Transformación por choque térmico

La transformación de células competentes, es el proceso gracias al cual podemos introducir nuestro

plásmido en la bacteria. La competencia es un estado fisiológico especial que presentan algunas bacterias de
forma natural, y que podemos inducir en otras, y que las hace especialmente permeables a la entrada de
plásmidos. Esta permeabilidad se debe a alteraciones que sufre la membrana celular.

Al ser un estado fisiológico especial, no todas las bacterias lo presentan, pero si podemos conseguir
mediante el proceso de transformación que ciertas bacterias que no son competentes, adquieran este rasgo de
forma temporal. En mis prácticas, he convertido bacterias, Escherichia Coli, en competentes mediante un
choque térmico en un medio con cationes divalentes, entre ellos el Ca2+.
La combinación de la temperatura y los cationes, aumenta la porosidad de la membrana celular,
facilitando la asimilación de los plásmidos. De esta forma atravesarán la membrana celular cualquier
plásmido que se encuentre en su forma circular o superenrollada. Los plásmidos “lineales” tienen más
dificultad para penetrar la membrana.

Para la transformación seguimos el protocolo siguiente:

1) Toma la reacción de ligación que tenemos en el hielo (ver el post de Ligación de un plásmido a un vector de
clonación) y añade 2 micro litro de ésta sobre el vial de células competentes. Se debe mezclar, agitando muy
suavemente el vial, nunca pipeteando.
2) Incubamos 5-30 minutos en hielo. La duración de ésta etapa no afecta al rendimiento de la transformación y
asimilación.
3) Se procede a realizar el choque térmico de las células que provocará la aparición de poros, con la ayuda del
Ca, en las membranas que dejarán pasar a los plásmidos. Esto es debido a que el Ca se une mediante
interacciones electrostáticas con el ADN (cargado negativamente), y a que tiene afinidad por los lípidos de
membrana (también con densidad de carga negativa). De ésta forma desestabiliza la membrana y acerca el
ADN a ésta. Para ello debemos tener un baño de agua a 42º C, durante 30 segundos. No agitar, ni remover el
vial.

Pasado este tiempo se ponen de nuevo en el hielo rápidamente de forma suave. De esta forma se cierran los
poros. En éste paso mueren una gran proporción de las células, por eso se deben coger cuando están en la fase
logarítmica de crecimiento celular.

4) Se añade 250 micro litro de medio S.O.C al vial de células. El medio SOC es especial para la
transformación de las células competentes. Es un medio isotónico que cubre las necesidades de las células tras
el estrés del choque térmico. Tiene peptona, que aporta nitrógeno y aminoácidos; extracto de levadura que
aporta vitaminas, en especial del grupo B; sales minerales sulfato de magnesio (fuente de magnesio, necesario
por ejemplo para la polimerasa), cloruro de sodio y de potasio necesarios para el transporte y el equilibrio
 osmótico; y la glucosa que aporta la energía y es una fuente de C, utilizada entre otras cosas para reparar la
perforación de la membrana celular tras el choque térmico5.

Triptona 20 g/l
Extracto de levadura 5 g/l
Glucosa 3,6 g/l
Cloruro potásico 0,186 g/l
Cloruro sódico 0,5 g/l
Cloruro magnésico 0,96 g/l
Composición del medio S.O.C.

5) Crecer durante una hora en el vial a 37º C en agitación fuerte (200 rpm).
6) Coge 20-50 micro litro a medios selectivos de cultivo sólidos. Se recomienda tomar dos volúmenes distintos
para que al menos una de las placas tenga las colonias en la cantidad justa para poder picarlas sin problemas.
7) Deja crecer las colonias en estufas de cultivo a 37º C. Si el antibiótico es ampicilina, basta con dejarlas
crecer 8 horas, para kanamicina es necesario cultivarlo toda la noche (las bacterias con ampicilina, también
pueden dejarse toda la noche).
Pasado el tiempo de crecimiento, ya se tienen los clones.

Transformación por electroporación

La electroporación o electropermeabilización consiste en provocar un aumento significativo de la

conductividad eléctrica y la permeabilidad de la membrana plasmática celular mediante un campo eléctrico
aplicado externamente. Es habitual en biología molecular como forma de introducción de diferentes
sustancias en células, como por ejemplo sondas moleculares, un fármaco que puede cambiar las funciones
celulares o un fragmento de DNA codificante, como puede ser un plásmido.

Cuando el voltaje que atraviesa una membrana plasmática excede su rigidez dieléctrica se forman poros. Si la
fuerza del campo eléctrico aplicado o la duración de la exposición al mismo se eligen apropiadamente, los
poros formados por el pulso eléctrico se sellan tras un corto período, durante el cual los compuestos
extracelulares tienen la oportunidad de entrar a la célula. Sin embargo, una exposición excesiva de células
vivas a campos eléctricos puede causar apoptosis o necrosis, procesos que provocan la muerte celular.

En biología molecular, el proceso de electroporación se usa frecuentemente para la transformación de

bacterias, levaduras y protoplastos vegetales. Además de membranas lipídicas, las bacterias también tienen
una pared celular compuesta de peptidoglicano y sus derivados. Sin embargo, las paredes son porosas por
naturaleza y sólo actúan como corazas que protegen a la célula de impactos ambientales severos.
Si se mezclan bacterias y plásmidos, éstos pueden transferirse al interior de las células durante la
electroporación. En este proceso suelen emplearse varios cientos de voltios, que atraviesan una distancia de
varios milímetros. A continuación, las células deben manipularse cuidadosamente hasta que tengan la
oportunidad de dividirse, produciendo nuevas células que contendrán copias del plásmido. Este proceso es
aproximadamente diez veces más eficaz que la transformación por métodos químicos.

Este procedimiento es también muy eficiente para la introducción de genes externos en células en cultivo,
especialmente en las de mamífero. Por ejemplo, se usa en el proceso de producción de ratones knockout, así
como en el tratamiento de tumores, terapia génica y terapias basadas en células.

Proceso

La electroporación se lleva a cabo en un electroporador, un aparato que crea un campo electromagnético a

través de la suspensión celular (típicamente bacterias, aunque se puede aplicar a otros tipos de células, como
se ha comentado anteriormente). La suspensión se pipetea en una cubeta de plástico o vidrio con electrodos de
aluminio en los costados.

Por ejemplo, para la electroporación de bacterias suelen utilizarse unos 50 μL de suspensión celular. Antes de
la electroporación las células se mezclan con los plásmidos con los que se quieren transformar. La mezcla se
pipetea en la cubeta, se selecciona el voltaje en el electroporador (unos 240 voltios, por ejemplo) y la cubeta
se inserta en el electroporador. Inmediatamente después de la electroporación se añade 1 ml de medio de
cultivo a las bacterias (en la propia cubeta o en un tubo de microcentrífuga) y se incuban a la temperatura
óptima de las bacterias durante una hora o más para después extenderlas en una placa con agar.

El éxito de la electroporación depende en gran medida de la pureza de la disolución de plásmido,

especialmente de su contenido en sales. Las disoluciones impuras pueden causar una pequeña explosión (un
arco eléctrico), en cuyo caso las células morirían. Si esto ocurre a menudo, podría ser necesaria una
sedimentación de las células antes de una nueva electroporación.