INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DOCTORADO EN CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

PROYECTO DE TESIS
CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS
S100A8 Y S100A9 EN CÉLULAS MONONUCLEARES DE
PACIENTES CON DEPRESIÓN CON Y SIN TRATAMIENTO
FARMACOLÓGICO ANTIDEPRESIVO Y SU VALIDACIÓN EN UN
MODELO MURINO

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTORA EN CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

PRESENTA:
M.C. CONCEPCIÓN GAMBOA SÁNCHEZ

TUTOR EXTERNO: DR. GILBERTO PÉREZ SÁNCHEZ

TUTOR INTERNO: DRA. ETHEL AWILDA GARCÍA LATORRE
COMITÉ TUTORAL
DR. JORGE PACHECO ROSADO
DRA. LUCIA QUEVEDO CORONA
DRA. GLORIA DE LA LUZ LEÓN ÁVILA

MAYO DE 2020
1. ANTECEDENTES
El Trastorno Depresivo Mayor (TDM) es un síndrome psiquiátrico caracterizado por
prolongada tristeza y melancolía, irritabilidad, problemas de sueño y apetito,
anhedonia, pensamientos suicidas y dificultad para la concentración y la memoria
entre otros síntomas, que duran más de dos semanas y no desaparecen a pesar de
que la causa aparente sí lo haya hecho (Belmaker et al., 2008).
Hasta el momento, el diagnóstico para el trastorno depresivo mayor se basa en las
escalas clinimétricas de Hamilton y Beck, que consisten en cuestionarios aplicados
por un profesional experimentado en el área de psiquiatría, que evalúan por puntaje
el estado físico y psicológico del paciente y, co relacionándolo con el expediente
clínico, determinan el grado de severidad de la enfermedad; en este sentido, una
puntuación mayor a 18 en la escala de Hamilton indica la presencia de este
trastorno. A pesar de ser usadas desde 1960, estas escalas han mostrado notables
desventajas: la principal es que se basan únicamente en la percepción tanto del
paciente como del evaluador y no toman en cuenta otros factores bioquímicos del
individuo (Mauthner, 2018).

TRATAMIENTO
Debido a la complejidad de este trastorno, ha sido difícil llegar a un adecuado
diagnóstico y tratamiento, ya que inicialmente se descubrió que existe una alteración
en la neurotransmisión, principalmente de serotonina en el sistema límbico, los
estudios se enfocaron más en esta, encontrándose que en esta patología se da la
recaptura de la serotonina, impidiendo su correcta transmisión. Debido a esto se
desarrollaron los Inhibidores Selectivos de la Recaptura de Serotonina (ISRS), los
cuales mejoran la neurotransmisión (Otte et al., 2016). De estos, el fármaco
fluoxetina es el más recetado y estudiado desde 1972, del cual se han caracterizado
sus propiedades farmacológicas más allá del bloqueo de la recaptura de serotonina,
tales como su acción antioxidante, restaurando los niveles de GSH en cerebro
(Peric’ et al., 2017). También muestra un efecto antiinflamatorio, disminuyendo la
translocación de NF⎢ B, y con esto las concentraciones de IL-1β, TNFα e IL-6
(Kostadinov et al., 2015).

TEORÍA DE LA TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES SOCIALES DE LA

DEPRESIÓN
El sistema nervioso y el sistema inmune han desarrollado una comunicación entre
sí a lo largo de la evolución, dada por neurotransmisores y citocinas, lo cual otorga
al sistema la habilidad de preparar al cuerpo para cualquier tipo de daño.
Al conjunto de alteraciones que se producen en el organismo como respuesta física
ante determinados estímulos dañinos se le conoce como estrés. Existen dos tipos
de estrés: el agudo, que termina una vez que el estímulo se ha eliminado, y el
crónico en el cual el estímulo se prolonga y no logra resolverse (Schiepers et al.,
2005). Dependiendo del tipo de estresor, como respuesta por parte del organismo
se activan vías de señalización que generan una respuesta específica al tipo de
daño. Los estímulos estresores más comúnmente estudiados son los provocados
por microorganismos,que activan la respuesta inmune.
Dicha activación es a su vez sensada por el sistema nervioso, el cual promueve una
serie de respuestas a nivel conductual, cuyo propósito es mantener toda la energía
del organismo centrada en eliminar ese daño, dicha respuesta se conoce en inglés
como “sickness behavior”, que consiste en aletargamiento, aislamiento social,
somnolencia, anhedonia entre otros, y desaparecen una vez que el daño ha sido
eliminado.
Con el desarrollo de vacunas, el cambio en el estilo de vida y la disminución de
amenazas físicas, son los estresores psicosociales los que originan en el individuo
vulnerabilidad ante el daño físico, por lo que tener una respuesta inmune
“anticipada”, es un mecanismo que se activa ante adversidades psicosociales.
Existen dos vías fisiológicas a través de las cuales la respuesta inmune se exacerba
ante un estresor psicosocial:

● El Sistema nervioso simpático: esta vía se encarga de dirigir las respuestas

inmunes innatas mediante la secreción de norepinefrina a nivel sistémico, la
cual señaliza en células inmunes a través de los receptores beta-
adrenérgicos, los cuales modulan la respuesta antiviral mientras que activan
la respuesta inflamatoria (Pinto et al., 2017).
● El eje Hipotálamo-hipófisis-adrenal: bajo condiciones normales, el eje
HPA suprime la respuesta inmune mediante la liberación de
corticosteroides por la glándula adrenal, sin embargo cuando el estímulo se
exacerba y prolonga a través del tiempo, el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal
(HPA) comienza a liberar cantidades elevadas de cortisol, ante las cuales,
como mecanismo compensador, el receptor de glucocorticoides del sistema
inmune crea resistencia ante el estímulo exacerbado, alterando las vías de
señalización río abajo, lo cual desencadena la expresión de citocinas pro
inflamatorias (Dantzer, 2018).
La activación del sistema nervioso simpático y el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal a
causa del estrés crónico en roedores y un 35% de humanos con depresión, tienen
como consecuencia la producción exacerbada de factores pro inflamatorios, que
provocan una inflamación estéril de bajo grado a nivel sistémico, en la que citocinas
pro inflamatorias como IL-1β, IL-6 y TNFα señalizan y comunican de manera
endocrina hacia el cerebro, que sensa estas citocinas y transmite señales hacia la
microglía, la cual se activa y manda mensajes a diversas áreas del sistema
límbico (hipocampo, amígdala, corteza prefrontal, hipotálamo),
desencadenando el llamado “sickness behavior”, y alterando la neurotransmisión en
estas áreas; también otras áreas relacionadas con el dolor (ínsula anterior, corteza
cingulada anterior dorsal) responden ante estímulos inflamatorios, señalizando
hacia el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, aumentando la producción de cortisol con
el fin de preparar el organismo para un posible daño. Como consecuencia, el
individuo no sólo comienza a manifestar cambios conductuales, sino que queda
sensibilizado sistémicamente ante un segundo estresor
En individuos con TDM que presentan inflamación sistémica de bajo grado, los
mecanismos para recuperarse de todas estas afecciones en los sistemas no son
suficientes, generando un fenómeno neuroinflamación, que a su vez manda señales
de daño a nivel periférico (Dean, 2017).
Se teoriza que, por tanto, en la comunicación entre el sistema inmune y el sistema
nervioso central, factores pro inflamatorios podrían estar retroalimentando el
trastorno, aun cuando el estímulo estresor inicial ya haya cesado. Evidencia de esto
han sido las altas concentraciones de DAMPs (HSP70, S100) encontrados en
sueros de pacientes, los cuales que activan vías de señalización para la producción
de citocinas pro inflamatorias que pondrán a girar de nuevo la maquinaria.

La familia de proteínas S100

Estas proteínas de aproximadamente 10 KDa se llamaron S100 por su solubilidad
en sulfato de amonio 100% saturado (Kessel et al., 2013). Las proteínas muestran
un 22-57% de identidad y varían entre 79 y 114 aminoácidos entre ellas. Existen
cuatro subgrupos principales de proteínas S100 en mamíferos (Tabla 2), de los
cuales S100A8 (calgranulina A), S100A9 (calgranulina B) y S100A12 (calgranulina
C) están fuertemente asociados con funciones pro inflamatorias. Particularmente
S100A8 y S100A9 constituyen el 45% de las proteínas citoplasmáticas en
neutrófilos y 5% en monocitos en estado basal (Marenholz et al., 2004).

Proteínas S100A8 y S100A9

La proteína humana S100A8, también conocida como Mrp8 o calgranulina A,

consiste en 93 residuos aminoácidos con un peso molecular de 10.8KDa; mientras
que la proteína S100A9 (Mrp 14 o calgranulina B) contiene 113 aminoácidos
resultando en un peso molecular de 13.2 KDa (Wang et al., 2018).
La combinación con iones divalentes modula la conformación, el plegamiento y la
oligomerización de ambas proteínas, la conformación preferente en condiciones
fisiológicas es la de heterodímero y heterotetrámero (complejo calprotectina). Sin
embargo, para funciones intracelulares de S100A8/A9, la hetero tetramerización
parece ser indispensable para favorecer rearreglos en el citoesqueleto (Vogl et al.,
2012).
El complejo calprotectina se secreta por neutrófilos al medio extracelular en forma
de dímeros, los cuales exhiben efectos pro inflamatorios sobre células endoteliales,
fagocitos y linfocitos mediante la unión a glicosaminoglicanos, RAGE y TLR4, a
través de los cuales induce la translocación de NF-⎢ B y/o IRF3 al núcleo. La
activación de NF-⎢ B resulta en la expresión elevada de IL-1β, IL-6 y TNF-α en
fagocitos en un proceso ligado a la generación de ROS (Wang et al., 2018). En
cerebro de ratón, mS100A8 induce la infiltración de neutrófilos y activación de la
microglia en el hipocampo, promoviendo la ocurrencia y desarrollo de la
neuroinflamación a través de la producción de TNFα e IL-6 (Pruenster et al., 2016).

Inhibidores de S100A8 y S100A9

Existen dos compuestos derivados de la quinolina- 3- carboxamida de segunda
generación desarrollados a partir de la droga antiangiogénica linomida (4-hidroxil-
N, 1-dimetil-2-pxp-N-fenil-1, 2-dihidroquinolina-3-carboxamida; roquinimex) utilizada
para inhibir el crecimiento del cáncer de próstata, pero que fue descartada por su
alta toxicidad (Williamson et al., 2013). Ambos compuestos han sido estudiados en
múltiples enfermedades autoinmunes y ciertos tipos de cáncer, tales son
Paquinimod y Tasquinimod, interactúan con S100A9 en monómero y dimerizado
con S100A8, impidiendo su interacción con el receptor TLR4 o RAGE (Bengtsson
et al., 2012).

Evidencias de S100A8 y S100A9 en depresión

S100A8/A9 han sido usados como biomarcadores de inflamación en una amplia
variedad de desórdenes inflamatorios como como gota, diabetes y obesidad
(Schiopu & Cotoi, 2013). Un cambio en la abundancia de S100A8/A9 es una
característica robusta de envejecimiento en tejidos mamíferos, involucrando un
rango de tipos celulares, incluyendo el sistema nervioso central, lo que sugiere que
S100A8/A9 puede estar involucrada en la inflamación relacionada por la edad (Cotoi
et al., 2014). En el Alzheimer se da una expresión significativa de S100A8 y S100A9,
los cuales son detectados en placas amiloides y microglía activada en cerebros de
ratones y pacientes (Vogl et al, 2012).
En un estudio de 2018 Gong y cols. describieron la presencia de las proteínas
S100A8 y S100A9 (Mrp8 y Mrp14 respectivamente en murino) en cerebro en un
modelo experimental murino de depresión inducida por estrés crónico leve
impredecible; para analizar el papel de esta proteína en el desarrollo de estrés
crónico, se administró una inyección intracraneal de ambas proteínas a ratones no
estresados, lo cual provocó una disminución en la preferencia a la sacarosa
mientras que aumentaba la producción de citocinas proinflamatorias a nivel sérico
Al analizar el comportamiento depresivo mediante la prueba de consumo de
sacarosa, se observó que el porcentaje de preferencia, disminuido en ratones
estresados, se recuperaba cuando estos eran tratados con el compuesto, lo cual no
sólo es indicador de que ambas proteínas son importantes en el desarrollo del
comportamiento depresivo en ratones sino que pueden ser importantes blancos
terapéuticos (Gong et al., 2018).
En un estudio realizado en el Instituto Nacional de Psiquiatría, utilizando marcadores
isobáricos para determinar niveles diferenciales de proteínas en un pool de células
mononucleares de 12 voluntarios sanos, 12 pacientes con TDM sin tratamiento y
otros 12 con tratamiento que no presentaron comorbilidades asociadas a procesos
inflamatorios. En estos pools se identificaron aproximadamente 200 proteínas con
niveles de expresión elevados con respecto a los voluntarios sanos, en este estudio
por primera vez se identificaron las proteínas S100A8 y S100A9 de manera elevada
en células mononucleares de pacientes con TDM severo sin tratamiento, sin
embargo al comparar estos con aquellos que recibieron tratamiento farmacológico,
los niveles principalmente de S100A8 se elevaron de manera considerable incluso
por encima de aquellos de los pacientes sin tratamiento, sin embargo aún queda
por validarse esa información e investigar si los pacientes estaban o no
reaccionando al tratamiento antidepresivo.

2. JUSTIFICACIÓN
En los últimos años, las opiniones de diversos autores coinciden en que las escalas
clinimétricas utilizadas para el diagnóstico y seguimiento clínico de los pacientes
con depresión mayor requieren el soporte de parámetros moleculares para
establecer una correlación adecuada con la condición fisiopatológica del paciente.
Por tanto, identificar los factores bioconductuales que pueden ser blanco para
prevenir y tratar depresión es un asunto de importancia pública.
A pesar de la cantidad sustancial de evidencia que muestra la importancia del
complejo calprotectina sobre enfermedades inflamatorias, poco se sabe sobre su
efecto en el trastorno depresivo mayor.
En vista de su papel en la fisiología de la inflamación, el complejo calprotectina es
un candidato valioso tanto para aplicaciones clínicas como biomarcador y vale la
pena explorar su potencial como blanco terapéutico.
3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
¿Existen alteraciones en los niveles de expresión de S100A8, S100A9 y
calprotectina en pacientes con TDM con tratamiento farmacológico antidepresivo
respecto a voluntarios sanos?
¿Cuál es el efecto de la fluoxetina en la expresión de S100A8, S100A9 y
calprotectina en el TDM?

4. HIPÓTESIS
La expresión de las proteínas S100A8, S100A9 y calprotectina se encuentra
alterada en células mononucleares y de cerebro durante la depresión y bajo el
tratamiento con antidepresivos

5. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la expresión de S100A8, S100A9 y calprotectina en células mononucleares
de pacientes con TDM con y sin tratamiento con antidepresivos y, a través de un
modelo murino experimental de depresión determinar la correlación de la expresión
de S100A8 y S100A9 en células mononucleares de sangre periférica y en cerebro.

6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Validar la expresión de S100A8 y S100A9 en células mononucleares de
sangre periférica (PBMCs) en pacientes con TDM con y sin tratamiento
farmacológico con antidepresivos.

2. Evaluar la correlación de los niveles de expresión de S100A8 y S100A9

PBMCs en pacientes con TDM con la severidad de los síntomas depresivos.

3. Evaluar la expresión de S100A8, S100A9 y calprotectina en células

mononucleares y áreas del cerebro relacionadas con la depresión con y sin
tratamiento con antidepresivos en un modelo murino experimental de
depresión.

4. Evaluar la actividad intracelular y extracelular de calprotectina en PBMCs y

áreas del cerebro relacionadas con la depresión con y sin tratamiento con
antidepresivos en un modelo murino experimental de depresión.
7. METODOLOGÍA
7.1. Diagrama de trabajo para el modelo murino experimental de
depresión

8. RESULTADOS: AVANCES
8.1. MODELO MURINO EXPERIMENTAL DE DEPRESIÓN
8.1.1. Pruebas conductuales: nado forzado
Se realizó la prueba de nado forzado y posteriormente se analizaron los videos para
evaluar el tiempo de nado/inmovilidad y escalado. Los resultados se observan en la
Figura 1.
Figura 1. Prueba de nado forzado. Se comparó el grupo de estrés contra el grupo control. Prueba
T- student de 2 colas

Para la prueba de nado forzado se realizó el análisis de tiempo de inmovilidad, nado

y escalado en 3 ocasiones, que se promediaron y sirvieron posteriormente para
comparación. Los resultados obtenidos muestran una diferencia estadística
significativa en la inmovilidad y el nado, no así para escalado, como se observa en
la Figura 1.
8.1.2. Pruebas conductuales: laberinto elevado en T

A B
Figura 2. Prueba de laberinto elevado en T. A. Prueba de ansiedad comparando el grupo de estrés
antes y después de la restricción crónica. B. Prueba de ansiedad comparando el grupo de estrés
contra el grupo control al final de la restricción.

Para la prueba de laberinto elevado en T se realizó una T-Student de dos colas

pareada para comparar el grupo de estrés antes y después y no pareada para
comparar con el grupo control. No se observó diferencia estadística significativa
entre el grupo control y el grupo de estrés antes de la restricción crónica (figura 2).
8.1.3. Pruebas conductuales: consumo de sacarosa

Figura 3. Pruebas conductuales. Centro: Prueba de consumo de sacarosa por 1h en las 3 semanas
de restricción. Derecha: prueba de consumo de sacarosa por 24h en las 3 semanas de restricción.

En la prueba de consumo de sacarosa por 1 h se observa una disminución

estadísticamente significativa únicamente a la semana 2 en el grupo problema
(estrés). Mientras que, en la prueba de consumo de sacarosa por 24 h el
comportamiento es diferente, y en la semana 1 y 2 no hay diferencia entre ambos
grupos, pero a la semana 3 ya se observa diferencia estadística significativa.
8.1.4. Análisis de los niveles de corticosterona
También se hizo un ELISA competitivo de corticosterona en orina de 24h después
del estrés. Como se observa en la gráfica, a pesar de no ser significativo, se observa
una tendencia a la alta en la concentración de corticosterona urinaria en el grupo de
estrés comparado con el control.
Figura 4 : Gráficas de concentración de corticosterona en orina de 24h después del periodo de
restricción en ratas control y estrés. Media:72402 SEM:12.951 T: 0.2104 p=0.83697

Se estandarizó un método de extracción de proteínas citosólicas, mitocondriales,

nucleares y de membrana tomado de Dimauro et al., 2012, a partir de tejido de bazo.
Se realizaron las estandarizaciones para western blot de la proteína S100A9 de rata,
en un gel de agarosa al 16% (figura 4). Como se observa, en cada uno de los dos
carriles cargados con 50 microgramos de proteína, se observa una banda tenue de
aproximadamente 15 KDa, que coincide con el peso reportado para la proteína
S100A9 en rata.
Figura 5: Western blot de la proteína S100A9R estandarizado en proteínas de
células mononucleares de ratas estresadas con CUMS

8.2. Experimentos con muestras de PBMCs de humanos

De estudios previos de proteómica que dieron origen al proyecto actual, derivó una
base de datos de proteínas expresadas diferencialmente en un pool de células
mononucleares de pacientes con depresión, las cuales se me asignaron para
realizar un análisis bioinformático, la validación de la expresión de dichas proteínas
por PCR en tiempo real en muestras individuales de pacientes (objetivo 1), y la
integración de esta información en un manuscrito para un artículo que será enviado
a la revista Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. Dicho
manuscrito tiene un avance del 80%; cabe destacar que el 20% restante
corresponde a la validación por PCR en tiempo real de la expresión de S100A8,
S100A9, cuya ejecución se encuentra pendiente hasta que las condiciones
laborales/académicas se regularicen.
8.2.1. Análisis bioinformático de proteínas
Se realizó un análisis bioinformático para la identificación de candidatos a
biomarcadores para depresión en células mononucleares de sangre periférica de
pacientes con diagnóstico de depresión mayor con y sin tratamiento farmacológico.
Para realizar este análisis se obtuvo una base de datos de los resultados ya
obtenidos por espectrometría de masas en tándem (TMT) de las muestras de
proteínas de células mononucleares de un pool de pacientes con TDM con y sin
tratamiento, así como de voluntarios sanos (Figura 6).

Figura 6: Mapa de calor de la expresión relativa de las proteínas encontradas en este estudio con
respecto al control. La fila superior corresponde a las proteínas expresadas en pacientes con TDM,
la fila media corresponde a pacientes con TDM bajo tratamiento farmacológico y la fila inferior
corresponde al perfil de expresión de voluntarios sanos.

Se obtuvieron aproximadamente 256 proteínas con una expresión diferencial entre

estos grupos, mismas a las que se les aplicó un análisis bioinformático de la
ontología de estas proteínas utilizando el programa FunRich para caracterizar los
procesos biológicos y moleculares en los cuales éstas proteínas se encontraban
participando. Mismos que se muestran en la figura 7.
A

B
Figura 7. Gráficos de la ontología para procesos biológicos (A) y funciones moleculares (B) en las
que se han reportado las proteínas encontradas en este estudio.

Aquellas proteínas que mostraron la tasa de cambio más abundantes se

seleccionaron para realizar un segundo análisis bioinformático con el programa
DisGeNET, esta vez para caracterizar las interacciones de las proteínas en estas
funciones. Los interactomas mostraron nodos relacionados con funciones biológicas
como degranulación plaquetaria y coagulación, mientras que en funciones
moleculares, las principales interacciones son de interacciones con ácidos
orgánicos y mecanismos de oxidación, en donde se observan S100A8 y S100A9
(Figura 8).
Figura 8. Interactomas de procesos biológicos y moleculares. (A) Interactoma de procesos
biológicos significativos en pacientes con TDM respecto a voluntarios sanos (B) Interactoma de
funciones moleculares significativas en el análisis ontológico de proteínas en PBMCs de pacientes
con TDM respecto a voluntarios sanos.
Basado en un análisis de la literatura se buscaron reportes de las proteínas con
mayor expresión en modelos animales, estudios humanos en depresión y en
enfermedades en general, y a partir de este análisis se realizó un diagrama de Venn
donde se agruparon los genes para visualizar aquellos que no habían sido
reportados. Como se observa en la figura 8, aquellos genes que quedan fuera de el
círculo azul, son aquellos no reportados específicamente en seres humanos con
Trastorno depresivo mayor.

Figura 9. Diagrama de Venn de genes reportados en modelos animales de TDM, humanos con
enfermedades en general y humanos con trastorno depresivo mayor.

Basado en la información proteómica obtenida en estos análisis, se eligieron 10

proteínas para validar por western blot, mismas que se describen en la tabla 3. Las
proteínas fueron seleccionadas con base en su nivel de expresión con respecto al
control: aquellos que tienen un cambio de expresión elevado(RSU1, EWSR1,
S100A8), aquellos que tienen un nivel de expresión moderado(S100A4) y los que
tienen un nivel bajo de expresión (S100A9 y ANXA11). Entre estos también se
seleccionaron algunos ya reportados para dar más peso a la validez interna de este
estudio(AHSG, CA1, YWHAZ, APOA1).
Tabla 2. Tasa de abundancia reportada entre grupos de las proteínas a evaluar como posibles

biomarcadores.

Se obtuvieron un total de 52 muestras de células mononucleares de sangre

periférica, de las cuales 14 fueron de voluntarios sanos, 14 de pacientes con
Trastorno depresivo mayor y 16 de pacientes con trastorno depresivo mayor
sometidos a tratamiento. las características demográficas se muestran en la tabla
3.

8.2.2. Análisis de la expresión génica por PCR en tiempo Real

Para evitar degradación de RNA, se procesó una muestra a la vez, a la que se le

trabajó de la siguiente manera: se realizó la extracción de RNA total a partir de los
tubos de trizol de estas muestras, ya descritos en la hoja técnica del reactivo, se
midió la concentración y pureza de las muestras utilizando el equipo nanodrop 2000,
el cual con 1 microlitro de muestra mostró los índices 260/280 y 260/230, se
consideró una muestra de buena calidad, aquella cuyos índices 260/280 estaban
entre 1.8 y 2 y cuyo índice 260/230 es mayor a 1. Al mismo tiempo se corrió en un
gel de agarosa al 1%, un microlitro de muestras de RNA para ver la integridad de la
muestra, el cual se observa en las siguientes figuras.
 Figura 10: Geles de agarosa
1% con muestras de RNA
obtenidas de células
mononucleares de pacientes
con TDM. Carril 1: marcador de
peso molecular; carriles 2 y 3:
muestra.

Se tomó 1 microgramo de RNA y se procedió a realizar el tratamiento con 1 microlitro

de DNAsa I por 15 minutos a 25°C, para después inactivar a 65°C por 10 minutos.
Una vez realizado esto se pasó a cDNA mediante retrotranscripción y se tomó 1
microlitro para hacer PCR punto final de beta actina. Las muestras se corrieron en
un gel de agarosa al 1%, el cual se observa en la figura 10.

Figura 11: Geles de agarosa 1%

con muestras de RNA obtenidas
de células mononucleares de
pacientes con TDM.(-): Control
negativo; (+): Control positivo; M:
muestra.

También se realizaron las estandarizaciones de western blot para las proteínas

S100A4H, S100A8H, S100A9H, Anexina 11, APOA1, EWSR1 y RSU1. Se
obtuvieron las condiciones para la proteína S100A8H, Anexina 11, S100A4 (Figura
12),EWSR1 y YWHAZ, mientras que SELP, S100A9H y RSU1 continúan en
estandarización.
Figura 12: Western blot de S100A9, S100A8 y B-actina en células mononucleares de humano.
AVANCES DEL SEMESTRE DE SEPTIEMBRE 2020 A FEBRERO

2021

Durante el semestre actual se desarrollaron cuatro aspectos del proyecto de

tesis:
1. Generación de base de datos de pacientes y purificación de ARNs
faltantes para el proyecto de tesis
2. Avances en la redacción del artículo de proteómica para búsqueda de
candidatos a biomarcadores de depresión en células mononucleares
humanas.
3. Implementación de un modelo de Machine Learning para predecir
comportamiento depresivo en ratas.
4. Redacción del artículo de revisión sobre la participación de las proteínas
S100 en enfermedades psiquiátricas.
Dichos aspectos del proyecto se describen a continuación con más detalle
adjuntando las evidencias de los mismos.

1. Generación de base de datos de pacientes y purificación

de ARNs faltantes para el proyecto de tesis
En el periodo del 15 de noviembre al 15 de diciembre de 2020, se obtuvieron
muestras faltantes para completar un número de 42 participantes, de los cuales
12 son voluntarios sanos (HV), 14 son pacientes con diagnóstico de trastorno
depresivo mayor (MDD Mayor depressive disorder) sin tratamiento y 16 son
pacientes con el mismo diagnostico con tratamiento farmacológico antidepresivo
(MDD-treatment patients), que consiste en Inhibidores selectivos de la recaptura
de serotonina. Las características demográficas de los 3 grupos se muestran en
la tabla 3.
Tabla 3. Características demográficas de la población de estudio.

De las muestras de sangre periférica obtenidas se realizó la obtención de células

mononucleares, mismas que fueron almacenadas en trizol a -70°C, posteriormente
se realizó la purificación de RNAm de dichas muestras, para posteriormente realizar
la digestión con DNAsa I (Invitrogen cat. No. 18068-015) siguiendo el protocolo del
fabricante y se procedió a hacer la retrotranscripción para obtener cDNA, mismo
que fue almacenado a -70°C para posterior uso (Figura 13).

2. Avances en la redacción del artículo de proteómica para

búsqueda de candidatos a biomarcadores de depresión en
células mononucleares humanas.
Se avanzó en la redacción del artículo, acortando la sección de metodología en
la parte experimental del estudio por TMT y modificando la sección de discusión,
agregando evidencias del consumo de alcohol en los pacientes con trastorno
depresivo mayor, eso debido al hallazgo de altas concentraciones de la proteína
RSU1 en pacientes depresivos con y sin tratamiento. Se considera mandar el
artículo a la revista “Clinical proteomics”, que publica artículos de proteómica
traslacional en los cuales se aplica la tecnología proteómica a la investigación
clínica y medicina molecular, con un factor de impacto por los últimos dos años
de 2.568 (https://clinicalproteomicsjournal.biomedcentral.com/). Se adjunta el
artículo como evidencia de los avances descritos en este reporte.

3. Implementación de un modelo de Machine Learning para

predecir comportamiento depresivo en ratas.
Como parte de la metodología para definir comportamiento depresivo en ratas,
se diseñó un modelo de aprendizaje automatizado, en el cual se realizó un
escrutinio de la literatura en búsqueda de datos de la prueba de nado forzado y
la concentración sérica de corticosterona. Generando dos bases de datos que
incluyen características de los animales de experimentación (cepa de las ratas,
edad y peso), características del paradigma de estrés y su duración, así como
los datos de la prueba conductual (hora de inicio, tiempos de inmovilidad, nado
y escalado, kit usado para medir corticosterona, concentración media y tipo de
muestra) (Tablas 4 y 5).
Tabla 4. Base de datos de la concentración de corticosterona de ratas control y con
comportamiento depresivo.
Tabla 5. Base de datos de la prueba de nado forzado en ratas control y comportamiento
depresivo.
Posteriormente se trabajó en el protocolo para definir el modelo, el cual consiste
en el entrenamiento del sistema con los datos obtenidos de la literatura,
generando valores de 0 a 1, los cuales serían representados como una sigmoide
en la que 0 representa los valores de las ratas resilientes y 1 representa los
valores producidos por las ratas con comportamiento depresivo (figura 14), una
vez implementado y entrenado el modelo se probaría con los datos generados
por las 8 ratas sometidas a estrés y las 8 ratas control en este estudio.

Figura 14. Propuesta de metodología para la clasificación de ratas resilientes y

comportamiento depresivo utilizando Machine learning.

Esta propuesta se presentó durante el evento online “Summer school of Machine

learning” de la universidad de Scoltek en Rusia, que se llevó a cabo del 16 al 21
de agosto de 2020, en el cual se recibió retroalimentación sobre la propuesta,
cuyos fundamentos de Deep learning fueron aplicados a la generación de un
código para entrenar el proyecto (Figura 15).

Figura 15. Código generado para entrenar el modelo de predicción de comportamiento

depresivo en ratas.
De este curso se obtuvo un certificado que se adjunta a este reporte.
Actualmente se está trabajando en el código para obtener los resultados de
manera gráfica, ya que no se cuenta con datos crudos de ambas pruebas, por
lo que se han solicitado a diversos autores los datos o videos de las pruebas
conductuales realizadas en sus proyectos, recibiendo respuesta por parte de las
páginas de www.noldus.com, que mandó por correo los videos de la prueba de
campo abierto, así como de la página www.nasa.gov, que proporcionó datos de
corticosterona sérica de ratones control de la cepa C57 BL/6, continuando así
con la elaboración de la base de datos. Este proyecto derivará en la redacción
de un artículo donde se comparará la efectividad de los distintos paradigmas de
estrés para evaluar comportamiento depresivo en roedores a través de los
resultados de sus pruebas conductuales, el cual contará con la siguiente
estructura:

IMPLEMENTACIÓN DE UN MODELO DE MACHINE LEARNING PARA

PREDECIR DEPRESSIVE-LIKE BEHAVIOR EN RATAS

INTRODUCCIÓN

1. El estudio del estrés y su importancia a través de los distintos paradigmas

en roedores
2. Breve descripción de los paradigmas y cómo se evalúan
3. Participación de la corticosterona en el estrés crónico, evaluación y
metodología
4. El problema de la subjetividad con que los paradigmas son evaluados,
necesidad de crear un modelo
MATERIALES y MÉTODOS
DATASETS generados a partir de revisión de la literatura
Nado Forzado
Corticosterona sérica
Prueba de consumo de sacarosa
PROGRAMAS
Python
TEMAS A EVALUAR
1. Definición de depressive-like behavior, ansiedad y control
2. Confiabilidad de los niveles de corticosterona y las pruebas conductuales
para evaluar estrés agudo y/o crónico
3. Evaluación de la efectividad de los paradigmas de inmovilidad y
restricción crónica
 4. Redacción del artículo de revisión sobre la participación de las
proteínas S100 en enfermedades psiquiátricas.

Se realizó la búsqueda en la literatura de las investigaciones que se están

realizando sobre las proteínas S100 en distintas enfermedades psiquiátricas,
encontrándose que en dichos padecimientos se han detectado alteraciones en
las concentraciones de las proteínas S100, por lo que se procedió a realizar una
revisión de la literatura en la que se reportan evidencias de la presencia e
importancia de las proteínas S100 en el neurodesarrollo así como su
participación en la fisiopatología, diagnóstico y tratamiento de enfermedades
psiquiátricas, utilizando la siguiente estructura:

S100 PROTEINS IN PSYCHIATRIC DISEASES

INTRODUCCIÓN
Generalidades de las proteínas S100
Estructura
Síntesis y formación de dímeros

IMPORTANCIA DE LAS PROTEÍNAS S100 EN EL SISTEMA NERVIOSO

CENTRAL
Reportes de las proteínas S100 en el desarrollo y funcionamiento del SNC

S100 EN DESÓRDENES PSIQUIÁTRICOS

Ansiedad
Esquizofrenia
Trastorno Depresivo Mayor
Trastorno Bipolar
TDAH y Autismo

Tratamiento, conclusiones y perspectivas

Actualmente el artículo cuenta con un 60% de avance en su redacción,

generación de tablas y figuras. La evidencia de los avances de dicho trabajo se
adjunta a este reporte.
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