INFORME DE LABORATORIO.

MEDICIÓN DE BIOMASA CELULAR

Ariel Castillo Moreno

Gabriel González Hidalgo
Gizela Levin Vergara
Sindy Medrano Díaz
Angie Rambao Sánchez

Ing. Ph.D Deivis Lujan Rhenals

Docente de la Asignatura

Biotecnología Alimentaria

Universidad de Córdoba
Facultad de Ingenierías
Ingeniería de Alimentos

2017
 INTRODUCCIÓN

La determinación cuantitativa de la biomasa es un aspecto clave para los bioprocesos ya

que permite establecer las tasas de producción, el consumo de nutrientes, el
comportamiento del crecimiento y los balances de masa de cualquier proceso biológico.
Las técnicas o métodos para medir la cantidad de biomasa más comunes son: conteo
directo en cámaras de Petroof-Hauser y de Neubauer, medición microbiana por densidad
óptica, y medición microbiana por peso seco, los cuales se basan en el conteo directo,
propiedades físicas y en la medición de peso respectivamente.
En la actualidad se ha empezado a mostrar gran interés en métodos alternativos para la
determinación de biomasa. Estos métodos alternativos se basan en conteo indirecto,
fundamentados en algún componente celular o actividad metabólica especifica.
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

DENSIDAD OPTICA
Se tomaron 3 mL de la muestra problema de cada dilución y se llevó al espectofotómetro
a 540nm
Luego, se agregaron 0,7mL de agua destilada a cada tubo para seguir diluyendo las
muestras, debido a que la Ley de Beer y Lamberty dice que el valor de la absorbancia
debe estar comprendido entre valores de 0 y 1, por lo tanto el factor de dilución (FD) sería
el siguiente:
Volumen final 3,7 𝑚𝑙
𝐹𝐷 = = = 1,233
Volumen inicial 3 𝑚𝑙
Tabla 1. Registro de Concentración de células vs Absorbancia

NÚMERO
CONCENTRACIÓN ABSORBANCIA
DE ABSORBANCIA FD
(N° Células/L) REAL
TUBO
1 0 0 1,233 0
2 3050000000 0,222 1,233 0,273726
3 4750000000 0,437 1,233 0,538821
4 11450000000 0,694 1,233 0,855702
5 15750000000 1,017 1,233 1,253961
6 16950000000 1,068 1,233 1,316844
Gráfica 1. Absorbancia vs Concentración de Célul
Se puede observar que los resultados experimentales fueron satisfactorios y de acuerdo a
la teoría fueron coherentes. Por otro lado, la presencia Saccharomyces cerevisiae causó
turbidez en las respectivas diluciones.

ABSORBANCIA
1.2E+11
1E+11
ABSORBANCIA

8E+10
R² = 0.9919
6E+10
4E+10
2E+10
0
0 5E+09 1E+10 1.5E+10 2E+10
CONCENTRACIÓN (N° Células/L)
De los resultados obtenidos por densidad óptica, se puede observar, que a medida que
aumentaba la cantidad de solución madre en los tubos (mayor número de células),
aumentaba también la absorbancia de la muestra, demostrando la ley de Beer- Lamberty,
la cual indica que la absorción de la luz incidente aumenta a medida que lo hace la
concentración de células debido a la turbidez que se presenta en la solución

CONTEO DIRECTO
Cuadrantes y su ubicación

1 2
5
4 3

Tabla 2. Número de células por cuadrante en cada muestra

Muestra Cuadrante Cuadrante Cuadrante Cuadrante Cuadrante

1 2 3 4 5
1 0 0 0 0 0
2 11 12 11 15 12
3 25 23 23 15 9
4 51 42 48 46 42
5 66 65 60 61 63
6 59 66 70 73 71
Para el cálculo del número de células por mililitro de solución determinamos el volumen
del cuadro central de la siguiente manera:
𝑽𝒄𝒄 = 𝐴 ∗ 𝜀
Donde
Vcc: Volumen del cuadro central (mm3)
A: área (mm2)
𝜀: Profundidad (mm)

𝑽𝒄𝒄 = 1 𝑚𝑚2 ∗ 0.1 𝑚𝑚 = 0.1 𝑚𝑚3

Expresado en litros:

1 𝑚3
0.1 𝑚𝑚3 = 1 ∗ 10 −10 𝑚3
1000000000 𝑚𝑚3

1000𝐿
1 ∗ 10 −10 𝑚3 ∗ ( ) = 𝟏 ∗ 𝟏𝟎−𝟕 𝑳
1 𝑚3
El recuento se realizó en el cuadro central, el cual tiene 25 cuadros. A continuación se
calcula el volumen de 1 cuadro:

𝑉𝑐𝑐 1 ∗ 10−7 𝐿
𝑽𝒄 = = = 4 ∗ 10−9 𝐿
25 25

Como se tomaron 5 cuadros del cuadro central de la cámara, se tiene un volumen de:

N° células N° total de células

=
mL Volumen

N° CÉLULAS EN VOLUMEN CONCENTRACIÓN

TUBO
EL RECUENTO (5 CUADROS) (N Células/L)

1 0 2 * 10-8 0

2 61 2 * 10-8 3,05E+09

3 95 2 * 10-8 4,75E+09

4 229 2 * 10-8 1,15E+10

5 315 2 * 10-8 1,58E+10

6 339 2 * 10-8 1,7E+10

Vt = Vc ∗ 5 = 4 ∗ 10−9 𝐿 ∗ 5 = 𝟐 ∗ 𝟏𝟎−𝟖 𝑳
Para determinar el número de células / L en cada tubo aplicamos la fórmula de cálculo de
la concentración celular:
 Tabla 3. Concentración de células en cada tubo

PESO PESO TUBOS

NÚMERO DE ABSORBANCIA
TUBOS + MUESTRA g cel/L
TUBO REAL
SECOS (g) SECA (g)
1 12,6219 12,6225 0 0
2 12,4752 12,4761 0,9 0,273726
3 12,2943 12,2955 1,2 0,538821
4 12,3036 12,3036 0,6 0,855702
5 12,3993 12,4005 1,2 1,253961
6 11,6851 11,6877 2,6 1,316844

El conteo directo es uno de los métodos más usados por su flexibilidad y rápido resultado,
pero las medidas deben ser realizadas muy rigurosamente y esta es su desventaja.

Una vez llevadas las muestras a la cámara de Neubauer a las diferentes concentraciones
se encontró que desde la dilución 4 hasta la 6 el número de células está fuera de lo
recomendado (se sugiere un número comprendido entre 20 a 50 N° células) por lo que se
precisaba una nueva dilución hasta encontrar un rango adecuado, este error de
procedimiento se ve reflejado en el número total de células/ L las cuales superan el rango;
según (Bastidas,2017) “Típicamente, el rango de concentraciones que permite contar el
hematocitómetro está entre 250.000 y 2,5 millones de células por ml. Intentaremos que la
muestra tenga una concentración en torno a 106 (1 millón) aplicando las diluciones
correspondientes. Por otra parte, por encima de 2,5 millones la probabilidad de cometer
errores de conteo crece demasiado, y también el tiempo y esfuerzo necesario para realizar
un recuento con certeza. Por encima de esta concentración es conveniente diluir la muestra
para acercar la concentración al rango óptimo”.

Como se puede observar se reportaron números de células/litros por encima de la

capacidad optima que pueden obtener, lo que incurre en un error.
PESO SECO

Absorbancia vs gr célula/L
3

2.5
y = 8.2775x3 - 15.731x2 + 8.106x - 0.076
2 R² = 0.8762
g cel/L

1.5

0.5

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
-0.5
ABSORBANCIA REAL

Después de obtenidos los resultados es evidente que el crecimiento de le microorganismo

saccharomyces cerevisiae es proporcional a las concentraciones al cual se hizo dichas
diluciones esto se puede comprobar en el comportamiento o la tendencia que tuvo la
concentración vs la absorbancia, quien arrojó que a más concentración mayor absorbancia.
Lo que traduce que este microorganismo crese efectivamente en aerobiosis y en
condiciones adecuada de temperatura, pH, entre otras (Muñoz et al. 2013).
La curva de crecimiento de un microorganismo representa el comportamiento de su
crecimiento a través del tiempo. Con base en ella, se determina cuanto mayor cantidad de
biomasa o de metabolitos (primario o secundarios) si hacemos un contraste entre la curva
de la gráfica anterior y la obtenida en el experimento, se puede evidenciar que tiene una
tendencia muy parecida, aunque lo ideal es tomar el tiempo para poder discutir el tiempo
de adaptación y el tiempo total de crecimiento.
Por otra parte se preguntaría porque crece un microorganismo que se diluye en agua
destilada, de aquí podemos observar que el sustrato o el medio sigue en sus óptimas
condiciones que le permite a este microorganismo desarrollándose.
Otro punto que se puede tocar es, que uno vez este se lleva a evaporación para obtener el
peso seco, la temperatura empieza aumentar su crecimiento se inhibe. 2Según (Muñoz et
al. 2013) los principales resultados con respecto al shock térmico fueron la disminución
progresiva de la biomasa a los 20 minutos bajo shock térmico, quedando con una
concentración de biomasa de 2,1gL-1 después de 4,5 horas de fermentación, y además, la
determinación de azúcares, confirmó una desaceleración en el consumo de éstos desde el
comienzo del shock térmico, quedando con una concentración de 0,182gL-1 una vez
alcanzadas las 3 horas y 20 minutos de fermentación. Adicionalmente, con estos datos, se
pudo obtener parámetros cinéticos, tales como la velocidad específica de crecimiento
(0,188h-1) los cuales fueron de gran importancia para entender el crecimiento de la
Saccharomyces cerevisiae en el proceso de fermentación aerobia.
 CONSULTAS
1. Consulte y explique otros métodos utilizados para la medición de la biomasa
microbiana:
De acuerdo a (Atlas et al1992); (Findlay et al. 1989); (Carmen, A. et, al, 2000)

1.1 Métodos microscópicos mediante epifluorescencia

La microscopia de epifluorescencia comenzó a emplearse a principios de los 70 y hoy
en día se considera como uno de los mejores métodos para la estimación de biomasa.
La epifluorescencia es debida a un agente de fluorocromo, a la adición de algún
anticuerpo marcado con fluorescencia (inmunofluorescencia) o una autoflorescencia
natural debido a la presencia de algún componente celular autofluorescente.
Cuando la epifluorescencia se debe a un agente fluorocromo, el procedimiento consiste
en la tinción de las bacterias con dicho agente y posterior recuento mediante
microscopía óptica con iluminación de epifluorescencia.
La epifluorescencia es un método simple y rápido. No obstante su reproducibilidad está
cuestionada y necesita equipo bastante costoso. La fluorescencia está basada en las
propiedades inmunológicas de las células. Es una técnica muy sensible y específica,
puede realizarse in situ. También puede llevarse a cabo mediante hibridación de sondas
fluorescentes de ADN o ARN (Fluorescent in situ hybridization, FISH) cada vez más
utilizadas en ecología microbiana.

1.2. Métodos de Siembra

El recuento de microorganismos viables se fundamenta en la capacidad de dichas
células de desarrollar una colonia visible en un medio de cultivo apropiado. En los
recuentos en placa por vertido, un volumen de 0,1 – 1 ml de la suspensión
microbiológica se mezcla con el medio de cultivo fundido y parcialmente enfriado en una
placa de Petri. En los recuentos en placa por siembra en superficie, se extiende un
volumen de aproximadamente 0,1 ml de la suspensión sobre la superficie del medio de
cultivo. Los resultados de los recuentos en placa se expresan como unidades
formadoras de colonias (UFC) por unidad de volumen de la suspensión microbiológica.
En el caso de muestras muy diluidas se puede emplear la filtración de membrana, en
las que tras la filtración de la muestra es el filtro el que es colocado finalmente sobre el
agar (Atlas, 1992). Otro tipo de recuentos lo constituyen aquellos que emplean un medio
de cultivo líquido como es el caso de la estimación del número más probable (NMP).

1.3. Métodos Indirectos de determinación de la biomasa

Se encuentran basados en la determinación de algún componente celular específico,
en la cuantificación de alguna actividad enzimática (métodos bioquímicos) o en la
medida de consumo de sustrato o de la formación de algún producto (métodos
cinéticos). Los métodos bioquímicos y cinéticos determinan, más que la viabilidad de
las bacterias la actividad ya que dependen más del estado metabólico de los
microorganismos que del número de individuos.
1.3.1. Componentes celulares específicos
Cualquier componente celular seleccionado para la estimación de la biomasa viva de
una muestra debe responder a tres criterios fundamentales:
• Estar presente únicamente en células vivas.
• Ser rápidamente degradado cuando las células mueran.
• Ser relativamente constante en concentración respecto a cambios en el estado
fisiológico celular y entre distintas especies.

1.3.1.1. Ácidos Nucleicos

La cantidad de ADN se determina mediante espectrofotometría, tras su extracción y
purificación. Existen diversas técnicas, si bien presentan la desventaja de que los
procedimientos de purificación son complejos, con diversas interferencias y bastante
costosos.

1.3.1.2. Proteínas
Existen varias técnicas para el análisis de proteínas totales de una muestra biológica.
Algunos están muy extendidos y se caracterizan por su sensibilidad, rapidez y
simplicidad. Es el caso de las técnicas de Lowry et al. (1951) y Bradford (1916). La
principal desventaja de la determinación de proteínas es que su cantidad en las células
está sujeta a fuertes variaciones debidas, fundamentalmente, a cambios en las
condiciones fisicoquímicas y al estado fisiológico celular.

1.3.1.3. Polisacaridos
Existen varias técnicas para la determinación del ácido murámico en muestras que
contengan microorganismos. Todas ellas se basan en la conversión del ácido murámico
a lactato, seguida del análisis enzimático o químico de la concentración de lactato. El
ácido murámico se extrae de las células mediante una hidrólisis alcalina y se purifica
posteriormente mediante cromatografía de intercambio iónico. Otros análisis más
sensibles necesitan del uso de cromatografía líquida (HPLC) o gaseosa (GC). Todas
estas técnicas son laboriosas, muy largas y necesitan de un equipamiento caro.

1.3.1.4. Lípidos
Las técnicas de análisis se basan, fundamentalmente, en la extracción celular de los
fosfolípidos con un disolvente orgánico, su posterior hidrólisis ácida para liberar el
fosfato y, por último, la determinación colorimétrica de éste. Son técnicas relativamente
sencillas, reproducibles y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fosfato; Findlay et al., 1989).

1.4. Métodos Bioquímicos

Las medidas de alguna actividad enzimática pueden considerarse como una alternativa
a los métodos tradicionales. Los ensayos enzimáticos son simples de realizar y sus
resultados se obtienen rápidamente. Además el equiparniento necesario no es ni
costoso ni complejo. La mayoría de las medidas de actividad enzimática se realiza
 mediante la conversión de sustratos específicos a productos coloreados que son
cuantificados fotométricamente.

1.4.1. Actividad Esterasa

EI principio en el que se basa la técnica del FDA es en el carácter hidrofóbico del
diacetato de fluoresceína, lo que le permite penetrar a través de la bicapa lipídica que
forma la membrana celular. Una vez en el interior celular, es convertido mediante la
actividad esterasa en fluoresceína, molécula de carácter hidrofílico que puede ser
almacenada intracelularmente dada 1ª baja permeabilidad de la membrana a ésta. Ya
que las células muertas se caracterizan por presentar abundantes orificios en sus
membranas, el FDA sólo teñirá células vivas.

1.4.2. Actividad Deshidrogenasa (DHA)

En una muestra biológica, la determinación de la actividad del sistema de transporte
electrónico puede realizarse por medida de la actividad deshidrogenasa. La
determinación de la actividad deshidrogenasa puede hacerse midiendo la capacidad de
los microorganismos para reducir un indicador o colorante redox.

2. Consulte las ventajas y desventajas de cada una de las técnicas utilizadas en el

experimento

2.1 Medición de la biomasa microbiana por conteo directo en cámara de

Neubauer.

Ventajas
 Es un método muy rápido.
 Puede ser utilizada con objetivos de inmersión, aunque la mayoría de los
recuentos se realizan con objetivos secos
 Exacto cuando se trabaja con muestras que contienen poblaciones
abundantes.
 Permite la observación de células viables y no viables.

Desventajas
 Es muy tedioso, no es práctico para un gran número de muestras.
 No distinguen células vivas de células muertas.
 Puede conducir a errores a la hora del conteo por la cantidad y el tamaño de
las células.
 Presenta dificultad de llenado en la cámara con liquido
 Sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 cel/ml).
Por debajo de este valor el Nº de células es poco significativo
estadísticamente. (MARTÍNEZ, 2012)
2.2 Medición de la biomasa microbiana por densidad óptica
Ventajas
 El método turbidimetrico puede realizarse tanto en el rango de luz visible, como el
de ultravioleta dando un gran espectro de acción.
 Se puede trabajar con densidades microbianas bajas, de microorganismos de
tamaño de unos cuantos nanómetros.
 La cuantificación de microorganismos permite establecer la población total de
microorganismos existentes.

Desventajas
 El trabajar con suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y
menor sensibilidad por el bajo nivel de absorción.
 No es posible diferenciar a las células vivas de las muertas.
 No se puede determinar la morfología de las células.
 Las suspensiones con las que se trabajan no deben tener una absorbancia mayor
a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer.

2.3 Medición de la biomasa microbiana por peso seco

Ventajas
 La técnica es útil para grandes volúmenes de muestra (Alché et al. 2016)
 Es sencilla

Desventajas
 En su determinación incluye no solo microorganismos activos, si no
microorganismos muertos, material inerte, polímeros extracelulares y materia
orgánica adsorbida.
 Los componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede
existir alguna degradación.
 La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el
ambiente tiene una humedad relativa alta.
(MARTÍNEZ, 2012)

3. ¿Que son los colorantes supravitales y para qué sirven?

Según (Martínez, 2014) es aquella que se realiza sobre la célula fresca recién obtenida,
con el objeto de realizar una observación de las estructuras teñidas con las células
vivas. Una ventaja que presenta este tipo de tinción es que emplea el colorante sobre
células o tejidos vivos aislados del organismo.

Los tipos de colorantes supravitales más empleados, son:

 Azul de prusia
 Azul de cresilo brillante
 Cristal violeta
 Violeta de metilo
 Nilo azul
 Rojo neutro
 Verde jano
 CONCLUSIONES

Los métodos de medición de crecimiento microbiano desarrollados (conteo directo,

densidad óptica y peso seco), presentaron un acercamiento un tanto preciso al número real
de células que se presentaba en las diferentes diluciones, sin embargo, la exactitud de los
mismos se vió afectada por diferentes situaciones tales como: la falta de diluciones
necesarias, el cansancio visual o las formaciones celulares abundantes para que no
alteraran el resultado; además, del exceso de tiempo que transcurrió entre las diluciones y
las mediciones ya que con esto no sólo aumenta el crecimiento del microorganismo
estudiado, sino también el riesgo de contaminación con otros agentes que se puedan
encontrar en el ambiente o en los instrumentos.
Por lo tanto, se concluye que fue posible comprobar las limitaciones y las ventajas frente a
las mediciones de la biomasa celular que cada uno de los tres métodos puede presentar.
 BIBLIOGRAFÍA
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Nacional de Trujillo. Ciencias Agropecuarias. Ingeniería Agroindustrial. Perú.
Extraído de https://es.slideshare.net/yuricomartinez/determinacion-de-biomasael
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 Alché, L., & Pettinari, J. (2016). Medida del crecimiento. Retrieved

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 Martínez Martínez, D. (2014). Práctica: Tinción supravital con azul de metileno.

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 Carmen, A. et, al. Determinación de la biomasa en procesos biológicos. Grupo de

Ttto de Aguas Residuales. Universidad de Sevilla. Tecnología del Agua. Vol. 205.
Octubre, 2000