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Transformacion Por Choque Termico
Transformacion Por Choque Termico
Al ser un estado fisiológico especial, no todas las bacterias lo presentan, pero si podemos conseguir
mediante el proceso de transformación que ciertas bacterias que no son competentes, adquieran este rasgo de
forma temporal. En mis prácticas, he convertido bacterias, Escherichia Coli, en competentes mediante un
choque térmico en un medio con cationes divalentes, entre ellos el Ca2+.
La combinación de la temperatura y los cationes, aumenta la porosidad de la membrana celular,
facilitando la asimilación de los plásmidos. De esta forma atravesarán la membrana celular cualquier
plásmido que se encuentre en su forma circular o superenrollada. Los plásmidos “lineales” tienen más
dificultad para penetrar la membrana.
Pasado este tiempo se ponen de nuevo en el hielo rápidamente de forma suave. De esta forma se cierran los
poros. En éste paso mueren una gran proporción de las células, por eso se deben coger cuando están en la fase
logarítmica de crecimiento celular.
4) Se añade 250 micro litro de medio S.O.C al vial de células. El medio SOC es especial para la
transformación de las células competentes. Es un medio isotónico que cubre las necesidades de las células tras
el estrés del choque térmico. Tiene peptona, que aporta nitrógeno y aminoácidos; extracto de levadura que
aporta vitaminas, en especial del grupo B; sales minerales sulfato de magnesio (fuente de magnesio, necesario
por ejemplo para la polimerasa), cloruro de sodio y de potasio necesarios para el transporte y el equilibrio
osmótico; y la glucosa que aporta la energía y es una fuente de C, utilizada entre otras cosas para reparar la
perforación de la membrana celular tras el choque térmico 5.
Triptona 20 g/l
Extracto de levadura 5 g/l
Glucosa 3,6 g/l
Cloruro potásico 0,186 g/l
Cloruro sódico 0,5 g/l
Cloruro magnésico 0,96 g/l
Composición del medio S.O.C.
5) Crecer durante una hora en el vial a 37º C en agitación fuerte (200 rpm).
6) Coge 20-50 micro litro a medios selectivos de cultivo sólidos. Se recomienda tomar dos volúmenes distintos
para que al menos una de las placas tenga las colonias en la cantidad justa para poder picarlas sin problemas.
7) Deja crecer las colonias en estufas de cultivo a 37º C. Si el antibiótico es ampicilina, basta con dejarlas
crecer 8 horas, para kanamicina es necesario cultivarlo toda la noche (las bacterias con ampicilina, también
pueden dejarse toda la noche).
Pasado el tiempo de crecimiento, ya se tienen los clones.
Cuando el voltaje que atraviesa una membrana plasmática excede su rigidez dieléctrica se forman poros. Si la
fuerza del campo eléctrico aplicado o la duración de la exposición al mismo se eligen apropiadamente, los
poros formados por el pulso eléctrico se sellan tras un corto período, durante el cual los compuestos
extracelulares tienen la oportunidad de entrar a la célula. Sin embargo, una exposición excesiva de células
vivas a campos eléctricos puede causar apoptosis o necrosis, procesos que provocan la muerte celular.
Este procedimiento es también muy eficiente para la introducción de genes externos en células en cultivo,
especialmente en las de mamífero. Por ejemplo, se usa en el proceso de producción de ratones knockout, así
como en el tratamiento de tumores, terapia génica y terapias basadas en células.
Proceso
Por ejemplo, para la electroporación de bacterias suelen utilizarse unos 50 μL de suspensión celular. Antes de
la electroporación las células se mezclan con los plásmidos con los que se quieren transformar. La mezcla se
pipetea en la cubeta, se selecciona el voltaje en el electroporador (unos 240 voltios, por ejemplo) y la cubeta
se inserta en el electroporador. Inmediatamente después de la electroporación se añade 1 ml de medio de
cultivo a las bacterias (en la propia cubeta o en un tubo de microcentrífuga) y se incuban a la temperatura
óptima de las bacterias durante una hora o más para después extenderlas en una placa con agar.