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Prácticas de Análisis de Laboratorio Microbiológicos
Prácticas de Análisis de Laboratorio Microbiológicos
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3.1 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR LA
TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)
I. Q. Sílvia Salas Sosa
Biol. Guadalupe Martínez Morales (Instructora)
Objetivo específico:
3.1.1Fundamento teórico
Las bacterias del grupo coliformes se utilizan desde el inicio del siglo XX como
indicadoras de contaminación fecal. Fueron definidas siempre como bastoncillos gram
negativos, no formadoras de esporas, que pueden crecer en presencia de sales biliares o de otros
agentes tensoactivos y que fermentan la lactosa a 37°C, con producción de ácido (ácidos
orgánicos y aldehidos) y gas en 24 horas.
Los coliformes totales son clasificados como bacilos gram negativos aerobios y
anaerobios facultativos no esporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y
gas después de incubación durante 24-48 horas a 35°C. Incluye los géneros Citrobacter spp.,
Klebsiella spp., Enterobacter spp., en este último se encuentra la E. coli, exclusiva de heces
animales homeotérmicos.
A través de diluciones sucesivas de la muestra, se busca obtener inóculos de al menos una célula
que presente crecimiento en el medio de cultivo, presentando en prueba presuntiva una
fermentación de la lactosa y en prueba confirmativa, fermentación de lactosa y
producción de gas.
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La cantidad de tubos positivos y negativos permite obtener una estimación de la densidad
de bacterias obtenidas a través de la aplicación de cálculos de probabilidad.
3.1.3 Equipo
3.1.4 Reactivos
3.1.5 Material
• Pipetas serológicas de 10 mL
• Pipetas serológicas de 5 mL
• Pipetas serológicas de 1 mL
• Tubos de cultivo
• Tubos de dilución
• Campanas de Durham
• Tapas metálicas
• Gradillas
• Asas de inoculación
• Bata
• Guantes de latex
• Cubrebocas
Nota: Todo el material que tenga contacto con las muestras debe ser esterilizado mediante
autoclave a 121 °C y 15 lb de presión durante 15 minutos.
3.1.6 Procedimiento
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b) Preparación de la solución de agua de dilución y de los diferentes medios de
cultivo: El responsable del área se encargará de preparar las soluciones conforme al
procedimiento CAMB6-03.
d) Análisis de la muestra.
i) Hacer la siembra en los tubos conteniendo el medio de cultivo Caldo Lactosado con
Purpurea de Bromocresol (CLPB) de concentración simple o doble.
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j) Incubar durante 48 horas a 35 ± 0.5°C y anotar en la bitácora de la incubadora.
k) Cuantificar los tubos positivos (color amarillo y/o producción de gas en la campana
Durham). Anotar en los formatos de la prueba presuntiva.
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m) En tubos de Caldo Lactosado Verde Bilis Brillante al 2% (CLVBB) para análisis de
los coliformes totales, e incubar 48h a 35 ± 0.5°C (incubadora).
n) En tubos de medio EC para análisis de los coliformes fecales, e incubar 24h a 44.5 ±
0.2°C (termobaño).
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p) Cuantificar los tubos positivos y anotar en los formatos de la prueba confirmativa.
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3.2 DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y E. COLI POR LA
TÉCNICA DE SUSTRATO CROMOGÉNICO ESPECÍFICO
I. Q. Sílvia Salas Sosa
Biol. Guadalupe Martínez Morales (Instructora)
Objetivo específico:
3.2.2 Equipo
• Sellador Quanty-Tray
• Incubadora a 35 °C ± 0.5AC
• Lámpara de luz ultravioleta
• Guantes de latex
• Cubrebocas
• Bata
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3.2.3 Reactivos
3.2.4 Material
• 30 frascos para agua de dilución con capacidad para contener 100 ± 2 mL.
• Pipetas serológicas de 10 mL esterilizadas
• 28 placas Quanty-Tray 2000
• 1 aza de inoculación
• 1 mechero de Bunsen
3.2.5 Procedimiento
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d) Desinfectar el área de trabajo con un germicida.
f) Encender el sellador IDEXX. Cuando este listo se encenderá el foco verde. Anotar
en la bitácora del sellador.
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h) Vaciar la dilución en una placa Quanty-Tray.
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k) Examinar las placas a las 24hrs. de acuerdo al procedimiento CATMPB6-02 (cuantificar
los cuadros amarillos y los cuadros que se tornan fluorescentes a la luz U.V.).
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Bibliografía
Tomasini Ortiz A. Cecilia, “Determinación de coliformes totales y E. coli por la técnica del sustrato
cromogenico específico”, procedimiento CATMPB6-02, 17p.
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3.3 TÉCNICA DE HUEVOS DE HELMINTO NMX-AA-SCFI-1999.
M.C. Martha Millán Cabrera
Biol. Guadalupe Martínez Morales (Instructora)
Objetivo específico:
3.3.2 Definiciones
a) Helminto: Término designado a un amplio grupo de organismos que incluye a todos los
gusanos parásitos (de humanos, animales y vegetales) y de vida libre, con formas y
tamaños variados.
3.3.3 Fundamento
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3.3.4 Equipo
3.3.5 Reactivos
Preparación:
Disolver los 800 g de reactivo en 1000 mL de agua desionizada y agitar hasta su completa
disolución. Medir la densidad con el densitómetro y en caso necesario ajustar a 1.3 g/cm3
agregando reactivo o agua según sea el caso.
Preparación
Homogeneizar 650 mL de ácido sulfúrico 0.1 N y con 350 ml de etanol para obtener 1 litro de
la solución ácida- alcohol. Almacene en un recipiente con tapa de rosca.
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Preparación
3.3.6 Material
Preparar un garrafón de plástico, translucido de 8 litros desinfectado con cloro (lo cual evita
que con el uso continuo las paredes del recipiente se deterioren), lavado con agua potable a
chorro y enjuagado con agua destilada. Tomar 5 litros de la muestra problema y
transportarla al laboratorio. La muestra debe estar correctamente etiquetada para evitar
cualquier posible confusión
3.3.8 Interferencias
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3.3.9 Precauciones
3.3.10 Procedimiento
a) Dejar reposar la muestra de cinco litros durante tres horas o toda la noche.
g) Aspirar el sobrenadante al máximo con la ayuda de una bomba de vacío sin mover el
sedimento.
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j) Resuspender las pastillas en 150 mL de ZnSO4 con una densidad de 1.3 y
homogeneizar las pastillas con ayuda de un vórtex o en su caso con aplicadores de
madera y agruparlas en un solo recipiente. Centrifugar a las mismas condiciones.
3.3.11 Cálculos
Contar todos los huevos que aparezcan en la cámara y dividirlo entre 5 que es el volumen
de muestra utilizada. Por último reporte el número de huevos HH/L.
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Bibliografía
Cifuentes E., Gómez M., Téllez MM., Romieu I., Ruiz-Velazco S. Factores de riesgo de
infección por Giardia intestinalis en pueblos agrícolas que practican la irrigación con aguas
residuales en México. Instituto Nacional de Salud Pública.
Irene de Haro Arteaga, Paz María Salazar Schettino, Margarita Cabrera Bravo. Diagnóstico
Morfológico de las Parasitosis, Segunda edición 1995.
Jiménez B., Chávez A., Barrios J. A., Maya C., Salgado V., Manual del curso determinación
y cuantificación de huevos de helminto.
Tay G., Velazco O., Aguilera R., Gutiérrez M. Parasitología Médica, quinta edición.
Soberón y Parra G., Peláez D., Parasitología Médica y Patología Tropical. 1980.
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