CUESTIONARIO 7 (TINCIONES)

1. Describa los dos tipos generales de fijación e indique ¿Cuál emplearía para bacterias y para
protozoarios?
Las dos principales formas de fijación son por calor, donde se realiza una fina extensión de una gota de muestra
liquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire, después, la preparación se pasa rápidamente por la flama de un
mechero, el calor mata a la célula y la adhiere al portaobjetos. La otra forma, la otra forma es la química, la cual no
daña demasiado al microorganismo y se realiza añadiendo una gota de fijador a la muestra, una gota de ácido
oxálico, formaldehido. Así entonces la empleada para bacterias es la fijación por calor mientras que para los
protozoarios la fijación química.

2. ¿Porque hay que esperar que los colorantes básicos sean más eficaces en condiciones alcalinas?
Si hablamos un poco sobre las propiedades de la membrana en microorganismos, pensemos que la carga exterior de
la célula es positiva ya que se encuentran protones en el exterior de ella misma para poder realizar el intercambio de
sustancias que requiere el microorganismo para su funcionamiento, mientras que en el interior se encuentra una carga
negativa por OH- disociados así como grupos fosfato en el medio interno de la célula; un colorante básico tiene una
carga positiva y en efecto requiere de condiciones básicas para poder funcionar ya que al disminuir la acidez (hacia
medio básico) aumenta la carga negativa momentáneamente al exterior de la célula por lo que aumenta la atracción
de la membrana por la apetencia de colorantes básicos así como el interior. Cabe mencionar que las células
bacterianas son abundantes en ácidos nucleídos, los cuales portan cargas negativas en forma de grupo fosfato; éstos
se combinan con colorantes básicos de carga (+). Los colorantes ácidos no tiñen a la célula bacteriana y, por tanto,
pueden utilizarse para teñir al fondo con un color de contraste.

3. De tres ejemplos de colorantes básicos, ácidos y neutros.

Entre los básicos podemos tener: la safranina, la fucsina básica y el cristal violeta.
Entre los ácidos podemos tener: la eosina, la fucsina ácida y el rojo congo.
En los neutros: tenemos el colorante de Romanosky.

4. De las tinciones empleadas en la practica e identifique cual es el colorante primario, el secundario o

mordente usado en cada una de ellas.
En la tinción de gram se tiene: que el colorante primario es el cristal violeta, el colorante secundario es la safranina
mientras que el mordente es el lugol.
En la tinción de Ziehl-Neelsen: el colorante primario es la fucsina, mientras que el colorante secundario es un color
de contraste de preferencia de color azul.
Tinción de esporas: el colorante primario es el verde de malaquita y el colorante secundario es la safranina.
Técnica de rojo congo: el colorante primario es el rojo congo mientras y el mordente de capsula.
Coloración de gránulos metalocromicos: el colorante primario es el colorante de Albert y el mordente es el lugol.

5. Método alternativo de Ziehl-Neelsen

1. Se cubre el portaobjetos con la muestra celular bacteriana en solución de carbofucsina
2. se tiñe durante 30 min aproximadamente.
3. Se lava con agua y posteriormente se agrega H2SO4 al 20% hasta que la película sea amarilla.
4. se realiza un tratamiento con alcohol al 95% por 2 min y se lava con agua.
5. se realiza una tinción de contraste con azul de metileno por 30 seg. , se lava y se deja secar.

6. ¿Que sustancias suelen usarse como mordentes? y de 3 ejemplos

Son sustancias que aumentan la afinidad o la atracción entre la célula y el colorante que por lo general forman
complejos ejemplos básicos son: ácidos, bases, sales metálicas y lugol.

7. Indique el método usado para tinción de flagelos.

También se le denomina la tinción de Lefson por su descubridor; primero el frotiz se deja secar al aire sin
calentamiento para evitar la desproteinización del flagelo (flagelina), se fija químicamente la suspensión bacteriana
mediante formol y se realiza una extensión en el porta, posteriormente se cubre la preparación con una mezcla de
ácido fórmico y el colorante rosa-anilina. La acción del ácido es que a los flagelos los engrasa y engruesa mediante
que el colorante rosa-anilina los tiñe ya que se precipita y se deposita en los flagelos, por último se deja secar al aire.

8. ¿Que son los gránulos meta-cromáticos, que otros nombres reciben y que colorantes se usan para la
tinción?
Las bacterias comúnmente almacenan materiales de reserva en forma de gránulos insolubles depositados como
polímeros neutros y osmóticamente inertes, los gránulos se usan como fuente de carbono cuando se restablece la
síntesis de proteínas y del ácido nucleico, también muchas bacterias acumulan gránulos de polifosfatos las cuales
son reservas de fosforo inorgánico que puede emplearse en la síntesis de ATP. Estos gránulos se conocen a veces
como gránulos de volutina o gránulos metalocromaticos debido a que se tiñen de rojo con un colorante azul, son
característicos de las corinebacterias. Los colorantes que se utilizan son tionina, cristal violeta, violeta de metilo,
safranina, fucsina básica etc.

9. ¿A que se le conoce como tinción negativa y porque recibe ese nombre?

También llamada como tinción de capsula, de tinta china ó rojo congo; como uno de sus nombres los indica es un
tinción para observar la capsula de algunos microorganismos, en esta tinción especial se tiñe todo aquel material que
no es la capsula del microorganismo, quedando un campo negro alrededor de la transparente capsula (en el caso de la
técnica con tinta china) ya que la capsula se encuentra compuesta por ciertos mucopolisacaridos que son
impermeables y no se tiñen con estos compuestos. Estos colorantes usados en la técnica son suspensiones por no
estar totalmente solubilizados (como la tinta china).
Se le llama negativa por el simple hecho de parecerse a un negativo de las fotos caseras, en la que la persona se ve
transparente, mientras que todo el campo exterior de la persona se observa obscuro.

10. Indique como se realiza el método de tinta china para observar la capsula.
Se realiza una preparación en fresco del microorganismo, se añade posteriormente tinta china, las partículas de
carbón de la tinta china no pueden teñir la capsula por tener mucopolisacaridos impermeables de manera de que solo
se obscurece el fondo. Al observar en el microscopio se observan los microorganismos como zonas claras alrededor
de la misma.
¿Qué es una tinción?
-Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar
el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias
que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos
biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios.
-Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar
grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo),
poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso
para resaltar organelos dentro de células individuales.
-Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Las dos principales formas de fijación son por calor, donde
se realiza una fina extensión de una gota de muestra liquida sobre un portaobjetos y
se deja secar al aire, después, la preparación se pasa rápidamente por la flama de un
mechero, el calor mata a la célula y la adhiere al portaobjetos. La otra forma es la
química, la cual no daña demasiado al microorganismo y se realiza añadiendo una gota
de fijador a la muestra, una gota de ácidos, formaldehido y alcoholes. Así entonces la
empleada para bacterias es la fijación por calor mientras que para los protozoarios la
fijación química. La fijación produce generalmente el encogimiento de las células, la
tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son
realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no
pueden realizarse con mucha precisión.
-Los colorantes son sales compuestas por un ión positivo y un ión negativo, uno de los
cuales está coloreado y se conoce como cromófero, el color de los denominados
colorantes básicos está en el ión positivo (tiñen componentes ácidos) (Ejemplos de
colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina), en los
colorantes ácidos está en el ión negativo (tiñen componentes básicos) (. Esos
colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo) y los neutros son sales
compuestas de un colorante ácido y uno básico (colorante de Romanosky).
-Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con
otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente. Un mordiente habitual es el ácido tánico y lugol. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora sí podrá atacar el
colorante.
-Parte auxócroma (reactiva), es responsable, en primer lugar del tipo y velocidad de
reacción entre la fibra celulósica y el colorante.
-Tinción simple son aquellas que utilizan un solo colorante y tienen por misión poner
en evidencia la morfología bacteriana. Adecuada para la observación y /o recopilación
microbiológica general.
-Tinción diferencial. La tinción diferencial requiere más de un tipo de colorante y se
utiliza para distinguir entre varios tipos de células bacterianas. Una tinción diferencial
típicamente consiste de tres pasos principales: primero un colorante primario, el cual se
utiliza para teñir a todas las células en la tinción; enseguida un paso de decoloración, el
cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de células y finalmente un colorante de
contraste, el cual tiñe las células recién decoloradas pero no tiene efecto sobre las
células que aún retienen el colorante primario.
- La reacción de la tinción de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se
encuentra en las paredes celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram positivas
tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen moléculas de
ácido teicoico. El ácido teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en
este proceso de tinción. Un complejo de las moléculas cristal violeta-yodo-ácido teicoico
es muy difícil de remover. Como la pared celular de las células Gram positivas retiene
estos compuestos, es más difícil decolorar una célula Gram positiva que una Gram
negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la célula Gram negativa,
pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de alcohol también disuelve mucho de la capa
exterior de lipopolisacárido de la pared celular de la pared Gram negativa, lo cual
acelera la remoción del colorante primario cristal violeta de estas células.
Cuando otro colorante, usualmente safranina, se añade, las células Gram positivas
siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo de
la safranina. Al final del procedimiento de tinción, las células Gram positivas serán del
color del cristal violeta, o colorante primario, y las células Gram negativas serán del
color de la safranina que es el colorante de contraste.
1. Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar.
2. Añadir 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por completo. Dejar
actuar el colorante durante 1 minuto.
3. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparación con la pízeta sobre el recipiente de
plástico para tinciones.
4. Agregar 1 ó 2 gotas de solución lugol a la preparación, y dejar actuar 1 minuto. Transcurrido el
tiempo, lava.
5. Con cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparación durante
10 segundos.
6. Añadir el colorante de contraste, safranina (1 ó 2 gotas) y dejar actuar durante 30 segundos.
Lava con la pizeta.
7. Dejar secar al aire y observar al microscopio.
-Tinción de Ziehl-Neelsen Coloración diferencial útil en la identificación de
Micobacterias aunque no permite la diferenciación de distintas especies. La
característica de ácido-resistencia de estos microorganismos hacen de esta coloración
un método rápido en el diagnóstico, presuntivo, de infección micobacteriana. Sin
embargo, debe subrayarse que es un diagnóstico presuntivo puesto que la falta de
bacilos ácido-resistentes en la coloración no excluye la presencia de estos. (Los
microorganismos teñidos con el primer colorante rosa o rojo son los ácidos resistentes,
presuntivamente micobacterias. Los otros organismos o células de la tinción son de
color azul.)
1. La muestra puede extenderse directamente en el portaobjetos o bien concentrarla y
examinar el sedimento.
2. Se prepara el frotis de forma habitual y se fija por calor o con alcohol metílico. El
portaobjetos que debe contener la preparación debe ser nuevo o extremadamente
limpio.
3. Cubrir la preparación con Fucsina Básica Fenicada solución según Ziehl y calentar
hasta observar emisiones de vapor pero evitando ebullición. Mantener caliente la
preparación (10-15 minutos).
4. Lavar con agua.
5. Decolorar con Alcohol-Clorhídrico 8:2 durante 1 minuto aproximadamente o bien
hasta que ya no aparezca un color rojo, a continuación lavar con agua.
6. Se realiza una tinción de contraste con Azul de Metileno Fenicado (3-4 minutos).
7. Lavar de nuevo con agua, secar al aire y observar con objetivo de inmersión.
-Tinción de SCHAEFFER-FULTON (tinción de esporas).
Se utiliza en la identificación de especies esporuladas, principalmente en la
identificación de bacilos Grampositivos anaerobios. (Las esporas se tiñen de color
verde y el resto del microorganismo queda teñido de color rosa o rojo).
1. La muestra puede extenderse directamente en el portaobjetos o bien concentrarla y
examinar el sedimento.
2. Se prepara el frotis de forma habitual y se fija por calor.
3. Cubrir la preparación con el colorante Verde de Malaquita (solución acuosa al 7,6%)
y calentar de forma que el disolvente del colorante se evapore.
4. Lavar con agua.
5. Se realiza una tinción de contraste con safranina O solución según Gram-Hucker
durante 1 minuto aproximadamente.
6. Lavar de nuevo con agua, secar al aire y observar.
-tinción de rojo congo. Utilizada para la identificación de K.pneumoniae, ya que al igual
que la tinción de tinta china, el colorante será el único que pueda penetrar al cuerpo del
bacilo sin lograr teñir la cápsula. (el bacilo se observará de color rojo y la cápsula como
un halo transparente).
1. colocar una gota de rojo congo en un portaobjetos.
2. Hacer una suspensión con la cepa, fijar.
3. adicionar mordiente de cápsula por 3 minutos.
4. Secar y observar.
-Tinta china. Se usa ampliamente para poder llevar a cabo la observación de la
presencia o ausencia de cápsula. Ya que el color de la tinta china es negro esto nos va
a permitir la penetración del colorante en ella así que será la única parte del m.o. no
teñido. (La cápsula se observará como una zona transparente alrededor del m.o. que se
teñirá de negro).
1. En un portaobjetos poner una pequeña muestra, una gota de tinta china y un
cubreobjetos, observar en seco fuerte con lente de inmersión.
-Los preparados bacterianos incoloros contra un fondo coloreado se denomina tinción
negativa, una técnica valiosa para la observación de formas generales, tamaños y las
cápsulas celulares. Las distorsiones del tamaño y forma de las células disminuyen al
mínimo porque no se requiere la fijación y las células no captan el colorante.

-Tinción de Loeffler. Se usa para poder llevar a cabo la diferenciación del género
Corynebacterium por medio de la presencia de los gránulos metacromáticos con ayuda
del colorante de Loeffler. (Los gránulos toman el colorante rápidamente y aparecen de
color azul intenso, si se sobretiñó disminuye el contraste con el citoplasma).
1. Cubrir el frotis de azul de metileno y dejarlos durante 1 minuto.
2. Lavar con agua y dejar secar; observar la preparación.

Tinciones Estructurales
Estructura Tinción
Flagelos Método de Fontana-Tribondeau
Método de Leifson
Esporas Método de Moeller
Método de Wirtz-Conklin
Schaeffer-Fulton
Cápsula Método de Hiss
Método de la Tinta china
Rojo congo
Corpúsculos Método de Albert
Gránulos Metacromáticos Método de Loeffler