UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA DE AGRONOMÍA

CURSO: BIOQUÍMICA

PROFESOR:

ALUMNO: MORILLO CHÁVEZ KEVIN JAIR

TRUJILLO – PERÚ
2019
 “Determinación de la KM – Vmax de la fosfatasa acida de
hígado de pollo”

I. Introducción

La cinética enzimática es el campo de la bioquímica que estudia la velocidad de reacción (Vₒ)

y el mecanismo de una reacción, normalmente se miden en términos de cuantos moles (µm)
de sustrato consumidos o productos formados cambian en un periodo de tiempo. Un
mecanismo es una descripción detallada pasa a paso de como una reacción ocurre a nivel
molecular. En las reacciones enzimáticas, donde la curva obtenida en la representación
gráfica Vₒ Vs [S] es una hipérbole Leonor Michaelis y Maude Menten dedujeron el
mecanismo de acción enzimática.
Por lo tanto, la actividad enzimática se ve afectada por varios factores uno de los cuales es la
concentración de sustrato. La constante de Michaelis (KM) se define como la concentración
de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima Vmax y
sirve para conocer la afinidad y saber la concentración mínima de sustrato a la que hay que
realizar los ensayos de actividad enzimática.

II. Objetivos

En la presente practica se realizó el estudio cinético de la fosfatasa acida de un extracto

hepático de pollo para el sustrato pNFP, (sintético, no natural), que permitió en este caso
estudiar el efecto de su concentración sobre la velocidad de reacción de la enzima de estudio
y calcular el KM y la Vmax.
III. Materiales y métodos

 Gradilla
 Tubos de ensayo
 Juego de pipetas de vidrio de 10, 5, 2, 1, 0,1ml
 Baño termostatizado
 Espectrofotómetro

Reactivos

 Extracto crudo de hígado de pollo (descongelado).

 p-nitrofenilfosfato sódico (pNFP) 1ml disuelto en buffer acetato 0.1M pH 5.0.
 Buffer acetato 0.1M pH 5.0.
 NaOH 1N
 Agua destilada

IV. Procedimiento

1° preparar una batería de 7 tubos y añadir los reactivos en el orden y volumen que sigue:

TUBOS B 1 2 3 4 5 6
Buffer acetato (ml) 2.90 2.85 2.80 2.75 2.70 2.40 1.90
Buffer sustrato pNFP (S,ml) ----- 0.05 0.10 0.15 0.20 0.50 1.00
Pre-incubar por 2 min. a
35°C
Extracto crudo de enzima (E, 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
ml)
Incubar por 5 min. A 35°C
Sol. NaOH (ml) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Agua destilada (ml) 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Invertir suavemente, reposar 15min. Y realizar la lectura spectromic 20 a 420
nm
2° Cuando se agita suavemente los tubos permite una mezcla homogénea de los ingredientes
y luego su temporización en un baño termostatizado (condiciones óptimas de °T y pH)

NOTA: Se toma con inicio de la reacción el momento en que se añade la enzima (E, extracto
de hígado), se recomienda añadir cada 30 segundos.

3° Añadiendo del NaOH 1M permite inactivar la enzima y alcalinizar el medio para la

formación del color amarillo desde el punto de vista formado.

4° Leímos las absorbancias a 420nm en el espectrofotómetro ajustando la absorbancia a cero

con el blanco (tubo B) posteriormente recogimos datos de absorbancia para cada tubo.

TUBOS B 1 2 3 4 5 6
Absorbancia a 420nm 0.05 0.08 0.17 0.26 0.32 0.37 0.42

V. Resultados

1 Con la ayuda de la recta patrón anterior calcular los µmol de pNF (P) formados en cada
tubo (anotamos en la tabla de abajo).

2 Calcular la velocidad de reacción (en µmoles de pNF/min.) para cada [S] (pNFP).

3 Calcular los inversos de la velocidad (1/Vo) y [sustrato] (1/[S]) y anotamos en la tabla.

TABLA 1

TUBOS B 1 2 3 4 5 6

ABSORBANCIA A 420NM 0.05 0.08 0.17 0.26 0.32 0.37 0.42

[pNFP] (Mm) ---- 0.01 0.02 0.03 0.04 0.1 0.2

[pNF] [µmol] 27.03 43.24 91.89 140.54 172.27 200 227.03

Vo (µmol min.¯¹) 0.08 0.17 0.27 0.33 0.38 0.43

1/[S] (mM¯¹) 100 50 33.33 25 10 5

1/Vo(min µmol¯¹) 12.5 5.88 3.70 3.03 2.63 2.38

ANEXOS