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1 | INTRODUCCIÓN
Más allá de su función como regulador biológico del reloj, la melatonina es una molécula
pleiotrópica que tiene su maquinaria sintética en muchos tejidos de vertebrados y ejerce múltiples
efectos fisiológicos. La melatonina actúa como un potente antioxidante y potenciador de la
respuesta inmune, lo que contribuye a su función antiinflamatoria y a su reducción en el estrés del
retículo endoplásmico. La melatonina periférica penetra fácilmente en la barrera hematoencefálica,
lo que le permite ejercer sus efectos sobre diferentes regiones cerebrales y, a la vez, ser sintetizada
localmente por los astrocitos. Además, aunque su efecto sobre la extensión de la vida no ha sido
completamente documentado, la melatonina ejerce múltiples acciones protectoras contra los
procesos de senescencia celular y envejecimiento orgánico. Se ha demostrado que el tratamiento
experimental con melatonina es neuroprotector en modelos de envejecimiento y roedor AD, ya que
su administración disminuyó la acumulación de Aβ y tau hiperfosforilada (p-tau), mejoró la
neuroplasticidad y la supervivencia neuronal, evitó la alteración del aprendizaje y la memoria, y
mejoró la ansiedad y el comportamiento similar a la depresión.
2 | MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 | Animales
En este estudio se usaron cepas adultas adultas de ratones 3xTg-AD que albergan mutaciones AD
familiares PS1/M146V, APPswe y tauP301L. Estos ratones imitan muchas de las características
críticas de la AD, como las patologías amiloide y tau, el aprendizaje y la memoria deteriorados, la
presencia de síntomas conductuales y psicológicos de la demencia (BPSD) y el estrés oxidativo.
Además, los ratones 3xTg-AD reproducen el curso temporal y las áreas afectadas por la patología
amiloide y tau de la neuropatología de la AD. Ratones 3xTg-AD y ratones control NoTg con el mismo
antecedente genético híbrido 129×C57BL/6 fueron derivados de la colonia española de ratones
homocigotos, en la Unidad de Psicología Médica de la Universidad Autónoma de Barcelona. Los
animales se genotiparon usando biopsias de la cola del ratón mediante análisis de PCR de ADN y se
separaron de acuerdo con el genotipo. Todos los animales se alojaron en jaulas Makrolon® bajo
condiciones de laboratorio estándar de alimentos y agua ad libitum, 22 ± 2 ° C, y 12 horas: ciclo de
12 horas de luz-oscuridad. La cría de animales, el tratamiento y los estudios de comportamiento se
realizaron en la Casa de Animales de la Universidad de Barcelona (UB, Barcelona, España). La
manipulación de animales y los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de
Ética para la experimentación animal (CEEA) de la UB (Ref .: DAAM 6523, CEEA), de conformidad
con el Decreto 214/1997 de la Generalitat de Cataluña y la Directiva 2010/63 / UE de la Unión
Europea para experimentos con animales.
A los 6 meses de edad, los ratones 3xTg-AD y NoTg recibieron tratamiento crónico con melatonina
(10 mg / kg de peso corporal) en su agua potable durante 6 meses, lo que corresponde a un período
de estadio patológico moderado a severo. La melatonina (SigmaAldrich, Darmstadt, Alemania) se
disolvió en un volumen mínimo de etanol absoluto (0,065% del volumen final) en botellas protegidas
de la luz y se añadieron al agua potable. Las botellas se cambiaron dos veces por semana y se registró
el consumo de líquido. Los grupos de control recibieron vehículo de etanol en el agua potable. Los
grupos experimentales fueron los siguientes: NoTg control (NoTg-ct), n = 16; NoTg con melatonina
(NoTg-MEL), n = 12; Control 3xTg-AD (3xTg-ct), n = 13; y 3xTg-AD melatonina (3xTg-MEL), n = 11.
2.3 | Pruebas conductuales y cognitivas
Después de completar todas las pruebas conductuales y cognitivas, los animales fueron decapitados
y se recogió sangre completa del tronco. Cerebro fue disecado inmediatamente en hielo para
obtener hipocampo y corteza cerebral.
3 | RESULTADOS
Seis meses de tratamiento con melatonina indujeron un efecto protector contra la patología similar
a AD, subyacente a alteraciones del comportamiento similares a BPSD (Figura 1A-F) y capacidades
mejoradas de aprendizaje y memoria (Figura 1G-I) en ratones de 12 meses. En la prueba de Corner,
los ratones 3xTg-ct presentaron un menor comportamiento exploratorio en comparación con los
ratones NoTg. Sin embargo, el tratamiento con melatonina normalizó eficientemente la latencia de
la alzada (Figura 1A) [genotipo, F (1, 45) = 8.295, P = 0.0061; interacción genotipo x tratamiento, F
(1, 45) = 12.34, P = 0.0010], así como el número total de alzadas (Figura 1B) [genotipo, F (1, 45) =
19.41, P <0.0001; interacción genotipo x tratamiento, F (1, 45) = 5.797, P = 0.0202]. En la prueba de
cuatro agujeros de Boissier, ambas cepas tratadas con melatonina mostraron mejoras en el
comportamiento exploratorio, como lo demostró el número total de exploraciones de cabeceo
(Figura 1C) [tratamiento, F (1, 28) = 5.476, P = 0.0266]. La prueba de caja oscura y luz el tratamiento
con melatonina normalizó el aumento del tiempo de congelación de ratones 3xTg-AD (Figura 1D)
[genotipo, F (1, 26) = 5.169, P = 0.0315; interacción genotipo x tratamiento, F (1, 26) = 5.884, P =
0.0225], además de la latencia para entrar en el área iluminada (Figura 1E) [genotipo, F (1, 28) =
15.88, P = 0.0004; tratamiento, F (1, 28) = 14.31, P = 0.0008; interacción genotipo x tratamiento, F
(1, 28) = 26.09, P <0.0001]. Además, el tratamiento con melatonina aumentó el número de entradas
al área iluminada en ratones NoTg y 3xTg-AD (Figura 1F) [genotipo, F (1, 29) = 11.25, P = 0.0022;
tratamiento, F (1, 29) = 7.481, P = 0.0105]. En la prueba NOR (Figura 1G-I), los ratones 3xTg-ct
exhibieron un déficit de memoria de reconocimiento, mientras que la administración de melatonina
aumentó la capacidad de ambas cepas para recordar objetos familiares a las 2 horas (Figura 1H)
[tratamiento, F (1, 48) = 4.182, P = 0.0464] y a las 24 horas (Figura 1I) [tratamiento, F (1, 48) = 4.632,
P = 0.0364]. Los efectos del tratamiento con melatonina en ratones 3xTg-AD y NoTg demuestran sus
efectos beneficiosos contra la ansiedad y favorecen la exploración y la cognición
independientemente del estado de la enfermedad.
Como se ha demostrado que el tratamiento con melatonina reduce los niveles totales de amiloide,
se intentó investigar si el tratamiento modificaba las proteasas implicadas en la formación de placas
seniles. Los niveles de las secretasas de procesamiento de APP ADAM10 (Figura 3A) y BACE1 (Figura
3B) no fueron diferentes entre las cepas, y el tratamiento con melatonina no modificó sus niveles.
De forma similar, no se observaron diferencias para péptidos que degradan Aβ tales como IDE
(Figura 3C) y neprilisina (Figura 3D). Estos hallazgos sugieren que los efectos de melatonina en los
niveles de Aβ no están asociados con vías específicas de proteostasis de APP en nuestras condiciones
experimentales.
FIGURA 3 - El tratamiento con melatonina no tuvo efecto sobre las secretasas de procesamiento
de APP o las enzimas degradantes de Aβ. Niveles de proteína relativa de ADAM10 (A), BACE1 (B),
IDE (C) y neprilisina (D) de ratones NoTg y 3xTgAD. Análisis en tejido de hipocampo. Los valores
se expresan como media ± SEM (n = 5-8)
El proteosoma es una máquina proteolítica compleja que rompe selectivamente las proteínas
aberrantes, y por lo tanto, investigamos el efecto del tratamiento con melatonina en esta
maquinaria de degradación. El tratamiento con melatonina no tuvo efecto sobre los niveles
elevados de proteína Hsp70 (Figura 4A) [genotipo, F (1, 41) = 28.74, P <0.0001] y los niveles de
proteínas ubiquitinadas (Figura 4B) [genotipo, F (1, 17) = 6.123, P = 0.0242] caracterizado en el tejido
de hipocampo 3xTg-AD. El análisis de Western blot no mostró diferencias en los niveles de las
subunidades centrales del 20S del proteasoma (Figura 4C) entre los ratones NoTg y 3xTg-AD. Sin
embargo, el tratamiento con melatonina indujo un aumento en la actividad tipo tripsina (Figura 4D)
[tratamiento, F (1, 41) = 15.09, P = 0.0004] en la corteza cerebral de ambas cepas, lo que sugiere
que el tratamiento con melatonina mejora la actividad del proteosoma a pesar de sus niveles de
proteína. De acuerdo con esto, la actividad tipo tripsina del proteosoma se redujo al 75% en la
corteza de ratones 3xTg-ct en comparación con la de ratones NoTg-ct. No se detectaron diferencias
en la actividad tipo caspasa (Figura 4E) y tipo quimotripsina (Figura 4F) entre las cepas o
tratamientos. Estos resultados sugieren la eliminación de proteínas aberrantes a través de la mejora
de la actividad del proteasoma como un efecto neuroprotector y promotor de la salud celular de la
melatonina.
Investigamos la activación de la vía de inflamación NF-κB. Los niveles de proteína de NF-κB (Figura
5A) se normalizaron después del tratamiento con melatonina en ratones 3xTg-AD [genotipo, F (1,
47) = 5,915, P = 0,0189; tratamiento, F (1, 47) = 7.741, P = 0.0077] y reducido en ratones NoTg,
demostrando el efecto antiinflamatorio potencial independientemente del estado de la
enfermedad. El tratamiento con melatonina también tuvo un efecto significativo sobre los niveles
de IL-1β escindidos de todos los grupos de ratón (Figura 5B) [tratamiento, F (1, 19) = 6,292, P =
0,0214]. Considerando que el tratamiento con melatonina redujo NF-κB y la forma madura de IL-1β
en el hipocampo, evaluamos los efectos posteriores en la inflamación evaluando la expresión de
ARNm en diferentes interleucinas en el y tejido cerebral de 3xTg-AD NoTg. El tratamiento con
melatonina tuvo un efecto significativo sobre la transcripción de genes proinflamatorios en el
hipocampo 3xTg-AD, concretamente IL-1β detectando la forma precursora (Figura 5C) [t (5) = 4.739,
P = 0.0026] y TNF-α (Figura 5D ) [t (4) = 3.286, P = 0.0152] y una tendencia a disminuir IL-6 (Figura
5E). El tratamiento con melatonina tuvo un efecto significativo sobre la expresión de citoquinas en
la corteza cerebral de todos los grupos de ratones, concretamente IL-1β (Figura 5F) [F (1, 34) = 13.22,
P = 0.0009], TNF-α (Figura 5G) [F (1, 26) = 8.009, P = 0.0089], e IL-6 (Figura 5H) [F (1, 25) = 4.744, P
= 0.0390]; mientras que el factor de genotipo fue solo significativo para IL-6 [F (1, 25) = 19.04, P =
0.0002] con un aumento de 5 veces en 3xTg-ct en comparación con NoTg-ct. La reducción de las
interleucinas inflamatorias en ratones NoTg y 3xTg-AD sugiere que el efecto antiinflamatorio de la
melatonina en ratones sanos y AD puede conducir a la prevención del inflamación y la inflamación
relacionada con la neurodegeneración, por lo tanto, prevenir y / o disminuir las patologías similares
a AD.
También investigamos los efectos del tratamiento con melatonina en Gas6, como una proteína
circulante implicada en la neuroinflamación y la supervivencia neuronal. Los análisis de suero
mostraron niveles de proteína Gas6 similares en ratones NoTg y 3xTg-AD bajo tratamiento de
control y una gran reducción en la concentración de Gas6 en ambas cepas cuando se trataron con
melatonina (Figura 6A) [tratamiento, F (1, 38) = 26.34, P < 0.0001]. En el cerebro, la expresión del
gen Gas6 no fue diferente entre las cepas cuando se analizó en el tejido de la corteza cerebral, ni
fue alterada por el tratamiento con melatonina (Figura 6B). Se sabe que Gas6 interactúa con la
familia TAM de receptores de tirosina quinasa: Tyro3, Axl y Mertk. El análisis de los niveles de
expresión de estos receptores en el tejido cortical mostró que la expresión del receptor Axl (Figura
6C) disminuyó en ratones tratados con melatonina de ambas cepas [tratamiento, F (1, 37) = 4,218,
P <0,0471]. No se observó una reducción significativa en la expresión de Tyro3 (Figura 6D) y Mertk
(Figura 6E). Estos resultados sugieren que la melatonina induce una disminución en la inflamación
sistémica, incluida una disminución en la circulación de Gas6. Este factor también afecta el cerebro,
como lo demuestra la modulación del receptor Axl.
FIGURA 6 - Melatonina moduló el sistema Gas6 / TAM en ratones NoTg y 3xTg-AD. Niveles de
proteína en suero de Gas6 (A), medidos por ELISA. Expresión génica en la corteza cerebral de Gas6
(B), Axl (C), Tyro3 (D) y Mertk (E). Los valores se expresan como media ± SEM (n = 10-12). Análisis
estadístico: A y C, ANOVA de dos vías, efecto del tratamiento $ P <0.05 y $$$ P <0.001
SIRT1 deacetilasa está asociada con la longevidad y la neuroprotección, y por lo tanto, investigamos
los efectos del tratamiento con melatonina en las vías de SIRT1. Los niveles de proteína SIRT1 (Figura
7A) en el hipocampo no fueron diferentes entre las cepas animales. Sin embargo, la administración
de melatonina cambió los niveles de proteína de algunos objetivos SIRT1 en el tejido del hipocampo,
como ac-H4 y ac-p53. No hubo diferencias entre las cepas con respecto a ac-H4 (Figura 7B), pero se
observaron niveles disminuidos en ratones tratados con melatonina [tratamiento, F (1, 34) = 5.542,
P = 0.0245]. La concentración total de p53 no fue diferente entre los grupos, sin embargo, los
ratones 3xTg-ct presentaron mayores niveles de ac-p53 [genotipo, F (1, 20) = 4.362, P = 0.0497] y el
tratamiento con melatonina normalizó la relación entre ac-p53 y p53 total niveles (Figura 7C) en
ratones 3xTg-AD [interacción genotipo x tratamiento, F (1, 20) = 4.413, P = 0.0485]. Estos resultados
muestran que el tratamiento con melatonina aumenta la actividad SIRT1 deacetilasa.
FIGURA 7 - La melatonina mostró activación de la vía neuroprotectora SIRT1 a través del aumento
de la desacetilación de los objetivos SIRT1 en ratones NoTg y 3xTg-AD. Niveles relativos de
proteína para SIRT1 (A) y ac-H4 (B). Proporción entre ac-p53 y la proteína p53 total (C). Análisis
en tejido de hipocampo. Los valores se expresan como media ± SEM (n = 5-10). Análisis
estadístico: B, ANOVA de dos vías, efecto del tratamiento $ P <0.05; D, ANOVA de dos vías, análisis
de efecto principal simple *** P <0.001 en comparación con NoTg, # P <0.05 en comparación con
el tratamiento de control
4 | DISCUSIÓN
Este estudio evaluó los efectos beneficiosos del tratamiento con melatonina sobre la cognición y el
estado cerebral en ratones NoTg y 3xTg-AD. Los ratones 3xTg-AD presentaron deterioro de la
memoria de reconocimiento evaluada mediante la prueba NOR como se informó previamente. Las
observaciones también indicaron un deterioro en el comportamiento exploratorio y un aumento en
la conducta similar a la ansiedad, que comprende el fenotipo de tipo BPSD característico de la cepa
3xTgAD. No obstante, la administración crónica de melatonina indujo un efecto neuroprotector
contra la pérdida de memoria en ratones 3xTg-AD. La melatonina también normalizó el fenotipo de
tipo BPSD, que comprende síntomas neuropsiquiátricos muy prevalentes en pacientes con AD. Tales
hallazgos de mejora en la memoria y el comportamiento general confirman los de estudios previos,
en ratones AD transgénicos tratados con melatonina. Sorprendentemente, la administración crónica
de melatonina también mejoró la memoria de reconocimiento, aumentó la exploración y disminuyó
los rasgos de ansiedad en ratones NoTg, lo que demuestra un efecto de mejora cognitiva y de
inducción del bienestar.