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Universidad Nacional Autnoma

de Mxico
Facultad de Estudios Superiores
Iztacala

Evaluacin de la produccin de trehalosa con relacin al


incremento de la concentracin etanlica en
Saccharomyces cerevisiae

Integrantes
Alvarez Rebollo Raziel Teuhmar

Garcia Jimenez Mariana

Gonzlez Meneses Diana Jacqueline

Jimenez Jocelyne Karina

Pea Ortega Claudia Elena


Resumen
La levadura Saccharomyces cerevisiae, utilizada en procesos industriales de fermentacin,
es capaz de resistir altas concentraciones de etanol, esto se debe a la trehalosa (disacrido
estabilizador de protenas). Los alimentos actuales contienen conservadores dainos para
la salud, por lo que un conservador natural como la trehalosa puede ser una excelente
opcin por su propiedad crioprotectora. Se traz como objetivo determinar la concentracin
entre 7 y 11% de etanol en la cual la produccin de trehalosa sea mayor. En cajas Petri se
colocaron las nuestras de medio de cultivo para aplicar el estmulo de etanol,
posteriormente se ocup el mtodo de antrona y se ley con espectrofotmetro. Las
concentraciones de 7 y 9% se encontraron dentro del rango de la literatura, sin embargo el
11% tiene mayor error debido al tiempo de almacenamiento del cultivo stock, por lo que
debe tener especial cuidado con mantener una fermentacin aerobia en el cultivo.


Palabras clave: Trehalosa, antrona, Saccharomyces cerevisiae, estrs celular

Introduccin

Las clulas de levadura se ven sometidas a varios tipos de estrs a medida que las
condiciones del medio cambian, tanto en situaciones naturales como durante procesos
industriales. Tanto el dao provocado por el estrs como la respuesta de la levadura al
mismo, depende del tipo y grado del estrs, y del estado de desarrollo de la levadura a
momento en que ocurre el estmulo. Sin embargo, en general, las condiciones adversas a
las que se enfrenta este organismo afectan principalmente a las estructuras celulares (por
ejemplo las membranas) y a las diferentes macromolculas, especialmente lpidos,
protenas y cidos nucleicos, las cuales sufren modificaciones estructurales que daan su
funcin. Para hacer frente a estas situaciones desfavorables, la levadura responde
rpidamente sintetizando molculas que le permiten atenuar o reparar el dao causado por
el estrs. Entre las molculas mejor caracterizadas en esta respuesta estn las llamadas
protenas de estrs. Su estudio ha evidenciado que la respuesta a nivel transcripcin es
importante para la supervivencia celular y ha llevado a la descripcin de varias vas de
transduccin de seales y factores de transcripcin involucrados en esta respuesta
(Folch-Mallol et al., 2004 ).

Saccharomyces cerevisiae es la especie de levadura utilizada por excelencia para la


obtencin de etanol a nivel industrial debido a que es un microorganismo de fcil
manipulacin y recuperacin, no es exigente en cuanto a su cultivo, no presenta alto costo,
tolera altas concentraciones de etanol, en la fermentacin produce bajos niveles de
subproductos, es osmotolerante, capaz de utilizar altas concentraciones de azcares,
presenta alta viabilidad celular y caractersticas de floculacin y sedimentacin para el
procesamiento posterior (Martnez, 2014).

Existen dos aspectos del metabolismo de S. cerevisiae que resultan particularmente


importantes: el metabolismo energtico, que determina las rutas bioqumicas favorecidas
para la transformacin del sustrato mayoritariamente a biomasa o etanol, y el metabolismo
de los compuestos de reserva en la levadura, glucgeno y trehalosa, que se relacionan con
su viabilidad y vida de anaquel como producto terminado.(Hernandez-Oropeza, et al, 2011)
Este microorganismo muestra 5 fases de crecimiento bien definidas cuando es cultivado en
medios lquidos con glucosa como fuente de carbono: la fase lag, la fase logartmica, el
cambio diuxico, la fase postdiuxica y la fase estacionaria. La fase lag es un periodo de
adaptacin en el cual la clula se prepara para dividirse. Durante la fase logartmica las
clulas alcanzan su mxima velocidad de duplicacin y llevan a cabo un metabolismo
fermentativo del que se produce etanol. Al disminuir la concentracin de glucosa, las clulas
atraviesan por el cambio diuxico, un periodo breve de tiempo en el cual no hay divisin, y
la clula cambia de un metabolismo fermentativo a uno respiratorio. En la fase postdiuxica
las clulas usan como fuente de carbono el etanol producido durante la fase logartmica e
incrementan su resistencia al estrs gradualmente; en tanto que la fase estacionaria se
presenta cuando los nutrientes del medio se han agotado y no hay divisin celular. En esta
fase, las clulas acumulan carbohidratos de reserva como trehalosa y glucgeno, alcanzan
el mximo nivel de resistencia a estrs y su pared celular se vuelve ms gruesa y resistente
t al, 2004)
a la digestin por liticasa. (Folch-Mallol, e

La glucosa es asimilada por el microorganismo mediante la gliclisis, luego de lo cual se


produce piruvato . Este intermediario puede ser metabolizado mediante dos procesos
celulares diferentes. Las clulas de S. cerevisiae son capaces de acumular sustancias de
reserva energtica como la trehalosa y el glucgeno. Estos compuestos de reserva
permiten explicar las caractersticas de la levadura que ser utilizada como insumo tanto en
la industria de panificacin como en la de elaboracin de bebidas alcohlicas. Entre tales
caractersticas se encuentran la viabilidad de la levadura, el poder fermentativo o la
velocidad de consumo de glucosa, la velocidad de generacin de anhdrido carbnico y la
vida de anaquel. (Hernandez-Oropeza, et al, 2011)

La trehalosa (-D-glucopiranosil-1,1--D-glucopiranosa), es un carbohidrato no reductor


formado por dos molculas de glucosa unidas mediante un enlace glucosdico -(1,1).
Distintos organismos, incluyendo plantas, animales, bacterias, algas y levaduras, son
capaces de sintetizar. La trehalosa tiene la funcin biolgica de proteger a ciertas
estructuras celulares como membranas y protenas presentes en el citosol cuando la clula
no se encuentra en condiciones ptimas de cultivo Adems, el dmero se hidroliza durante
la gemacin, lo que significa que tambin tiene una funcin como carbohidrato de reserva
en la reproduccin de la levadura. (Hernandez-Oropeza, et al, 2011)
En S. cerevisiae, la trehalosa presenta dos funciones principales:
a) metabolito de proteccin celular sustituyendo esferas de solvatacin de una
estructura proteica,
b) como molcula de reserva.

La biosntesis de la trehalosa ocurre por completo en el citosol. El nucletido uridil-glucosa


fosfato, UDPG, reacciona con la glucosa- formar trehalosa-6-fosfato mediante la accin
enzimtica de la trehalosa-6-fosfato sintetasa. Despus, una fosfatasa especfica rompe el
enlace fosfato de la trehalosa-6-fosfato, formando trehalosa. Ambas enzimas asociadas en
un complejo denominado trehalosa sintasa. (Hernandez-Oropeza, et al, 2011)

Estudios sobre la biosntesis de trehalosa abordados principalmente desde un punto de


vista experimental, han demostrado que la levadura acumula este bajo condiciones de
cultivo poco favorables, tales como la limitacin del crecimiento por glucosa o nitrgeno,
temperaturas altas o choques osmticos Tambin se ha estudiado la regulacin de los
genes que codifican el complejo trehalosa sintasa. (Hernandez-Oropeza, et al, 2011)

Este carbohidrato se acumula en el citosol de las levaduras bajo condiciones de estrs


abitico debido a su efecto protector contra la desecacin, altas temperaturas, congelacin,
alta salinidad y oxidacin. Debido a estas propiedades, la trehalosa tiene importantes
aplicaciones en la industria alimentaria, cosmtica, farmacutica y en la investigacin. En la
trehalosa, las molculas de glucosa que la conforman estn unidas por sus carbonos
anomricos o reductores, caracterstica que la distingue del resto de los carbohidratos, pues
le impide participar en reacciones de xido-reduccin con protenas (llamadas reacciones
de Maillard). Las propiedades qumicas de la trehalosa son muy deseables en un
conservador, pues no produce oscurecimiento ni afecta el sabor de los productos
alimenticios. El mecanismo mediante el cual la trehalosa preserva biomolculas tan
delicadas es mediante la captacin de molculas de agua en la superficie de las mismas.
Cuando el medio es deshidratado, la trehalosa resguarda la estructura tridimensional de
protenas y membranas, mantenindose funcionales hasta que nuevamente entren en
contacto con agua. La levadura (Saccharomyces cerevisiae), es capaces de acumular
trehalosa arriba de 10% su de su peso seco y pueden sobrevivir sin agua por aos, por
estos motivos la trehalosa puede servir como un conservador natural, el cual no es daino
para la salud como los que se emplean en la actualidad.

Miles de productos alimenticios con componentes prohibidos por la Organizacin Mundial


de la Salud (OMS) circulan por kioscos, almacenes y supermercados, con atractivos
envoltorios o calcomanas de regalo, con cupones para adquirir, pequeos pedazos de
plstico o para participar en diversos concursos, porque, su mercado-objetivo son los
nios. Hay ingredientes que producen alergias, migraas, hiperquinesia e insomnio en los
nios como los CI 19140 y el SIN 102. Otros como el amarillo crepsculo (o Amarillo Ocaso
6) y el CI 15958 y SIN 110 puede provocar posibles lesiones renales a altas
concentraciones. El Carmn de Indigo (o Indigotina) produce hiperactividad e intolerancia
alimentaria. La Azorrubina (CI 14720) es causante de irritacin, e intolerancia.(Melo-Ruiz, V,
2012)

Los conservantes o aditivos son aquellas sustancias orgnicas o inorgnicas que se le


agregan a los alimentos con la intencin no slo de preservar el tiempo de almacenamiento
del alimento, sino con el objeto tambin de mejorar su textura, apariencia, sabor, color y
contenido vitamnico. Los colorantes buscan dar un color atractivo a los alimentos. Si bien
hay algunos que son inofensivos como los de origen natural, hay otros artificiales como la
tartrazina, que puede producir alergia, siendo lo ms grave el shock anafilctico o
reacciones adversas al activar mecanismos no inmunolgicos. Los agentes surfactantes
como el Dixido de Azufre, Bisulfito de Sodio impide la decoloracin (frutas sedas, algunos
langostinos frescos y algunas papas secas, fritas y congeladas) y el crecimiento de
bacterias en el vino. Tambin destruyen la Vitamina B-1 y pueden causar graves
reacciones, especialmente a los asmticos (Muoz-Vivas, F.J, 2008).

Antecedentes

Bandara, et al (2009) prob diferentes concentraciones de EtOH en diferentes cepas de


levaduras obteniendo como resultado que la trehalosa tienen un papel en la resistencia
ante EtOH.

Chander (1997) prob el efecto del estrs salino en la produccin de trehalosa para
aumentar la resistencia al EtOH probando as que hay una relacin entre osmotolerancia y
resistencia al EtOH.

Schiraldi, et al (2002) Remarca el potencial de la trehalosa para su uso en conservadores,


debido a su propiedad crioprotectora, alta solubilidad y estabilidad al procesarlo.

Gmez (2008) Comprob de forma experimental con muestras de espinaca, que la


trehalosa es efectiva como conservador, ya que protegi dichas muestras y mantuvo la
calidad de las mismas.

Martnez (2014) Comprob de forma experimental la resistencia de diferentes cepas de


Saccharomyces cerevisiae ante diferentes porcentajes de etanol, obteniendo como
resultado que las levaduras son resistentes al etanol, sin embargo su crecimiento es muy
bajo, los porcentajes utilizados fueron de 8 a 15%

Objetivos

General:

Determinar el porcentaje entre 7 y 11% de etanol en el cual la produccin de


trehalosa sea mayor

Especficos:

Evaluar el crecimiento de biomasa en Saccharomyces cerevisiae

Determinar la concentracin de trehalosa a partir del mtodo de antrona


Materiales y mtodos

Se prepar el medio de cultivo con 2.5 g de extracto de levadura, 5 g de peptona, 5 g de


dextrosa y 2.5 de agar bacteriolgico en 250 mL de agua destilada, se calent hasta
disolver los reactivos. Se verti el medio en frascos mbar y juntos con 16 cajas petri se
esterilizaron.
En 100 mL de medio se adicion 3 g de Saccharomyces cerevisiae, mantenindola en una
incubadora a 25C durante dos das. Para medir la biomasa de Saccharomyces cerevisiae,
homogeneizamos los frascos y realizamos una curva patrn con ayuda del Spectronic 20;
utilizando 0.01 del medio con levadura hasta 1 g en 10 mL de medio , al terminar contamos
con la concentracin de levadura.
En las respectivas cajas petri, tomamos 9.3 mL de cultivo y .7 mL de etanol repitiendo
cuatro veces. En otro tratamiento se colocaron 9.1 mL de cultivo y 0.9 mL de etanol con sus
respectivas cuatro repeticiones. El tercer tratamiento contena 8.9 mL de cultivo ms 1.1 mL
de etanol con 4 repeticiones. Y el cuarto tratamiento fue nuestro testigo con 10 mL de
cultivo.
Se esper una hora para que el etanol estuviera en contacto con el medio y para desecharlo
se mantuvo en la incubadora a 50C hasta que el medio se evapor, se rasp los restos y
se pesaron 20 mg de biomasa. Para poder hacer la curva se us una solucin de antrona
preparada con 0.4 g de antrona en 200 mL de cido sulfrico y una solucin de glucosa con
200 mg de glucosa en 200 mL de agua destilada de la cual se tom 1 mL y se diluy en 10
mL de agua destilada; obteniendo as el Stock.
En 6 tubos de ensayo se colocaron de 50 L hasta 300 de glucosa con agua destilada
450-200 L teniendo un tubo blanco con 500L con agua destilada.
Se llevaron al espectrofotmetro con una longitud de onda a 630 nm.
Mientras se realizaba la curva
patrn, los 20 mg de la biomasa
producida de cada caja se
colocaron en tubos de ensaye con 3
mL de solucin de cido
tricloroactico [.05 M] preparada con
0.817 g de cido tricloroactico en
100 mL de agua destilada; la
biomasa se dej con la solucin
aproximadamente una hora.
Posteriormente cada uno se diluy
tomando de cada tubo 250L con
2.5 mL de solucin de antrona con
250L de agua destilada y se
someti a una segunda dilucin
tomando 300L de cada factor mas
2.5 mL de antrona. Se agitaron en el Vrtex hasta homogeneizar y llevarlos a bao mara
durante 10 minutos y se esper hasta quedar en temperatura ambiente.Para finalizar se
llevaron los tubos problema al espectrofotmetro para medir la concentracin de trehalosa
Resultados

La Grfica 2. muestra los resultados de los tratamientos a los cuales se les aplic 7, 9 y
11% (v/v) de etanol en el medio con el propsito de estresar a las levaduras. En la primera
columna se encuentra el grupo testigo, al cual no se le aplic ningn tratamiento de etanol,
este grupo muestra una concentracin de trehalosa con un valor promedio de 18.22 g.
En la segunda columna se encuentra el grupo al cual se le aplic tratamiento de etanol
7% (v/v), este grupo muestra una concentracin de trehalosa con un valor promedio de
19.46 g. En la tercera columna se encuentra el grupo al cual se le aplic tratamiento de
etanol 9% (v/v), este grupo muestra una concentracin de 41.82 g. En la cuarta columna
se encuentra el grupo al cual se le aplic tratamiento de etanol 11% (v/v), este grupo
muestra una concentracin de trehalosa con un valor promedio de 27.22 g.

Grfica 2.Concentraciones de trehalosa en g presentados ante estmulo de etanol al 7, 9 y 11% en el


medio de cultivo
Discusin de resultados

Los resultados muestran que, en general los estmulos de etanol son efectivos para inducir
una respuesta de trehalosa en la levadura. Sin embargo, en el caso del grupo con el
tratamiento de 11% de etanol, se muestra una baja notable en la concentracin de
trehalosa, Presentando una desviacin bastante alta en donde se observa que hay mayor
ndice de error, resultando as extrao, pues llegan a soportar una concentracin de etanol
hasta de un 18%, aunque dicha tolerancia depende de la cepa (Carballo, 2000). Desde el
punto de vista metablico puede obtenerse la primer pista del origen de los errores en el
grupo de 11%, pues la levadura Saccharomyces cerevisiae es anaerobia facultativa
(Madigan, et al, 2004) lo cual significa que cuando se encuentra en ausencia de oxgeno
genera como productos etanol y dixido de carbono, factor que pudo generar un aumento
en la concentracin total de etanol en dicho grupo. La importancia del oxgeno para el
crecimiento de un organismo est directamente relacionada con el metabolismo, pues
mediante los procesos metablicos se conserva la energa obtenida de su fuente energtica
(Willey, et al, 2009) que en este caso es ATP sintetizado a partir de la dextrosa en el medio
YPD.
Como sabemos todos los organismos vivos crecen y se desarrollan de manera ptima bajo
ciertas condiciones ambientales. Las condiciones de temperatura, humedad, salinidad etc.,
en el ambiente varan en el espacio y tiempo alejndose muchas veces de las condiciones
ptimas para el crecimiento y reproduccin del organismo. (Martnez , 2004) Por otro lado el
la concentracin de nutrientes en el medio pudo haber sido un factor determinante en el
crecimiento de la levadura y por ende una razn importante de porqu se agot el oxgeno
de manera que se pas de respiracin a fermentacin, pues la concentracin de los
nutrientes puede afectar tanto a la velocidad de crecimiento, como al rendimiento del
crecimiento de un microorganismo. A concentraciones muy bajas de un nutriente dado, la
velocidad de crecimiento se reduce, en tanto que de niveles moderados a altos del
nutriente, las velocidades de crecimiento pueden ser idnticas, el rendimiento de clulas
contina incrementndose, pues se encuentra directamente vinculado con el transporte
pasivo a travs de la membrana celular (Madigan, et al, 2004) , y si no hay una
concentracin alta o moderada la clula tiene dificultad al pasar nutrientes a travs de su
membrana y por ende dificultades para cubrir sus necesidades metablicas. Si
consideramos adems, que los medios de cultivo stock contenan 3 g de levadura en 100
mL de medio YPD puede decirse que se encuentra en una concentracin alta, pues en
dicho volumen de medio se coloc 1 g de dextrosa (fuente principal de carbono). Con lo
dicho anteriormente se sustenta la sospecha del fallo en el grupo de 11% de etanol en el
medio, pues se gener una mayor cantidad de biomasa y ferment los nutrientes del medio
al estar cerrado el frasco en donde se almacen dicho medio.
Por otra parte tambin se sabe que las levaduras en concentraciones un tanto elevadas de
etanol, su crecimiento es ms lento. Y esto se debe a que las clulas fueron daadas
parcialmente con el etanol. Se ha reportado que el etanol inhibe el crecimiento de los
microorganismo y causa daos en el ADN mitocondrial de las clulas de levaduras y la
inactivacin de algunas enzimas . Pero del mismo modo se ha reportado que las clulas de
levadura han desarrollado mecanismo adecuados para hacer frente a varios tipos de daos
causados por el aumento de la concentracin de Etanol (Martnez.2004 ). Pudiendo ser as
otro de los motivos por el cual la concentracin al 11% sali tan baja pero no es muy
confiable, ya que en el grupo control no se observa un crecimiento favorable como en la
concentracin al 9% observando que la levadura con buen cuidado y sin tantas variables
extraas puede alcanzar su punto mximo a esa cantidad.

Conclusiones

Se debe tener cuidado en el mantenimiento de la fermentacin aerobia de la


levadura ya que esto afecta el crecimiento de biomasa y en la sntesis de sus
productos.

La mayor produccin de trehalosa en la levadura se present en el tratamiento de


9% de etanol.

La concentracin de trehalosa va en aumento a la par de la concentracin de etanol.

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