Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Piedras Aguilar Josué Alejandro

Determinación de Proteínas por el método de Lowry y

Bradford

Sección: 1 Grupo: 4IM1

Métodos de Análisis
Determinación de proteínas por el método de Lowry y Bradford

Objetivos:
 Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas
empleando un método fotométrico.
 Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la
precisión y exactitud entre el método de Lowry “Estándar” y Bradford
“Prueba”.
 Conocer el efecto de las sustancias no proteínicas en el desarrollo de
color para ambos métodos.
 Analizar las ventajas y desventajas del método de Lowry y Bradford con
respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas.
Fundamentos:
 Lowry
La determinación de proteínas por este método se basa en el desarrollo de
color, mediante una reacción que se efectúa en dos etapas. La primera cosiste
en la formación de un complejo colorido entre al menos4 enlaces peptídicos de
la proteína y el cobre cúprico en un medio alcalino (Reacción de Biuret).
La segunda es la reducción del reactivo de Folin (Ácido fosfomolibdico, Acido
fosfotungstico). Por el complejo cobre proteína, dando como resultado un color
azul de intensidad proporcional a la concentración de la proteína 590 nm. “La
tonalidad del complejo colorido depende del contenido de tirosina y triptófano”.

Etapa 1.-
Biuret Cu + Proteína Complejo
Condiciones Alcalinas (Por lo menos 4 enlaces Cu – Proteína
(𝑁𝑂2 𝐶𝑂3 , 𝑁𝑎𝑂𝐻) peptídicos)
(Color Azul)
Etapa 2.-
Complejo Reactivo de Folin
Complejo colorido Azul
Cu – Proteína (Acid. Fosfomolibdico y
(Lectura a 590 nm)
(Color Azul) Acid. Fosfotungstico)

Reactivo A: (𝑁𝑂2𝐶𝑂3, 𝑁𝑎𝑂𝐻).

Reactivo B: Sulfato de cobre (Cu).
Reactivo C: Mezclando 1 mL de reactivo B con 50 mL de reactivo A.
Reactivo D: Reactivo de Folin.

 Bradford
La determinación de proteínas implica la reacción del Azul Brillante de
Cromassie G -250, con las proteínas originando un complejo colorido que se
lee a 595 nm. Esta reacción es independiente de la composición de aminoácidos
de las proteínas.
El enlace entre el colorante y la proteína es muy rápido, aproximadamente 2
minutos a temperatura ambiente.
Proteína + Azul de Complejo
Cromassie
Colorante – Proteína
Λ=465
(Lectura a 595 nm)
Datos experimentales “Lowry”

Tabla 1. Curva de calibración de Hemoglobina por met. De

Lowry
Tubo No. Cantidad de proteina (µg)
𝐴590
Serie A Serie B
1 25 0.089 0.078
2 50 0.107 0.127
3 75 0.135 0.145
4 100 0.141 0.17
5 125 0.246 0.261

Curba de calibracion de Hemoglobina

por el metodo de Lowry
0.3 0.261
0.246
0.25

0.2
0.145
ABS.

0.15 0.127
0.107 y = 0.0017x + 0.0341
0.089
0.078
0.1 R² = 0.9745

0.05

0
0 20 40 60 80 100 120 140
[ ]
 Tabla 2. Replicas para análisis estadístico
Tubo No. Cantidad de proteína
(µg)
𝐴590

1 0.175 82.2
2 0.17 79.28
3 0.163 75.2
4 0.179 84.53
5 0.165 76.37
6 0.199 96.2
7 0.168 78.12
8 0.179 84.53
9 0.172 80.45
10 0.166 76.95

Tabla 3. Resultados del análisis estadístico

S 𝑆2 % C.V µ

81.38 6.13 37.66 7.53 76.99 a 85.76

Tabla 4. Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el método de Lowry

Tubo No. Sustancia Cantidad de proteína (µg) Tipo de interferencia
𝐴590 generada

1 Tris pH 7.0 0.038 2.27 Negativa

2 SDS 0.154 69.95 Negativa
3 Glicerol 0.17 79.28 Sin Interferencia
4 TCA 0.084 29.11 Negativa
5 Detergente 0.139 61.2 Negativa

Tabla 5. Prec. Exac. De Lowry

Precisión Exactitud Inexactitud
92.47 8.56 91.51
Datos experimentales Bradford

Tabla 6.Curva de calibración de Hemoglobina por met. De

"Bradford"
Tubo No. Cantidad de proteína
(µg) 𝐴595
Serie A Serie B
1 25 0.286 0.216
2 50 0.336 0.37
3 75 0.386 0.388
4 100 0.436 0.426
5 125 0.536 0.526

Curba de calibracion de Hemoglobina por

el metodo de Lowry
0.6 0.536
0.526
0.5 0.436
0.388
0.386
0.4 0.336
0.286 y = 0.0025x + 0.2115
ABS.

0.3
R² = 0.9781
0.2

0.1

0
0 20 40 60 80 100 120 140
[ ]
 Tabla 7. Replicas para el análisis
estadístico
Tubo No. Cantidad de proteína
(µg)
𝐴595

1 0.297 34.78
2 0.289 31.53
3 0.293 33.15
4 0.296 34.38
5 0.282 28.68
6 0.279 27.46
7 0.294 33.56
8 0.295 33.97
9 0.296 34.38
10 0.299 35.6

Tabla 8. Resultados del análisis estadístico

S 𝑆2 % C.V µ

32.74 2.7 7.29 8.24 30.8 a 34.67

Tabla 9. Efecto de algunas sustancias no proteínicas en el método de Bradford

Tubo No. Sustancia Cantidad de proteína (µg) Tipo de interferencia
generada
𝐴590

1 Tris pH 7.0 0.421 85.23 Positiva

2 Glicerol 0.439 92.56 Positiva
3 Detergente 0.368 63.67 Positiva
4 SDS 0.36 60.41 Positiva
5 TCA 0.265 21.76 Negativa

Tabla 10. Prec. Exac. De

Bradford
Precision Exactitud Inexatitud
91.76 -56.33 156.33
Análisis estadístico entre ambos métodos utilizado para la determinación
de proteínas, Método de prueba “Bradford” y Método de referencia
“Lowry”

Concentración Met. Met. Di Di - Di

de Prueb. Ref. (𝐷𝑖 − 𝑋𝐷𝑖)2
hemoglobina "Bradford" "Lowry"
en (µg) 1 34.78 82.2 -47.42 1.214 1.474
2 31.53 79.28 -47.75 0.884 0.781
3 33.15 75.2 -42.05 6.584 43.349
4 34.38 84.53 -50.15 -1.516 2.298
5 28.68 76.37 -47.69 0.944 0.891
6 27.46 96.2 -68.74 -20.106 404.251
7 33.56 78.12 -44.56 4.074 16.597
8 33.97 84.53 -50.56 -1.926 3.709
9 34.38 80.45 -46.07 2.564 6.574
10 35.6 76.95 -41.35 7.284 53.057
Sumatoria de las diferencias -486.34 Sumatoria 532.983
de las diferencias -48.634

Tabla 12. Interpretación de datos para determinar si

existe o no diferencia significativa
Exactitud t "calculada" < t "tablas" NDSE
-19.99 2.262
Precisión f "calculada" > f "tablas" SDSE
5.153 3.72

Formulario
Discusiones
Para esta práctica se utilizó como método de regencia el método de Lowry y
como método de prueba el método de Bradford.
Sin embargo al obtener la tabla de calibración para hemoglobina por el método
de referencia se observó un comportamiento inadecuado ya que la recta si
cumple con la ley de Bouger y Beer a excepción en las concentraciones de 100
microgramos.
En ese punto de la gráfica se observa una caída en los puntos, pero esto puede
deberse a errores aleatorios o sistemáticos por parte del analista y de los
instrumentos. Un ejemplo de ellos puede ser que analista no cumpla con el
conocimiento necesarios para el manejo de los instrumentos como por ejemplo
no aforar correctamente y hasta cero la pipetas utilizadas y en forma vertical
de frente a la mirada cuidando que el menisco quede por arriba de la línea de
graduación, O bien que no se tuvo cuidado de la cantidad exacta de proteína y
se adiciono más o menos. Sin embargo también se tiene que considerar que
los instrumentos son utilizados por varios analistas y no se conoce el uso que
se le da por parte de cada analista.
Sin embargo al obtener la ecuación de la recta y descartando los puntos
aberrantes se obtiene un coeficiente de relación de 0.9871 con respecto a la
recta y por tal modo la dispersión de los puntos no es tan amplia. Con respecto
al análisis estadístico se obtuvo una desviación estándar de 6.13 lo cual no
existe una dispersión tan grande entre ellos con respecto a la media de los
datos obtenidos. Y un coeficiente de variación de 7.53 %.
Para nuestro método de prueba que este caso fue el método de Bradford
Obtenemos resultados similares sin embargo no existió una cada tan drástica
como con el método de referencia, y de igual manera se descartaron algunos
puntos ya que se alejaban más de la recta trazada, ya que nuestro coeficiente
de relación es aún mayor ya que obtuvimos 0.9889 con respecto a la recta lo
cual nos habla de una bueno similitud. Con una desviación estándar de 2.70 lo
cual que se disminuyó de forma considerable los errores cometidos en el
método anterior y un coeficiente de variación de 8.24.
Es por ello que con este método se cumplió la ley de Bougert y Beer en unas
concentraciones de 25 a 125 microgramos.
Al analizar los métodos por separado se ve un comportamiento bueno y muy
similar entre ellos, pero al ocurre al realizar una análisis estadístico entre
ambos métodos ya que al preparar las réplicas del tubo 3 para el método de
Braford se observa un diferencia significativa muy notable con la
concentración teórica de la curva de calibración.
Para este error puede existir una gran cantidad de explicaciones,
principalmente que para ambos métodos los analistas fueron diferentes. Un
analista se encargó de realizar la curva de calibración y otro las réplicas para
el análisis estadístico en ambos métodos. Lo ideal tuvo que haber sido que solo
un analista fuera encargado de realizar ambos métodos el mismo día y en las
mismas condiciones para disminuir la mayor cantidad de errores.
Ya que analizar ambos métodos obtenemos una diferencia significativa en
cuanto a la precisión y sin diferencia significativa para la exactitud ya que en
el método de prueba las concentraciones calculadas fueron mucho menores a
la concentración teórica esperada y esto se ve reflejado en un resultado con
signo negativo. Sin embargo para este error se notaron bastantes anomalías
entre ellas una de las más importantes que los analistas fueron diferentes y
dos que el material utilizado no estaba del todo limpio y eso puede causar
interferencias entre los métodos.
Conclusiones
En general se puede concluir que ambos métodos cumplen con el objetivo para
la determinación de proteínas en este caso la hemoglobina.
Ambos métodos son buenos para realizar dicha práctica sin embargo ambos
métodos tienen ventajas y desventajas dentro de las ventajas de cada método
se encuentran que para el método de Bradford la cantidad de tiempo es mucho
menor que la cantidad de tiempo con respecto al método de Lowry, Sin
embargo el método de lowry es mucho más estable que el método de Bradford
y aunque más económico con respecto al otro pero no es tan sensible como el
método de Bradford y que el método de Bradford se lleva a cabo en solo una
etapa con respecto al método de Lowry.
En general ambos métodos son considerados métodos de referencia pero para
fines prácticos uno de ellos se consideró como método de prueba y otro como
método de referencia.
Con respecto a las sustancias interferentes utilizadas para cada método tos
las sustancias tuvieron efecto interferente ya fuese + o – y eso fue más notable
en el método de Bradford por la sensibilidad del mismo.
Bibliografía
 Humberto Garcia Arellano, Rafael Vazquez Duhalt, Cuantificación de Proteínas:
Una revisión. Disponible en:
http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_1998_2/bitacora.pdf [Consulta:
20/08/2019].
 Skoog, Duglas A.; F. James Holler; T. A. Nieman. 2001. Principios de Análisis
Instrumental. 5a ed., Editorial Mc Graw Hill Interamericana de España, Madrid,
España.
 Determinación de Proteínas: Método de Bradford. Disponible en:
https://bioquibi.webs.ull.es/practicas/3.pdf [Consulta: 20/08/2019]