inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e

incluso perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad
enzimática puede ser debido a que:
1. La unión al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al

centro activo está impedido.
2. Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún aminoácido que
forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad
catalítica de la enzima.
3. La inmovilización puede originar un cambio conformacional que da
lugar a una forma inactiva.
4. las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalización

o desactivación de la enzima.
Si la pérdida de actividad no es total después de la inmovilización, los

cambios (disminución o aumento de la actividad enzimática) se deberán
principalmente a efectos difusionales, electrostáticos, estéricos y/o del
microentorno.
1) Efectos difusionales:
Como consecuencia de la inmovilización, la difusión de los sustratos

hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias
de tipo externo e interno.
a) resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en
el medio de reacción, el sustrato deberá atravesar la película líquida
estacionaria (capa de Nernst o de disfusión) que rodea el soporte. En las
proximidades de un soporte no cargado, la concentración de sustrato es
menor que en el resto de la disolución, puesto que existe un gradiente de
concentración a través de la zona de difusión. Por tanto, los valores de
KM para las enzimas inmovilizadas son siempre aparentes (KM ap.).
b) resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos

tienen que atravesar el interior del gel, microcápsula, fibra o poro del
soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada.
Existen diversas maneras de minimizar estos efectos difusionales como
por ejemplo: disminuir el tamaño del biocatalizador, aumentar la
concentración de sustrato, incrementar la agitación o el flujo en el
reactor, etc. Con estas medidas se consigue reducir el grosor de la capa
de Nernst, y como consecuencia, el valor de km’ disminuye.
2) Efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte:
Si el sustrato y el soporte tienen la misma carga existe una repulsión

mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atracción. Cuando el
sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de km’ aparente
puede verse reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en
disolución. Hornby y col. desarrollaron una expresión matemática que
permite calcular la actividad de las enzimas inmovilizadas, teniendo en
cuenta tanto los factores de difusión como los electrostáticos. La
expresión de Michaelis-Menten en este caso es:
Vmax
Vo =
KM + X Vmax RT
D RTxzFV
donde x=espesor de la capa de Nernst; D=coeficiente de difusión;

T=temperatura (ºK); z=valencia del sustrato; F=constante de Faraday;
R=constante universal de los gases y V=gradiente de potencial en el
soporte. Se puede disminuir el valor de KM ap., variando tanto el término
de difusión como el término electrostático. En el primer caso, la
disminución del valor de KM ap. se consigue al disminuir el tamaño del
soporte (con lo que disminuye el término “x”) o al aumentar el flujo o la
agitación. En el término electrostático, si “z” y “V” tienen el mismo
signo, es decir si el soporte y el sustrato tienen la misma carga, el término
electrostático es menor de 1 y KM ap. aumenta. Si tienen cargas opuestas,
la KM ap. disminuye. Si no poseen carga, KM ap. sólo dependerá del
término de difusión.
3) Impedimentos estéricos o de tamaño de sustrato:
En un principio, cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya

una pérdida apreciable de su actividad. Este hecho suele ser válido en el
caso de que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de
sustratos con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima
inmovilizada disminuye drásticamente. Por ejemplo, muchas hidrolasas
unidas covalentemente a soportes sólidos, a pesar de que son muy activas
frente a sustratos pequeños, muestran una actividad muy baja hacia
proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos. Este “efecto estérico” se
puede evitar mediante una inmovilización covalente a través de un brazo
espaciador enzima-soporte más largo.
4) Efectos en el microentorno:
La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual,

especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados eléctricamente. El
efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH óptimo
de la catálisis enzimática y, muchas veces, un ensanchamiento en el
intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar. Por ejemplo, una
enzima unida a un soporte cargado negativamente (como el CM-
sephadex) tendrá en su microentorno una concentración mayor de
hidrogeniones que en el medio de reacción. Como resultado, la enzima
inmovilizada será más activa a un pH más alcalino. La enzima sería más

activa a pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado
positivamente (v.g. DEAE-sephadex).
10.6. INMOVILIZACION DE COFACTORES
Todas las técnicas de inmovilización mencionadas son válidas para

aquellas enzimas que no requieran cofactores, o para aquellas cuyos
cofactores se encuentren fuertemente ligados como por ejemplo flavinas).
Pero otras enzimas requieren otros cofactores que son sensibles al medio,
caros y por tanto, es necesaria su regeneración. Cuando se trata de
cofactores cargados, que se disocian rápidamente en el medio (como
NADPH y el ATP), se deben coinmovilizar junto con la enzima (Enzima
1) para asegurar su participación en la catálisis. En esta co-
inmovilización debe estar presente otra enzima (Enzima 2 que permita la
regeneración del cofactor, para que pueda funcionar en sucesivos ciclos
catalíticos. El reciclado de los cofactores se puede solucionar de dos
maneras:
1. El cofactor se puede unir a la superficie del entramado de una

enzima reticulada, o por otro lado, se puede fijar a un soporte
junto con la enzima.
Figura 10.9.- Métodos para el reciclado de cofactores, (a) en enzimas

reticuladas; (b) en enzimas unidas a soportes
En ambas situaciones es fundamental que el brazo se separa del cofactor

del soporte sea lo suficientemente largo para que sea accesible a las dos
enzimas.
2. En reactores de membrana se ha desarrollado un sistema que

consiste en aumentar artificialmente el peso molecular del
cofactor mediante su unión a polietilenglicol. De esta manera el
cofactor sigue en solución, pero puede atravesar los poros de la
membrana semipermeable. Por ejemplo, se ha conseguido la
regeneración del NADH en un reactor de membrana que se
emplea en la obtención industrial de L-leucina a gran escala. El
NAD(H) se une covalentemente al polietilenglicol PEG-20000, lo
que impide su difusión a través de la membrana y permite la
reducción del ceto-isocaproato en presencia de una L-leucina
deshidrogenasa dependiente de NAD (Figura 10.11). En el mismo
reactor esta presente la formato deshidrogenasa que permite el
reciclado del cofactor.
Figura 10.11.- Regeneración de NADH durante la síntesis de L-leucina

en presencia de formato deshidrogenasa (FDH)
10.7. ELECCIÓN DEL MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN
Aunque se han desarrollado y aplicado muchas técnicas de

inmovilización a numerosos enzimas, se reconoce que no existe un
método universal válido para todos los enzimas en todos los casos. No
obstante, gracias a toda la información disponible en la actualidad, se
pueden hacer generalizaciones sobre cada método de inmovilización
(Tabla 10.2) y así, podremos seleccionar el más adecuado para cada
aplicación específica. La elección ha de tener en cuenta las condiciones
de la reacción biocatalizada, el tipo de reactor que se vaya a utilizar, el

tipo de sustrato que tenga que ser procesado y otros factores.
Tabla 10.2.- Comparación de los diferentes métodos de inmovilización
METODO Inclusión en Atrapamiento Reticulado Adsorción Unión

Membranas química covalente
Preparación Intermedia Difícil Intermedia Sencilla Difícil Fuerza de unión
Débil Media Débil-Media Media Fuerte
Actividad enzimática Media-Alta Baja Baja Media Alta
Regeneración soporte Posible Imposible Imposible Posible Difícil
Coste proceso Medio-Alto Medio Medio Bajo Alto
Estabilidad Media Alta Alta Baja Alta
Validez General General Limitada General Limitada
Resistencia microbiana Sí Sí Sí No No
En general, los métodos de preparación difícil y de mayor coste

proporcionan biocatalizadores más estables y duraderos; en cambio
aquellos métodos más sencillos como el atrapamiento o la adsorción,
donde la unión de la enzima con el soporte es débil, originan derivados
inmovilizados que presentan pérdidas de actividad y que deben ser
repuestos continuamente. Una vez elegido el método más conveniente,
los derivados que preparemos deben estar caracterizados según las
indicaciones establecidas por el Working Party on Immobilized
Biocatalysts:
Tabla 10.3.- Caracterización de un derivado inmovilizado
Descripción
1. Esquema de reacción general
2. Enzimas a insolubilizar
3. Tipo de soporte empleado
4. Método de inmovilización
Preparación
1. Condiciones de reacción
2. Rendimiento en peso seco
3. Actividad residual del sobrenadante
Caracterización físico-química
1. Configuración del biocatalizador fisico-química
2. Grado de hinchamiento
3. Grado de compresibilidad en columna
4. Abrasión en sistemas de agitación
5. Velocidad mínima de fluidización Cinética
Cinética
1. Estabilidad de la enzima almacenada
2. Estabilidad operacional
3. Posibilidad de reutilización
4. Grado de conversión
5. Limitaciones difusionales
10.8. APLICACIONES DE LA ENZIMAS INMOVILIZADAS

Las aplicaciones más importantes de las enzimas inmovilizadas se
pueden clasificar en:
1. Aplicaciones analíticas: biosensores
2. Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas
3. Aplicaciones industriales: en la industria química, farmacéutica,
alimentaria y de tratamiento de residuos.
BIBLIOGRAFÍA
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Complutense S.A. España, 2001
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Capitulo IX y X Del Texto de Enzimología 2015

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Enzimología Iván Paz Aliaga

PRODUCCIÓN DE ENZIMAS MICROBIANAS

El explosivo desarrollo de las enzimas proteolíticas de origen bacteriano

1. No debe ser patógeno ni producir toxinas. La reglamentación de la

FDA (Food and Drug Administraron), considera GRAS a una enzima

Aspergillus Niger alfa amilasa, celulasa, glucoamilasa, lactasa,

5. La selección del organismo puede hacerse igualmente en términos de

HACIA QUE APUNTAN LAS INVESTIGACIONES ACTUALES

1. El uso eficiente de los nutrientes del medio de cultivo; en este sentido

2. Producción de enzimas microbianas de origen vegetal o animal, por

3. Producción de enzimas termoestables; por mutación dirigida ha sido

4. Sobreproducción de enzimas mediante el incremento del número de

5. Mayor tolerancia a los cambios de pH, modificación de la

Para controlar la síntesis enzimática, las células microbianas cuentan con

ENZIMA MICROORGANISMO INDUCTOR

Un mecanismo menos frecuente de inhibición lo constituye la

ENZIMA MICROORGANISMO REPRESOR

Una vez conocidos los mecanismos regulatorios de la producción de una

Medida de la actividad enzimática durante la producción

Una vez definidas las condiciones del ensayo, se selecciona la técnica

Para enzimas extracelulares, la actividad se determina por unidad de

- La enzima es activa a pesar de su ubicación; el sustrato y el producto

- Es necesario romper las células para extraer la enzima pues de otra

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS PROCESOS DE

Técnicas de fermentación en cultivo semisólido

Existen dos formas de fermentación, en cultivo semisólido y en cultivo

El cultivo semisólido conocido también como sistema Koji, es la forma

Las fermentaciones sólidas se llevan a cabo en charolas delgadas; las

El cultivo semisólido tiene la desventaja de mostrar un difícil control de

muy difícil regular el pH; es difícil también pensar en utilizar este

ENZIMA MICROORGANISMO SUSTRATO

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F.- colector de muestra, G.- bomba de centrífuga, H.- cultivo de T. viride

La casi totalidad de enzimas producidas por el mundo occidental

Es frecuente entonces encontrar temperaturas de máxima producción de

En cuanto al pH se distinguen 4 valores que no necesariamente

 El pH de máximo crecimiento del microorganismo productor

 El pH de máxima actividad de la enzima

Es evidente que en el caso de todas las enzimas proteolíticas, el pH de

Aunque no constituye un método de purificación en el sentido estricto del

Algunas enzimas requieren de ciertos iones en el medio para su

En la tabla 9.7 se presenta algunos ejemplos en los cuales la fuente de

desempeñando entonces varias funciones, fuente de carbono y de energía

Por otro lado, para la fuente de nitrógeno existen muchas alternativas, la

ENZIMA FUENTE DE MICROORGANISMO

En ocasiones la relación carbono/nitrógeno es importante, por ejemplo en

FUENTES INORGÁNICAS FUENTES ORGÁNICAS NO

Pasta de algodón Peptonas

La adición de agentes surfactantes al medio de cultivo, específicamente

ENZIMA MICROORGANISMO Relación de producción

Normalmente los estudios de laboratorio emplean medios de cultivo

producción, por lo que es posible emplear materias primas de alto costo,

Por los requerimientos de oxígeno los procesos fermentativos se dividen

Existe una concentración óptima de oxígeno para cada enzima, así la L-

Cinética de producción de enzimas

La producción de enzimas está asociada al crecimiento de los

A diferencia de lo que sucede para muchos metabolitos primarios, en el

La mayor parte de las enzimas microbianas son producidas en cultivo

concentración de la enzima al inicio de la purificación es alta, su precio

El tamaño de la producción también está relacionado con el costo de la

El grado de purificación de la enzima depende del área de aplicación

PRINCIPALES ETAPAS EN LA RECUPERACIÓN DE ENZIMAS

Si la enzima está ligada a la pared celular o a alguna membrana celular,