CONTENIDO

INTRODUCCIÓN

FUNDAMENTOS Y ALCANCES

INSTRUMENTACIÓN

APLICACIONES
 TÉCNICAS INSTRUMENTALES DE ANÁLISIS
ESPECTROGRAMA
TERMOGRAMA

CROMATOGRAMA
POLAROGRAMA
 CLASIFICACIÓN
Cromatografía

Gases Líquidos

Gas-sólido Gas-líquido Columna Plana

Capa fina Papel

Partición Adsorción Intercambio Exclusión

iónico
Líquido Líquido
Sólido Líquido
Permeación en gel Filtración
 CROMATOGRAFÍA:

Técnica de separación que permite analizar

mezclas complejas.

•La separación se lleva a cabo mediante

equilibrios de distribución de los analitos entre
dos fases: Una fija que puede ser un sólido o un
líquido soportado y una móvil que puede ser un
gas o un líquido.
 DEFINICION DE HPLC

⚫ Es una técnica utilizada para separar los

componentes de una mezcla, que se lleva a cabo
entre dos fases una fija que puede ser un sólido, un
líquido, un gel, un tamiz molecular o una resina
intercambiadora de iones soportados y una móvil
que es un líquido a alta presión
 ALCANCES

Para sustancias:

• Termolábiles
• Compuestos iónicos
• Polímeros
• Macromoléculas
 VENTAJAS LIMITACIONES

• Eficiente, permite alta resolución • La muestra debe de ser

miscible en la fase móvil líquida
• Requiere muestras pequeñas
• Muestras “sucias” requieren de
un clean-up previo
• Alta sensibilidad, detecta ppm y
a menudo ppb (Depende del
Detector) • Es necesario algo de
entrenamiento y experiencia
• Cuantitativas.

• Alta velocidad de análisis.

• Buena exactitud.
CLASIFICACIÓN

Adsorción

Partición Normal
Reversa

Catiónico
Intercambio Iónico Aniónico
PAR IÓNICO

Permeación
Exclusión
Filtración
 MECANISMOS DE SEPARACIÓN

Intercambio Iónico Partición

Xm

S
Adsorción Exclusión
 MECANISMOS DE SEPARACIÓN

✓ Separación basada
Adsorción
en la partición en los
coeficientes de partición
m s
de los analitos entre la
OH OH
OH OH fase móvil y la fase
Si
estacionaria
Partición
Si Si

O O

✓ Separación basada en
la adsorción/desorción
del analito sobre una
superficie polar
 MECANISMOS DE SEPARACIÓN

Separación basada en
el tamaño molecular
del analito y acción de
Intercambio Iónico tamizado del empaque
 Separación basada en el de la columna
intercambio iónico entre
el contraión y la
interacción ionica del
grupo ionico de la fase
enlazada
Exclusión
SEPARACIÓN DE LOS COMPUESTOS

F
A
S
E

M
Ó
V
I
L

Inyección Migración Elución

compuestos
 PROCESO DE SEPARACIÓN.

  
Tiempo 1 
  
  


 

    
  


Tiempo 2     


   


Fase móvil Fase estacionaria


Muestra

 PROCESO DE SEPARACIÓN

  
Tiempo 3     
  
Respuesta

Cromatograma

Tiempo (minutos)
Línea base
CROMATOGRAMA

tr
tr
del detector
Respuesta

tr

Tiempo

tr= tiempo de retención absoluto

ANÁLISIS CUALITATIVO

• Valores de retención corregido (Tiempo,

Distancia y volumen de retención)
• Adición de patrón
• Series Homólogas
• Dos columnas
• Multicolumnas
• Técnicas Auxiliares: IR, RMN, Masas
 Los componentes, en una muestra, si están
presentes se manifiestan por la aparición
de ciertos picos.

tiempo de
retención (tR)
respuesta del detector

altura del pico

inyección área del pico

“pico” del solvente

línea de base

tiempo
 ANÁLISIS POR ADICIÓN DE ESTÁNDAR

Se puede confirmar la presencia o ausencia de un supuesto

componente tras la adición del compuesto conocido a la
muestra, el cromatograma no debe presentar ningún pico nuevo
y debe observarse el aumento de algunos picos ya existentes

▪ Sospecha verdadera
El pico del componente sospechoso aumenta de tamaño

▪ Sospecha falsa
se mantiene el cromatograma inicial pero con la aparición de un
nuevo pico
 X
SOSPECHA FALSA:
APARICION DE NUEVOS PICOS

S2

S1
S3

S1
SOSPECHA VERDADERA:
EL CROMATOGRAMA SE
MANTUVO Y AUMENTÓ EL
PICO DEL COMPONENTE
SOSPECHOSO.
 ANALISIS CUANTITATIVO

• Cuantificación por áreas o alturas.

• C  altura o área del pico

• Métodos de cuantificación.
• Normalización
• Normalización con factor de Respuesta
• Estándar externo
• Estándar interno
 ANALISIS CUANTITATIVO

•La cantidad de determinada sustancia es directamente

proporcional al área del pico obtenido en el cromato
grama.

1 l INYECTADO
2 l INYECTADO

•Existen varios métodos para cuantificar un pico

cromatográfico, siendo los más comunes:

• Normalización con factor de respuesta de 1.0.

• Normalización.
• Estandarización externa.
• Estandarización interna.
 SISTEMA CROMATOGRÁFICO

BOMBA
INYECTOR

FASE MÓVIL

DETECTOR SISTEMA DE DATOS

 PREPARACIÓN DE LA FASE MOVIL:
(DESGASIFICACIÓN Y FILTRACIÓN)

He

• Gas Inerte • Vacío

 FASE MÓVIL
CARACTERÍSTICAS.

•Grado HPLC
•Polaridad
•Viscosidad
•Fuerzas Iónicas y pH
•Solubilidad con la muestra
•Compatibilidad con la columna
PROGRAMACIÓN DE LA FASE MÓVIL.

• ISOCRÁTICO
Una misma composición de fase móvil

• GRADIENTE
Se cambia la composición de la fase móvil
 BOMBAS
%B

Composición
Tiempo
❖ Isocrática
Binaria
Ternaria
❖ Gradiente
Cuaternaria
 CLASIFICACIÓN

⚫ Mecánicas
Reciprocantes
Desplazamiento continuo

⚫ Neumáticas
 REQUISITOS

⚫ Debe producir presiones estables hasta 6000psi

⚫ Mantener el flujo libre de pulsaciones

⚫ Generar intervalos de caudales de flujo (0.1 a

10ml/min)

⚫ Control y reproducibilidad del flujo de solvente

⚫ Componentes de la bomba resistentes a la

corrosión
 INYECTORES

Inyector
Automático

Inyector Manual
 CARACTERÍSTICAS DEL INYECTOR
MANUAL.

• Válvula de 6 puertos

• Utiliza un loop
• 2 posiciones: carga e inyección
• Jeringa para introducir la muestra

• Limpieza manual del loop

 CARACTERÍSTICAS DEL
AUTOMUESTREADOR.

• Automatización
• Productividad
• Lavado automático del loop
• Mayor repetibilidad y precisión
 COLUMNAS
Características Generales

Tamaño de Partícula

Tamaño de Poro

Longitud (10,15,25 cm)

Fase Estacionaria

Diámetro Interno (2,4,4.6 mm)

CLASIFICACIÓN DE COLUMNAS.

⚫ Preparativas

⚫ Analíticas

Diámetros:1 y 6mm
Material: vidrio ó metal
Longitud:0.3 y 6m
 DETECTORES

Índice de Refracción
Uv-vis ( fija)

Uv-vis
Fluorescencia (Arreglo de diodos)
 FUNCIÓN DEL DETECTOR.

Es el encargado de sensar la señal de cada

eluato a la salida de la columna
 DETECTOR DE ÍNDICE DE
REFRACCIÓN.

• Universal
• No destructivo de la muestra
• Baja sensibilidad : %w
• No compatible con gradiente
• Sensible a la temperatura ambiente
 DETECTOR DE UV -VIS

• Alta sensibilidad
• No destructivo
• Selectivo
• Rango 190-700 nm
• Compatible con gradiente
 DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS

Rango 190-700 nm

Rango de Absorbancia -0.005 a 2.6 UA

Ruido a Largo plazo 0.7 x 10 -3 AU/hora

Compatible con gradiente

 DETECTOR DE FLUORESCENCIA.

• Alta sensibilidad
• Compatible con gradiente
• Selectivo:  excitación,  emisión
• Rango de trabajo: 190-700 nm
• Compuestos con fluorescencia nativa (estructura
cíclica conjugada)
• Formación de derivados: Precolumna y Post columna
 ALIMENTOS Y BEBIDAS

Carbohidratos

Ácidos Orgánicos

Vitaminas

Aditivos

Lípidos
Proteínas
y
Aminoácidos

Contaminantes Capsaicinas
 POR QUE ES UNA TÉCNICA…….

• Precisa y Cuantitativa ( Área de pico RSD < 1%)

• Análisis de Multicomponentes en Matrices Complejas.

• Adecuado para Compuestos Termolábiles y no volátiles

• Análisis Rápidos (5 - 30 minutos)

• Detección Sensible y Selectiva (niveles pg –ng)

• Flexible – Amplia Selección de Columnas, Fase Móvil y Detectores

• Automatización
 ALGUNAS APLICACIONES EN ALIMENTOS
⚫ Componentes Naturales SEPARACIÓN DETECCIÓN
⚫ Carbohidratos II, FR IR
⚫ Lípidos, Triglicéridos y Colesteroles FR, SL UV, IR
⚫ Ácidos Grasos y Ácidos Orgánicos II, FR UV, IR
⚫ Proteínas, Péptidos y Amino Ácidos FR, II UV/Vis, FL
⚫ Aditivos
⚫ Acidulantes, Edulcorantes, Emulsificantes FR, SL UV
⚫ Antioxidantes y Conservadores FR UV
⚫ Colorantes y Secantes, Saborizantes FR UV/Vis
⚫ Vitaminas FR UV, FL
⚫ Contaminantes
⚫ Micotoxinas (Aflatoxinas) FR FL, UV
⚫ Pesticidas y Residuos de Fármacos FR UV, FL
⚫ PAHs y Nitrosaminas FR UV, FL

SL: Sólido Liquido

II: Intercambio Iónico FR: Fase Reversa
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACION DE
AZÚCAR EN LECHE CONDENZADA

Tomar una muestra

de leche y diluir con Adicionar Precipitar ,filtrar y
agua ácido sulfúrico diluir la muestra
Diluido y
mezclar

Inyectar al Filtrar en una membrana de

cromatógrafo 0.45 μm
 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

• Detector: UV/ Visible

• Columna: Acero inoxidable LC-18
Diámetro interno: 250cm x 4,6mm
Diámetro de partícula: 5 μm
• Condiciones de operación :
• Flujo: 2 ml/min
• Presión: 150MPa
• Tiempo de corrida:10 min.
• Fase móvil: acetonitrilo-agua 55/45
• Detección UV: 214 nm,
 VITAMINAS
Imprescindibles para el crecimiento de muchos organismos

• Vitaminas hidrosolubles -- ácido ascórbico (Vit. C), Niacina,

Niacinamida (Vit. B2), Piridoxina (Vit. B6), Tiamina (Vit B1),
ácido fólico, Riboflavina, ácido pantoténico,
cianocobalamina (Vit. B12) y Biotina.
• Vitaminas liposolubles --Vitaminas A, D2, D3, E, y K

• HPLC - el mejor método para multivitaminas

• Con columnas C8 y C18 de actividad reducida con

detección UV .
• Vitaminas hidrosolubles: con reactivos de par iónico como
fase móvil .
• Vitaminas Liposolubles: Columna de Sílica con detector de
UV.
 DETERMINACIÓN DE VITAMINA A EN MIELES
POR (HPLC)

Tomar una porción

de miel y agregar Diluir con agua Decantar, extraer
vitamina “A” hasta grado HPLC la fase orgánica y
homogenizar y hexano Diluir con metanol

Inyectar al Filtrar a través de una

cromatógrafo membrana de 0.2 μm
 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

• Detector: UV/ Visible

• Columna: Acero inoxidable LC-18
Diámetro interno: 15cm x 4,6mm Diámetro
de partícula: 5 μm
• Condiciones de operación :
• Flujo: 1,5 ml/min
• Volumen de inyección: 20 μl
• Tiempo de corrida:10 min.
• Fase móvil: Metanol al 100% grado HPLC
• Detección UV: 254 nm,
DETERMINACIÓN DE VITAMINA “A” EN JUGO DE
ZANAHORIA POR (HPLC)

Tomar una muestra

de jugo de Agregar solución Calentar, enfriar,
zanahoria filtrar y de Hidróxido adicionar hexano
diluir de potasio y diluir con
sulfato de sodio

Inyectar al Cubrir el matraz con

cromatógrafo aluminio y reposar la
mezcla por 1hr.
 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

• Detector: UV/ Visible

• Columna: Acero inoxidable LC-18
Diámetro interno: 4.5cm x 250mm
• Condiciones de operación :
• Flujo: 0.75 ml/min
• Fase móvil: Metanol/agua 95/5
• Detección UV: 325 nm,
Vitaminas de extractos de Plantas
Condiciones Cromatográficas

1. Tiamina

2. Ácido Ascórbico
Mezcla de Proteínas

Condiciones Cromatográficas
 Proteínas
De los Blancos del Huevo

Condiciones Cromatográficas
Azúcar/Dulcificantes
en leche desnatada

Condiciones Cromatográficas
 Toxinas en Alimentos
Aflatoxinas en Cacahuates

Condiciones Cromatográficas
Complemento Dietético/ Extracto de Plantas
Vitaminas Gordas-Solubles en Piensos

Condiciones Cromatográficas
Antioxidantes fenólicos en productos de
alimentación grasos

Condiciones Cromatográficas
 Componente de Sabor
Piperina en pimienta negra

1. Piperina

Condiciones Cromatográficas
 Capsaicinoides componente de sabor
Ensayo de Nivel de calor para pepitas de
Habanero

2. Capsaicina

Condiciones Cromatográficas
3. Dihidrocapsaicina
Complemento Dietético / Extracto de Plantas
Tocoferols en Aceite de Palma

Condiciones Cromatográficas
 Conservadores
Ácido Sórbico y Ácido Benzoico

Ácido Benzóico

Ácido Sórbico

Condiciones Cromatográficas
 Esteroides
Anticonceptivo de Hormonas
β - Estradiol

Noretindrona

Condiciones Cromatográficas
 HIDROCARBUROS AROMÁTICOS
POLINUCLEARES
Condiciones Cromatográficas
 AROMÁTICOS
BIFENILOS POLICLORADOS (PCBS)

Condiciones Cromatográficas
BENZIDINA

Condiciones Cromatográficas
Corticosteroides

Condiciones Cromatográficas
FENOLES EN AGENTES CONTAMINADORES
FENOLES DE PRIORIDAD AMBIENTAL

Fenol p-nitrofenol

o-clorofenol
pentaclorofenol

Condiciones Cromatográficas
 ANTIDEPRESIVOS (TRICÍCLICOS)

Condiciones Cromatográficas
 NUCLEÓTIDOS, NUCLEÓSIDOS
ADENINA, ADENOSINA, ATP, ADP Y AMP
1. (ATP) Trifosfato de Adenosina

(AMP) Adenosín Monofosfato

2. (ADP) Adenosín Difosfato

Adenosina
Adenina
Condiciones Cromatográficas
 ANTICONVULSIVOS -
BENZODIAZEPINAS

Flurazepam

Diazepam

Condiciones Cromatográficas
Oxazepam
 Ing. Lilia Palacios Lazcano
E-mail: l_palacios8@yahoo.com.mx