PRUEBA DE COOMBS – DIRECTO

El suero de Coombs o antihumano (anticuerpo IgG antihumanos o

complemento), se obtuvo en un principio inyectando suero humano (anticuerpo IgG o
complemento humano) a ciertos animales como conejos y chivos.
La prueba de Coombs Directo se basa en poner en contacto el suero de Coombs con
glóbulos rojos revestidos de proteína humana (anticuerpo IgG o complemento humano),
los que serán aglutinados siguiendo un reconocido princípio.
En la clínica las proteínas detectadas en la superficie eritrocítica están
representadas por IgG (anticuerpos calientes) y fracción C´ del complemento
(anticuerpos fríos).
El suero de Coombs de mayor uso actualmente es de origen monoclonal y de
amplio espectro; puede detectar ambos componentes; pero pueden prepararse fracciones
específicas anti IgG o anti C´ al inyectar los antígenos específicos.

PROCEDIMIENTO:
1.- Se prefiere usar sangre coagulada. El coágulo se tritura ayudándose a la
separación de los glóbulos rojos con aplicadores de madera. Extraer los coágulos y
completar la capacidad de un tubo de 13 x 100 con sol. fisiológica.
Lavar 3 veces con suero fisiológico los glóbulos rojos centrifugando a máxima
revolución por 5 min. cada vez y descartando el sobrenadante cada vez, en la última
lavada luego de obtener un sobrenadante transparente, descartar la misma y preparar una
suspensión de glóbulos rojos lavados 1 gota de glóbulos rojos lavados más 4 gotas de
solución salina fisiológica. Se mezcla.
2.- De esta dilución se toma 1 gota y se añade 1 gota, de suero de Coombs en
otro tubo limpio. Mezclar, llevar a centrifugar 2 min. a 1.000 – 2.000 r.p.m. junto con un
control negativo que en vez del suero de Coombs llevará 1 gota de solución salina
fisiológica, más una gota de suspensión de glóbulos rojos. Llevar a la lámpara de
Wiener . Leer.

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RESULTADOS:
Aglutinación: Coombs Positivo.
No hay aglutinación: Coombs Negativo.
Coombs positivo indica la presencia de Ig G o C´ adheridos al glóbulo rojo,
asumiéndose que la prueba se ha efectuado con suero antihumano de espectro amplio; en
el mismo sentido se asume que la presencia de las fracciones referidas han sido
producidas por el mismo organismo, en estas condiciones puede señalarse la existencia
de una Anemia hemolítica autoinmune. Sin embargo se presentan situaciones donde la
prueba de Coombs positiva no es indicativa obligatoriamente de anemia Hemolítica
Autoinmune que son enunciadas a continuación: 1) Adsorción por parte de los glóbulos
rojos de complejo droga-antidroga en personas tratadas con ciertas drogas como:
penicilina, quinidina, estibofén y fenacetina.
2.- Adsorción de globulinas normales por agentes capaces de lesionar membrana
eritrocítica: cationes metálicos como el cromo (contaminación de sangre en tubos
tratados con solución sulfocrómica), cefalotina, cefalosporinas. En personas tratadas con
alfametil dopa se ha conseguido un 20% de Anemia Hemolítica; su mecanismo se ha
explicado a través de la lesión de membrana eritrocitaria.
3.- Puede observarse Coombs positivo en personas con gran proporción de
reticulocitos, cuando se usa suero de Coombs de amplio espectro, por su contenido en
antitransferrina.

UTILIDAD CLÍNICA:
INVESTIGACIÓN DE AUTOANTICUERPOS:
La mayoría de los termoanticuerpos son detectables por anti IgG mientras que un
pequeño porcentaje solo se puede detectar con antiC3d. Las críoaglutininas se pueden
detectar usualmente con anti C3d y raramente con anti IgM.

ANTICUERPOS INDUCIDOS POR DROGAS:

Anemia hemolítica inducida por drogas cuyos anticuerpos generalmente son IgG,
algunas veces estos anticuerpos dirigidos contra el complejo droga-proteína sobre el
glóbulo rojo normalmente fija el complemento (en los eritrocitos) el cual puede
detectarse entonces por anti-C3b o anti C3d.
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 - anemia hemolítica del recién nacido.
- Investigación de una reacción post-transfusional.

PRUEBA DE COOMBS INDIRECTO:

FUNDAMENTO:
Se basa en la determinación de anticuerpos incompletos (IgG) circulantes en el
suero del paciente, previa fase de sensibilización de los glóbulos rojos (glóbulos rojos
con un antígeno específico) con los anticuerpos incompletos, dicha reacción se pone de
manifiesto de forma macroscópica mediante la adición del suero de Coombs.
La diferencia patogenética estriba (con respecto a los anticuerpos incompletos
detectados mediante Coombs Directo), en que cuando existe una prueba de Coombs
directa positiva, se han producido anticuerpos contra los propios glóbulos rojos del
paciente y es posible detectarlos en el eritrocito, en cambio los anticuerpos observados
con el Coombs indirecto no son auto-anticuerpos sino iso-anticuerpos y solo es dable
apreciarlos o detectarlos en el suero.

INVESTIGACIÓN DE LA VARIABLE D
PROCEDIMIENTO:
Una vez finalizado el procedimiento para la investigación del Rh (D), si este es
negativo, se debe descartar la presencia de la variante D (también se debe practicar
cuando la investigación de Rh (D) sea débilmente positivo) para lo cual no se descarta el
tubo donde se llevó a cabo la investigación del Ag Rh (D) el mismo se lleva a incubar a
37º C en Baño de María por 15 a 30 minutos, luego se lava 3 veces con suero fisiológico
centrífugado cada vez por 5 minutos a máxima revolución descartando el sobrenadante
cada vez. Al sedimento que quede se le añaden de 1-2 gotas de suero de Coombs.
Mezclar. Centrífugar durante 1-2 minutos a 1.000-2.000 r.p.m. Leer con ayuda de una
lámpara Wiener.

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RESULTADOS:
Aglutinación: D positivo = Rh(+).
No Aglutinación: D negativo = Rh (-)

UTILIDAD CLÍNICA DEL COOMBS INDIRECTO:

1.- Detección y titulación de anticuerpos anti Rh en embarazadas Rh (D)
negativo.
2.- Investigación de anticuerpos en el suero de personas que van a recibir sangre
y donde aparentemente son compatibles desde el punto de vista de grupo ABO y Rh
(llamadas Pruebas Cruzadas Mayores o Menores).
3.- En la determinación de otros antígenos de lso grupos sanguíneos (Kell, Kidd,
Duffy, D, etc). En este caso los anticuerpos específicos lo que hacen es sensibilizar a los
glóbulos rojos donde se investiga el antígeno y posteriormente con el suero de Coombs
se manifiesta la aglutinación.
4.- En general es aconsejable someter a todas las embarazadas a esta prueba para
investigar anticuerpos que puedan pasar a la circulación fetal y causar Anemia
Hemolítica del Recién nacido; pero a pesar de que se ha presentado este accidente por
anticuerpos anti C, Kell, etc., en la práctica por razones de frecuencia sólo se indaga el
anti-D. Además de la investigación de aglutinina y hemolisinas en mujeres
incompatibles con el grupo sanguíneo del marido, básicamente en embarazadas Rh (D)
negativo y grupo O.

FENÓMENO L.E.
INTRODUCCIÓN:
La prueba de fenómeno L.E., es una de las primeras pruebas generadas para el
diagnóstico del Lupus Eritematoso Diseminado(L.E.D) de uso todavía en nuestro
medio, a pesar del advenimiento de pruebas más sensibles y específicas, quizás por lo
económica de la primera recurriendo solo a pruebas más sofisticadas como anticuerpos
antinucleares (ANA), anticuerpos antiADN (ANTI-DNA), etc, cuando el fenómeno L.E.
es positivo para descartar o confirmar con estas pruebas antes nombradas y más
específicas, el diagnóstico de esta enfermedad. Sin embargo siempre se debe tener en
cuenta que el Fenómeno L.E. por ser una prueba inespecífica y sensible solo en el
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período agudo y pre-tratamiento de la enfermedad, solo es sugestiva de la misma cuando
es positiva, refiriéndose aunque en forma esporádica la presencia de fenómeno L.E.
positivo en enfermedades relacionadas desde el punto de vista patogenético llamadas
también autoinmunes tales como: Hepatitis lupoide, artritis reumatoidea, vasculitis,
ingestión de drogas (hidrolacina, procainamida, isoniacida, anticonvulsivantes, etc.).

FUNDAMENTO:
Los pacientes son L.E.D. y otras condiciones señaladas (Colagenosis, ingestión
de drogas) tienen presente en su suero una Ig tipo “G” que tiene capacidad lítica sobre la
cromatina nuclear; esta capacidad parece estar relacionada con una actividad anti-ADN,
que tiene en consecuencia alteraciones morfológicas en la cromatina nuclear de
neutrófilos o linfocitos; debido a que el núcleo se homogeniza transformándose en una
masa hialina de color rosado difuso que recibe el nombre de Cuerpo hialino. Este
cuerpo hialino ejerce cierta atracción sobre neutrófilos y monocitos (fagocitos) que lo
rodean para fagocitarlo constituyendo lo que se llama Roseta (antes de la fagocitosis).
Una vez que los fagocitos ya sea neutrófilos o monocitos toman parte del cuerpo hialino
y lo incluyen en su interior, este modifica la morfología de estos fagocitos, al observarse
un cuerpo hialino rechazando el núcleo del correspondiente fagocito que recibe el
nombre de Célula L.E.

METODO DE CONLEY MODIFICADO

PROCEDIMIENTO:
Mediante este método la sangre es depositada en un frasco conteniendo la
cantidad suficiente de anticoagulante (heparina) para procesar una muestra fluída, y lo
suficientemente pequeña para impedir la inhibición del fenómeno, la inclusión de perlas
de vidrio y la ulterior rotación facilitan la labilización de la membrana celular para la
penetración del Factor L.E., posteriormente la incubación permite el tiempo necesario
entre el anticuerpo Anti D.N.A. (Factor L.E.) y el ADN celular, finalmente los
leucocitos son concentrados mediante centrifugación y teñidos con Wright-Giemsa.

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TÉCNICA:
1.- En un frasco o tubo (13 x 75) de vidrio donde se han depositado 5 perlas de
vidrio y 50U, de heparina se colocan 5ml de sangre. Mezclar.
2.- El frasco o el tubo se lleva a un rotador de V.D.R.L. durante 30 minutos o en
su defecto por mezcla manual durante 15 minutos. Luego se incuba durante 1 hora en
Baño de María a 37º °C.
3.- La muestra se lleva a dos tubos de sedimentación de Wintrobe se llenan con
ayuda del dispositivo de la aguja de Wintrobe y se llevan ambos tubos a centrífugar a
máxima revolución (5000 r.p.m.) por 15 minutos. Separar plasma sobrenadante y tomar
la capa de glóbulos blancos concentrados, situada por encima de la columna de
eritrocitos de color rojo claro.
4.- Depositar este material de glóbulos blancos concentrados en dos láminas
portaobjetos y realizar como mínimo dos frotis por aposición y luego colorear con
Wright-Giemsa (aumentando el tiempo de c/colorante en 2 a 4 minutos siguiendo el
mismo procedimiento para dicha coloración explicado en esta guía. (Ver coloraciones
habituales o de rutina en hematología).
5.- Una vez coloreadas, las láminas se llevan al microscopio óptico para su
observación con objetivo de 100x y aceite de inmersión haciendo un recorrido
exhaustivo de cada lámina de por lo menos 20 min.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:
Para considerar esta prueba positiva es decir, fenómeno L.E. positivo cuando se
lleguen a observar un mínimo de 2 células L.E. por lámina. La sola observación de
cuerpos hialinos o rosetas sin la observación de células L.E. no es suficiente para
considerar una prueba de Fenómeno L.E. positivo, reportando en dicho caso sólo lo que
se observa y recomendando una repetición de dicho examen o prueba en un período de
15 días; tomándose en cuenta que esta prueba solo es útil si el paciente no está siendo
tratado con esteroides o medicamentos inmunosupresores.

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 ESTUDIO DE HEMOSTASIA Y COAGULACIÓN
PRINCIPIOS SOBRE EL MATERIAL INSTRUMENTAL
Y MUESTRA SANGUÍNEA A UTILIZAR
Los estudios de coagulación y hemostasia resultan sencillos desde el punto de
vista técnico, pero se hace necesario mantener un cuidado muy riguroso en su
realización, única forma de evaluar e interpretar cabalmente sus resultados.
Los principios señalados a continuación deben ser insoslayables en todo estudio
de hemostasia y coagulación.
1.- Los tubos a utilizar deben ser de preferencia de plástico o silicone en su
defecto si son de vidrio deben estar completamente limpios, sin rayaduras, ni trazas de
residuos.
2.- Las muestras se hacen necesario obtenerlas con jeringas plásticas o jeringas
de vidrio siliconadas.
3.- Es necesario depositar las muestras de sangre para la obtención de plasma en
tubos siliconados.
4.- En las pruebas donde se requiere la confrontación con un control, las muestras
del testigo tanto como del paciente deben ser tratadas de igual forma, especialmente en
el tiempo de extracción, centrifugación y realización técnica.
5.- El anticoagulante de preferencia para obtener el plasma a utilizar para la
realización de las pruebas de coagulación, debe ser el citrato de Na al 3,2 % usado en
una proporción de 1 parte de citrato por 9 partes de sangre. El plasma debe ser separado
tan rápidamente como se pueda después de ser obtenido. No deben usarse plasmas
hemolisados, lipémicos o ictéricos, pues provocan interferencia en la realización y
resultados de las pruebas. El plasma debe ser procesado dentro de las 4 horas después de
haber sido obtenida la muestra. En caso de pacientes con valores de Hto. por debajo de
20 %, la cantidad de muestra sanguínea debe ajustarse para 0,5 ml de anticoagulante (ver
tabla de ajustes).
6.- Cada laboratorio debe unificar sus procedimientos y extrapolar sus resultados
a los valores conseguidos según el método usado.
7.- Debe utilizarse siempre una muestra control en cada determinación.

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 AJUSTE DEL VOLUMEN DE MUESTRAS SEGÚN EL HTO. EN LAS
PRUEBAS DE COAGULACIÓN

Hto (%) VOLUMEN DE SANGRE POR 0,5 ML DE

ANTICOAGULANTE
En Adultos (ml) En Ñiños (ml)

10 3,0 1,8
12 3,0 1,8
14 3,1 1,9
16 3,2 1,9
18 3,3 2,0
20 3,4 2,0
> 20 < 50 4,5 2,7
> 50 4,5 2,7

ml de Anticoagulante = 0,000185 x V x (100- Hto)

V = Vol sangre

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OBTENCIÓN DE SANGRE VENOSA PARA ESTUDIOS DE COAGULACIÓN
El estudio más práctico para obtener sangre venosa en la flexura anterior del
brazo. Un torniquete facilita la obtención. Usar una aguja puntiaguda nunca menor de
calibre 21. Tanto la aguja como la jeringa deberán estar limpias, secas y estériles.
Para efectuar los estudios de coagulación se deben descartar los primeros 2 a 3
ml de sangre. Esta porción se puede emplear para citometría hemática, contaje de
glóbulos blancos, recuento de plaquetas, o para determinar velocidad de sedimentación
globular (VSG), sí se coloca en un tubo con EDTA. También, se puede colocar en un
tubo sin anticoagulante para determinar anticuerpos antiplaquetarios, anticuerpos
anticardiolipina o hierro sérico, TIBC, etc.

MÉTODO DE LA DOBLE JERINGA DE PLÁSTICO

Se utiliza para el estudio de coagulación.
PROCEDIMIENTOS:
1.- Desinfectar la piel en el sitio de punción con algodón humedecido con un
definfectante apropiado, por ejemplo, alcohol al 70%.
2.- Preparar la jeringa y la aguja tipo “mariposa” (calibre 21-23 G), cuidando que
la técnica sea aséptica.
3.- Aplicar un torniquete en el brazo (por encima del sitio de punción)
suficientemente apretado para que restrinja el flujo de la sangre venosa.
4.- Desinfectar nuevamente el sitio de punción, y secar la piel con algodón o gasa
limpios, secos y estériles.
5.- Asegurarse que el émbolo de la jeringa esté hasta el fondo, es decir, que la
jeringa no contenga aire. Insertar la aguja de la jeringa en una vena con un movimiento
preciso. Evitar maniobras de exploración, las cuales producen liberación de sustancias
tromboplásticas.
6.- Halar lentamente el émbolo y obtener de 2 a 3 ml de sangre. Esta se puede
agregar en un tubo con EDTA al 10% (1,5 mg/ml de sangre) para los estudios de
citometría sanguínea, contaje de glóbulos blancos, recuento de plaquetas o para VSG.
También puede ser adicionada en un tubo sin anticoagulante para determinar
anticuerpos antiplaquetarios, anticuerpos anticardiolipina, hierro sérico ó estudios
bioquímicos, TIBC, etc.
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 7.- Retirar la jeringa de la aguja y sustituirla por otra jeringa.
8.- Obtener el volumen de sangre deseado halando el émbolo muy despacio.
9.- Soltar el émbolo y colocar una gasa seca en el sitio de punción, retirando
después la aguja con un solo movimiento.
10.- Presionar ligeramente la gasa sobre el sitio de punción y pedir al paciente
que continúe aplicando la presión durante unos minutos.
11.- Agregar la sangre venosa en los tubos plásticos correspondientes, dejando
deslizar la sangre por las paredes del mismo, evitando de esta manera producir
hemólisis.
12.- Tapar inmediatamente los tubos plásticos y mezclar suavemente. Si se
utilizan tubos de vidrio deben ser previamente siliconados, ya que el vidrio produce
activación de la fase de contacto del sistema intrínseco de la coagulación. Una vez
tomada la muestra el tubo debe ser tapado inmediatamente para evitar cambios de pH
que alteren los resultados.
13.- Centrífugar la sangre a alta velocidad (4500 r.p.m, 2400 g) durante 20
minutos a 4º C, para obtener plasma pobre en plaquetas (PPP).
14.- Separar el PPP, repartirlo en alícuotas y utilizarlos para pruebas de
coagulación.
Nota: también se utiliza esta técnica de la doble jeringa para obtener plasma rico
en plaquetas (PRP), el cual es requerido para estudios de funcionalismo plaquetario. En
este procedimiento, al llegar al punto 13 del procedimiento anterior, se centrifuga la
sangre a baja velocidad (800 r.p.m.) durante 8 minutos a temperatura ambiente y luego
se separa el plasma (PRP).

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 PRUEBAS DE HEMOSTASIA PRIMARIA
TIEMPO DE SANGRÍA:
FUNDAMENTO:
Se basa en medir el tiempo que tarda en dejar de sangrar una herida provocada en
el paciente, que se traduce en el tiempo que tardan las plaquetas en formar un tapón
plaquetario.
TIPOS DE MÉTODOS MÁS USADOS:
a.- Método de Duke.
b.- Método de Ivy Modificado.

a.- Método de Duke: Procedimiento: se realiza asepsia en el lóbulo de la oreja

del paciente frotándola con un algodón impregnado de alcohol isopropílico. Se espera
que seque, y con una lanceta de punción capilar o con un bisturí de los utilizados en las
amigdalectomías, se perfora la parte inferior del lóbulo de la oreja, apoyándose en la
cara posterior del mismo con una lámina portaobjeto, en ese momento se hace funcionar
el cronómetro. La punción se debe practicar en sitios sin heridas, rasgaduras o venas
visibles. Al transcurrir 1 minuto de la punción se debe tocar con la superficie de un
papel de filtro contra la herida, sin ejercer mucha presión. Posteriormente esta operación
se práctica cada 30 segundos, utilizando una nueva zona del papel de filtro hasta que el
mismo deje de absorber sangre, en este momento se detiene el cronómetro.

VALOR NORMAL:
De 1 a 3 minutos.
Es tolerante dentro del rango de normalidad un tiempo de sangría de 5 minutos,
pero si esto ocurriese es aconsejable efectuar de nuevo el tiempo de sangría al paciente
en el otro lóbulo de la oreja.

UTILIDAD CLÍNICA:
Un tiempo de sangría dentro de los límites normales sólo nos indica el buen
funcionamiento de la hemostasia primaria y de las plaquetas tanto en cantidad como en
calidad, por tanto, en los cuadros patológicos donde esta fase se encuentra afectada

70
ocasionando que el tiempo de sangría se encuentre alargado (mayor de 3 minutos). A
continuación se mencionan algunos de estos cuadros patológicos:
1.- Púrpura Trombocitopénica: cualquiera sea la causa, si las plaquetas se
encuentran por debajo de 50.000 plaquetas x mm3.
2.- Enfermedad de Von Willebrand: en esta condición las plaquetas son
normales en cantidad y calidad (aparentemente), pero tienen dificultad de adherirse al
factor Von Willebrand del endotelio vascular, actualmente se habla más de un síndrome
que de una enfermedad por las causas diversas que lo pueden originar y los diferentes
tipos existentes, sin embargo en la mayoría de los pacientes se ha detectado una
deficiencia del factor Von Willebrand plasmático transportador del factor VIII
plasmático.
3.- Tromboastenia de Glazman: en esta enfermedad el número de plaquetas es
normal, pero las mismas son defectuosas cualitativamente, aparentemente por un defecto
en una proteína contráctil o glicoproteína plaquetaria (IIb-IIIa), y/o disminución de
fibrinógeno intraplaquetario.
4.- Falta de liberación de ADP plaquetario: sobre todo luego de la ingestión de
ciertas drogas como la Aspirina, Dipiridamol, Pirazolona, las mismas inhiben la
liberación de ADP de las plaquetas cuya función principal es propiciar la agregación
plaquetaria.
b.- Método de Ivy Modificado: es un método estandarizado, mucho más preciso
y exacto que el método de Duke, debido a que utiliza una hojilla de bisturí calibrada con
un plantilla para provocar una herida de una longitud y profundidad predeterminadas a
una tensión sanguínea constante, lo cual constituye una ventaja sobre el método
tradicional de Duke donde se utiliza una hojilla de bisturí o lanceta con la cual se
provoca una herida de profundidad variable dependiendo de la presión que se ejerza
sobre la zona a pinchar; la herida se realiza en una zona susceptible a cambios de
temperatura que pueden afectar el tiempo de sangrado y con una tensión sanguínea no
controlada.

PROCEDIMIENTOS:
1.- Se procede a colocar un mango de tensiómetro a 40 mm de Hg constante en el
brazo del paciente.
71
 2.- Se procede de inmediato a efectuar la asepsia de la zona del antebrazo
elegido, la cual no debe presentar lesiones cutáneas o venas visibles.
3.- Luego se procede a colocar una plantilla que tiene una ranura central de 1
cm. de longitud sobre el área del antebrazo desinfectado, luego se realizan dos heridas
en forma horizontal equidistantes colocando una hojilla calibrada para provocar una
herida de 1mm de profundidad, la misma puede ser colocada y calibrada en un
dispositivo llamado Aparato de Mielke, o más recientemente se han ideado lancetas
calibradas sobre soporte plástico descartable.
4.- El Cronómetro se debe disparar una vez que las heridas sean efectuadas, la
presión sanguínea a 40 mm de Hg debe mantenerse constante durante todo el tiempo de
la prueba. Al minuto de haber realizado las heridas se debe tocar las mismas sin ejercer
presión con el borde de un papel de filtro, luego cada 30 segundos se llevará a cabo esta
misma operación utilizando un sitio diferente del papel de filtro, hasta que la herida deje
de sangrar y el papel deje de absorber en este momento se detiene el cronómetro y se
registra el tiempo.

VALORES REFERENCIALES:
4,5 ± 2,5 minutos.

RETRACCIÓN DEL COAGULO

FUNDAMENTOS:
La sangre colocada en un tubo seco (in vitro) se coagula por activación del
Factor XII en contacto con el vidrio, una vez coagulada la sangre se da el proceso de
retracción del coágulo para la posterior exudación del suero, este proceso va a depender
de dos factores importantes:
1.- El número de plaquetas.
2.- Capacidad funcional de las plaquetas (secreción de la trombostenina enzima
responsable de la retracción).
PROCEDIMIENTO:
Rotular 1,2 y 3 (3 tubos) de 13x100 limpios y secos. Proceder a extraer la sangre
del paciente, seleccionando una vena palpable y que pueda ser punzada de una forma
limpia, sin dificultades, la sangre debe ser extraída con una jeringa plástica. Desde el
72
momento de la entrada de la sangre al inicio de la jeringa, se debe poner en marcha el
cronómetro. Se deben extraer 3ml. para esta prueba, y debe depositarse lo más rápido
posible en los tubos de 13x100 rotulados anteriormente, colocando la sangre en el
siguiente orden: Tubo No. 3, Tubo No. 2 y de último el tubo No. 1 (1cc en cada tubo) los
tubos deben ser colocados en el Baño de María a 37°C por una hora. Al cabo de dicho
tiempo se efectúa le lectura y se reporta siguiendo el siguiente patrón:
- Retracción del coágulo nula: cuando el coágulo, transcurrida 1 hora sigue
pegado a todas las paredes de los tres tubos.
(+) = Alguno de los 3 tubos, presenta el coágulo despegado de una de las paredes
del tubo observando el tubo en plano frontal girando el tubo 90º. Ver dibujos.

(++) = Alguno de los tubos presenta separación del coágulo de dos paredes o
pared y media.
(+++) = Separación de tres paredes del tubo.
(++++) = Separación total del coágulo de todas las paredes del tubo quedando
suspendido en el tubo medio o en el fondo del tubo.
- Se debe reportar la mayor retracción del coágulo observada en los tres tubos.
Cuando la retracción es nula (reporte), se puede dejar uno de los tubos una hora
más a 37°C en Baño de María y a las dos horas se puede hacer el reporte colocando la
observación que el reporte es a las dos horas de prueba.

VALORES REFERENCIALES:
(++) a (++++).

SIGNIFICADO CLÍNICO:
Principalmente en dos condiciones se puede observar una retracción el coágulo
inadecuada (nula o 1 +):
1.- Trombocitopenia.
2.- Enfermedad de Glazman.
Así mismo cualquier factor que impida la adherencia y/o agregación plaquetaria
producirá déficit en la retracción. En la Enfermedad de Von Willebrand se encuentra
normal.
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 Una prueba adicional de rutina que evalúa la fase de Hemostasia Primaria es el
Contaje de Plaquetas.
Otras pruebas que evalúan la Hemostasia Primaria son utilizadas en Centros
especializados en Hematología como los Bancos de Sangre, siendo pruebas un poco
sofisticadas y costosas pero muy sensibles y precisas, que ayudan a profundizar el
estudio cuando el origen de una enfermedad hemorrágica se debe a un defecto
plaquetario y las pruebas de rutina por sí solas no son suficientes para establecer un
diagnóstico adecuado. Dichas pruebas son:

a.- Agregación Plaquetaria.

b.- Determinación de Factor 3 plaquetario.
c.- Adhesividad plaquetaria.
d.- Determinación de anticuerpos antiplaquetarios.
e.- Prueba de Rumpel-Leede (Prueba del Lazo).

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 TIEMPO DE PROTROMBINA O TIEMPO DE QUICK
FUNDAMENTO:
Es el tiempo que tarda el plasma control y la muestra a investigar en coagular al
ser sometidos a la acción de concentraciones adecuadas de extracto tisular
(tromboplastina tisular) y calcio, por activación del Mecanismo extrínseco de
Coagulación cuyo producto final es el coágulo debida a la transformación final del
fibrinógeno en fibrina.

PROCEDIMIENTO:
Las muestras de plasma y la tromboplastina deben estar en gradillas con hielo en
la nevera a 4°C mientras se procesa la prueba. El calcio debe mantenerse en Baño de
María a 37°C. Si son varias muestras (plasma citratado) que se van a procesar las
mismas se pueden efectuar de forma seriada distribuyendo siempre en el mismo sentido
los reactivos. Aquí vamos a explicar el proceso en una sola muestra.
1.- En tubos de 12x75 2 tubos por muestra, dos tubos para el plasma control, 1
tubo para la tromboplastina (que puede traer el calcio incorporado que debe ser
resuspendido con agua destilada momentos antes de la prueba, si es un reactivo
comercial). Cada muestra debe procesarse por duplicado y cada vez que se monte la
prueba se debe montar un control por duplicado también. Todos se deben colocar a 37°C
en Baño de María al momento de la prueba.
2.- En los dos tubos del plasma del paciente se deben pipetear 0,1 ml de plasma
citratado del paciente (en cada uno) y 0.1ml de plasma control en cada uno de los tubos
del plasma control siempre se debe hacer o dispensar los reactivos en orden. Esperar 3
minutos.
3.- Luego agregar 0,1ml de tromboplastina o en su defecto 0,2ml de
tromboplastina con calcio incorporado. En el primer caso esperar tres minutos y luego
agregar 0,1 ml de calcio al 0,025M procesar una muestra a la vez, es decir primero la
muestra en el primer tubo, luego el duplicado y de la misma forma se hace con el
control.
4.- Luego de disparar el cronómetro el tubo se deja en el Baño a 37°C
mezclándose durante 7 segundos, luego el mismo se saca y se mezcla de forma inclinada
tratando de poner en contacto la mezcla con el vidrio para que se active el mecanismo de
75
la coagulación, simultáneamente se debe observar el momento justo en que se formen
las mallas de fibrina para inmediatamente parar el cronómetro y registrar el tiempo
obtenido, el cual debe promediarse con el tiempo del duplicado al igual que el del
control y compararlos para realizar un control de calidad de la prueba, técnica y
reactivos utilizados.

VALORES REFERENCIALES:
Dependen de los valores obtenidos con el plasma control y del método empleado,
pero los límites referenciales son los siguientes: 10 a 15 segundos.

UTILIDAD CLÍNICA:
Este tiempo se considera alargado cuando el mismo se encuentra más de 3
segundos por encima del tiempo obtenido en el plasma control; existen ciertas patologías
donde esto puede ocurrir:
a.- Déficit de Factor VII.
b.- Déficit de Factor II (Hipoprotombinemia)
c.- Déficit de Factor V (Parahemofilia)
d.- Déficit de factor X.
e.- C.I.D. , Fibrinólisis secundaria.
f.- Disfibrinogenemia o Afibrinogenemia.

INR: ESTANDARIZACIÓN DE LAS TROMBOPLASTINAS COMERCIALES

Usualmente el TP es reportado en segundos, porcentaje de actividad o razón; hoy
en día se está introduciendo como unidad del resultado del TP, el INR ó RIN (Razón
Internacional Normalizada), particularmente para pacientes que se tratan con
anticoagulantes orales.
Desde 1983, todas las tromboplastinas comerciales poseen un Indice de
Sensibilidad Internacional ó ISI el cual es asignado tomando como referencia de la
Preparación de Referencia Internacional (IRP) ó reactivo de Manchester aprobado por la
Organización Mundial de la Salud y el Comité de expertos en Estandarización
Biológica. A esta tromboplastina inicial se le asignó un ISI el cual representa la

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sensibilidad relacionada con la preparación del Manchester. Un ISI cercano a 1.0,
significa que la tromboplastina posee una buena sensibilidad.

SIGNIFICADO E IMPORTANCIA DEL INR:

El cálculo del INR ó RIN, se basa fundamentalmente en la razón obtenida entre
el tiempo que se obtuvo del plasma problema y el tiempo de un plasma de referencia o
de la mezcla de plasmas normales. La razón entonces es elevada al ISI que posee la
tromboplastina comercial utilizada como reactivo. La formula sería la siguiente:

INR = razón del TP(ISI)

Razón de TP= X del T.P del paciente

X del T.P del control

Existen actualmente tablas ó monogramas para el cálculo del INR (Fig. 2), sin
embargo en la actualidad la mayoría de los aparatos automatizados para la realización de
estudios de coagulación revelan este valor directamente.
El INR es sumamente importante en el control de los pacientes que reciben
anticoagulantes orales y cuyo tratamiento debe ser ajustado para evitar recidiva del
problema trombótico que padece ó manifestaciones hemorrágicas por dosis elevadas
(Rango terapéutico). El resultado del INR depende esencialmente del ISI, de la
tromboplastina comercial utilizada (bien sea de tejidos biológicos ó recombinantes) y de
la dosificación recibida en los pacientes bajo régimen de anticoagulación oral.
Como el efecto inicial de la Warfarina o cualquier otro anticoagulante oral es
tardío (48 a 72 hrs), el TP debería practicársele al cabo de este tiempo, para conocer el
nivel del INR y luego repetidamente hasta obtener el INR terapéutico, luego 2 o 3 veces
semanales de acuerdo con la respuesta del paciente. Si el INR, permanece estable las
primeras semanas, se puede extender su determinación a una vez por semana ó cada 15
días, pero es recomendable no excederse de 8 semanas. Se debe tener en consideración
que enfermedades interrecurrentes, la administración de drogas o medicamentos pueden
modificar el INR, la ingesta de dietas ricas ó pobres en vitamina K, pueden potenciar o
disminuir la respuesta a la anticoagulación.

77
 La determinación del INR en la determinación del TP ha permitido la
implementación del rango terapéutico de acuerdo con la condición clínica del paciente
para maximizar el beneficio del tratamiento sobre el riesgo hemorrágico o trombótico
que pueda presentar e paciente anticoagulado
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL
FUNDAMENTO:
Es el tiempo necesario para que el plasma citratado forme un coágulo de fibrina
después de la adición de calcio y de un fosfolípido (tromboplastina parcial), gracias a la
activación del mecanismo intrínseco de la coagulación.

PROCEDIMIENTO:
1.- Se obtiene plasma citratado pobre en plaquetas el cual debe mantenerse a una
temperatura comprendida entre 4°C y 10°C hasta el momento de su uso.
2.- La tromboplastina parcial (cefalina) viene suspendida con un activador
(kaolín, ácido elágico o celita) el cual debe tomar la temperatura de cuarto antes de
realizar la prueba.
3.- Una vez que se vaya a realizar la prueba tanto el plasma paciente, plasma
control, como la tromboplastina parcial y el calcio deben mantenerse a 37°C en Baño de
María dispensados en sus respectivos tubos. Al igual que en el tiempo de Quick se debe
realizar cada muestra y el control por duplicado.
4.- Se deben dispensar 0,1ml del plasma paciente en 2 tubos 12x75 y 0,1ml en 2
tubos de plasma control. Se esperan tres minutos. Se añaden en el mismo orden 0,1ml de
cefalina o tromboplastina parcial. Se mezcla, esperar tres minutos. Agregar ahora en un
tubo a la vez, 0,1ml de calcio 0,025M inmediatamente disparar el cronómetro mezclar
por rotación el tubo dentro del Baño de María 37°C por 20 segundos, sacar el tubo y
poner en contacto la mezcla con las paredes del tubo y detener el cronómetro una vez
que se observen las mallas de fibrina. Registrar el tiempo, ahora continuar con los otros
tubos de igual forma.

VALORES REFERENCIALES:
Depende así como en todas las pruebas de tiempo que evalúan los factores de la
coagulación del tiempo obtenido en el plasma control. No debe existir una diferencia
78
mayor de 5 a 6 segundos entre el tiempo de tromboplastina parcial exhibido por la
muestra del paciente y la del plasma control, en estos casos se dice que el T.T.P en el
paciente se encuentra alargado (ej: T.T.P Control 30” T.P.T. paciente 36”. Sin embargo
cuando el T.P.T. es activado el tiempo referencial normal debe ser: 25 – 40
segundos

SIGNIFICADO CLÍNICO:
El tiempo de tromboplastina parcial (T.T.P) es una prueba muy sensible ante las
alteraciones del proceso de coagulación propiamente dicho (formación del coágulo rojo).
Su alteración (alargamiento) compromete el déficit de algún factor plasmático, en
especial de aquellos implicados en el Mecanismo Intrínseco de la coagulación (VIII, IX,
XI, XII) y en el déficit de factores que intervienen en la vía común (X y V). Su
interpretación correcta se debe llevar a cabo tomando en cuenta los resultados del resto
de las pruebas que estudian el mecanismo hemostático y de coagulación realizados al
paciente, y en especial los resultados del Tiempo de Protrombina (T.P). Cuando el T.P.
se encuentra normal y el T.T.P alargado se piensa que sólo está comprometido el
Mecanismo intrínseco y deben hacerse otras pruebas para determinar el factor específico
de ese mecanismo que está deficiente, para ello pueden realizarse las mezclas de
corrección y la dosificación de factores (VIII, IX, XI y XII) .
Cuando el T.P. y el T.T.P se encuentran alargados es probable un déficit a nivel
de los factores de la vía común (X y V). Ahora si solo está alargado el T. protrombina se
piensa que el déficit más probable es del factor VII (Vía extrínseca).
T.T.P ALARGADO EN:
a.- Hemofilia A o B (VII, IX)
b.- Defecto de Hageman (XII).
c.- Déficit de Factor V (Parahemofilia).
d.- Déficit de Factor X.
e.- Hipofibrinogenemia (Fibrinógeno por debajo de 100 mg/dl).
f.- C.I.D.
g.- Fibrinolísis secundaria con productos de la degradación de la fibrina (P.D.F)
aumentados.

79
MEZCLAS DE CORRECCIÓN:
Se lleva a cabo cuando el T.T.P., T.P y T.T. se encuentran alargados, para
dilucidar el factor o factores deficitarios que provocan la alteración de dichas pruebas.
Se realiza con partes iguales de plasma normal o comercial y plasma del paciente
con el tiempo alargado con esta mezcla se realiza de nuevo el tiempo o los tiempos
alterados, si se observa corrección del mismo se procede a llevar a cabo las otras dos
mezclas una con suero normal envejecido proveniente de un paciente normal de 24
horas en delante de haberse obtenido conservado en refrigeración a 4º C o en
congelación más plasma del paciente en cuestión, y finalmente una tercera mezcla con
plasma adsorbido normal que viene a ser un plasma normal el cual debe adsorberse con
Hidróxido de Aluminio o Sulfato de Bario de la siguiente manera:
1.- Se agregan en un tubo de 12x75, 2 volúmenes, de plasma normal más 1
volumen de Sulfato de Bario. Se mezclan y se incuba en frío por 10 a 15 minutos,
mezclando cada 5 minutos.
2.- Transcurrido el tiempo reglamentario se lleva a centrifugar 5 minutos a
máxima revolución. El sobrenadante es el plasma adsorbido normal listo para ser usado.
Antes debe ser probado haciéndole un T. de protrombina que debe ser mayor de 30” y el
T.T.P alargado.

PROCEDIMIENTO PARA HACER CORRECCIÓN DE T.T.P

1.- Se rotulan tres tubos de 12 x 75 como: P. Normal, P.A.N.(Plasma adsorbido
nornal) y S.N. (Suero Normal); preparar un 4to. Tubo que llevará el plasma control.
2.- A continuación se va agregar en cada tubo lo siguiente según este esquema:
TUBO PLASMA CONTROL:
0,1 ml de cefalina + 0.1 ml plasma control. Esperar 10 minutos a 37º C en Baño
de María. Agregar 0.1 ml de calcio . Repetir el TTP si dá alargado proceder a realizar la
siguiente mezcla:
TUBO PLASMA NORMAL (P.N).
0,1 ml de plasma normal + 0,1 ml plasma paciente, 0,1 ml cefalina. Esperar 10
minutos 37º C en Baño de María. Agregar 0,1 ml de calcio. Medir el tiempo y si hay
corrección, continuar con las siguientes mezclas:
80
PLASMA ADSORBIDO NORMAL (P.A.N).
0,1 ml de P.A.N. + 0,1 ml plasma paciente + 0,1 ml de cefalina. Esperar 10
minutos a 37º C en Baño de María. Agregar 0,1 ml de calcio.
SUERO NORMAL (S.N).
0,1 ml de suero normal + 0,1 ml plasma paciente + 0,1 ml de cefalina. Esperar 10
minutos a 37º C en Baño de María. Agregar 0,1 ml de calcio.
(a) Agregar el calcio (Cloruro de Calcio 0,025N) tubo por tubo es decir, que al
agregar el Ca., se debe disparar el cronómetro esperar 20 segundos. Sacar el
tubo, poner en contacto la mezcla con el vidrio y al observar la formación de
las mallas de fibrina parar el cronómetro y así proceder con los otros tubos.
(b) .- Comparar los resultados e interpretar su significado clínico. Las siguientes
situaciones se pueden originar o resultar.

A.- Generalmente el T.T.P debe haberse corregido con el plasma normal +

plasma paciente, debido a que el P.N. posee todos los factores y suplemente
cualquier defecto del P. paciente.

B.- Cuando el T.T.P corrige con el S. Normal pero no con el P.A.N. quiere decir
generalmente que el factor deficitario se encontraba en el suero normal, el cual
posee los siguientes factores de la coagulación: II, VII, IX, X y los factores XI y
XII que no se absorben ni se consumen, sospechándose en la mayoría de los
casos por su frecuencia una hemofilia B o déficit de factor IX.

C.- Cuando el T.T.P corrige con el P.A.N. pero no con el S. Normal quiere decir
que el factor deficitario se encuentra en el P.A.N. el cual contiene: I, V, VIII,
XIII y el XI y XII que no se absorben ni se consumen. Siendo el déficit más
frecuente el del factor VIII o Hemofilia A. Aún cuando en la Enfermedad de Von
Willebrand este tiempo también se altera y se corrige con P.A.N., pero estos
pacientes generalmente y a diferencia de aquellos con Hemofilia A presentan el
tiempo de sangría alargado. Existen sin embargo, pacientes con Von Willebrand
cuyo T.T.P es normal.
81
 D.- Cuando el T.T.P se corrige con S.N. y con P.A.N. entonces se sospecha de
déficit de los factores XI o XII, cuya diferenciación se puede lograr por la clínica
de ambas deficiencias que son distinguibles.
E.- Cuando el T.T.P, T.P o T.T no corrigen con ninguno incluso con plasma
normal, se sospecha de un anticoagulante circulante o presencia de inhibidores
(anticuerpos).

El plasma control se incluye en la batería de la prueba para controlar el

procedimiento y reactivos de la prueba y asegurarnos que la misma se esta llevando a
cabo correctamente y que sus resultados son fieles y exactos.
Para realizar mezclas de corrección del T. de Protrombina se realiza de la misma
manera descrita para el T.T.P pero sustituyendo la cefalina activada por la
Tromboplastina tisular, y en el caso del T.T se hace con trombina exógena.

TIEMPO DE TROMBINA:
FUNDAMENTO:
Es el tiempo necesario para que se forme un coágulo de fibrina después de la
adición de una cantidad estándar de trombina a una cantidad determinada de plasma
citratado.

PROCEDIMIENTO:
PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE TROMBINA:
A.- Se prepara una solución de trombina básica diluyendo trombina bovina
comercial (Liofilizada) con una cantidad determinada de solución salina 0.1454
(0.85%). Para obtener una concentración de 1000 de NiH/ml. Esta solución puede
congelarse en pequeños volúmenes y es estable por 6 meses. A continuación se prepara
una solución de trabajo de trombina diluyendo la solución de referencia con tampón
Veronal de Ower para obtener un tiempo de trombina de 18 a 25 seg. Durante 20
minutos a 37º C es estable esta solución de trabajo.

82
REALIZACIÓN DEL TIEMPO DE TROMBINA

1.- Se precalientan durante 3 min. a 37º C en Baño de María en un tubo de

plástico preferiblemente 0,1 ml de plasma del paciente. El plasma control debe tratarse
igual que la muestra del paciente.

2.- Se añade 0,1 ml de Trombina. Inmediatamente se dispara el cronómetro. Se

mantiene el tubo dentro del Baño de María a 37 ° C durante 10 segundos rotándolo en la
gradilla, luego se saca del baño y se comienza a mezclar y cuando se observe la
formación de las mallas de fibrina se detiene el cronómetro y se registra el tiempo
obtenido.
3.- La determinación del tiempo de trombina del paciente debe realizarse por
duplicado, igual que el control normal. Los resultados de las muestras por duplicado no
deben variar en más de tres segundos.

VALORES REFERENCIALES:
15 a 20 segundos (no debe ser mayor de 3 segundos con respecto al control).

INTERPRETACIÓN CLÍNICA:
Los tiempos de Trombina alargados se observan en los casos de pacientes que
toman heparina; en la hipofibrinogenemia menor de 90 mg/dl y en la mayoría de los
casos de Disfibrinogenemia. Los Productos de la Degradación de la Fibrina (P.D.F),
cuando se encuentran elevados interfieren en la polimerización de los monómeros de la
fibrina. Este tiempo suele ser normal en los casos de Mieloma múltiple y
Macroglobulinemia. El tiempo de trombina se puede prolongar en los casos de
enfermedad hepática en los que los niveles de fibrinógeno son normales y los PDF no
aumentan. Parece que el fibrinógeno que se sintetiza no es funcional y no llega a
polimerizarse normalmente.

83
 PRUEBA DE FACTOR XIII (TEST DE LA ÚREA).
FUNDAMENTO:
El factor XIII activado por la trombina, actúa en presencia de iones calcio para
estabilizar el coágulo de fibrina promoviendo la formación de enlaces covalentes entre
las cadenas de fibrina γγ y  por un proceso de transaminación. Un coágulo
estabilizado es insoluble en Urea 5 M o ácido monocloroacético al 1%.

PROCEDIMIENTO:
1.- Pipetear 0,5 ml de plasma citratado en un tubo de 13 x 100.
2.- Agregar 0,5 ml de cloruro cálcico 0,025M, mezclar e incubar 30 min a 37º C.
3.- Retirar el coágulo con cuidado y se coloca en otro tubo conteniendo 5 ml de
Urea 5M o 3ml de Ac. Monocloroacético 1%. Dejar reposar a T.A. y observar la
solución del coágulo a la 1,2,3 y 24 horas.

INTERPRETACIÓN:
La disolución del coágulo en menos de 24 horas es anormal e indica deficiencia
grave de factor XIII por debajo de 1%. En algunos casos de Disfibrinogenemia se ha
descrito una solubilidad anormal del coágulo de fibrina por alteraciones estructurales del
fibrinógeno que perjudican la acción del factor XIII.

PREPARACIÓN DEL HIDROXIDO DE ALUMINIO AL 2%

PARA LA OBTENCIÓN DEL P.A.N.
En un cilindro de 1 litro, verter todo el contenido de un frasco de Droxigel 240
ml al 4% o de Alutrin 180 ml al 4%. Completar la medida del cilindro con agua
destilada. Dejar en reposo después de mezclar y permitir la sedimentación hasta el
siguiente día, descartar el sobrenadante. Repetir la operación. Finalmente doblar el
volumen del frasco de Droxigel original es decir, 480 ml o 360 ml de Alutrin al 4% y
completar con agua destilada.

84
 PREPARACIÓN DEL PLASMA ADSORBIDO NORMAL (P.A.N).
Mezclar 3 partes de un pool de plasma normal y una parte de Hidróxido de
aluminio al 2%. Mezclar. Mantener en Baño de María a 37º C. Agitar en 3-4 ocasiones,
al cabo de 10 minutos, centrifugar a máxima revolución durante 5 minutos. Tomar el
sobrenadante y guardar en alícuotas de 0,5 ml en congelación (P.A.N).
Para considerar como adsorbido adecuadamente un plasma, este debe tener un
tiempo de protrombina de alrededor de 2 minutos (120 seg).

CUADRO INTERPRETATIVO DE LAS MEZCLAS DE CORRECCIÓN

DEL TIEMPO DE PROTROMBINA

CORRECCIÓN DEL PLASMA DE PRUEBA

CON UNA MEZCLA DE COMPONENTE DE
VOLUMEN IGUAL
_______________________________________________________________________
Causa del alargamiento del T. Plasma Suero Plasma
de Protombina Absorbido Envejecido Normal
_______________________________________________________________________
Deficiencia de Fibrinógeno Corrección No hay Corrección
Corrección
_______________________________________________________________________
Deficiencia de Protrombina No hay No hay Corrección
Corrección Corrección
_______________________________________________________________________
Deficiencia de Factor V Corrección No hay Corrección
Corrección
_______________________________________________________________________
Deficiencia de Factor VII No hay Corrección Corrección
Corrección
______________________________________________________________________
Deficiencia del factor X No hay Corrección Corrección
Corrección

_______________________________________________________________________
Presencia de Anticoagulante No hay No hay No hay
Corrección Corrección Corrección
_______________________________________________________________________

85
 CUADRO INTERPRETATIVO DE LAS MEZCLAS DE CORRECCIÓN
DEL TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL

_______________________________________________________________________
CAUSA DE UN TIEMPO PARCIAL MEZCLAS DE CORRECCIÓN
DE TROMBOPLASTINA ALARGADO PLASMA SUERO PLASMA
ADSORBIDO ENVEJECIDO NORMAL
_______________________________________________________________________
Deficiencia del Factor XII Corrección Corrección Corrección

_______________________________________________________________________
Deficiencia del Factor XI Corrección Corrección Corrección

_______________________________________________________________________
Deficiencia del Factor X No hay Corrección Corrección
Corrección
_______________________________________________________________________
Deficiencia de Factor IX No hay Corrección Corrección
Corrección
______________________________________________________________________
Deficiencia del factor VIII Corrección No Hay Corrección
Corrección
_______________________________________________________________________
Anticoagulante Circulante No hay No hay No hay
Corrección Corrección Corrección
_______________________________________________________________________

86
 DOSIFICACIÓN DE FIBRINÓGENO
MÉTODO ELLIS Y STRANSKY
FUNDAMENTO:
Se añade trombina al plasma diluido en una solución tampón. La variación de la
absorbancia de la solución plasmática se registra en un espectrofotómetro. El valor del
fibrinógeno se obtiene comparando los valores de la absorbancia con los de la curva de
calibración previamente determinada.

PROCEDIMIENTO:
1.- Se añaden 0,5 ml de plasma citratado cada uno de los tubos de ensayos del 20
ml que contienen 10 ml de un tampón de barbital, solución salina (0,1 M/L a pH: 7,2).
Mezclar.
2.- Se pipetean 6 ml de la solución anteriormente preparada (Paso No. 1) y se
transfieren al interior de las cubetas. A una de ellas se le añaden 2 gotas de solución;
calcio-trombina (volúmenes iguales de una solución básica de trombina preparada a una
concentración de 33.8 ó de NIH/ML en solución salina fisiológica (NaCL 0,145M) y
solución de cloruro cálcico 3,38M). Mezclar invirtiendo el tubo durante 15 seg.
3.- La otra muestra sin la solución de calcio-trombina se utiliza como blanco.
4.- Después de una incubación de 20 min se lee la absorbancia a 470nm en un
espectrofotómetro.
5.- Se construye una curva de calibración seleccionando al azar 6 muestras de
plasma a partir de las cuales se representa la absorbancia obtenida por el método de
Ellis-Stransky frente a la concentración de fibrinógeno determinada por el método de
Rotnoff-Menzie (1951) sobre papel gráfico lineal y se dibuja la línea ajustada. Las
futuras concentraciones de fibrinógeno pueden determinarse utilizando sólo el método
de Ellis-Stransky y por referencia a esta curva de calibración. Para cada nueva partida de
solución de calcio-trombina hay que preparar una nueva curva de calibración.

87
INTERPRETACIÓN:
Los valores normales por este método varían de 1,6 a 3,4 g/L o 160 a 340 mg/dl.
En los casos de afibrinogenemia congénita, hipofibrinogenemia y disfibrinogenemia se
observan valores bajos. Además, también puede observarse valores bajos en los casos de
coagulación intravascular diseminada (C.I.D). y fibrinolísis primaria y se obtienen
niveles elevados de fibrinógeno en el embarazo, estados post-operatorios, tumores y
muchos transtornos inflamatorios.
DOSIFICACIÓN DE FIBRINOGENO
MÉTODO CULLEN VAN SLIKE
PROCEDIMIENTO:
1.- En un pequeño frasco de precipitación colocar 1 ml de plasma a investigar.
Diluir con 15 ml de Agua destilada. Añadir 1 ml de calcio al 0,1 M (Cloruro de Calcio al
1,11%).
2.- Llevar a la estufa a 37º C hasta que se forme un coagulo sólido. Con ayuda de
los aplicadores recoger el coágulo y lavarlo 3 veces en agua destilada, disolver el
coágulo con 0,5 ml del Hidróxido de sodio, ayudándose con calor, puede proceder de 2
maneras, según las disponibilidades:
a.- Depositar la fibrina en un tubo de Folin de 25 ml y añadir el Hidróxido de Na
colocar en agua hirviendo.
b.- El coágulo de fibrina se introduce en un tubo de 12 x 75, se agrega 0,5 ml de
hidróxido de sodio y se lleva a una estufa entre 50-100º C.
3.- Una vez disuelto el coágulo se completa hasta la cantidad de 25ml con agua
destilada.
4.- Marcar 3 tubos de colorimetría con B, P y s.
B= Blanco: 5 ml de agua destilada.
0,5 ml de Reactivo de Fenol.
3 ml de Carbonato de Sodio al 15%.
P= Problema: 5 ml de Diluido de Fibrina.
0,5 ml de Reactivo Fenol.
3 ml de Carbonato de Sodio al 15%.
S= Standard 0,2 ml de solución a 0,2% de Tirosina.
5,8 ml de Agua Destilada.
88
 0,5 ml de Reactivo Fenol.
3,0 ml de Carbonato de Sodio al 15%.
Esperar 30 minutos. Leer P y S contra B en filtro verde (540nm).

Calculo:
Concentración de Standard x lectura del problema
Lectura del Standard

VALORES REFERENCIALES:
150 – 300 mg/dl.

METODOS DE ESTUDIO DE LOS PROCESOS FIBRINOLITICOS

TIEMPO DE TROMBINA SERIADO
TÉCNICA:
1.- Colocar 2 filas de 5 tubos en Baño de María a 37º C. Rotular control y
paciente.
2.- En la primera fila colocar 0,2 ml de plasma normal y en la segunda 0,2 ml de
plasma paciente.
3.- Añadir en el tiempo 0,20, 40, 60 y 120 minutos 0,1 ml de trombina. Medir y
registrar el tiempo de coagulación para cada tubo.
4.- La trombina debe estar concentrada de tal manera que 0,1 ml de trombina
debe coagular a 0,2 ml de plasma alrededor de 12” (segundos).
RESULTADOS:
En fibrinólisis o coagulación intravascular diseminada, el tiempo de coagulación
se alarga desde el primero hasta los restantes tubos. El control permanece igual o
ligeramente alargado.
La trombina deberá permanecer en hielo durante toda la experiencia.

89
 TIEMPO DE LISIS DE EUGLOBINAS
PRINCIPIO:
Se basa en precipitar en medio ácido las euglobinas del plasma donde se
encuentran el fibrinógeno, plasminógeno y activadores del plasminógeno, quedando en
solución la mayor parte de los inhibidores. El precipitado de euglobinas es disuelto, con
preferencia en medio alcalino y luego es coagulado. El tiempo de lísis de este coágulo es
inversamente proporcional a la actividad fibrinolítica plasmática. Un tiempo acortado
indica presencia de plasmina o aumento de activadores (u otras enzimas proteolíticas).
MATERIAL:
Plasma Citratado (I) 0,30 ml.
Agua Destilada (II) 4,2 ml.
HCL, 0,1N (III) 0,15 ml.
Tampon Imidazol pH 7.3 (IV) 0,39 ml.
Trombina (20 VI/ml) (V) 0,10 ml.
Plasma Citratado (I) 0,50 ml.
Agua Destilada (II) 8,00 ml.
Acido Acético 1% (III) 0,10 ml.
Solución de Borato (IV) 0,50 ml.
Cloruro de Calcio 0,025M (V) 0,50 ml.

CONSTITUCIÓN DE LA SOLUCIÓN BORATO

Cloruro de Sodio 9,00 g.
Borato de Sodio 1,00 g.
Agua Destilada C.S.P. 1.000 ml
PH: 9,0
ó
Plasma Citratado (I) 0,50 ml.
Agua Destilada (II) 7,70 ml.
Ácido Acético 0,8% (III) 0,15 ml.
Tampón de Michadis pH 7,35 (IV) 0,50 ml.
(Disuelto 1/5 en agua destilada)
Trombina (20 VI/ml) (V) 0,10 ml.
90
 La indicación para usar unos u otros de los reactivos dependerá de la facilidad o
frecuencia de uso de los mismos, en cada laboratorio en particular.
TÉCNICA:
1.- Una vez obtenida la muestra debe mantenerse en baño de hielo hasta su
procesamiento. El mismo debe llevarse a cabo dentro de los 20 min. posteriores. La
sangre se centrífuga 10 min. a 3.000 rpm. La prueba debe realizar por duplicado.

2.- Se agrega el plasma (I) a un tubo de centrífuga que contiene el agua destilada
(II) y se lleva a pH ácido, agregando en cada tubo el ácido acético o el ácido clorhídrico
(III), en la cantidad y tal cual se indica en la sección de material ya desglosado.
3.- Los tubos se mezclan por inversión y se dejan 20 minutos en la heladera a
4º C para que se complete la precipitación de las euglobinas. Luego se centrífuga 5 min.
a 3.000 rpm.
4.- Se descarta el sobrenadante y se colocan los tubos invertidos sobre un papel
de filtro, durante 2 min, para que escurra todo el líquido.
5.- Se agrega a cada tubo tampón o solución de borato (IV) en cantidad similar al
volumen original del plasma y a 37º C y luego se mezcla con una varilla, hasta la
disolución total del precipitado. Se agrega el coagulante (trombina o cloruro de calcio
V), y se registra el tiempo al cual la mezcla se coagula. Los tubos se dejan a 37º C, se
inspeccionan cada 15 min. y se registran el tiempo de lisis total del coágulo.

RESULTADOS:
El coágulo debe permanecer formado más de 120 min.

LISIS DE LAS EUGLOBINAS ACORTADAS:

Significa fibrinólisis anormal, por aumento de activadores del plasminógeno y la
presencia de plasmina.

LISIS DE LAS EUGLOBINAS PROLONGADA:

91
 Mayor de 16-18 horas hace pensar en cuadros de hipofibrinolísis, por lo cual, en
casos de pacientes con antecedentes trombóticos, se deben estudiar los componentes de
este sistema pre y post éstasis venoso.
NOTA:
Una lísis anormalmente acortada puede ocurrir por hipofibrinogenemia. En este
caso puede agregarse a las euglobinas disueltas del paciente, fibrinógeno purificado o
solución de euglobina del control normal, siendo esta última de utilidad en la evaluación
de los tratamientos trombolíticos.

CAUSAS DE ERROR:
En esta técnica, las principales fuentes de error, es la contaminación de los
reactivos y la dificultad en la disolución del precipitado de las euglobinas. Esto puede
ocasionar la falta de formación del coágulo, que si no se tiene la suficiente vigilancia, se
puede confundir con una lísis anormal. Por lo tanto, es muy importante cerciorarse
siempre que el coágulo se ha formado, y después vigilar su desaparición.

PRUEBA DE ETANOL
METODO DE GODAL Y ABILGOARD
1.- Se requiere sangre citratada (1/9 v/v en citrato de sodio 0,1M) que se le ha
agregado 25 ul de Trasylol 5000 U/ml. Se obtiene plasma pobre en plaquetas por
centrífugación.
2.- Se colocan 500 ul de plasma en un tubo de vidrio y se incuba 3 min a 20 ° C.
Posteriormente se agregan 150 ul de etanol al 50%. El tubo se agita suavemente para
mezclar bien y se deja en reposo a 20º C 10 min, al cabo de los cuales se lee el resultado.
La lectura se debe realizar antes de las dos horas de extraída la muestra.
RESULTADOS:
La presencia de un gel indica el resultado positivo. Los resultados se leen y
reportan por cruces +++ gel, ++ fibras gruesas; + fibras finas.
Esta prueba es sensible a las variaciones del fibrinógeno. Descenso severos de
fibrinógeno pueden dar resultados negativos y su positividad aumenta cuando el
fibrinógeno es alto. También se positiviza si se añade al plasma una proteína anómala,
92
de peso molecular (60.000 D), que se encuentran en ciertas patologías y precipita con
etanol, en presencia de fibrinógeno.
Esta prueba es muy sensible a la presencia de complejos solubles,
correspondientes a los monómeros de fibrina (detecta hasta 8 mg%). En cambio, en el
caso de complejos formados con productos tempranos de la lísis de fibrina, el umbral de
detección es de 200 mg%.

METODO DE BREEN Y TULLIS:

Esta técnica fue publicada en 1968 y modificada en 1969. Esta basada en la
descrita en el manual de la clínica Mayo (USA), que introduce la variante de la
observación del tubo a temperatura ambiente y a 37º C y de la anticoagulación de la
muestra de sangre con citrato de sodio 0,1 M adicionado con Trasylol.
La extracción de la muestra de sangre se realiza en la misma forma que se
describió en el caso de método de Godal. Los autores modificaron la ejecución de la
prueba en la siguiente forma:
1.- Se colocan en un tubo de vidrio 500 ul de plasma pobre en plaquetas.
2.- Se añaden 220 ul de etanol al 50% y se mezclan con suavidad.
3.- La mezcla se deja 10 minutos a temperatura ambiente, se lee y si es positiva,
se coloca 10 min. en Baño de maría a 37º C y se vuelve a leer.
RESULTADOS:
Lo mismo que en el método anterior, el resultado se expresa por cruces. Con
cierta frecuencia sucede que la positividad observada en la lectura a temperatura
ambiente desaparece cuando se coloca el tubo a 37º C, durante 10 min. Esta diferencia
se debe en parte, a altos niveles de fibrinógeno, que afectan la prueba. Por lo tanto, para
interpretar los resultados se debe tener en cuenta el nivel de fibrinógeno. Considerando
lo expuesto, se resta valor a la prueba positiva que se negativiza a 37º C.

PRUEBA DEL SULFATO DE PROTAMINA

MÉTODO DE GUREWICH Y HUTCHINSON
MATERIAL:
Citrato de sodio 0,1 M; trasylol 5000 U/ml, tampón tris 0,05 M, pH 6.5 (tris
hidroximetilaminometanol 6,057 g para 1000 ml de agua destilada). Ajustar pH con
93
HCL 1N; sulfato de protamina (SP). Lilly al 1% en tampón tris, a partir de la cual se
preparan diluciones 1/4 ,1/10; 1/20 y 1/40, con el mismo tampón.
MÉTODO:
Se recoge una muestra de sangre en citrato de sodio 0,1 M, en una relación 1/9
V/V. Se añaden 62 ul de aprotinina (5.000 U/ml) cada 10 ml de sangre. Se centrífuga
para obtener plasma pobre en plaquetas.

2.- Se colocan en tubos de vidrio 200 ul de cada una de las diluciones de SP y se

añaden igual volumen del plasma en estudio.
3.- Después de agitar con suavidad, se dejan los tubos a temperatura ambiente,
manteniéndolos tapados. Se observan a los 30 min., 2 horas y 24 horas, usando una luz
directa y fondo negro. La prueba debe efectuarse dentro de las dos horas siguientes a la
extracción de la muestra.

RESULTADOS:
La aparición del precipitado formado se informa o reporta como sigue: g =
aparición de un gel; fs = fibras; fy = precipitado plumoso. Si el precipitado es granuloso,
o no hay precipitado, la prueba es negativa.
Esta prueba es más sensible que la prueba de Etanol, ya que se positiviza , en
presencia de solo 2 mg% de monómeros de fibrina o de productos de la degradación del
fibrinógeno o fibrina (P.D.F) y es más específica porque es influenciable por las altas
concentraciones o de proteínas anómalas.

94
 UNIDAD IV

ANOMALIAS SANGUÍNEAS Y PRUEBAS DE HEMÓLISIS

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1.- Identificar en un frotis sanguíneo coloreado las alteraciones morfológicas presentes
en el glóbulo rojo de un paciente con Anemia Nutricional: Ferropénica o
Megaloblástica.
2.- Identificar en un frotis sanguíneo coloreado las alteraciones morfológicas presentes
en el glóbulo rojo de pacientes con diversos tipos de Anemia Hemolítica tales como
Anemia Falciforme, Talasemia, Esferocitosis y Ovalocitosis.
3.- Identificar en un frotis sanguíneo coloreado las alteraciones morfológicas típicas de
las Leucemias Aguda y Crónicas Mieloides o Linfoides.
4.- Efectuar la determinación de urobilinógeno fecal tomando en cuenta las causas de
error y valores referenciales.
5.- Determinar el índice hemolítico realizando su interpretación clínica tomando como
base los resultados obtenidos en el laboratorio.
6.- Explicar el fundamento y utilidad clínica de la prueba de Fenómeno Falciforme.
7.- Efectuar el fenómeno falciforme según el método rápido.
8.- Efectuar la determinación de Hb. fetal tomando en cuenta su fundamento, utilidad
clínica y causas de error.
9.- Explicar el fundamento y utilidad clínica de la electroforésis de Hb.
10.- Efectuar de manera eficiente el test de Ham interpretando los resultados
correctamente.
11.- Efectuar el test de sucrosa tomando en cuenta su fundamento, utilidad clínica y
causas de error más frecuentes.
12.- Explicar el fundamento y utilidad clínica de la prueba de fragilidad osmótica de
manera eficiente interpretando los resultados obtenidos.

95
“UROBILINOGENO FECAL E ÍNDICE HEMOLÍTICO”

FUNDAMENTO:
El sulfato ferroso en solución alcalina, reduce la urobilina presente en la muestra
de heces a urobilinógeno, el cual al reaccionar con el Reactivo de Erlich, desarrolla un
color rosado que se compara con un patrón natural o artificial (fenoftaleína), cuya
intensidad es directamente proporcional a la concentración de urobilinógeno fecal
presente en la muestra que se lee a 540nm.

FACTORES DE ERROR:
Ciertos productos de la digestión como el Indol y el Escatol pueden reaccionar
con el Reactivo de Erlich, originando color rosado que se puede cuantificar como
Urobilinógeno por ello se agrega Acetato de Na para que esta interferencia desaparezca.
- Debe evitarse la luz y el oxígeno debido a que las mismas oxidan el
urobilinógeno a urobilina el cual no es capaz de desarrollar color al
reaccionar con el reactivo de Erlich.
1.- A 1,5g de heces se añaden 10ml de agua destilada y se emulsiona utilizando perlas o
varillas de vidrio o madera. Luego agregar 10ml de sulfato ferroso al 20% preparado
recientemente, agregar 10ml de Hidróxido de Sodio 2,5N. Tapar la fiola y dejarla en la
oscuridad, por lo menos 2 horas. Luego filtrar con papel Whatman No. 2.
2.- Rotular 2 tubos de colorimetría.
B (Blanco)
P (Problema)
Tubo B: 2 ml de filtrado + 2ml de HCL 6N + 6ml de Acetato de Na saturado.
Tubo P: 2 ml del filtrado + 2ml del reactivo de Erlich. Esperar 10 minutos. Añadir 6ml
de Acetato de Sodio Saturado.
Tubo Estándar: lleva 5ml de un patrón de color preparado cada vez que se vaya a
realizar la prueba de la siguiente manera:
1ml de Fenoftaleína al 0,05%
5ml de Carbonato de Sodio al 15%
Completar hasta 100ml con agua destilada.

96
 Se realizan las lecturas del problema, blanco y estándar calibrando el aparato, es
decir; llevándolo a 0 con un blanco de Agua destilada en un fotocolorímetro de Klett con
filtro verde o a 540nm en un espectrofotómetro.

CALCULO:
U. fecal mg/100g de heces = Lectura de P-Lectura de B. Vf. 3,87
Lectura del Stándard
Vf = Volumen final del problema (10ml).
3,87 = cantidad en gr. de heces, cuando se toman 2ml del filtrado procedente de la
emulsión de 1,5gr. en 30 ml de solución final.
CALCULO:
30ml ______________ 1,5g.
2ml ______________ X 100g de heces = 1000
X = 0,1g ___________
0,1
0,00387 = representa la cantidad de urobilinógeno que se asemeja al color
desarrollado por el patrón artificial de Fenoftaleína.
0,00387 x 1.000 = 3,87

VALORES REFERENCIALES:
13,62 – 84,46 mg/100g de heces

INDICE HEMOLÍTICO:
Parámetro que representa la cantidad de Urobilinógeno contenido en 100g de
heces dependiente de 100g de Hemoglobina. Se calcula de la siguiente manera:
Indice Hemolítico = Urobilinógeno mg/ 100g heces x 100
Masa hemoglobínica total (grs)

Masa de Hb total: Volumen sanguíneo x Hb (gr de Hb/100ml)

100

97
Cálculo del volumen sanguíneo:
Peso en Kgs x 70 (adulto)
Peso en Kgs x 80 (niños)

VALORES REFERENCIALES:
2,68 – 14,64 mg/100g de heces/100g de Hb.

REACTIVOS
1.- Hidróxido de Sodio 2,5 N (10%)
2.- Carbonato de Sodio 15%
3.- Sulfato Ferroso. Para cada prueba pesar 2 gr de SO4 Fe 7H2O y completar
hasta 10 ml con agua destilada.
4.- Ácido Clorhídrico 6N se diluyen 6 volúmenes de HCL concentrado, en 4
vols. de agua destilada.
5.- Reactivo de Erlich: p-dimetil-amino bensal 0,7gr.
Ácido Clorhídrico concentrado 150ml
Agua 100ml
6.- Estándar de Fenolftaleina al 0,5%
Solución stock: Fenolftaleína 50mgs
Etanol c.s..p. 100ml
Saturar en medio ambiente. Filtrar.

UTILIDAD CLÍNICA Y LIMITACIONES DE AMBAS PRUEBAS

Las variaciones normales del urobilinógeno fecal en muchas ocasiones dependen
de la motilidad y de la acción bacteriana. La hipermotilidad y la diarrea reducen el
tiempo de la fermentación bacteriana y por consiguiente también de la cantidad de
urobilinógeno.
La constipación (estreñimiento) influye provocando valores elevados. Los
procesos hepáticos o cirrosis provoca que la bilirrubina y los pigmentos biliares no sean
metabolizados con suficiente rapidez lo que provoca una disminución de los niveles de
urobilinógeno. Así mismo, los antibióticos de amplio espectro pueden barrer con la flora

98
intestinal que contribuye a la formación de los pigmentos biliares entre ellos el
urobilinógeno disminuyendo sus niveles mientras esta flora se recupere y cese la
ingestión de antibióticos. Si no existe sospecha de ninguna de estas circunstancias antes
mencionadas, el urobilinógeno se convierte en un parámetro importante para medir la
cantidad de hemólisis que se experimentan con niveles elevados de Urobilinógeno fecal
en las personas con anemia hemolítica, aún cuando en otro tipo de anemia como la
Anemia Megaloblástica que cursa con Eritropoyésis Inefectiva también se observan
niveles elevados de urobilinógeno.
El índice hemolítico, se perfila como un parámetro mucho más exacto para la
investigación de las anemias hemolíticas, debido a que relaciona el urobilinógeno con la
masa de hemoglobina total circulante, refiriéndose los valores en 100grs. de
hemoglobina, de manera que el índice expresaría la cantidad de urobilinógeno
dependiente de la destrucción de 100grs de hemoglobina. De manera, que en un paciente
con Anemia Hemolítica Severa, con una masa de hemoglobina disminuída, pudiera
obtenerse valores de Urobilinógeno dentro de los límites máximos normales o
ligeramente aumentados, mientras que el índice hemolítico estaría considerablemente
elevado.

FENÓMENO FALCIFORME:
Existen dos técnicas o métodos para su realización.
1.- Método rápido.
2.- Método lento.

FUNDAMENTO GENERAL:
El agotamiento de oxígeno provocado por el consumo (método lento) o por la
reducción (método rápido) generan cambios en la orientación de las moléculas de Hb. S,
los mismos se expresan mediante la alteración morfológica que provoca que el glóbulo
rojo adopte la forma de media luna o navícula (sickle cell).

99
PROCEDIMIENTO:
1.- Método Rápido:
1.- En un portaobjeto corriente limpio, colocar una gota de sangre obtenida del
pulpejo del dedo o proveniente de sangre tomada con heparina preferiblemente.
2.- Añadir 1 gota de Bisulfito de Na al 2% recién preparado (sin mezclar).
3.- Cubrir el preparado con un cubreobjeto.
4.- Observar en el microscopio con el objetivo de máximo aumento en seco, a los
10 minutos. Si a los 60 minutos cuando se vuelva a observar el preparado no se observan
cambios se dá por terminada la prueba.

2.- Método Lento:

A un frotis de reticulocitos preparado en forma rutinaria, se le cubre los bordes
(de la laminilla cubreobjeto) con parafina sólida fundida con ayuda de un aplicador. El
preparado se observa al día siguiente si no se observan cambios, volver a observar a las
48 horas y de nuevo a las 72 horas y reportar.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN CLÍNICA

En casos de pacientes normales, los glóbulos rojos bajo estas condiciones
adoptan la forma clásica esferoidal, si la muestra de sangre es muy concentrada se
aprecia la formación de pilas de moneda (Rouleaux).
Cuando la muestra tratada corresponde a una persona que presenta el gen
Falciforme, los eritrocitos adoptan una forma alargada con extremos puntiagudos únicos
o bifurcados.
La interpretación clínica de la presencia del fenómeno falciforme en una muestra,
es que en la misma se encuentra presente el gen falciforme lo cual puede interpretarse
como que el paciente presenta:
a.- Anemia Falciforme: donde la prueba de fenómeno falciforme se observa
precozmente y la mayoría de los glóbulos rojos se observan en forma de media luna o
cambur.
b.- Enfermedad heterocigota: (Combinación de SC, Talasemia con Hb S, etc.)
donde las células falciformes son escasas.

100
 c.- Tara falciforme: (A/S) donde el número de células falciformes observadas es
menor que aquel observado en paciente con Anemia Falciforme.

REACTIVO:
BISULFITO DE SODIO AL 2%
Bisulfito de sodio 100mg.
Agua destilada: 5ml
Agitar vigorosamente, preparar al momento de realizar la prueba.

DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA FETAL

MÉTODO DE SINGER:
FUNDAMENTO:
La hemoglobina fetal (ά 2, γ 2), es resistente a la precipitación cuando es tratada
con álcalis. Las otras hemoglobinas normales: A1, A2, y otras anormales Hb S, C, D, E,
etc., son susceptibles a esta acción precipitando en presencia de álcalis. La Hb fetal
presente en el filtrado tiene una máxima absorción a 540nm.

PROCEDIMIENTO:
1.- En un tubo de cultivo colocar 3,2ml de hidróxido de potasio 12N.
2.- Añadir 0,2ml de una solución de hemolisado al 10% (concentrado de Hb).
Esta solución se llama A se mezcla por inversión 10-20 veces.
Desde el momento en que se añade la solución de hemolisado al 10%, se tiene
que poner a funcionar el cronómetro y al minuto exacto, detener la desnaturalización
agregando 6,8ml de sulfato de Amonio al 50% de saturación. Mezclar 5-6 veces
invirtiendo el tubo vigorosamente.
3.- A los 5 minutos filtrar esta solución con un papel de filtro # 2 y esta será la
solución B.
4.- Preparar el blanco de la solución B con 1,6ml de Hidróxido de Potasio 12N
más 3.4ml de sulfato de amonio al 50% de saturación. Así mismo preparar la solución C
con 5ml de agua destilada más 0,02cc del hemolisado al 10% y su solución blanco C
llevará solo 4ml de agua destilada.
101
 5.- Leer a 540nm o filtro verde usando como calibrador del aparato agua
destilada y antes de leer la solución B y la solución C calibrar antes con los blancos
respectivos para cada reacción (blanco de B y blanco de C).

CALCULO:
Hemoglobina fetal (%) = ¼ lectura de B x 100
Lectura de C.
La solución B se encuentra 4 veces más concentrada (1/50) con respecto a la
solución C (1/200).

VALORES REFERENCIALES
Hasta 2% en adultos.

UTILIDAD CLÍNICA:
La hemoglobina fetal constituye del 45 al 90% de la Hb total presente en el
recién nacido. Normalmente persiste un 15% al año de nacido y 5% a los dos años de
edad. Después de los 30 meses las concentraciones son semejantes a las del adulto
normal (hasta el 2%).
La concentración de la Hb. fetal varía y representa un índice de madurez fetal. A
medida que el feto madura la concentración de Hb. fetal disminuye. En los pacientes con
Talasemia mayor los valores Hb fetal se sitúan en 40-100%, en la talasemia menor los
valores de Hb. fetal a menudo no son altos, predomina en cambio el aumento de la Hb
A2.
La Hemoglobina fetal también se ha conseguido aumentada en una condición
hereditaria conocida como Persistencia del gen de la Hb. fetal donde alcanza valores de
26% o más. Generalmente la condición es asintomática, sin anemia y por lo general un
hallazgo fortuito.

102
PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE HEMOLISADO
Se debe utilizar muestras sanguíneas obtenidas con anticoagulante de preferencia
que sea heparina o de sangre desfibrinada.
Los glóbulos rojos se lavan tres veces con S.S.F. a la máxima centrifugación o a
3.000 rpm durante 5 minutos y una última lavada durante 10 minutos.
Añadir la mitad del volumen del empaquetado globular de Agua Destilada, agitar
enérgicamente durante 5 minutos. Llevar la muestra al congelador durante 30 a 60
minutos (hasta completar congelación).
Descongelar al cabo de dicho tiempo en Baño de María a 37º C. Añadir un
volumen igual de cloroformo y agitar durante 5 minutos. Centrifugar a 3.000 rpm. o a
máxima revolución durante 15 minutos. Decantar el sobrenadante donde se encuentra el
hemolisado. Por debajo de esta capa de hemolisado se debe situar bien definida y de
color rojo claro el estroma, y en el fondo el cloroformo utilizado para la extracción.
Cuando en la solución de hemolisado obtenida se note algún grumo se aconseja
centrifugarlo de nuevo. Finalmente se determina la concentración de Hb. del
hemolisado, y se ajusta al 10% si es necesario según tabla confeccionada para tal fin.
Para ser utilizado debe tener menos de 40 horas.

REACTIVOS:
1.- Hidroxido de Potasio 12N: A 1 volumen de hidróxido de Potasio N/A (50ml)
añadir 2 volúmenes de agua destilada (100ml). Esta solución es estable a medio
ambiente.
2.- Sulfato de Amonio al 50% de Saturación: tomar 50ml de Sulfato de Amonio
saturado y 50ml de agua destilada, colocar 0,25ml de ácido Clorhídrico concentrado.
Esta solución dura indefinidamente en medio ambiente.

103
 TABLA DE PREPARACIÓN DEL HEMOLISADO AL 10%
HEMOGLOBINA DEL CANTIDAD DEL AGUA
HEMOLISADO HEMOLISADO DESTILADA
11.0gr 0.91ml 0.09ml
11.5gr 0.87ml 0.13ml
12.0gr 0.83ml 0.17ml
12.5gr 0,80ml 0,20ml
13.0gr 0.77ml 0.23ml
13.5gr 0.74ml 0.26ml
14.0gr 0.71ml 0.29ml
14.5gr 0.68ml 0.32ml
15.0gr 0.66ml 0.34ml
15.5gr 0.64ml 0.36ml
16.0gr 0.62ml 0.38ml
16.5gr 0.60ml 0.40ml
17.0gr 0.58ml 0.42ml
17.5gr 0.56ml 0.44ml
18.0gr 0.55ml 0.45ml
18.5gr 0.54ml 0.46ml
19.0gr 0.52ml 0.48ml
19.5gr 0.51ml 0.49ml
20.0gr 0.50ml 0.50ml
20.5gr 0.40ml 0.51ml
21.0gr 0.48ml 0.52ml
21.5gr 0.47ml 0.53ml
22.0gr 0.46ml 0.54ml
22.5gr 0.45ml 0.55ml
23.0gr 0.44ml 0.56ml
23.5gr 0.43ml 0.57ml
24.0gr 0.42ml 0.58ml
24.5gr 0.41ml 0.59ml
25.0gr 0.40ml 0.60ml

104
 ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA

FUNDAMENTO:
Cuando una proteína (en este caso la Hb) es colocada en un campo
eléctrico a ph alcalino, tiende a migrar del polo negativo al positivo, puesto que se
bloquean las cargas positivas, por ello las hemoglobinas con mayor carga negativa
tenderán a migrar en forma más amplia.
Tomando en cuenta lo antes expuesto la Hb. A normal migrará hasta un
punto determinado (comparándose con un patrón normal), la Hb S migrará por detrás de
la Hb A, el cambio de un aminoácido de carga negatoiva (Ac glutámico) por un
aminoácido neutro (valina) como ocurre con la Hb. S le hará perder una carga negativa,
lo que explica la menor migración de este tipo de Hb.
La Hb Fetal migrará evidenciándose detrás de la Hb A, y antes de la Hb.
S; por detrás de la Hb. S migrarán en orden de Hb C y la E y muy cerca del punto de
sembrado del hemolisado la Hb A2. La Hb D suele migrar a la misma distancia de la Hb.
S, cuando se utiliza un buffer alcalino por lo cual para obtener una mejor separación se
debe utilizar un buffer ácido.
Existen diversos tipos de electroforésis de Hb. tales como:
- Electroforésis de papel.
- Electroforésis de gel de agarosa.
- Electroforésis en acetato de celulosa.
- Electroforésis en gel de poliacrilamida.

105
 PRUEBA DEL SUERO ÁCIDO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA
HEMOGLOBINA PAROXÍSTICA NOCTURNA TEST DE HAM

FUNDAMENTO:
En la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN), los eritrocitos son sensibles a
la lisis por el complemento, el cual se activa por la vía alterna y se une a ellos en el
suero acidificado. Los individuos con HPN tienen una población de eritrocitos
inusualmente sensibles a la lisis por complemento en medio acidificado, a diferencia de
los eritrocitos normales.
Cuando una prueba de hemólisis de la sucrosa o sacarosa da un resultado
positivo, se recurre a la prueba de HAM para confirmar el diagnóstico de la
hemoglobunuria paroxística nocturna (HPN).

PROCEDIMIENTO:
1.- Tomar sangre sin anticoagulante del paciente y de un control normal ABO
compatible, y preparar suspensiones al 50% en solución salina fisiológica.
2.- Utilizar suero fresco no hemolisado (o bien guardado a –70º C o – 20° C)
obtenido de una paciente y de un control normal ABO compatible.

3.- Preparar suero normal inactivado al calor sometiéndolo a una temperatura de

56º C durante 30 min. a 1 hora.
4.- HCL 0,2N.
5.- NH4 OH 0,21M.

TECNICA:
Preparar 5 tubos. Añadir 0,5 ml de suero normal a los 2 tubos indicados en el
esquema más adelante explicado, a continuación añadir los otros sueros y ácido según se
indica, mezclar. Después de añadir las suspensiones de eritrocitos de los tubos, mezclar
e incubar en Baño de María a 37º C. Después de 30 minutos, centrífugar y comprobar si
hay señales de lisis en el líquido sobrenadante.

106
_______________________________________________________________________
TEST DE HAM
_______________________________________________________________________
ESQUEMA DEL PROCEDIMIENTO
_______________________________________________________________________
NO. TUBO 1 2 3 4 5
_______________________________________________________________________
Suero Normal 0,5
Fresco (ml) 0,5
______________________________________________________________________
Suero del paciente 0,5
(ml) 0,5

_______________________________________________________________________
Suero Normal (ml)
Inactivado a 56º C 30 min 0,5
_______________________________________________________________________
HCL 0,2 N (ml) 0,05 0,05 0,05

_______________________________________________________________________
Susp. 50% Eritrocitos
Del paciente (ml) 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
_______________________________________________________________________
Interpretación de (-) Indicios a
resultados (-) a (+ a (+++) (++++)
Indicios (++++)

_______________________________________________________________________

INTERPRETACIÓN Y RESULTADOS
La lísis de las células de la H.P.N. se produce con suero acidificado normal y del
paciente (muchas veces en menor grado). Si también se observa lísis con el suero normal
acidificado e inactivado por el calor, la prueba no es positiva, puesto que se sabe que las
células marcadamente esferocíticas pueden reaccionar de esta forma.
Una prueba positiva del suero acidificado define la presencia de la H.P.N., tanto
en la HPN típica como en la anemia aplásica. Por otra parte, también se ha observado
una prueba positiva de suero acidificado (HAM) en una alteración poco frecuente,
anemia diseritropoyética congénita de tipo II (ADC de tipo II) o HEMPAS. Sin
embargo, en la ADC de tipo II, nunca se produce la lísis con el propio suero del paciente
y sólo con un 30% de suero normal. Además, la prueba de Sucrosa es negativa en la

107
ADC tipo II; se cree que la hemólisis se debe a la presencia de un anticuerpo en algunos
sueros normales que reacciona con un antígeno raro.

TEST DE SUCROSA (SACAROSA)

FUNDAMENTO:
Tanto en las pruebas selectivas como en las de confirmación, la sucrosa o
sacarosa isotónica proporciona un medio de bajo contenido iónico que promueve la
unión de los componentes del complemento a los eritrocitos. En la Hemoglobinuria
Paroxística Nocturna (H.P.N), una proporción de los eritrocitos es anormalmente
sensible a la lísis mediada por el complemento, el cual es activado hasta el final de la
cascada de activación con la consecuente lísis de los eritrocitos anormales.

PRUEBA SELECTIVA DE LA SANGRE TOTAL

MATERIAL:
ESPECIMEN: Sangre completa del paciente recogida en citrato de Na 3.8%,
Oxalato de K como anticoagulantes.
REACTIVOS: Sucrosa al 10% disolver 10g de sucrosa en agua destilada hasta
un volumen final de 100ml. Este reactivo se prepara diariamente, o en el momento de su
realización.

TÉCNICA:
1.- Añadir una parte de sangre a 9 partes de solución azucarada o de sucrosa.
Mezclar enseguida e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
2.- Centrífugar por 5 min. a máxima revolución y observar la hemólisis en el
líquido sobrenadante.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:
La ausencia de hemólisis constituye una prueba negativa para H.P.N. Su
presencia (hemólisis en el sobrenadante) significa que hay que realizar la prueba
confirmatoria de hemólisis de la sucrosa. Una muestra de sangre control normal debe dar
un resultado negativo.
108
CAUSAS DE ERROR: FALSOS POSITIVOS:
1.- Si se utiliza sangre desfibrinada; 2) en los casos de pacientes anémicos sin
HPN, ó 3) si el agua azucarada (solución de sacarosa) no ha sido recién preparado.

FALSOS NEGATIVOS:
Si se utiliza heparina o EDTA como anticoagulantes. Excesiva centrifugación,
reactivo de Coombs contaminado o inactivado.

PRUEBA CONFIRMATORIA DE SUCROSA

MATERIAL: ESPÉCIMEN:
Lavar los eritrocitos procedentes del paciente y de una persona normal, 2 a 3
veces con suero fisiológico centrifugando a máxima revolución por 5 minutos cada vez
descartando el sobrenadante en la última lavada, y preparar suspensiones al 50% en
solución de Na Cl 0,15M (paciente y control normal).
Utilizar suero fresco compatible de tipo ABO procedente de un individuo
normal. El suero almacenado a –70º C o a temperatura inferiores es satisfactorio por lo
menos durante 1 año.

REACTIVOS:
1.- Solución isotónica de sucrosa: disolver 92.4g de sucrosa en 91ml de
NaH2PO4 50m M y 9 ml de de NaH2PO4 50m M y ajustar el pH a 6.1 con HCL ó
NaOH. Añadir agua destilada hasta completar un volumen de 100ml. Esta
solución puede conservarse durante 2 semanas a 4º C ó se puede usar la solución
azucarada preparada como se explica en el Test de Sucrosa selectivo.
2.- Hidróxido amónico (NH4 OH) 0,01M.

TÉCNICA:
1.- Preparar 2 tubos añadiendo 0,05ml de suero a 0,85ml de solución de sucrosa y
mezclar. Añadir 0,1ml de la suspensión de eritrocitos del paciente a uno de los tubos y
0,1ml de la suspensión de eritrocitos normales al otro, mezclando rápidamente.
2.- Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 30min. Centrífugar a
máxima revolución por 5min. Si existe hemólisis en el sobrenadante, determinar el
109
porcentaje. Utilizar como blanco la mezcla de suero y sacarosa y cómo estándar 0,1ml
de suspensión de los eritrocitos del paciente más 0,9ml de NH4 OH 0,01M o agua
destilada. Leer a 540nm.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:
Una hemólisis del 5% o menos es un resultado negativo. Cierto número de
hemopatías pueden provocar este grado de hemólisis. Un resultado de 5 a 10% se
considera dudoso y uno superior al 10% es positivo y virtualmente diagnóstico de
H.P.N.

CAUSAS DE ERROR:
Falsos Positivos: 1) Raramente, en casos de hemólisis autoinmune o anemia
megaloblástica, 2) Si se guarda la solución de sacarosa (sucrosa) durante largo período
antes de utilizarlo. Falsos Negativos: Suero sin actividad de complemento, por haber
sido almacenado inadecuadamente.

PRUEBA DE FRAGILIDAD OSMÓTICA ERITROCITARIA

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS DE LA PRUEBA

Los hematíes suspendidos en una solución hipotónica de cloruro de sodio

absorben agua, se hinchan y, después de alcanzar el volumen crítico, adquieren una
forma esférica y finalmente estallan. Las células de forma esférica o esferocitos que se
encuentran en gran proporción en la Anemia esferocítica congénita, son más pequeñas
que los glóbulos rojos normales por lo cual tienen un volumen muy pequeño y una
capacidad de expansión limitada. Por todo esto, el esferocito estalla al absorber
pequeñas cantidades de agua a concentraciones relativamente altas de sal. De allí que su
fragilidad osmótica está aumentada y su resistencia osmótica disminuída. Lo contrario
sucede con las células delgadas o aplanadas de la anemia ferropénica, talasemia, anemia
falciforme, que absorben cantidades considerables de agua y alcanzan el volumen crítico
110
a concentraciones bajas de cloruro sódico para destruirse ya que poseen una fragilidad
osmótica disminuída y una resistencia osmótica aumentada.
La fragilidad osmótica de los hematíes está aumentada si hay hemólisis a
concentraciones mayores de 0.5% de cloruro sódico. Por otro lado la fragilidad osmótica
está disminuída y una resistencia osmótica aumentada.

PRUEBA CUANTITATIVA SIN INCUBAR

REACTIVOS

1.- SOLUCIÓN DE DEPOSITO DE CLORURO SODICO:

Se prepara una solución de cloruro sódico al 1% disolviendo 1g de cloruro sódico
químicamente puro en 100ml de agua destilada.

2.- SOLUCIONES DILUIDAS:

Se preparan a partir de la solución madre de CLNa al 1% de la siguiente manera:
% CLNa(ml) H2O dest. (ml)
0,10 10 90
0,20 20 80
0,25 25 75
0,30 30 70
0,35 35 65
0,40 40 60
0,45 45 55
0,50 50 50
0,55 55 45
0,60 60 40
0,65 65 35
0,70 70 30
0,75 75 25
0,80 80 20
0,85 85 15
0,90 90 10
111
 Estas soluciones se conservan bien durante semanas a 4°C.

TÉCNICA:
1.- Se colocan tubos para el control y tubos para el paciente en una gradilla;
tantos como soluciones de ClNa se hayan preparado. Se incluye un tubo de 0,0 % de
ClNa que llevaría 5 ml de agua destilada y 0,02 ml de sangre, este tubo representaría el
100 % de hemólisis.
Estos tubos deben estar químicamente limpios y secos.
2.- Pipetas serológicas de 5 ml.
3.- Pipetas calibradas para dispensar 0,02ml, las pipetas de Shali se recomiendan
para trasvasar la sangre.
4.- Se prefiere que la sangre sea heparinizada tanto la del control como la del
paciente.
5.- Se añaden 5ml de c/u de las diluciones de cloruro sódico a los tubos de
ensayo de cada fila (la fila del control y la fila del paciente) empezando desde el de
mayor concentración de ClNa a la solución de CLNa de menor concentración.
6.- Se añaden con la pipeta de Shali 0,02 ml de sangre del paciente a cada tubo de
la primera fila, y la misma cantidad de la sangre normal del control a la segunda fila:
después de cada traslado de sangre deberán limpiarse bien la pipeta con solución salina,
soplándolas con fuerza.
7.- Inmediatamente se mezcla bien por inversión el contenido de los tubos que se
dejan reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente, se vuelven a mezclar y se
centrífugan a 4.000 r.p.m. durante 5min.
8.- En un fotocolorímetro o espectrofotómetro a 540nm provisto de un filtro
verde (540 nm ) se mide el grado de hemólisis en el sobrenadante de cada uno de los
tubos que contengan CLNa a una concentración específica y 0,02ml de la muestra de
sangre del control o del paciente, comparando con la hemólisis total del tubo con agua
destilada y sangre (sin solución salina) y empleado el sobrenadante de la preparación de
cloruro de sodio al 0,85% como blanco.

112
 9.- El porcentaje de la hemólisis en cada uno de los tubos se calcula de la
siguiente manera. Por ejemplo, si la lectura del tubo de 100% de hemólisis (0,0 % ClNa)
fuera 210 y la del tubo de 0,4% es 105 el % de hemólisis sería 50%.
100% hemólisis _________________ 210
X _________________ 105
X = 50%

10.- El porcentaje de hemólisis en cada tubo se ilustra gráficamente con la

concentración correspondiente de cloruro sódico; el % de hemólisis en el eje vertical (Y)
y en el horizontal (X) la concentración de CLNa correspondiente.
Cada laboratorio debe determinar sus propios valores normales sin embargo a
continuación se muestra los siguientes valores referenciales en sangre normal:

NaCL% HEMOLISIS %
0,3 97 – 100
0,4 50 – 90
0,45 5 – 45
0,5 0–5
0,55 0

INTERPRETACIÓN:
Aunque la fragilidad osmótica sea esencialmente una medida de la esferocitosis,
proporciona datos más objetivos que el examen de un extendido sanguíneo. La
diferencia de más de un tubo entre el paciente y el control es significativa.

CAUSAS DE ERROR:
1.- Es esencial la pureza química del cloruro sódico. Las impurezas mínimas
también actúan como agentes hemolíticos.
2.- Exactitud de la concentración de la solución preparada de cloruro sódico-
3.- Los volúmenes relativos de sangre y solución salina se recomienda una
dilución 1:100 o si se usa la pipeta de Shali una dilución de 251..
113
 4.- Un cambio de pH con 0,1 equivale a un cambio de tonicidad del 0,01%,
específicamente, una disminución de pH aumenta la fragilidad.
5.- La subida de la temperatura aumenta la fragilidad, una subida de 5º C
equivale a un cambio de la tonicidad de alrededor 0,01%. La temperatura ambiente debe
ser suficientemente constante.

PRUEBA CUANTITATIVA DESPUÉS DE INCUBACIÓN

PROCEDIMIENTO:
Dos volúmenes de 2ml de sangre estéril y heparinizada en tubos de ensayo
taponados se incuban a 37º C durante 24 horas. El segundo tubo servirá de reserva en
caso de contaminación. La prueba se prepara de manera parecida a la descrita para la
prueba de fragilidad osmótica cuantitativa sin incubar, pero con la adición de un tubo
que contenga una solución al 1,2% de CLNa que servirá de blanco en caso de que
aumente la hemólisis. La lectura y cálculos se realizan de igual manera a la descrita en la
prueba sin incubar y la gráfica se realiza como se indicó anteriormente.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:
Los valores normales de referencia para la prueba de FCM (fragilidad
corpuscular media que no es más que la concentración de cloruro sódico a la cual se
produce la lisis del 50% de eritrocitos), después de la incubación desde 0,465 a 0,590%
de CLNa. La incubación a 37º C durante 24 horas aumenta la fragilidad de los eritrocitos
normales. El aumento de la hemólisis es incluso más intenso para los eritrocitos de la
esferocitosis congénita, y la de anemia hemolítica puede iniciarse entre 0,7 y 0,65% de
CLNa y puede ser completa en casi 0,4%. La prueba permite el reconocimiento de la
esferocitosis hereditaria de bajo grado o leve en que la fragilidad osmótica no incubada
puede ser normal

INDICACIONES:
Sólo cuando se sospecha una esferocitosis hereditaria, por ejemplo, en una
anemia hemolítica inexplicable acompañada de esplenomegalia, está indicada la prueba
de la fragilidad osmótica incubada. Puesto que la prueba de la fragilidad osmótica no

114
incubada puede ser normal en la esferocitosis leve (hereditaria), una prueba incubada
anormal puede ser decisiva para establecer el diagnóstico.

CAUSAS DE ERROR:
Además de las causas mencionadas para la prueba no incubada, puede producirse
una contaminación bacteriana provocando el aumento del grado de hemólisis.

PROTEÍNAS DE BENCE JONES:

PRINCIPIO:
Se fundamenta en la capacidad que tiene la proteína de Bence Jones (globulina)
de precipitar en la orina acidificada calentada a 50º C, y su nueva disolución cuando se
hierve la orina a 100º C.

TECNICA:
1.- Muestra: orina fresca recién emitida de la mañana: se toma 10ml. de orina
fresca mezclada se centrifuga por 10 min. a máxima revolución; en su defecto filtrar la
orina.
2.- Pipetear en un tubo limpio y seco 5ml. de la orina centrifugada o filtrada, se
le agrega 1ml. de Acido acético al 50% y luego 2ml de cloruro de sodio saturado.
Mezclar.
3.- Calentar la preparación en mechero. Observar si la turbidez de la preparación
al comenzar a hervir desaparece la Proteína de Bence Jones es (+); si la turbidez al
calentarse no desaparece la prueba es negativa (-).

INTERPRETACIÓN CLÍNICA:
Prueba diagnóstica de: Mieloma Múltiple.

115
 “ CITOMETRÍA DE FLUJO “

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.- Explicar el fundamento de la citometría de flujo.
2.- Describir los principios y utilidad clínica de la citometría de flujo.
3.- Enunciar los tipos de muestras y condiciones requeridas para obtener óptimos
resultados.
4.- Interpretar los resultados obtenidos en una citometría de flujo.
5.- Explicar las ventajas y desventajas del uso de un citómetro de flujo.
6.- Determinar la importancia de una citometría de flujo.

DEFINICIÓN
La citometría de flujo resultó de la aplicación del conocimiento de técnicas y
ciencias que ya se habían desarrollado en forma independiente como la tecnología láser,
la producción de anticuerpos monoclonales, la histoquímica, la fluorocromoquímica y la
ciencia computacional.
La citometría de flujo es básicamente un microscopio sofisticado, con capacidad
de analizar rápidamente múltiples propiedades de células aisladas, suspendidas en un
medio líquido.

PRINCIPIOS BÁSICOS
El citómetro de flujo consta de cuatro subsistemas básicos:

1.- Sistema de fluidos: transporta las células desde el tubo conteniendo la

muestra, hasta la región de los sensores.
2.- Sistema óptico: genera y colecta impulsos luminosos, derivados de las
células. Los detectores ópticos son cinco: FSC (Forward Scatter), SSC (Side Scatter), y
tres detectores de fluorescencia, para diferentes fluorocromos.
3.- Sistemas electrónicos: amplifica y digitaliza las señales detectadas.

116
 4.- Base de datos: transforma los impulsos eléctricos en gráficas y números,
legibles y almacenados en un computador. Estos sistemas varían de un modelo de
citómetro a otro.
Las células que han sido previamente incubadas con anticuerpos monoclonales
específicos (Ej: CD4) marcadas con un fluorocromo determinado, son forzadas a pasar
por diferencias de presión, a una velocidad de varios miles por segundo, en una sola fila,
dentro de una corriente de solución salina (sheath), a través de un rayo de luz láser de
gran intensidad.
Cada célula emite señales luminosas fluorescentes (que van a variar de acuerdo
al fluorocromo que se encuentre unido al Ac. Monoclonal pegado a la célula), que al
pasar por el rayo luminoso dispersan (scatter ) la luz incidental. En otras palabras, las
células son “interrogadas” en forma individual, al atravesar el rayo luminoso
(usualmente Láser). Estas señales luminosas son amplificadas y convertidas en
impulsos eléctricos, que luego son digitados, procesados, almacenados, y demostrados
gráficamente por un computador.
Los citómetros de flujo modernos, miden simultáneamente varios parámetros de
cada célula, lo que permite un análisis independiente o correlacionado de la misma. Por
ejemplo, el FSC se utiliza para medir el tamaño celular. El detector SSC mide
complejidad o granularidad celular, lo que permite discriminar entre granulocitos (SSC
elevado) y monocitos (SSC menor), ya que ambos tipos de células tienen un tamaño
similar (igual FSC).
Para ser estudiada con la medida de la inmunofluorescencia, las células viables
en suspensión son marcadas con anticuerpos monoclonales, conteniendo
fluorocromógenos que se unen específicamente a los antígenos celulares.
Los detectores de fluorescencia para diferentes fluorocromos (fluoresceína,
ficoeritrina, etc.) captan las señales luminosas, que son clasificadas por el subsistema
electrónico. La escala de medición se convierte en una escala logarítmica, cuyo objetivo
es incrementar el rango y, en consecuencia, la discriminación entre poblaciones
celulares, en un gran número de aplicaciones.

117
 De esta forma se mide el porcentaje de células marcadas y la intensidad de la
fluorescencia de cada célula individual, lo que permite el estudio de la distribución de
los antígenos de superficie.
Simultáneamente se puede utilizar dos o más anticuerpos para marcar diferentes
antígenos de células individuales.

MATERIALES Y CONDICIONES REQUERIDAS:

TIPOS DE MUESTRAS:
_ Médula ósea.
_ Sangre periférica.
_ Líquidos biológicos (pleural, LCR, ascitis).
_ Tejidos sólidos (ganglios linfáticos, cilindro de médula ósea M0-M7 y
tricoleucemias).

ANTICOAGULACIÓN:
_ EDTA preserva la morfología, reduce la agregación plaquetaria.

ALMACENAMIENTO:
_ Ideal a temperatura ambiente (18 – 22°C), no mayor de 24 horas.

118
APLICACIONES CLÍNICAS: Las aplicaciones de la citometría de flujo son
múltiples. A continuación se resumen algunas de las más importantes:
ANÁLISIS DE PARTÍCULAS: Distribución por: tamaño, concentración, refracta-
riedad . Detección de infecciones. Diagnóstico
de: anemias, leucemias, etc.
SORTING: Riqueza celular
Producción de anticuerpos
Verificación de análisis
Estudios de toxicidad
Concentración celular

ONCOLOGÍA: Clasificación celular

Enumeración de clones
Tipificación de leucemias
Cuantificación de DNA

Análisis de ciclo celular

Enfermedad residual mínima
Estudio de apoptosis
Monitoreo de drogas
Transplante de médula ósea

BIOLOGÍA CELULAR: Contenido de RNA y DNA

Mutagénesis
Toxicidad celular
Contenido proteico
Estructura celular
Desórdenes genéticos
Transplante de órganos
119
120
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
VENTAJAS
Esto incluye la capacidad de medir múltiples parámetros simultáneamente, la
rapidez del análisis, la posibilidad de medir gran número de células y la precisión,
proveyendo al médico de datos más objetivos y cuantitativos.
La sensibilidad del citómetro de flujo permite la detección de rasgos celulares
distintos, difíciles de objetivar por otros métodos.
Una de las grandes ventajas es poder analizar muestras muy pequeñas,
conteniendo escaso número de células.
Finalmente, la capacidad de separar o escoger diferentes subpoblaciones de
células, permitiendo de ese modo, aislar aquéllas de interés particular.

DESVENTAJAS
Tal vez la desventaja más significativa es el requerimiento de que las células
deben estar en una suspensión de “células únicas”, para su análisis. Obviamente, hay
muchos tipos de tejido en los cuales no es posible obtener estas suspensiones, por su
background fibroso (ej.: piel); si bien se obtiene resultados, analizarlos es lo difícil.

Los análisis por citometría de flujo de tejidos y / o fluidos corporales, deben ser
interpretados siempre en correlación con una preparación histológica y / o citológica de
la muestra estudiada, a fin de confirmar que la población de interés está presente en la
suspensión celular.
Es una prueba costosa.

CONTROL DE CALIDAD EN HEMATOLOGÍA

El Control de calidad en Hematología debe hacerse extensivo a cualquiera de sus
aspectos clínicos y de laboratorio, ya que en la práctica resulta difícil considerarlos de
forma aislada. Por lo tanto, se debe asegurar el control de calidad de las técnicas
diagnósticas aplicando los mismos principios que las de cualquier otro procedimiento
analítico. De allí, que debe procurarse ante todo una correcta recolección de las muestras

121
sanguíneas (control pre-analítico), su adecuada manipulación y el empleo de los
métodos más fiables (control analítico). Ello obliga por tanto, al mantenimiento
periódico de los instrumentos analíticos y a una verificación sistemática de la calidad de
las técnicas y de sus correspondientes reactivos mediante la ayuda de especímenes de
control adecuados y de procedencia garantizada. Finalmente, el laboratorio debe también
velar por la claridad y corrección en la forma de expresar los resultados a objeto de
facilitar su interpretación clínica (control postanalítico).

En Hematología, al igual que en otras disciplinas se ha hecho del común empleo, el de

los autoanalizadores, estos han contribuido de manera decisiva no sólo a incrementar la
rapidez en la obtención de los análisis, sino fundamentalmente a mejorar la exactitud y
precisión de los resultados. Así mismo, la posibilidad de obtener de forma sistemática
los parámetros que anteriormente se realizaban de forma manual, lo cual hacía el
procedimiento engorroso y por tanto, aumentado el factor de error, o en su defecto en
algunos casos el suministro esporádico de dichos parámetros. Con los autoanalizadores,
hoy en día, se aporta un conjunto de parámetros tales como: Volumen Corpuscular
Medio (VCM), entre otros, de gran utilidad diagnóstica. Como contrapartida, tales
instrumentos precisan una atención técnica permanente, por cuanto un fallo en su
calibración o pequeñas variaciones intrínsecas del sistema pueden repercutir sobre un
número considerable de resultados.

Sin embargo, aquellos laboratorios con reducido volumen asistencial continúan

empleando los métodos convencionales o manuales donde el colorímetro, centrífuga y el
microscopio ocupan aún un lugar destacado. Este instrumental, aunque simple y
reducido precisa, al igual que los autoanalizadores, un control de calidad constante, por
lo cual, no debe confundirse en Hematología control de calidad con automatización.
CONCEPTOS BÁSICOS
Para la realización de un programa de control de calidad en el laboratorio clínico y en
cualquier área del mismo, esto presupone el conocimiento de una terminología básica sin
la cual resulta difícil interpretar el significado de los resultados obtenidos.

122
EXACTITUD: Es la aproximación de una medida a su valor real. Un método exacto
es, por tanto, aquel que suministra una medida correcta o real del parámetro analizado.

PRECISIÓN: Se define como la aproximación del valor de una medida a sí mismo,

cuando se realizan varias determinaciones de la misma empleando el mismo método.

ERROR: Es la desviación de una medida con respecto a los criterios de exactitud y

precisión.
El error puede ser de dos tipos: aleatorio o sistemático. El Error Aleatorio obedece a
causas difíciles de determinar, que casi siempre surgen de forma esporádica. Por el
contrario, el Error Sistemático suele obedecer a causas difíciles de identificar, por
cuanto, se repite siempre de la misma manera (deficiente calibración de los instrumentos
analíticos, errores sistemáticos en la preparación de los reactivos y otros).

ERRORES PREANALÍTICOS: Son aquellos que comienzan a operar desde el

momento de obtener la muestra, hasta el instante de iniciar el procedimiento de
laboratorio.

ERRORES ANALÍTICOS: Son aquellos involucrados en la determinación de

laboratorio propiamente dicha.

ERRORES POSTANALÍTICOS: Son de tipo administrativo que pueden invalidar el

informe final. Los errores más frecuentes a este nivel se producen por obtención de
muestra al paciente equivocado, rotulación errónea de tubos, boletas o petitorios de
exámenes, procedimiento de una muestra que no corresponde, errores en la
identificación del informe o reporte final.

FIABILIDAD: La capacidad para mantener la exactitud y precisión en el futuro.

MEDIA: Es el resultado promedio y se calcula a partir de todas las mediciones.

123
DESVIACIÓN ESTÁNDAR: Es la dispersión de un grupo de valores alrededor de la
media (DE).

DISPERSIÓN: Corresponde a la variabilidad de una medida alrededor de su valor

medio. La dispersión de una medida se determina mediante dos parámetros: media
aritmética (X) y desviación estándar (DE).

COEFICIENTE DE VARIACIÓN: Corresponde al valor de la desviación estándar

(DE) y expresada en tanto por ciento de la media.
CV (%) = DE x 100
___________

PATRÓN DE REFERENCIA: Es una sustancia cuyas características han sido

analizadas mediante procedimientos físicos, químicos y a la cual se le ha designado un
valor específico (Ej: estándar de Hb.). Los estándares de referencia internacionales están
fabricados por organizaciones internacionales: Ej: Organización Mundial de la Salud
(OMS), Consejo Internacional de Estandarización de Hematología (CIEH).

MUESTRA DE REFERENCIA: Es una sustancia estable elaborada de acuerdo con las

características de un patrón nacional e internacional, y que normalmente es utilizada
para controlar la exactitud de una determinada técnica rutinaria (Ej: plasma de
referencia).

CONTROL: Una muestra con características similares a las muestras problemas que se
emplean para verificar la precisión o reproducibilidad de un método o técnica
determinada. Ocasionalmente puede servir para calibrar instrumentos, si se conoce el
valor verdadero de la medida que se quiere controlar.

CALIBRADOR: Es una sustancia o material que cumple las especificaciones de un

estándar de referencia. Se usa para calibrar aparatos o para ajustar medidas y obtener

124
resultados exactos. Ocasionalmente puede utilizarse como control. Por lo general, los
calibradores son más caros que los controles y disponibles sólo en cantidades limitadas.
Para la calibración de los autoanalizadores, es muy común el empleo de controles
constituidos por suspensiones de células sanguíneas (humanas o animales), destinados a
la determinación de parámetros básicos como Hb., Hto., índices eritrocitarios, entre
otros.

HISTOGRAMA: Es la representación gráfica del número de valores obtenidos para

un determinado parámetro y proporciona una imagen de la distribución de frecuencias.
La forma simétrica corresponde a una distribución o gaussiano y la forma asimétrica
puede estar desviada a la derecha o izquierda. En los autoanalizadotes, el histograma
permite conocer si existe una distribución normal de las diferentes células sanguíneas en
cada muestra.

INTERVALO DE CONFIANZA: El intervalo de confianza se define como un

conjunto de valores dentro de los cuales está situada la media verdadera. En general, el
intervalo de confianza mínimo corresponde al 95 %, es decir, la probabilidad de que el
valor medio sea el verdadero es del 95 % o uno de cada veinte valores puede hallarse
fuera de los límites de confianza. En una distribución normal el límite de confianza
mínimo corresponde a todos los valores incluidos dentro de las dos desviaciones
estándar de la media (2 DE).
El control de calidad en Hematología, así como, en cualquier otra área del laboratorio, se
lleva a cabo de dos maneras: 1) Control de calidad Interno (CCI) y 2) Control de Calidad
Externo (CCE), lo que permite controlar y asegurar la exactitud y precisión.

1) CONTROL DE CALIDAD INTERNO (CCI): Se realiza diariamente en cada

laboratorio mediante el empleo de controles y patrones en Hematología y tiene como
finalidad asegurar la fiabilidad de los procedimientos e instrumentos. El único patrón
existente en Hematología es el de Cianometahemoglobina.
El Control interno debe realizarse desde la preparación del material que hay que utilizar
para la extracción y manipulación de las muestras de sangre hasta su procesamiento y
entrega de los resultados.
125
Los controles pueden ser comerciales y muestras propias que deben ser elegidas al azar
y se emplean para verificar la reproducibilidad de los resultados correspondientes.
Para realizar el control de calidad interno el uso de las muestras control puede llevarse a
cabo a través de dos procedimientos diferentes:
a) Elaboración de una gráfica control
b) Método de las sumas acumulativas

a) ELABORACIÓN DE UNA GRÁFICA CONTROL:

- Antes de usar una muestra control se debe procesar por lo menos 10 veces
consecutivas, la muestra (analito) en cuestión y determinar el valor de la
media y la DE para cada parámetro que se vaya a controlar. Estas
mediciones, deben hacerse con mucho cuidado en condiciones idóneas y
constantes para obtener resultados óptimos.
- Con los valores obtenidos se elabora una gráfica control en la que el valor de
la media se traza como línea basal y las dos líneas que representan (+ 2 DE)
con valor positivo y con valor negativo (– 2 DE), se trazan por encima y por
debajo de la media.
DE se calcula como la raíz cuadrada de la sumatoria de d2 dividido entre n-1
siendo: n= representa el N° de mediciones, d= diferencia entre los valores
individuales y la media.
- La muestra control es procesada a lo largo del día conjuntamente con las
muestras de los pacientes y los valores obtenidos en cada determinación se
marcan en la gráfica. Cuando no existe ningún problema, los puntos que se
van obteniendo se sitúan muy próximos a la línea de base.

b) LA SUMA ACUMULATIVA:
Este método proporciona una representación visual sencilla de los datos obtenidos en la
prueba de precisión; se emplea para técnicas en las que la muestra control debe ser
procesada durante días consecutivos. Es útil para controlar la variación de la respuesta
de un instrumento en el transcurso del tiempo.
La Suma Acumulativa se utiliza de la siguiente manera:

126
 - Debe procesarse la muestra un mínimo de 10 veces consecutivas para obtener
el valor de la media y la DE.
- Las muestras controles pueden ser procesados en cualquier momento del día.
Cada vez que la muestra se mide, el valor promedio se resta del valor
observado y se grafica la diferencia. Si los resultados obtenidos son similares
al resultado promedio inicial, con sólo diferencias aleatorias (algunas + y
otras -), de tal forma que la suma acumulativa oscile alrededor de 0, la
gráfica será aproximadamente horizontal. Silos resultados obtenidos se alejan
progresivamente del valor promedio su alineación consecutiva tendrá una
pendiente que indica un desajuste en la marcha de la técnica o instrumento.
- Es importante, la escala que se use para trazar los resultados. Las unidades
del eje horizontal ( Ej: un día) deben corresponder en escala a 2 DE del eje
vertical.

Cuando no se emplean controles, puede recurrirse a unos análisis estadísticos de los

resultados obtenidos con las muestras del propio laboratorio procesados a lo largo del
día, o al día siguiente. La sustancia que se mida debe ser lo suficientemente estable para
permitir esta espera.

2) CONTROL DE CALIDAD EXTERNO (CCE):

La evaluación externa de la calidad es un complemento importante de un sistema de
control de calidad interlaboratorios realizado cada mes que al analizar una misma
muestra controlen la exactitud de los métodos que emplean en la realización de las
técnicas. Consiste en el envío de muestras del mismo material de un centro de referencia
a muchos laboratorios para que allí se examinen (por lo general se envían una muestra
normal y otra anormal), de la misma forma como son analizadas las restantes muestras
del propio laboratorio. Los laboratorios luego regresan los resultados obtenidos al centro
de referencia, en donde se analizan estadísticamente. Este análisis incluye la media, DE
y una indicación de su rendimiento en relación al de otros laboratorios y muchas veces
con el de propio centro de referencia.
127
Generalmente el control de calidad externo se realiza sobre las técnicas más usuales y
básicas tales como recuentos celulares, el hematócrito, determinación de la
concentración de hemoglobina, los índices eritrocitarios y las pruebas básicas de
coagulación (tiempo de protrombina, tiempo de trombina, tiempo de tromboplastina
parcial, dosificación de fibrinógeno).
En la práctica, el límite aceptable de desviación deberá tomar en cuenta las necesidades
clínicas así como las metas razonables de precisión y exactitud. Para niveles de
hemoglobina, la desviación no deberá ser mayor al 5 % del valor real.
Para hematócrito de 6 %.
Para el n° de leucocitos de 10 %.
Para la cuenta de plaquetas de 25 %.

CONTRO DE LA TOMA DE MUESTRA:

Es muy importante la comunicación que debe existir entre el laboratorio, personal
médico, de enfermería y paciente para la obtención de una muestra de calidad.
Los valores hematológicos están bajo la influencia de su fuente de origen. Los datos
obtenidos de una punción venosa no pueden compararse con los obtenidos de punción
capilar. Estos valores dependen también de: Edad, sexo, hábitos de fumar,
administración intravenoso o diuréticos.

CAUSAS DE ERROR
a) Errores de identificación del paciente:
- Registrar un nombre equivocado o incompleto.
- Error al registrar el número equivocado
- Error en la fecha de extracción
b) Empleo de anticoagulante inadecuado y en proporción errónea.
c) Uso del torniquete durante mayor tiempo del necesario, provocando
hemoconcentración, aumento de recuento de células.
d) Perforación de la vena por la parte profunda, con la formación de un hematoma y la
subsiguiente lesión de tejidos que al producir la entrada de líquido tisular en la
muestra puede diluirla y acelerar el proceso de coagulación.
128
e) Extracción sanguínea excesivamente lenta con coagulación parcial de la sangre en la
jeringa o tubo de la muestra.
f) Introducción de la sangre en el tubo de recogida por vaciamiento de la jeringa bajo
presión y con la aguja puesta, lo que puede provocar hemólisis.
g) Agitación excesiva de la mezcla de sangre-anticoagulante con formación de espuma
(hemólisis) o mezcla insuficiente con formación de microcoágulos.
h) Llenado insuficiente de los tubos al vacío que contienen una proporción determinada
de anticoagulante.
i) Presión excesiva a nivel del dedo (punción capilar) para conseguir la salida de una
cantidad muy escasa de sangre.

En relación con el Anticoagulante es importante recordar que:

En Hematología el anticoagulante idóneo debe cumplir los siguientes requisitos:
- No alterar el tamaño de los hematíes
- No producir hemólisis
- Evitar al máximo la agregación plaquetaria
- No alterar la morfología de los leucocitos
El anticoagulante más usado es el EDTA:
- Preserva la morfología de las células leucocitarias hasta 2 horas después de la
extracción sanguínea.
- Preserva la conservación de los elementos formes durante 24 horas si se
mantiene a 4 ° C.
- Evita la agregación plaquetaria y preserva la morfología plaquetaria.
- Un exceso de EDTA puede producir: disminución del hematócrito, aumento
del CHCM (Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media).
- Cambios degenerativos y contracción de los glóbulos rojos y blancos.

Los extendidos sanguíneos preparados con muestra anticoagulada con EDTA:

- Con menos de 1 hora a temperatura ambiente muestran pocos cambios.
- A las 3 horas ya se pueden notar algunos cambios.
- Después de 6 a 8 horas los cambios son muy evidentes como leucocitos
vacuolados con cambios nucleares degenerativos.
129
 - La morfología de los hematíes no se ve muy afectada antes de las 6 horas a
temperatura ambiente. Después de este lapso pueden aparecer crenados.
- Si la temperatura ambiente es alta estos cambios se aceleran y se retrasan si
se mantiene la muestra a 4°C.
- También se puede observar hematócrito aumentado, VSG disminuido, cuenta
leucocitaria y plaquetaria disminuidos, VCM disminuido. La Hemoglobina se
mantiene por varios días.

La Heparina aglomera los leucocitos y produce una coloración azul en el fondo de los
extendidos sanguíneos coloreados.

CONTROL DE LA REALIZACIÓN DEL EXTENDIDO SANGUÍNEO

El extendido sanguíneo es de gran importancia en Hematología ya que la evaluación
morfológica de las diferentes células sanguíneas depende de lo bien hecho de estos y de
la calidad de la tinción.
La técnica debe ser impecable procurando que no quede muy fino ni muy grueso,
consiguiendo una distribución adecuada y proporcional de las células en diferentes áreas
del frotis.
CAUSAS DE ERROR
- Uso de material (porta y cubreobjetos ) sin desgrasar, sucio o su orilla no es
uniforme. Los cubreobjetos deben guardarse en un frasco con alcohol y
sacarse justo antes de que se usen y secarse con un trapo limpio libre de
grasa.
- Si se parte de punción capilar, no deberá emplearse nunca la primera gota.
- Si se parte de punción venosa, el frotis deberá hacerse con la máxima rapidez
posible, o máximo 1 hora después de haber obtenido la muestra, un retraso
mayor puede deteriorar la calidad de la morfología.
- La fijación insuficiente puede afectar las tinciones y la morfología. Esto es
muy probable si el alcohol metílico no es absoluto o si ha absorbido agua de
una atmósfera húmeda.

130
 - Si el extendido de sangre se observa excesivamente teñido de azul puede
deberse al excesivo grosor del mismo, o que el lavado fue insuficiente, o que
el colorante estuviera contaminado o en su defecto demasiado alcalino.
- Si el extendido de sangre es excesivamente rojo, puede deberse a que el
colorante, o amortiguador estuvieran muy ácidos o haberse contaminados.
- Un precipitado de colorante indica que este necesita filtrarse. Esto se debe
hacer diariamente.

CONTROL DE REACTIVOS, INSTRUMENTOS Y MÉTODOS

a) REACTIVOS:
Debe controlarse su caducidad, conservación, sistema de almacenamiento. Cuando se
utilizan autoanalizadores deben controlarse periódicamente la calidad y características
de reactivos empleados.
b) INSTRUMENTOS:
CENTRIFUGA:
- Controlar la velocidad rotacional y el temporizador cada 6 meses;
comparando el reloj con un cronómetro.
- Revisar las bandas de hule de las tapas de las centrífugas cada mes y
reponerse cuando se hayan gastado.
- Los cabezales deben limpiarse solo con agua y jabón.
- Equilibrar cuidadosamente los tubos colocados en el cabezal en caso de
usarla.
BAÑO DE MARÍA:
- No deben sufrir variaciones de temperatura superiores a +/- 1 °C de la
deseada para cada determinación.
NEVERAS:
- Controlar la temperatura la cual debe encontrarse entre 2 y 4 °C.

MICROSCOPIO:
- Deben chequearse cada 12 meses por personal técnico.
- Luego de usarse deben limpiarse con papel especial.

131
 - Deben guardarse o protegerse con forros especiales para cubrirlos del polvo y
humedad.
ESPECTROFOTÓMETROS:
- Calibrarse regularmente usando soluciones de referencia. Ej: estándar de
hemoglobina.
AUTOANALIZADORES:
Diariamente verificar el estado inicial del instrumento mediante el uso de:
Calibrador comercial suministrado por la empresa respectiva de acuerdo a las
determinaciones que sea capaz de hacer el equipo.
Muestra control del día anterior (guardada a 4 °C).
Una muestra cualquiera del día procesada 3 veces consecutivas.

PIPETAS:
Es conveniente usar una pipeta bien graduada y con una precisión garantizada de 1 %
error. Se debe verificar la calibración una vez, antes de emplearlas por primera vez.

MÉTODOS:
Causas de error en la determinación de la concentración de hemoglobina:
1- Error en la obtención de la muestra de sangre:
- Estasis prolongada causada por usar más de 1 minuto el torniquete en el
brazo del paciente, lo que origina resultados falsamente elevados de
hemoglobina en las muestras de sangre venosa.
- En sangre capilar cuando se ejerce una presión excesiva en el sitio de punción
aumenta el flujo de los líquidos tisulares diluyendo la muestra sanguínea.
- Uso de anticoagulante inadecuado.
- Coagulación parcial de la sangre.
2- Errores de dilución o pipeteo:
- Uso de pipetas sucias, mal lavadas, calibradas o húmedas.
- No eliminación del exceso de sangre adherida a las paredes externas de la
pipeta antes de dispensar lo medido.
- Dilución incompleta de la sangre en el reactivo.
3- Errores en la transformación de la hemoglobina en cianometahemoglobina:
132
 - Empleo del reactivo mal preparado necesario para la completa
transformación de la hemoglobina en cianometahemoglobina.
4- Errores en la medida:
- Instrumentos no calibrados.
- Cubetas sucias, deterioradas o no ajustadas.
- Soluciones turbias de cianometahemoglobina.
5- Sangre lipémica.
6- Recuento de Leucocitos muy elevado.
7- Errores en la conservación del reactivo:
- Abandonado en la mesa y se expuso a la luz.
- Conservación del reactivo en botellas de polietileno. Se pierden grupos
Cianuros (CN) con formación exclusiva de metahemoglobina en vez de
cianometahemoglobina.

CAUSAS DE ERROR EN LA DETERMINACIÓN DEL HEMATOCRITO

a) Manejo defectuoso de la muestra:
- Empleo de una relación sangre/anticoagulante incorrecta.
- El exceso de EDTA produce un falso bajo valor de hematocrito por
retracción de hematíes.
- El estasis prolongada causada por el uso del torniquete puede originar
resultados falsamente elevados del hematocrito.
- Si la muestra se almacena por más de 6 a 8 horas. Ocurrirá un falso aumento
del valor hematócrito.
- Homogenización defectuosa de la sangre antes de llenar el capilar.
- Un coágulo en la muestra puede ser fuente de error.

b) Falla en la realización de la técnica:

- Llenado insuficiente de los tubos con sangre.
- La heparina de los tubos capilares se puede deteriorar menos si se almacenan
en un sitio fresco.
- Una centrifugación corta o baja velocidad puede impedir que las células se
empaquen al máximo.
133
 - Sí la centrífuga se usa continuamente durante un período prolongado,
particularmente en ambientes de temperatura elevada, el calor que se genera
puede hemolisar la muestra.
- Los leucocitos, las plaquetas y los hematíes especialmente, que ese
encuentren atrapados pueden causar errores. El plasma atrapado aumenta en
los pacientes con policitemia o con otras afecciones como la drepanocitosis y
la esferocitosis hereditaria.
- Cuando se leen los tubos de hematócrito se deben excluir los leucocitos y las
plaquetas.

CONTROL DEL RECUENTO MANUAL DIFERENCIAL

CAUSAS DE ERROR:
a) Error de muestreo para cada tipo celular: está determinado por la frecuencia del tipo
celular en la población de leucocitos y por el número de células contadas,
generalmente 100 a 200.
b) En las muestras de sangre leucopénicas puede no ser posible contar más de 50
células.
c) Para las poblaciones celulares de baja frecuencia como eosinófilos, basófilos, el
error de muestreo es significativo.
d) Variaciones en la tinción de las células.
e) Distribución irregular y no aleatoria de los leucocitos al realizar el frotis.
f) Variaciones subjetivas del observador en la clasificación de las células. Para que un
recuento diferencial leucocitario tuviera valor desde el punto de vista estadístico,
deberá observarse un mínimo de 1000 células.

CAUSAS DE ERROR AL REALIZAR EL RECUENTO CELULAR MEDIANTE

EL HEMATOCITÓMETRO O CÁMARA DE NEUBAUER

a) Errores de equipos
- Pipetas mal calibradas , sucias o húmedas.
- Cámaras mal ajustadas, sucias o mojadas.
- Uso de cubreobjetos deformables, no rígidos.
134
b) Errores de muestreo
- Sangre de punción capilar que no fluya libremente.
- Sangre anticoagulada parcialmente con microcoágulos.
- Proporción incorrecta de sangre / anticoagulante.

c) Errores de realización de la prueba

- Llenado incompleto de la pipeta (burbujas de aire)
- Mezclado insuficiente de la muestra sanguínea.
- No se debe agitar el tubo, pues se forma espuma que impide la medición de
cantidades exactas.
- Tomar las muestras con la pipeta, en forma rápida y precisa, si se rebasa la
línea del volumen deseado ligeramente, ajustar colocando un papel
absorbente en la punta de la pipeta . Si se rebasa más que ligeramente, usar
una nueva pipeta.
- No limpiar el exceso de la pipeta antes de introducirla en la solución
disolvente.
- No descartar las 2 primeras gotas antes de aplicar la muestra en la cámara.
- Células mal distribuidas en el fondo de la cámara.

d) Errores al realizar el recuento

e) Error al efectuar los cálculos

RECUENTO LEUCOCITARIO
La muestra se mide por duplicado. Realizarla en las primeras 6 horas después de obtener
la muestra.

RECUENTO PLAQUETARIO
Se recomienda hacer 2 diluciones y tomar la media de dos cuentas. Las cuentas deben
coincidir con un margen del 10 %.

135
CAUSAS DE ERROR EN EL RECUENTO DE RETICULOCITOS
- Contar en área del extendido de sangre donde no estén bien distribuidos los
eritrocitos. No deben estar sobrepuesto, ni aglomerados en el área del
extendido de sangre examinada.
- Cuenta de un número insuficiente de eritrocitos.
- Confundir los cuerpos de Heinz, siderocitos y las partículas de colorante
precipitado con reticulocitos.
- Esplenectomía. Causa la presencia de otros cuerpos de inclusión dentro de los
eritrocitos que pueden confundirse con reticulocitos.

CAUSAS DE ERROR EN LA DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD DE

SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG)

- La VSG depende de la temperatura ambiente. Rango normal: 18 a 25 °C.

- Cualquier demora más allá de 2 horas para realizar la prueba.
- El tubo debe mantenerse perfectamente vertical.
- El calibre y longitud del tubo de sedimentación.

CAUSAS DE ERROR EN LA PRUEBA DE FENÓMENO FALCIFORME

- Reactivo almacenado. Debe prepararse el mismo día en que se utilice.

- Permitir que la preparación se deseque antes de ser examinada.
- Informar antes de las 24 horas una prueba negativa. Se debe esperar por lo
menos 24 horas para informar una prueba negativa de inducción de los
drepanocitos ( método lento).
- Efectuar la prueba después de transfusión reciente, los resultados no serán
confiables.
- Pueden obtenerse resultados falsos negativos en muestras de sangre extraídas
del cordón umbilical, o que contengan un porcentaje bajo de hemoglobina S,
característica que presentan algunos portadores de drepanocitosis.
- Es importante la concentración de metabisulfito de sodio: soluciones
hipertónicas puede provocar la crenación de los eritrocitos (falsos positivos);
136
 por el contrario, las soluciones hipotónicas puede provocar esferocitos y por
ello falsos negativos.

CONTROL
Se recomiendan procesar simultáneamente una muestra anormal conocida que contenga
Hb S y otra muestra normal.

CONTROL DE CALIDAD EN COAGULACIÓN

Causas de error

a) En la obtención del plasma

- Estasis venosa demasiado prolongada favorece la fibrinólisis local.
- Punción venosa inadecuada.
- Dilución errónea del plasma (sangre/anticoagulante). El exceso de
anticoagulante puede provocar alteraciones en los resultados de los tiempos
de coagulación.
- Presencia de hemólisis en el plasma.
- Tiempo de centrifugación inadecuado.
- Conservación demasiado prolongada de plasma antes de realizar la prueba.
Conduce a un descenso de la actividad de los factores V y VIII.
- El uso de vacutainer para la extracción de sangre. No se recomienda porque
la sangre con mucha presión, lo que puede causar hemólisis de eritrocitos con
liberación de sustancias promovedoras de la coagulación y la consecuente
alteración de los estudios respectivos. El llenado parcial del tubo puede
provocar una errónea relación sangre/anticoagulante.
- Las agujas recomendadas son las # 20 y de 1 pulgada de longitud, las de
menor diámetro pueden producir la hemólisis de los eritrocitos.
- Los tubos para la recolección de la sangre deben ser plásticos y con tapa de
goma para disminuir los cambios de pH de la sangre o plasma.
- Los tubos para realizar el tiempo de coagulación deben tener diámetro
uniforme, sin rayones.

137
 - Después de la centrifugación se separa el plasma sin tomar la capa de
leucocitos y plaquetas con el objeto de no removerlos ya que tienen
sustancias tromboplásticas.
- Se debe evitar la hemólisis, lipemia y coágulos.

b) Instrumentos
- Baño de María
- El registro manual del punto final de coagulación requiere de un baño de
María de temperatura controlada a 37 °C ± 1 °C.
- Se debe vigilar antes de comenzar a realizar las pruebas, el nivel de agua.
- Debe lavarse constantemente para evitar el crecimiento de hongos y el agua
debe ser destilada para que esté libre de sales. El agua turbia o contaminada
ensucia las paredes de los tubos que se introducen en el baño y se dificulta la
observación de la formación de los coágulos.
- Mantenerlos prendidos y tapados a fin de evitar que el agua se evapore y de
que les caiga polvo.
- Se debe tener una buena fuente de luz (neón) para la observación de la
formación de coágulos (técnica manual).
- Centrífuga: los resultados de una prueba de coagulación pueden verse
afectados por variaciones en la fuerza centrífuga relativa a que se somete la
muestra.
FCR = RPM x R (radio de centrífuga en cm)

c) Reactivos
- Se recomienda seguir las instrucciones del fabricante.
- Deben ser de preparación reciente y de buena procedencia.
- Si son liofilizados se debe esperar 5 minutos después de reconstituido antes
de utilizarlos.
- No mezclar reactivos de diferentes lotes.
- Al prepararlos es necesario anotar la fecha.
- Debe descartarse si aparece turbidez o precipitados.

138
 - Almacenar la tronboplastina tisular y las parciales, así como el anticoagulante
a 4 °C y 10 °C.

El anticoagulante de elección es el CITRATO DE SODIO TRISÓDICO 0,109 M, ya

que preserva mejor los factores lábiles de la coagulación (V y VIII), además la
neutralización del calcio es más rápida.
Es importante conocer que un exceso de citrato, un aumento (mayor de 50%) o
disminución de Hto.( menor o igual al 20 %), puede producir alargamiento de las
pruebas por:
- En el caso del exceso de Citrato, el excedente puede mezclarse con el cloruro
de sodio provocando alargamiento de las pruebas de coagulación.
- Si el hematocrito es superior o igual al 50 %, que da exceso de citrato ya que
la proporción de plasma es poca; por el contrario valores de Hto iguales o
menores de 20 %, alteraría los resultados de estas pruebas porque existiría un
exceso de plasma y una cantidad faltante de anticoagulante y por ende una
proporción anticoagulante/sangre inapropiada..

Tromboplastinas
Existen disponibles muchas presentaciones comerciales de tromboplastinas y de
tromboplastinas activadas. Para solucionar el problema de la variabilidad se recomienda
utilizar reactivos estandarizados en la medida de lo posible.

Trombina
- Debe mantenerse en hielo después de descongelada.
- La trombina congelada pierde su estabilidad a –20 °C después de un mes.
Controles
Existen los comerciales liofilizados y las casas productoras afirman que funcionan mejor
cuando provienen de las mismas fuentes comerciales que fabricaron los reactivos de
tronboplastinas y las activadas para el TPTa.

139
d) Técnica
Cada laboratorio debe estandarizar sus métodos y establecer los valores de referencia.
- El plasma no debe mantenerse a 37 °C durante más de 10 minutos.
- Determinar las condiciones óptimas de pH: 7,2-7,4 y fuerza iónica
(reacciones enzimáticas).
- Definir el ordenamiento de los pasos de las pruebas.
- El modo de agregar y de mezclar los reactivos durante el período de
incubación puede causar variaciones en los resultados.
- El tiempo y la velocidad de centrifugación.
- La manera y la frecuencia en el movimiento de los tubos donde se observaría
la formación del coágulo ( técnica manual).
- El punto final de la prueba.
- Modo de reportar los resultados.

En conclusión se deben tomar las siguientes precauciones de control de calidad:

- Obtener la sangre con mucho cuidado usando la técnica de las dos jeringas,
utilizando jeringas de plástico o siliconadas con agujas de calibre grueso.
- Almacenar el plasma en tubos de plástico muy bien tapados y practicar las
pruebas durante las primeras 4 horas.
- Congelar y almacenar el plasma que no se pueda estudiar durante las
primeras 4 horas.
- Utilizar una concentración de 0,1 ml/l de citrato de sodio para anticoagular la
sangre.
- Seguir estrictamente las instrucciones del fabricante para el almacenamiento
y uso de los productos.
- Mantener la temperatura de reacción a 37 °C +/- 1 °C.
- Vigilar el pH y la molaridad de los reactivos empleados.
- No debe permitirse que el plasma permanezca más de 10 minutos a 37 °C,
así como los reactivos empleados de acuerdo a las recomendaciones de los
fabricantes.
- Incluir controles diariamente en las pruebas que se practiquen.
140
 -
Causas de Error en el Método de Ivy modificado del Tiempo de Sangría
- Si la plantilla se presiona excesivamente la incisión será demasiado profunda
y el tiempo de sangrado falsamente prolongado. Lo contrario ocurrirá cuando
la presión aplicada sea débil.
- El sangrado abundante indica que probablemente se haya herido algún vaso
superficial.
- Si se toca la herida con papel de filtro puede arrastrarse algun agregado
plaquetario, lo que prolonga el tiempo de sangrado.

TIEMPO DE PROTROMBINA
- Asegurarse que la temperatura se encuentra a 37 °C +/- 1 °C.
- Vigilar que las pipetas esten correctamente calibradas
- Reconstituir o descongelar un nuevo tubo de tromboplastina y repetir la
prueba.
- Asegurarse que el pH de la mezcla de los reactivos sea aproximadamente de
7,4.
- Los resultados obtenidos con las muestras de los pacientes no deberán
informarse, a menos que la media control se encuentre dentro de los límites
de +/- 2 DE.

CAUSAS DE ERROR
- Mantener la sangre a temperatura ambiente pues el frío activa el factor VII en
algunos plasmas.
- Separar el plasma pobre en plaquetas 1 hora después de obtener la muestra,
como máximo. Tapar el tubo hasta que se use, para evitar la pérdida de CO2 y
por ende del pH.
- Realizar la prueba durante las primeras 4 horas. Si no es posible congelar el
plasma bruscamente y guardarlo en tubos de plástico a – 70 °C, o menos.
- Mezclar bien la tromboplastina antes de usarla.
- Usar agua destilada o desionizada para reconstituir los reactivos.

141
VENTAJAS DE LA RAZÓN:
- Es importante la expresión de los resultados en forma de Razón que no es
más que el TP paciente (seg) entre el TP control (seg).
- Obvia el deterioro de reactivos y pérdida de actividad de factores.
- Minimiza diferencias debidas a técnicas.
- Facilita la comparación de resultados.

RANGO TERAPEUTICO
Son los valores entre los cuales debe estar comprendida la relación de un paciente
sometido a tratamiento con drogas cumarínicas para considerarlo bien anticoagulado.

VENTAJAS DEL INR (RAZÓN INTERNACIONAL NORMALIZADA)

- Uniformidad en valores de aquellos pacientes que viajan y son tratados en
diferentes localidades geográficas.
- Mejor asistencia a los pacientes al reducirse los riesgos.
- INR = ( R )ISI Siendo R la razón, ISI: índice de sensibilidad internacional.

TPTa: Tiempo Parcial de Tromboplastina Activado

Causas de Error
- Todas las pruebas deben realizarse a 37 °C.
- Las muestras de plasma deben permanecer en hielo hasta el momento del
estudio y procesarse en un lapso menor de 2 horas después de obtenidas
- Todas las determinaciones deben realizarse siguiendo exactamente la misma
técnica para obtener resultados exactos y reproducibles. El tiempo de
incubación, pH, la temperatura y la magnitud de la activación de contacto
influyen en los resultados.

Tiempo de Trombina

142
 - La principal causa de error es la rápida inactivación de la solución de
trombina debida a su absorción en las superficies. Esta absorción es
particularmente pronunciada en el vidrio.
- La solución de trombina debe mantenerse en hielo después de descongelarla.
- La solución congelada de trombina pierde su estabilidad a – 20 °C después de
un mes.

Prueba de la Úrea o Test del Factor XIII

Causas de Error
El sistema es sensible a varias concentraciones de fibrinógeno plasmático. Por lo tanto
no es una medición absoluta del factor XIII. Los efectos de los niveles de fibrinógeno
son más evidentes por debajo de 0,8 g/l y por arriba de 8,0 g/l.

* Parte del material sobre control de calidad fue gentilmente cedido por la Dra.
Milagros Núñez de Barboza Jefe de la Cátedra de Práctica Profesional de
Hematología, Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina, LUZ.

143
 RECOMENDACIONES PARA LA MANIPULACIÓN SEGURA DE AGUJAS Y
MATERIAL PUNZOPENETRANTE
La manipulación de agujas y objetos punzo-penetrantes (bisturí, lancetas, láminas y
laminillas material de vidrio, defectuoso, instrumentos puntiagudos) en el laboratorio,
cuando no es llevada a cabo siguiendo las precauciones necesarias conlleva a accidentes
(pinchazos, laceraciones, heridas) a través de los cuales ocurre exposición a sangre o
fluidos corporales que podrían ser potencialmente infecciosos (VIH, VHB, VHC, entre
otros). Se ha reconocido que en el personal de laboratorio que ha adquirido alguna
infección ocupacional a sangre y fluidos corporales, la vía de transmisión principalmente
involucrada ha sido percutánea (pinchazo con agujas y material punzopenetrante).
Las siguientes son recomendaciones prácticas que cada persona que trabaja con los
instrumentos y fluidos corporales antes señalados, debe adoptar en su faena diaria con el
fin de prevenir cualquier accidente, estas recomendaciones son producto de una revisión
de publicaciones de los organismos internacionales (OMS, OPS, ODC) que regulan
sobre la materia.

PARA AGUJAS Y JERINGAS:

- Nunca reencapucharlas.
- No doblarlas ni romperlas.
- Nunca manipular la aguja para separarla de la jeringa; de ser necesario,
utilice pinzas.
- Utilice las agujas y jeringas sólo para extracciones sanguíneas.
- Nunca utilice las agujas para transferir liquidos.
- Descártelas en recipientes (ad hoc) los cuales deben ser herméticos (a prueba
de pinchazos), deben contener solución descontaminante y se ubicarán lo
más cercano posible al área de trabajo.
- Nunca descarte las agujas directamente a las papeleras.
- Asesórese en la obtención de dispositivos para extracciones sanguíneas de
tipo seguro.
- Utilice siempre guantes al manipular agujas y jeringas.
- Lave sus manos después de manipular estos materiales aún cuando haya
utilizado guantes.
144
OTROS MATERIALES PUNZO-PENETRANTES:
Los bisturíes y lancetas manipúlelos con sumo cuidado, los utilizados no deben ni
doblarse, ni romperse, descártelos en recipientes herméticos, los cuales deben contener
solución descontaminante.

- Al seleccionar el material de vidrio (tubos de ensayo, pipetas ,etc.) verifique

que no esté quebrado.
- Nunca elimine directamente a la papelera restos de vidrio del laboratorio,
colóquelo en recipiente hermético y descártelo.
- Utilice siempre guantes al manipular este material.
- Lave sus manos después de cualquier manipulación de este material, aún
cuando haya utilizado guantes.

CONDUCTA A SEGUIR EN CASO DE UN ACCIDENTE DE EXPOSICIÓN A

SANGRE O FLUÍDOS CORPORALES

PRIMEROS CUIDADOS DE URGENCIA

PINCHAZOS O HERIDAS:
- Lavar inmediatamente la zona cutánea lesionada con abundante agua y jabón.
- Permitir el sangrado en la herida o punción accidental.
- Realizar asepsia de la herida con alcohol al 70 % vol. (3 minutos) o solución
yodada al 2 %.
- Dependiendo del tamaño de la herida cubrir con gasa estéril.

CONTACTO CON MUCOSAS (OJOS, NARIZ, BOCA):

- Lavar abundantemente con agua o suero fisiológico. No utilizar
desinfectantes sobre las mucosas.

145
CUALQUIERA QUE HAYA SIDO EL ACCIDENTE:
- Notifique inmediatamente el accidente al supervisor, jefe o persona
encargada de asegurar que se den los pasos correspondientes en forma
eficiente.
- La persona notificada (jefe, supervisor), debe realizar una evaluación del
accidente ocurrido.
- Cada institución tendrá la medicación disponible en todo momento para
iniciar el tratamiento contra VIH; ya que en caso de que el accidente haya
ocurrido con material potencialmente infeccioso para VIH, dicha medicación
se debe iniciar en el accidente dentro de las seis horas de ocurrido el mismo,
preferentemente antes de completar las dos horas.
- Se realizará la extracción de sangre para VIH en el accidentado. En ningún
caso se debe demorar el inicio del tratamiento para VIH.
- Es necesario conocer el estado clínico serológico del paciente fuente de la
muestra involucrada en el accidente. Si el estado serológico es desconocido,
el médico prescribirá la realización de los siguientes exámenes previo
consentimiento del paciente: serología para VIH y marcadores de hepatitis.
En caso de no poder evaluarse el paciente fuente, éste debe ser considerado
como Positivo y procederse en consecuencia.
- Comunicar el accidente al PROGRAMA REGIONAL ETS-SIDA (Sede
Ambulatorio Dr. Francisco Gómez Padrón, Municipio Maracaibo, Estado
Zulia).
- Seguir las recomendaciones pertinentes emanadas del programa.

TIPS QUE SE DEBEN CONOCER SOBRE EL MANEJO DE SUSTANCIAS

QUÍMICAS EN EL LABORATORIO:
En el laboratorio se utilizan una gran variedad de sustancias químicas cuya
manipulación representa un riesgo para la salud de los trabajadores, así como para la
comunidad y el medio laboral; por este motivo es necesario que todo el personal tenga
conocimiento sobre las propiedades, peligrosidad y procedimientos adecuados para el
uso de las mismas, así como de las normas seguridad, lo que permitirá lograr el manejo

146
seguro de estas sustancias, contribuyendo de esta forma a disminuir los riesgos de
accidentes y enfermedades.

Antes de usar una sustancia química infórmese muy bien de sus características, modo de
usarlo, y sobre todo de las precauciones que se deben observar. Identifíquese la sustancia
química y preste atención a las advertencias indicadas en las etiquetas. Elabore una hoja
de información de seguridad (M.S.D.S.) y revísela cada vez que vaya a utilizar el
producto.
La M.S.D.S. comunica datos importantes como:
- Nombre común y fórmula química
- Información sobre el fabricante
- Ingredientes químicos peligrosos
- Peligros del químico a la salud
- Información sobre la inflamabilidad, explosividad y reactividad
- Equipos de protección personal y técnicas de extinción de incendios
- Medidas de control de derrames y escapes

* Material recopilado y suministrado por la Comisión de Higiene y Seguridad de la

Escuela de Bioanálisis, Facultad de Medicina, LUZ.

147
PARÁMETROS HEMATOLÓGICOS MANUALES Y AUTOMATIZADOS:
ANALOGÍAS Y DISCREPANCIAS.

El interés en la medida de las células sanguíneas data de 1674 cuando Antonie

Van Leeuwenhoek afirma haber medido glóbulos rojos, y desde allí hasta hoy los
métodos manuales han constituido el procedimiento tradicional de recuento celular.
Tienen como fundamento la realización de una dilución sanguínea con un microcapilar
calibrado con una pipeta dilutora y el posterior recuento de las células (hematíes,
leucocitos y plaquetas) con el hematocitómetro y el microscopio convencional.
En cuanto a los métodos electrónicos tenemos que 1934, se realizó el primer
recuento automatizado de células sanguíneas. En la década de los 60 aparecen los
primeros instrumentos eficaces utilizando métodos basados en la resistencia electrónica
o impedancia, proporcionando resultados seguros para los 7 parámetros hematológicos
básicos. A mediados de los 70 se desarrollaron mejores sistemas, que incluían recuento
de plaquetas. Hasta que a partir de la decada de los 90, se desarrollaron instrumentos que
combinan diferentes tecnologías entre ellas dispersión de luz láser y citometría de flujo
proporcionando el recuento diferencial de las células blancas.
Tales sistemas de recuentos electrónicos se basan en diferentes métodos, de
los cuales destacan como más empleados:
1.- Método de la resistencia eléctrica.
2.- Método de campo obscuro.
3.- Método del rayo láser.
4.- Citometría de flujo

MÉTODO DE LA RESISTENCIA ELÉCTRICA: Fue descrito por primera vez por

Coulter, en 1956, y es el más empleado en los sistemas de recuento semiautomatizado
(Coulter DN, Coulter M5-30,Coulter D2/30, Coulter 2F) y automatizados como Coulter
counter Modelo S y S “Plus” (Coultronics Electronics Ltd), los sistemas Systex E-4000,
E-5000, CC-780, CC-800,etc (TOA instruments) y otros por lo que es el empleado por
la mayoría de los instrumentos hematológicos de recuento más usuales.
Se fundamenta en el hecho de que las células son malas conductoras de la
electricidad, al contrario de lo que sucede con los líquidos dilutores, tales como, la
148
solución salina fisiológica, que conduce bien la corriente eléctrica. Además este método
toma en cuenta la amplitud del impulso generado por las células sanguíneas para
determinar el tamaño de la célula.
Para realizar el recuento de sangre es diluída 1/50.000 y mediante un sistema de
aspirado por vacío (P) se hace pasar a través del orificio. La resistencia eléctrica (RE)
del líquido que pasa a través del orificio se mide mediante dos electrodos situadas a
ambos lados del mismo. Mientras pasa el diluente la RE es mínima y constante, pero
cuando una célula sanguínea atraviesa el orificio, se produce un aumento de aquella un
cambio de potencial entre los electrodos, que permanece mientras la célula atraviesa e
orificio. La amplitud del impulso eléctrico es proporcional al tamaño de la célula.
Tanto el número de los impulsos como su amplitud son detectados en un osciloscopio y
registrado mediante un sistema adecuado.

MÉTODO DEL RAYO LÁSER: Se basa en el empleo de un detector situado detrás de

un capilar, por donde se hacen circular las células. Cuando una célula intercepta el rayo
láser, el rayo deja de incidir sobre el detector, registrándose el grado de interferencia que
produce la célula a su paso, el cual es proporcional al tamaño de las misma. Ej: ELT,
ELT 7, ELT 800 etc (Ortho Diagnostic Instruments) y el Sistema H-1 (Technicon
Instrumens).

CITOMETRÍA DE FLUJO: Esta resultó de la aplicación del conocimiento de

técnicas y ciencias que ya se habían desarrollado en forma independiente como la
tecnología láser, la producción de anticuerpos monoclonales, la citoquíica, la
fluorocromoquímica y la ciencia computacional.

La citometría de flujo consta de 4 subsistemas básicos:

1.- Sistema de fluidos: Transporta las céllas desde el tubo conteniendo la muestra, hasta
la región de los sensores.
2.- Sistema óptico: Genera y colecta los impulsos luminosos, derivados de las células.
Los detectores ópticos son 5: FSC (Forward Scatter) luz láser dispersada hacia delante,
SSC (Side Scatter) luz dispersada hacia los lados, y tres detectores de fluorescencia, para
diferentes fluorocromos.
149
3.- Sistema electrónico: Amplifica y digitalisa las señales detectadas.
4.- base de datos: Transforma los impulsos eléctricos en gráficas y números, legibles y
almacenados en un computador.
FUNDAMENTO: Las células son transportadas por una corriente de fluido a baja
velocidad dentro de una corriente de diluente a una mayor velocidad, como la corriente
de ambos fluidos se mueven a diferentes velocidad no se mezclan, este efecto se conoce
como flujo laminar. Además, este método hace que las células sean alineadas y
enfocadas en una sola línea garantizando su paso una a una a través de la zona de
censado (rayo de luz láser), esto se conoce con enfoque hidrodinámico. Además, las
células son estudiadas con la medida de la inmunofluorescencia, para esto las células
viables en suspensión son marcadas con anticuerpos monoclonales, conteniendo
fluorocromógenos que se unen específicamente a los antígenos celulares. Cada célula
emite señales fluorescente, que al pasar por el rayo luminoso dispersan (scatter) la luz
incidental. Entonces, los citómetros de flujo de última generación (como el CD-4000),
toman en cuenta, además de la tecnología de fluorescencia, la dispersión óptica así a
medida que las células entran en una zona de censado, interactúan con el rayo de luz
láser proveniente del subsistema de iluminación. Luego el subsistema de detección mide
la luz no dispersada de la superficie y de las estructuras internas, además de la
fluorescencia emitida por los ácidos nucleicos teñidos de las células sanguíneas.

Estas señales luminosas son amplificadas y convertidas en impulsos eléctricos,

que luego son digitados, procesados y almacenados, y demostrado gráficamente en un
computador.
De esta manera se mide el porcentaje de células marcadas y la intensidad de la
fluorescencia de cada célula individual, lo que permite el estudio de la distribución de
los antígenos de superficie. Simultáneamente se puede utilizar dos o más anticuerpos
para marcar diferentes antígenos de células individuales.
Existen además, analizadores hematológicos automatizados como el SE- 9500
que cuantifica las células maduras e inmaduras, y reticulocitos, mediante el uso de 5
canales de detección. Para esto separa las células maduras de las inmaduras y luego
analiza cada una por separado. Los leucocitos maduros los diferencia por un método
llamado de radio frecuencia (dispersión de luz e inmunofluorescencia) y corriente
150
directa (impedancia), y las inmaduras incorpora reactivos específicos de antígenos,
tomando en cuenta la composición y cantidad de lípidos de los leucocitos, además utiliza
la histoquímica para hacer un análisis más completo. El histograma de reticulocitos se
obtiene discriminandolos de trombocitos y glóbulos rojos a través de 2 parámetros: la
intensidad de luz dispersada (intensidad de disperión frontal - Forward Scatter intensiti)
y la intensidad de la fluorescencia. Luego, los reticulocitos son clasificados de acuerdo
a la intensidad de la fluorescencia, la cual es un reflejo del contenido de RNA de cada
célula.

LFA: Intensidad de fluorescencia baja

MFR: Intensidad de fluorescencia media
HFR: Intensidad de fluorescencia alta

En cuanto a las plaquetas los métodos utilizados para determinarlas son los
siguientes:
_ Impedancia automatizada (por enfoque hidrodinámico o no).
_ Dispersión de luz láser (combinada con citometría de flujo).
_ Métodos manuales por microscopía (recomendado por ICSH – Internacional
Comité for Standarization in Hematology).
_ Contraste de fase.
_ Estimado por coloración en lámina.
Ninguno de estos métodos posee suficiente exactitud para propósitos terapéuticos
cuando los contajes son inferior a 50.000 / mm3
Debido al tamaño tan pequeño de las plaquetas y las muchas interferencias que la
rodean, siempre ha significado un gran reto para los métodos analíticos de contaje
celular.
Los clínicos requieren que los laboratorios dispongan de corajes de plaquetas
exactos, precisos y reproducibles, particularmente para los pacientes en tratamiento de
quimioterapia, radiación u otras causas de severa trombocitopenia. Las decisiones de
tratamiento están basadas en cambios discretos a niveles de contajes muy bajos (5.000 a
50.000 / mm3 ), la inexactitud o imprecisión del contaje de plaquetas a estos niveles tan

151
bajos puede colocar por debajo o por encima del punto crítico el contaje de plaquetas del
paciente permitiendo una incorrecta decisión médica.
El contaje inexacto podría resultar en el uso innecesario de un producto muy
valioso de sangre un incremento en los costos para el paciente o el hospital y, tal vez un
deterioro del paciente que recibe un transfusión no necesaria.
Todos los métodos automatizados, normalizan algoritmos para separar plaquetas
de no plaquetas. Para que estos algoritmos trabajen, el rango de distribución debe ser
dominado por plaquetas normales. Este gran número de plaquetas normales es el punto
de referencia o el fundamento del método de algoritmos. Una vez que la población de
plaquetas normales es identificada los algoritmos separan plaquetas de no plaquetas.
Las muestras trombocitopénicas especialmente aquellas de pacientes de
oncología tienen un bajo número de plaquetas normales y anormales junto con partículas
no plaquetarias, esto genera una distribución de plaquetas menos homogénea. Bajo estas
condiciones la normalización de algoritmos falsamente incluye partículas no plaquetas o
excluye pequeñas o gigantes plaquetas. Como resultado el contaje de plaquetas puede
ser sobreestimado o subestimado.
De esta forma los contajes automatizados para plaquetas en rango normal no son
cuestionado, pero los contajes por debajo de 100.000 / mm3 requieren una verificación y,
una revisión y, una revisión manual cuando están por debajo de 50.000 / mm3 .
El sistema CELL-DYN 4000 posee dos tecnologías de contaje plaquetario,
impedancia y Öptico, la última revisión incluye una tercera metodología basada en la
combinación de dos tecnologías inmunología y inmunofluorescencia.
Para decisiones terapéuticas, un nuevo método Inmunoplaquetas (CD-61) CELL-
DYN ofrece una cuarta dimensión a las tecnologías ópticas y de impedancia. Esta cuarta
dimensión es el antígeno CD-61, encontrado en todos los restos de plaquetas normales y
activadas. Los anticuerpos monoclonales específicos contra CD61 no reaccionan con
ninguna otra célula sanguínea por lo tanto es un marcador ideal para plaquetas.
En cuanto a la Hemoglobina tenemos que desde 1967, el ICSH recomienda el
método colorimétrico de la cianoheoglobina como el más fiable para la dosificación de
la hemoglobina por su exactitud y precisión y porque puede ser verificado mediante el
empleo de un patrón de referencia internacional, siendo así el más utilizado en la
determinación de Hb manual y automatizado. Sin embargo los reactivos contienen
152
cianuro potásico el cual requiere de cautela en su manejo y eliminación. Actualmente se
esta buscando el riesgo ocupacional, ya en 1990 en EEUU el laboratorio estandarizado
para exposición ocupacional para riesgos químicos, fomenta la eliminación de químicos
tóxicos tanto como sea posible. Japón ha limitado estrictamente el uso de cianuro.
En vía de resolver este problema, se ha desarrollado un nuevo método para esta
determinación que utiliza sulfato de sodio laurel. Este método tiene la ventaja de
conversión rápida y reactivo no tóxico. Este método da resultados precisos
corroborando en forma manual y automatizada con el uso de patrones comerciales de
cianometahemoglobina.

MÉTODO AUTOMATIZADO
VENTAJAS:
1.- Rapidez del análisis.
2.- Capacidad de medir múltiples parámetros simultáneamente.
3.- Poca manipulación de la muestra sanguínea.
4.- Determinación confiable de índices eritrocitarios.
5.- Empleo de reactivos no tóxicos en la determinación de los diferentes parámetros.
6.- Determinación de índices reticulocitarios y grado de madurez de reticulocitos.
Esto es muy importante para la vigilancia terapeútica de ciertos casos como anemias por
falla renal crónica y el consecuente tratamiento con eritropoyetina recombinante y el
seguimiento de trasplante de médula ósea.
7.- Exactitud y precisión en la cuantificación de plaquetas por el método de
inmunofluorescencia (anti DD61) importante en pacientes con tratamiento de
quimioterapia, radiación y otras causas de severa trombocitopenia (contaje de plaquetas
entre 5.000 a 50.000 mm3 ).

DESVENTAJAS:
1.- Incremento del costo de los exámenes.

153
2.- No detecta ciertas anormalidades celulares ( linfocitos atípicos, fenómenos de
Rouleaux, cuerpos de Howell Jolly, anillos de Cabot, agregados plaquetarios,
células inmaduras) que pueden estar presente en recuento celular normal.
3.- Se requiere del examen manual del extendido sanguíneo en aquellos casos
donde el equipo automatizado arroja las alarmas o avisos hematológicos.
4.- Las oportunidades de trabajo en el campo asistencial se reducen, ya que el
manejo de un equipo automatizado generalmente está a cargo de un solo operador.
5.- Error instrumental. Presencia de partículas extrañas en el líquido diluyente, lisis
incompleta de hematíes en el recuento de leucocitos, desajuste electrónico de los
cálculos matemáticos que realiza el sistema, desajuste en la calibración del sistema, falta
de reproducibilidad del sistema.

154
 ACTIVIDADES DE AUTOEVALUACIÓN

UNIDAD I
PREGUNTAS DE UNIESCOGENCIA

1.- LA SANGRE CAPILAR:

a.- Es útil para realizar electroforésis de Hb.
b.- Es de naturaleza venosa
c.- Es la de preferencia para estudios hematológicos de rutina en el adulto.
d.- Se puede obtener del pulpejo del dedo, del lóbulo de la oreja y talón de recién
nacidos.

2.- EN LA PUNCIÓN Y EXTRACCIÓN DE SANGRE VENOSA:

a.- Se debe tomar en cuenta sólo el aspecto técnico de la toma de la muestra: torniquete,
jeringa, alcohol, etc.
b.- Implica 3 factores importantes el bioanalista o técnico encargado, el paciente y sus
venas y el equipo empleado para la venipuntura.
c.- El paciente puede permanecer de pie para la extracción venosa.
d.- La aguja de la jeringa debe introducirse con el bisel hacia abajo en la vena
seleccionada.

PREGUNTAS DE COMPLETACIÓN
3.- Los anticoagulantes se pueden clasificar de acuerdo a su mecanismo de acción en
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________.
4.- El extendido sanguíneo coloreada es útil para ______________________________

______________________________________________________________________.

155
5.- PREGUNTAS DE APAREAMIENTO
RELACIONE LOS ELEMENTOS DE LA COLUMNA A CON LOS DE LA B:
COLUMNA A COLUMNA B
1.- Hb. ( ) Indice Eritropoyético
2.- Hto. ( ) Método Hemacitocitómetrico
3.- V.S.G. ( ) 150.000 a 400.000 mm3
4. Reticulocito ( ) Un tubo vertical hasta empaquetarse
5.- Contaje Blancos ( ) Método Semicuentitativo
6.- Contaje de Plaquetas ( ) Resistencia eléctrica y dispersión
de luz láser
7.- Automatización en Hematología ( ) Relación % de volumen de
eritrocitos en sangre total.
( ) Sulfohemoglobina método
estándar y más usado.
( ) Solución de Turk: presencia de
glóbulos rojos y plaquetas.

UNIDAD II
PREGUNTAS DE UNIESCOGENCIA
6.- EN LA DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS:
a.- Se debe realizar en láminas
b.- Sólo debe ejecutarse en tubos
c.- Se determinan sólo antígenos
d.- Ninguna de ellas

7.- EN LA DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS EN TUBOS:

a.- Se puede determinar Ags. o Acs. de grupos sanguíneos
b.- Sólo se emplean para determinar Ags. de grupos sanguíneos
c.- Son pruebas de Aglutinación Indirecta
d.- Ninguna de ellas

156
8.- LA PRUEBA DE COOMBS DIRECTO:
a.- Es útil para la determinación de Acs. incompletos en suero del paciente.
b.- Su utilidad clínica principal es el diagnóstico de la A. Hemolítica autoinmune
c.- Emplea suero del paciente y requiere una fase previa de sensibilización.
d.- Ninguna de ellas.

9.- El Coombs Indirecto se fundamenta en : ___________________________________

y su utilidad clínica es ____________________________________________________

______________________________________________________________________.

10.- PREGUNTA DE APAREAMIENTO. RELACIONE LOS ELEMENTOS DE LA

COLUMNA ¨A¨ CON LOS DE LA COLUMNA ¨B¨.
COLUMNA A COLUMNA B
1.- Acs. incompletos unidos a glób. Rojos ( ) Coombs Indirecto
2.- Acs. incompletos en suero ( ) Célula L.E.
3.- Células fagocitarias con masa hialina interna ( ) Coombs Directo
4.- Prueba específica para anticuerpos Anti ADN ( ) Acs. Antinucleares
( ) Grupos sanguíneos
UNIDAD III
PREGUNTAS DE UNIESCOGENCIA:
11.- LA TÉCNICA DE LA DOBLE JERINGA PARA REALIZAR LOS ESTUDIOS
DE COAGULACIÓN:
a.- Se emplea con la finalidad de evitar la contaminación con factor 3 plaquetario de la
sangre extraída.
b.- Es útil sólo para obtener suficiente cantidad de sangre para realizar todos los estudios
de hemostasia y coagulación.
c.- Se emplea para obtener la muestra sanguínea necesitada para realizar sólo los
estudios que evalúan los factores de la coagulación.
d.- Ninguna de ellas.
157
12.- ENTRE LAS PRUEBAS QUE EVALÚAN EL COMPONENTE PLAQUETARIO
a.- El contaje de plaquetas puede evaluar la calidad y cantidad de las plaquetas
b.- La retracción del coágulo evalúa la capacidad de adhesión de las plaquetas.
c.- El TP, TPT y T:T evalúan mecanismo extrínseco, intrínseco y fibrinógeno
respectivamente.
d.- Ninguna de ellas.

PREGUNTAS DE COMPLETACIÓN
13.- El tiempo de Sangría se fundamenta en ___________________________________
______________________________________________________________________.
14.- En el T:P:T: se emplea un reactivo que actúa como sustituto plaquetario: ________
______________________, éste activa a _____________________________________
___________________________.
15.- PROBLEMA DE DIAGNÓSTICO
Paciente del sexo masculino que presenta hemorragias nasales y gingivorragias. Se le
realizaron los siguientes exámenes de laboratorio:
Hb.: 13,8 g/dl Hto.: 44 % Cta. Blanca: 9.100 x mm3
Plaquetas: 256.000 x mm3 Reticulocitos: 1,2 %
T. de Sangría (Ivy modificado): 10´ 32´´ Retracción del coagúlo: +++
T.P control: 12,5 ´´ T.P.T. control 28,6 ´´ T:T control: 17,8´´
T.P paciente: 13,5 ´´ T:P:T: paciente: 36,7´´ T.T paciente: 18 ´´
Mezclas de Corrección:
P.P + P.N: T.P.T: 32,5´´ P.P.+ P.A.N.: T.P.T.: 38,5´´ P.P+S.N: T.P.T: 33´´

Diga el Diagnóstico Posible: _______________________________________________

¿Cuáles otras pruebas confirmarían el diagnóstico? _____________________________
____________________________________________________________________.

158
UNIDAD IV
PREGUNTAS DE UNIESCOGENCIA
16.- CON RESPECTO AL FENÓMENO FALCIFORME:
a.- Se fundamenta en la desorientación de la Hb C cuando se desoxigena causando
deformación del glóbulo rojo.
b.- Emplea un agente reductor para provocar desoxigenación de la Hb D.
c.- Su positividad indica la presencia del gen falciforme
d.- Suele dar positivo en casos de Anemia Falciforme, Tara Falciforme y Talasemia.

17.- EL TEST DE SUCROSA:

a.- La baja concentración iónica que propicia la sucrosa permite la unión de los
componentes del complemento a los eritrocitos causando lisis de los mismos.
b.- Se emplea conjuntamente con el test de Ham para el diagnóstico de H.P.N.
c.- Tiene una alta especificidad y baja sensibilidad.
d.- Ninguna de ellas.

PREGUNTAS DE COMPLETACIÓN
19.- La determinación de Urobilinógeno Fecal se puede ver afectada por varios factores
tales como: _____________________________________________________________;
por tanto debe combinarse con el cálculo de ___________________________________.
20.- PROBLEMA DE DIAGNÓSTICO:
Paciente con diversas manifestaciones clínicas tales como: dactilitis, crisis dolorosas en
miembros inferiores, retardo en el crecimiento, infecciones respiratorias a repetición. Se
le realizaron los siguientes exámenes de laboratorio:
Hb.: 8,5 g/dl Hto.: 30 % Cta. Blanca: 12.500 x mm3 Plaquetas: 355.000 x mm3
Reticulocitos: 5,4 %
Imagen Microscópica: Hipocromía moderada, anisocitosis con predominio de
microcitos, presencia de drepanocitos y dianocitos, esquistocito, eritroblastos
ortocromáticos, basofília difusa, punteado basófilo, cuerpos de Howell-Jolly.
Médula ósea: Hiperplasia Eritroide. Fenómeno Falciforme: Positivo
Electroforésis de Hb.: S/F
Diga el Diagnóstico Posible: ___________________________________________.
159
 RESPUESTAS CORRECTAS

UNIDAD I
1.- d 2.- b 5.- COLUMNA B: ( 4 )
(5y6)
(6)
(3)
(6)
(7)
(2)
UNIDAD II
6.- b 7.- a 8.- b 10.- COLUMNA B: ( 2 )
(3)
(1)
(4)
UNIDAD III
11.- a 12.- c 15.- Hemofilia B. Cuantificación IX

UNIDAD IV
16.- c 17.- b 20.- Síndrome Falciforme Talasémico

160
 BIBLIOGRAFÍA

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Sanford – Davidson. Ed. Salvat. Séptima Edición. 1984. Tomos I y II.

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