UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

PROYECTO DE TESIS

“Efecto de la concentración de NaCl y relación C:N en la

producción de polihidroxialcanoatos (PHA) por Halomonas sp en
cultivo por lote a nivel de laboratorio.”

AUTORES:
Moya Calderon Delia Pierina
Ore Macedo Heber Jonatan

ASESOR:
Dr. Roberto J. Vega Paulino

NUEVO CHIMBOTE – PERÚ

2018
 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

PROYECTO DE TESIS

“Efecto de la concentración de NaCl y relación C:N en la

producción de polihidroxialcanoatos (PHA) por Halomonas sp en
cultivo por lote a nivel de laboratorio.”

AUTORES:
Moya Calderon Delia Pierina
Ore Macedo Heber Jonatan

Revisado y aprobado por el Asesor

………………………………………………………….

NUEVO CHIMBOTE – PERÚ

2018
l. GENERALIDADES

1.1. TÍTULO
Efecto de la concentración de NaCl y relación C:N en la
producción de polihidroxialcanoatos (PHA) por Halomonas sp en
cultivo por lote a nivel de laboratorio.

1.2. PERSONAL INVESTIGADOR

1.2.1. AUTOR (es):
.
 Moya Calderon Delia Pierina
 Ore Macedo Heber Jonatan

1.2.2. ASESOR: Dr. Roberto J. Vega Paulino

• Docente visitante del Dpto. Académico de Biología, Microbiología
y Biotecnología de la Universidad Nacional del Santa

1.3. TIPO DE INVESTIGACIÓN

1.3.1. Por su propósito: Aplicada
1.3.2. Por su naturaleza o profundidad: Investigación
explicativa

1.4. LOCALIDAD E INSTITUCIÓN D O N D E SE DESARROLLARÁ

EL PROYECTO
• Nuevo Chimbote, D e p a rt ame n t o de Ancash, Universidad
Nacional del Santa - Laboratorio de Investigación.

1.5. DURACION
• 8 meses

1.6. CRONOGRAMA DE TRABAJO

PERIODO 2017-2018
Mes Mes Mes Mes Mes Mes Mes Mes
ACCIONES
1 2 3 4 5 6 7 8
Preparación del PTI x
Preparación de técnicas e
x x
instrumentos
Recolección de datos x x x x
Análisis e interpretación
x x
de resultados
Elaboración de informe
x x
final
Presentación y
x
sustentación

1.7 RECURSOS (PERSONAL, EQUIPOS, MATERIALES, SERVICIOS)

RECURSO DISPONIBLES Cantidad Código de partida

Material biológico Aislado

Material de laboratorio (vidrio) 40

Reactivos y sustancias diversas 15

RECURSO NO DISPONIBLES

Adquisición de bienes, equipos e 5

instrumentos de laboratorio

Servicios diversos

1.8. PRESUPUESTO ANALÍTICO EN BASE AL CLASIFICADOR DE

GASTOS VIGENTE

Código de partida Descripción de partida Costo (S/.)

especifica especifica

1.9 FINANCIAMIENTO

Financiador Aporte (S/.) Participación (S/.)

UNS 600 66.67 %
Autofinanciado 300 33.33 %
TOTAL 900 100 %
 lI. PLAN DE INVESTIGACION

2.1. Antecedentes
Un primer trabajo corresponde a Koller et al. (2011); quien presentó un
artículo científico: “Perspectivas en polihidroxialcanoatos producido por
microorganismos” en la Universidad de Tecnología, Graz, Austria. En este
trabajo destaca la importancia de tener una mejor comprensión de la ecología
de los microorganismos productores de PHA a fin de que tales
conocimientos, como la evaluación del ciclo de vida, sirvan de base para
procesos de producción sostenible (tanto en el aspecto económico como en
el medio ambiente) de una manera más limpia previo a su implementación
industrial.
Describe que, la competencia económica entre la producción de PHA con
polímeros a base de gasolina es un potente limitante debido a la
comercialización a bajo costo de éste último; sin embargo, tal problema se
mitiga aprovechando la diversidad filogenética y el estilo de vida de tales
microorganismos productos de PHA junto a la utilización de materiales
renovables.
A lo largo de la publicación, Koller detalla y compara métodos para la
detección y caracterización rápida y precisa de PHA en células bacterianas;
asimismo, describe la presencia e importancia de éstas en diferentes
ecosistemas.

Un segundo trabajo de Mothes et. al (2008), se denomina: “Coproducción

biotecnológica de solutos compatibles y polihidroxialcanoatos utilizando el
género Halomonas” en el Instituto Saxon para Biotecnología aplicada,
Leipzig, Alemania. Se trata de un proyecto de investigación centrado en el
análisis de la síntesis de PHA con la producción simultánea de ectoína dado
por la bacteria moderadamente halófila Halomonas elongata.
La bacteria acumuló 50% p/p de PHA junto a un 14% de ectoína en un lapso
de 2 a 3 días en condiciones de laboratorio escalando de matraces de 500
ml a un biorreactor de 2 litros. Se realizó en un medio mineral con un ph de 7
a 30°C con 120 rpm, utilizando glucosa como única fuente de carbono y
energía; la biomasa fue cuantificada espectrométricamente a 700 nm, la
concentración de glucosa por HPLC y el contenido de PHA por cromatografía
de gases. Se utilizaron procedimientos simples de transfusión y filtración
(etapa dowstream) para reducción de costos.
Para el proceso, se resaltan las características favorables de H. elongata
como la capacidad de crecer a concentraciones de NaCl entre 30 y 200 g/L.

Flores Velásquez et. al (2018), presentaron un artículo científico:

“Rendimiento de polihidroxialcanoatos (PHA) en microorganismos halófilos
aislados de salinas”, en La Universidad Mayor de San Marcos, Lima, Perú.
En el trabajo determinan el rendimiento de polihidroxialcanoatos (PHA)
producido por microorganismos aislados de suelos y aguas de las Salinas de
Lambayeque.
Utilizaron un medio HM1 con glucosa y HM2 a 30°C, con 125 rpm,
modificando las concentraciones de NaCl a 15, 20 y 25 g/100 ml. Del 100%
de microorganismos aislados, el 30% obtuvo células con PHA de entre 62 a
91 a las 144 horas; el 35%, de entre 49 a 61 a las 168 horas; en el 20%, de
entre 65 a 84 a las 192 horas, y en el 15%, de entre 45 a 48 a las 216 horas.
La mayor producción de PHA fue a una concentración de NaCl de 25%, con
un aproximado de 69 células de PHA a 144 horas, con un biomasa de 0.575
g/L y un Yp/x de 0.725 g/g.

Rojas Fernández et. al (2016), realizaron un proyecto de investigación

científica: “Producción de polihidroxialcanoatos (PHAs) A PARTIR DE
Ralstonia eutropha en un medio de harina con yuca como fuente de carbono”,
en La Universidad del Cauca, Popayán, Colombia.
En la investigación, se estudió la producción de PHA mediante fermentación
bacteriana de glucosa, obtenida a partir de harina de yuca HMC1 empleando
Ralstonia eutropha en un medio con diferentes relaciones carbono/nitrógeno
(12:1, 16:1, 20:1, 24:1, 28:1) siendo la relación óptima de 20 que favorece la
acumulación intracelular del biopolímero alcanzando una producción de 0.62
g/L de PHA.
En el proceso, de hidrólisis enzimática para la obtención de jarabe de glucosa
a partir de harina de yuca se logró obtener un equivalente de dextrosa del
79%, corroborando un alto rendimiento del proceso. Esta hidrólisis, no generó
productos secundarios que actúen como compuestos antagónicos para el
desarrollo de la bacteria en el medio de fermentación.

Teniendo en consideración los antecedentes, planteamos e l siguiente problema:

¿Cuál es el efecto de la concentración de NaCl y relación C:N en la
producción de PHA por Halomonas sp en un cultivo por lote. a nivel de
laboratorio?

2.2. Justificación del problema

La presente investigación se enmarca en encontrar las condiciones óptimas
de salinidad y relación C:N para la producción de PHA por medio de
microorganismos obtenidos de ambientes salinos y obtener aquella con una
alta productividad, presentándolas como posibles cepas productoras de PHA
a nivel industrial. Estos microorganismos presentarán una ventaja de otros
microorganismos productoras de PHA debido a su crecimiento óptimo en
condiciones salinas, haciendo que el proceso de producción de PHA sea
realizado en condiciones no estériles, disminuyendo la probabilidad de
contaminación por parte de otros microorganismos, y ofreciendo una
alternativa en la reducción de costo.
 2.3. Importancia
La innovación de alternativas para la sustitución del plástico convencional
viene siendo la tendencia en estos últimos años ante la imposibilidad del
tratamiento del plástico. Existen actualmente diferentes alternativas, de las
cuales el PHA viene ocupando un lugar muy privilegiado debido a las
propiedades similares del plástico convencional, así como ser de naturaleza
degradable.
Si bien la producción de PHA se presenta como una alternativa frente a la
problemática que trae consigo el uso del plástico convencional, no significa
una solución real y total hasta ahora debido a las limitaciones económicas
que trae consigo la producción de este, generalmente enmarcado en la
productividad de parte de los microorganismos productores de PHA y en el
costo significativo de producción.
Por lo tanto, este proyecto se enmarca en el aislamiento de microorganismos,
que es uno de los proyectos con mayor interés de parte de diferentes
científicos del mundo (como investigaciones hechas por Yoji, 2017; Rosa
Margesin y Franz Schinner, 2011) con la finalidad de encontrar
microrganismos con características óptimas que puedan aminorar el costo de
producción de PHA.
El aislamiento de microrganismos será en ambientes salinos en el litoral
norteño del Perú, proponiendo aquellos con alta productividad para realizar
procesos que no requerirán la esterilización de la materia prima,
aprovechándose que estos microorganismos crecen en condiciones salinas.
Estas ventajas se convierten para la industria en una baja de costo de
producción debido al ahorro energético provenientes de la operación de
esterilizado, así como el coste del equipo donde se realiza esta operación.
Estos microorganismos halófilos también permitirían una ventaja para la
realización de procesos en lote y continúo debido a que la probabilidad de
contaminación es baja, siendo este último punto uno de los limitadores para
usar estos tipos de cultivo debido a la alimentación propia de cada cultivo y
de una posible contaminación en el flujo de salida en el caso del cultivo
continúo debido a las condiciones salinas en el que se lleva el proceso.
En la continuación del proyecto, es importante también determinar las
condiciones C: N y de salinidad optimas en la productividad de PHA en las
cepas seleccionadas con la finalidad de promover y ofrecer una solución real
en la reducción de costo en la producción de PHA mediante el uso de
bacterias halófilas a nivel industrial.

2.4. Objetivos

2.4.1. Objetivo general

Determinar el efecto de la concentración de NaCl y relación C:N en la producción
de polihidroxialcanoatos en cultivo por lote por Halomonas sp a nivel de
laboratorio.

2.4.2 Objetivos específicos

 Aislar e identificar una o varias cepa(s) de Halomonas sp productoras

de PHA de Las Salinas de Huacho y/o de los humedales en los
alrededores de la Mina La Salinera.
 Diseñar un medio de cultivo para la fermentación de la(s) cepa(s) de
Halomonas sp seleccionada para la producción de PHA por lote.
 Evaluar el efecto de la concentración de NaCl y relación C:N sobre el
Yx/s, Qp y Rx mediante la metodología de diseño factorial.

2.5. Hipótesis

En la producción de polihidroxialcanoatos (PHA), utilizando concentraciones

de NaCl de 16%, 24%, 30% y relaciones C:N de 16, 20 y 14; el tratamiento
más adecuado que produce un mayor rendimiento en términos de Qp, Yx/s y
Rx por Halomonas sp. en un cultivo por lote a nivel de laboratorio es a una
concentración de NaCl de 24% con una relación C:N de 20.

2.6 Marco Referencial (Marco Teórico)

POLIHIDROXIALCANOATOS:
Polihidroxialcanoatos (PHA), plástico biodegradable

En definición se puede decir que los Polihidroxialcanoatos son compuestos

de almacenamiento de bacterias que se acumulan en el interior de la célula
(Margesin & Schinner, 2001), sin embargo, ya desde un punto de vista
químicos, los Polihidroxialcanoatos son biopoliésteres con varias cadenas
laterales y ácidos grasos que contienen grupos hidroxilo en la posición 4 o
5. Existe tres tipos de PHA: (1) ácido hidroxialcánicos de cadena corta
(PHASCL) que contiene en su estructura una cadena lateral de alquilo. El
PHASCL contiene 3-5 átomos de carbono (poli-3-hidroxibutirato (P3HB),
poli-4-hidroxibutirato (P4HB)). (2) Ácidos hidroxialcánicos de longitud de
cadena media (PHAMCL), contiene cadenas laterales de alquilo. El
PHAMCL contiene de 6-14 carbonos. (3) ácido hidroxialcánicos de cadena
larga, formado por 14 átomos de carbono (Visakh,2014).

Propiedades de PHA

Las propiedades de los monómeros de PHA va a depender de los diferentes

organismos productores de PHA y variará de propiedades físicas y químicas
de un microorganismo a otro como también de la fuente de carbono que se
use en la fermentación.
Si bien es importante que el PHA sea amigable con el ambiente tenemos
que mencionar algunas propiedades que le muestran como alternativa para
reemplazar a plásticos como el polipropileno (PP), teniendo propiedades
similares a este, también presenta ciertos inconvenientes a sus propiedades
mecánicas. Consideremos las siguientes propiedades: (1) una elevada
temperatura de fusión que llega aproximadamente a 170°C, que al mismo
tiempo no se encuentra muy lejos de su temperatura de degradación. Una
solución a estos problemas puede ser la combinación con otros monómeros
que puede conferir menor rigidez y propiedades más duras, asa reduciendo
el punto de fusión (Visakh,2014).
Uno de los problemas es la establecida por los cambios químicos que
puede sufrir el PHA dentro de la célula bajo diferentes condiciones, la cual
esencialmente depende de los nutrientes presentes en el medio de cultivo.
Es de interés actual el modificar la composición química a una en la cual
puede ser estable. Las cadenas laterales insaturadas de PHA son
justamente susceptibles a las modificaciones químicas. Son las posiciones
12 y 13 aquellos que están más relacionados con la cristalinidad, ofreciendo
una modificación con repercusiones directas en la propiedad requerida.
Ahora es necesario decir que las propiedades físicas dependen
directamente de la longitud de los grupos colgantes como la distancia entre
los enlaces éster del polímero (Visakh,2014).

Ahora mencionemos algunas propiedades del PHA de manera específica:

Propiedades termomecánicas

De manera sencilla esta dependerá de la longitud de los grupos colgantes

que se extienden desde la columna vertebral, así como la naturaleza
química de estos grupos y la distancia presente en los enlaces éster. Esta
nueva mención es para recordar algunas maneras de clasificación, siendo
el de la longitud una de las principales, siendo ahora las que tienen un
grupo 3-hidroxilo y un grupo carboxilo en la cadena lateral lo que permitirá
una modificación adicional; halógenos, carboxilo, hidroxilo,
exposi,fenoxi,etc. Esto no otorga productos de interés. Las formas de cómo
obtener estos tipos de polihidroxialcanoatos con grupos funcionales extras:
i. elegir el microorganismo hospedador; ii. Eligiendo las condiciones de
cultivo y la fuente de carbono y/o iii. Modificaciones químicas durante la
extracción y purificación.

Propiedades de biocompatibilidad

Actualmente, el PHA tiene una aplicación potencial para el manejo de

heridas, ortopedia, administración de medicamentos, etc. Y esto se debe a
que en las modificaciones en la longitud de cadena ha traído algunas
consecuencias en la citotoxicidad del PHA, siendo más compatible cuando
la cadena es más larga.
Una de los mejores avances es la copolimerización delPHB con el PHHx
teniendo una mayor accesibilidad a la adhesión de las células. (Berezina &
Martelli,2014).

HALOMONAS:
Tradicionalmente, los microorganismos halófilos se han aislado de los
alimentos salados, aunque los estudios realizados durante las últimas 3
décadas han permitido su aislamiento y caracterización de entornos
hipersalinos, principalmente lagos salinos, salinas y suelos salinos. Las
respuestas de los microorganismos al aumento de las concentraciones de
NaCl son bastante diferentes, pero se observan algunos patrones y, por lo
tanto, en función de sus requisitos óptimos de NaCl, los microorganismos se
clasifican en diferentes categorías: no halófilas, que requieren ~ 0.5 - 1% de
NaCl para el crecimiento (algunos pueden tolerar altas concentraciones de
NaCl y se definen como halotolerantes); ligeramente halófila, con
requerimientos óptimos de NaCl entre 1 y 3%; moderadamente halófila,
creciendo de manera óptima en medios con 3-15% de NaCl; y
extremadamente halófilas, que requieren más del 15% de NaCl para un
crecimiento óptimo (Kushner, 1978).
Los microorganismos moderadamente y extremadamente halófilos están
representados por bacterias y arqueas (Ventosa et al., 1998; de la Haba et
al., 1011). La familia Halomonadaceae incluye actualmente 90 especies
agrupadas en diez géneros y, con algunas excepciones, son halófilas y en
algunos casos también son alcalifílicas, siendo Halomonas el género más
importante con más de 60 especies (de la Haba et al. 2011). Se han publicado
algunas revisiones sobre esta familia (Garrity et al. 2005; Arahal y Ventosa
2006).

Los microorganismos halófilos forman un grupo tremendamente diverso.

Dentro del árbol filogenético de la vida, los microorganismos halófilos y
altamente halotolerantes se encuentran dentro de cada uno de los tres
dominios: Archaea, Bacteria y Eukarya. Los halófilos no son menos diversos
a nivel de su fisiología, bioquímica, biología molecular y genética. Un aspecto
poco conocido, incluso para muchos científicos que estudian la vida en altas
concentraciones de sal, es la sorprendente diversidad morfológica que
muestran estos halófilos en sus entornos naturales. Solo relativamente pocos
han pasado tiempo examinando muestras de agua o sedimentos de
ambientes hipersalinos en el microscopio. Esto se debe lamentar, ya que los
hábitats con alto contenido de sal se encuentran entre los objetos más
gratificantes para el examen microscópico (Javor, 1989; Oren, 2002).

La acumulación de PHB se informó por primera vez en la bacteria Gram-

positiva Bacillus megaterium (Lemoigne, 1926, 1927). Posteriormente,
también se encontró PHB en bacterias gramnegativas (Forsyth et al., 1958),
y ahora se sabe que es un material de reserva común en varias especies
bacterianas (Steinbüchel y Füchtenbush, 1998), así como en Archaea. El
último grupo incluye principalmente halófilos extremos (Fernández-Castillo et
al., 1986; Hezayen et al., 2000).
La acumulación de PHB por Archaea extremadamente halófila se informó por
primera vez en las especies Haloarcula marismortui y Haloferax mediterranei
(Fernandez-Castillo et al. al., 1986; Kirk y Ginzburg, 1972). Aunque algunos
otros organismos extremadamente halófilos también pueden producir PHB
(Fernández-Castillo et al., 1986), Hfx. mediterranei acumula altas cantidades
de polímero: aproximadamente el 65% del peso de células secas de almidón
o glucosa, con una concentración óptima de sales del 25% (p / v) y bajo
condiciones de limitación de fosfato en cultivos discontinuos, y hasta el 46%
de PHB en Cultivos continuos (Lillo y Rodríguez-Valera, 1990; Rodríguez-
Valera y Lillo, 1992). El alto nivel de acumulación de polímeros y la densidad
celular de Hfx. mediterranei en un quimiostato podría indicar que la
producción de PHB está asociada con el crecimiento celular. La producción
de PHA en cultivo continuo no es factible con la mayoría de los
microorganismos, ya que acumulan PHA durante su fase estacionaria de
crecimiento (Sección 2) (Babel et al., 2001). Dos ejemplos de no halófilos
capaces de soportar la producción de PHB asociada al crecimiento son una
cepa mutante de Azotobacter vinelandii y una cepa de Alcaligenes latus que
tiene una deficiencia en la asimilación del sustrato (Babel et al., 2001).
Además de tener la ventaja de producir altas cantidades de PHB de una
fuente de carbono barata, Hfx. Mediterranei, como la mayoría de los
miembros de la familia Halobacteriaceae, puede ser fácilmente lisada en
presencia de agua, lo que implica un procedimiento simple para la
recuperación del polímero (Rodríguez-Valera y Lillo, 1992). Esta especie
también es capaz de producir el copolímero poli (3HB-co-3HV) a partir de
almidón sin un precursor adicional (Rodríguez-Valera y Lillo, 1992), una
característica que no suele encontrarse en los microorganismos. La alta
concentración de sal requerida para la producción óptima de polímeros
permite que el cultivo se realice en condiciones que no son estrictamente
estériles. Por otro lado, las grandes cantidades de sal requeridas para los
cultivos podrían presentar un inconveniente, ya que el costo de las sales
puede igualar aproximadamente el precio de la fuente de carbono
(Rodriguez-Valera y Lillo, 1992) y puede acelerar aún más la corrosión de las
fuentes de carbono. fermentadores de acero inoxidable usados (Chisti, 1992;
Park et al., 2002). También Hfx. Mediterranei produce exopolisacáridos
asociados con la síntesis de PHB, que podrían interferir con la purificación
del poliéster y dificultar el proceso de fermentación debido a la alta viscosidad
a altas concentraciones del polisacárido. Más recientemente, también se
informó que una cepa 56 designada como arquea extremadamente halófila
produce PHB con fuentes de carbono en exceso y cantidades reducidas de
extracto de levadura en el medio (Hezayen et al., 2000). Cuando se cultiva
de forma resistente a la corrosión. Cuando se cultiva en un biorreactor
resistente a la corrosión con ácido butírico y acetato de sodio como fuente de
carbono, el organismo podría almacenar hasta un 53% de PHB de su peso
seco celular. Sin embargo, el período de tiempo para la acumulación de PHB
fue de hasta 11 días, lo que llevó a una productividad volumétrica del
polímero considerablemente reducida (Hezayen et al., 2000). La PHB sintasa
de la cepa 56 se caracterizó adicionalmente (Hezayen et al., 2002), y al igual
que algunas enzimas producidas por miembros de la familia
Halobacteriaceae, mostró una alta termoestabilidad, pero su actividad
residual permaneció invariable en presencia o ausencia de NaCl (Hezayen et
al., 2002). Sin embargo, a diferencia de las polimerasas sintasas de bacterias
no halófilas, la enzima cepa 56 posee una especificidad de sustrato muy
estrecha y ni siquiera fue capaz de incorporar 3-hidroxivalerilo en el polímero
(Hezayen et al., 2002).

Los halófilos han desarrollado dos estrategias básicas diferentes de

acumulación de soluto osmorregulador para hacer frente al estrés hídrico
causado por altas concentraciones de sal en su entorno: el "mecanismo de
sal en el citoplasma" y el "mecanismo de osmolito orgánico". El "mecanismo
de la sal en el citoplasma", descubierto por primera vez en las halobacterias,
se considera la típica estrategia de arqueo de la osmoadaptación. Las
halobacterias y los microorganismos relacionados acumulan K + en
concentraciones molares para hacer frente a una alta osmolalidad externa
(Eisenberg y Wachtel, 1987; Larsen, 1973). Sin embargo, se sabe que
algunas bacterias anaerobias halófilas emplean esta estrategia y acumulan
K + o Na + según la fase de crecimiento (Oren et al., 1997; Rengpipat et al.,
1988). El género recientemente descubierto Salinibacter como miembro del
filo Cytophaga-FlavobacteriumBacteroides también acumula K + en el
citoplasma y muestra una tolerancia a la sal comparable a la de Archaea
extremadamente halófila (Antón et al., 2002). En contraste con estos
organismos, las arqueas metanogénicas (p. Ej., Metanohalophilus), así como
las bacterias quimioheterótrofas fototróficas y aeróbicas emplean el
mecanismo orgánico de osmolito y acumulan moléculas orgánicas polares o
bipolares, altamente solubles en agua llamadas solutos compatibles
(Galinski, 1995; Lai et al. , 1991; Severin et al., 1992).

A pesar de la abundancia de iones inorgánicos como el Na + y K +,

respectivamente, en medios de crecimiento con alto contenido de sal, estos
iones se excluyen en gran medida del citoplasma de microorganismos de la
estrategia osmolítica (Sadler et al., 1980; Ventosa et al., 1998). Para una
variedad de bacterias no halotolerantes y halotolerantes se demostró que
este estado se altera solo después de un aumento repentino en la salinidad,
lo que resulta en una acumulación transitoria de K +. Este catión inorgánico
se acumula a corto plazo después de un aumento repentino de la salinidad.
Actúa de manera transitoria como un osmolito para restaurar el volumen
celular y la presión de la turgencia hasta que sea reemplazado por solutos
compatibles (Dinnbier et al., 1988; Reed et al., 1985; Whatmore et al., 1990).
Además, se cree que K + sirve como un mensajero celular en la regulación
de la actividad enzimática y la expresión génica (Sutherland et al., 1986;
Booth y Higgins, 1990). También se sabe que la acumulación de K + favorece
la respiración de las células expuestas a una crisis osmótica (Meury, 1994).
K + influye en la generación de un gradiente de protones (pH) como
componente del gradiente electroquímico de protones a través de las
membranas citoplásmicas (Padan et al., 1976; Tokuda et al., 1981). También
se requiere para la generación de un gradiente electroquímico de Na + en la
absorción de ácidos orgánicos (Tokuda et al., 1982).

2.7. Diseño experimental

Para nuestro diseño experimental usaremos un diseño factorial. El Factor A

estará representando a la relación C:N, teniendo tres niveles. Estos niveles
son 16, 20 y 24 la relación en los medios de cultivo que prepararemos. Por
otra parte, como Factor B tendremos a la salinidad, el cual su expresión
será expresando en p/v% en cada medio, teniendo a los siguientes; 16%,
24% y 30%.
Mediante el diseño factorial determinaremos, las condiciones óptimas de
salinidad como de C:N así como la interacción de estos dos para producir
PHA (interacción nula, sinérgica o negativa). Debido a que es un diseño
factorial los tratamientos serán de manera combinada, obteniendo a 9 como
numero de tratamientos. Ya que para que se valido es necesario el número
de réplicas, nosotros realizaremos 3, teniendo un total de 27 corridas.
Nuestro diseño experimental se puede observar en la tabla 1.

2.8. Metodología

Toma de muestra

Recolectar las muestras de la Salinas de Huacho y Humedales en los

alrededores de la Mina La Salinera., de coordenadas 11°16'25.2"S
77°34'50.6"W y 8°52'51.2"S 78°38'42.7"W respectivamente.
Tomar las muestras de agua (a una profundidad de entre 0 y 20 centímetros);
recogerlas en frascos de vidrio de boca ancha previamente esterilizado y
rotulado; inmediatamente tomar medidas de ph, temperatura y concentración
de NaCl (en ambiente natural).
Las muestras de suelo se recolectarán con una espátula, retirando los 5 cm
superficiales y colectando aproximadamente 250 gramos.
Para su procesamiento, transportar las muestras al Laboratorio de
Investigación de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional del
Santa.

*Para determinar concentración de NaCl en el medio:

Se tomarán tres gramos de suelo de cada cuadrante y se colocarán en un
tubo de ensayo. Se agregarán 1000 μL de agua destilada y 1000 μL de
cromato de potasio (KCrO4). Después, se agregará nitrato de plata (AgNO3)
lentamente hasta que se presente una coloración rojiza, lo cual indica la
presencia de NaCl.
 SALINIDAD (p/v)
16% 24% 30%
Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 1 Replica 2 Replica 3 Total Promedio
16 Y111 Y112 Y113 Y121 Y122 Y123 Y131 Y132 Y133 Y1** Ý1**
C:N

20 Y211 Y212 Y213 Y221 Y222 Y223 Y231 Y232 Y233 Y2** Ý2**
24 Y311 Y312 Y313 Y321 Y322 Y323 Y324 Y325 Y333 Y3** Ý3**
Total Y*1* Y*2* Y*3* Y***
Promedio Ý*1* Ý*2* Ý*3* Ý***
Tabla 1: Diseño Factorial con dos factores; salinidad y C: N en la producción de PHA. Cada uno con tres niveles y cada tratamiento será replicado tres veces.
Para calcular la cantidad de cloruro de sodio de cada muestra se utilizará la
siguiente fórmula:
NaCl= ([(Z ml AgNO3) * (0.005844 g NaCl)] / 1 mL AgNO3)/(Yg Na) = [(X g
NaCl) * (23 g Na)] / 58.5 g NaCl)
Donde:
Z equivale a los mL gastados de AgNO3 en la titulación
X a los gramos de NaCl en la muestra
Y a los gramos de Na+ contenidos en la sal.

A. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS HALÓFILOS

Para el aislamiento, será realizado en dos fases:

1. Enriquecimiento de las bacterias presentes en las muestras:

De las muestras obtenidas, colocar 1gr o 1ml en 9 ml de caldo nutritivo
modificando NaCl a 9% (Tabla I). Las muestras serán incubadas a
30°C dejando el tiempo necesario hasta observarse la turbidez o
formación de películas en la superficie del caldo.
Para su conservación, mantenerlo a 4°C.

Nutrientes g/L
Extracto de carne 1
Extracto de levadura 2
Peptona 5
NaCl 90
Tabla I. ksksjkds

2. Para el aislamiento propiamente dicho:

Tomaremos alícuotas del medio que enriquecimos anteriormente y
sembramos en placa por el método de estría, en agar nutritivo modificado
(Tabla II).
Incubar a 30°C, por aproximadamente 48 horas.

Nutrientes g/L
Extracto de carne 1
Extracto de levadura 2
Peptona 5
NaCl 90
Agar 15
Tabla II. ksksjkds

B. SELECCIÓN DE BACTERIAS HALÓFILAS PRODUCTORAS DE

PHA

Para la selección de las bacterias realizaremos el método de Sudán B para

visualizar cuál de ellas son capaces de producir PHA según Guzmán y
Hurtado (2011). Procedimiento:
1. Realizamos un frotis en seco a partir de las colonias presentes en las
placas.
2. Cubrimos con Sudán B durante 15 minutos.
3. Decolorar con xilol y dejar secar a temperatura ambiente.
 4. Contrateñir con safranina por 50 segundos.
5. Lavar con agua destilada.
6. Observar con lentes de inmersión; los gránulos de PHA se observan
de un color gris mientras que las células vegetativas de un
color rosado.

De las colonias formadas, aislarlas en viales para cultivos puros (agar

nutritivo) a 30°C durante 48 horas. Posteriormente, refrigerar a 4°C.

C. PRUEBAS BIOQUÍMICAS Y MICROBIOLÓGICAS:

Las cepas que presenten acumulación de PHA, realizar:

- Análisis macroscópicos: borde, forma, superficie, tamaño, color

- Coloración Gram.
- Tinción de endosporas.
- Indol
- Prueba de la catalasa
- Prueba de oxidasa
- Licuefacción de gelatina
- Actividad ureasa
- TSI

Describir, reportar y comparar resultados con TABLE BXII.c.94. Comparison

of key phenotypic characteristics of Alcanivorax spp. and other heterotrophic
marine bacteria belonging to the Gammaproteobacteriaa,b – BERGEY’S
MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY.

D. EVALUACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS:

 Relación C:N: 16 – 20 – 24
 NaCl (p/v): 10% - 18% - 27%
 Ph: 7.0
 Temperatura: 30°C
 Rpm: 125 rpm

DISEÑO DE MEDIO PARA UN CULTIVO POR LOTE:

Considerando una: Xf = 2 g/L y un exceso de 40%.

** De bibliografía, fórmula empírica de la célula: 𝐶𝐻1.88𝑂0.53 𝑁0.25 ; donde el

PM = 25.88752144 g/mol.

- Determinando E(%):
 C = (12/25.88752144) * 100 = 46.35
 N = ((14*0.25)/ 25.88752144)* 100 = 13.52

Determinación de parámetros cinéticos:

Una vez inoculado en el medio de fermentación, muestrear (1ml) cada 1 hora.
Al inicio de la idiofase, guardar muestras (2ml) cada 10 minutos para su
posterior evaluación de producto. (Considerando 60 puntos = 60 horas =
180ml)
Construir gráfica de crecimiento microbiano, asimismo, determinar el
consumo de sustrato (glucosa y amonio) por medio de kits enzimáticos.
Hallar parámetros cinéticos: u, Yx/s, Yp/s, qs, qp, Qx, Qp, Rx.
Realizar tinción Gram de manera paulatina.

*El método descrito se realizará si se trabaja en matraces Erlenmeyer.

De lo contrario, se utilizará un biorreactor cuantificando la biomasa con los
sensores respectivos.

F. EXTRACCIÓN DE PHA:

Para la obtención del PHA se tomarán los viales extraídos, y serán

centrifugados a 4 000 rpm durante 20 minutos. Se expulsa el sobrenadante y
se lava los pellets con solución salina para eliminar el exceso de sales y se
deshidrata a 42 °C hasta llegar a un peso constante.
En el tubo con la biomasa deshidratada se agrega 1 mL de hipoclorito de
sodio al 5% con la finalidad de debilitar la membrana y facilitar la
recuperación de la membrana. Al paso de dos horas se agrega 1 mL de
Cloroformo y se visualiza la formación de dos fases.
Al pasar 20 minutos se centrifuga los tubos a 3 500 rpm durante 5 minutos y
se obtienen dos fases; la primera con hipoclorito de sodio y restos celulares
y el inferior con cloroformo y el PHA.
Extraemos la fase líquida del cloroformo y la pasamos a otro recipiente de
vidrio, y llevamos a la estufa a 40 °C por el tiempo suficiente en que se
evapore el cloroformo.
Para la determinación del PHA, las muestras obtenidas son pasadas a un 1.5
mL de H2SO4 80% , se calienta por 30 minutos a 90 °C y se deja enfriar a
una temperatura ambiente e baño María. Se lectura en un espectrofotómetro
de luz ultravioleta.
G. CUANTIFICACIÓN DE PHA:

Para realizar la curva de calibración de PHB se realizará mediante su

trasformación a ácido crotónico. Pesar 5 mg de PHB en un tubo de ensayo
y agregar 1 ml de ácido sulfúrico concentrado (98%) y llevar a un agitado por
1 minuto.
Luego llevar a un digestor a 90 °C por una hora y agitar cada 15 minutos de
manera periódica.
Al finalizar la hora, añadir 4 mL de fase móvil (ácido sulfúrico 0.014N filtrado
en Nylon de 0.45 um y sonicada por 15 minutos), siendo esta solución la
solución Stock.
A partir de esta solución haremos diluciones, tomando 2 mL de la solución
Stock y agregándole 2 mL de fase móvil obteniendo una solución de 4 mL y
repetir el mismo paso, 2 mL de la solución anterior y agregar 2 mL de fase
móvil, hasta obtener 14 diluciones siendo la solución Stock una solución de
1000 ppm (1 ppm=1mg/L).
Las 14 diluciones se pasan por un filtro de Nylon de 0.45 um en microviales
para HPLC y colocar en bandeja de HPLC y analizar las muestras en un
sistema cromatográfica liquida HPLC-UV con un equipo UHPLC y una
columna Shodex.
La elución se realiza con 0.01N H2SO4 (Fase móvil) a un flujo de 1 mL min-
1 a 50 °C.
Medir la absorbancia a 210 nm (Absorbancia de ácido crotónico) y realizar la
curva de calibración.

Para cuantificar el PHB en biomasa; pesar PHB entre 3 a 5 mg de biomasa y

colocar en un tubo Eppendorf de 2 mL y agregar 500 uL de ácido sulfúrico.
Colocar en un digestor a 90°C en un hora.
Tomar 20 uL de la solución anterior y completar con 1480 uL de fase móvil
en un tubo Eppendorf. Luego medir con HPLC el área del pico obtenido y
calcular con la curva de calibración la cantidad de nanigramos de PHb en el
volumen inyectado. Luego calcular el %PHB presente en la biomasa.

𝑥∗𝑦 𝑏
( 𝑎 )∗𝑐
%𝑃𝐻𝐵 = 1000000 ∗ 100%
𝑑
( )
Donde x = masa (nanogramos), y= 1500 uL (volumen de muestra diluido),
a=10 uL (volumen de inyección), b=500 uL (volumen de H2SO4), c=20 uL
(volumen de muestra sin diluir), d= biomasa (mg).

2.8 Análisis estadísticos

Para obtener conclusiones a partir de los datos obtenidos del diseño de

experimento factorial vamos a utilizar el software SPSS para realizar un
análisis de varianza de dos factores y determinar tres conclusiones; La
salinidad tiene un efecto principal en la producción de PHA, la relación C:N
tiene un efecto principal en la producción de PHA, interacción entre la
salinidad y la relación C.:N en la producción de PHA.
 2.9. Referencias bibliográficas

Anasilvia Del Pilar Flores Vásquez, E. I. (2018). Rendimiento de polihidroxialcanoatos

(PHA) en microorganismos halófilos aislados de salinas. Revista peruana de
biología, 153 - 160 .

G. Mothes, T. S. (2008). Biotechnological Coproduction of Compatible Solutes and

Polyhydroxyalkanoates using the. Germany.

Martin Koller, I. G. (2011). Linking ecology with economy: Insights into

polyhydroxyalkanoate-producing microorganisms. Austria.

Nina Gunde-Cimerman, A. O. (2005). Adaptation to Life at High Salt Concentrations in

Archaea, Bacteria and Eukarya . Springer.

Rodrigo Yoji Uwamori Takahashi, Nathalia Aparecida Santos Castilho, Marcus Adonai
Castro da Silva, Maria Cecilia Miotto and André Oliveira de Souza (2017)
Prospecting for Marine Bacteria for Polyhydroxyalkanoate Production on Low-Cost
Substrates. Lima.

Rosa Margesin y Franz Schinner (2011) Potential of halotolerant and halophilic

microorganisms for biotechnology.

Potential of halotolerant and halophilic microorganism for biotechnology. Rosa

Margesin & Franz Schinner. Abril 7, 2001

Polyhydroxyalkanoates (PHAs), their Blends, Composites and Nanocomposites: State

of the Art, New Challenges and Opportunities. Visakh P. M. Diciembre 1, 2014.
India.
Polyhydroxyalkanoates: Structure, Properties and Sources. Nathalie Berezina & Silvia
Maria Martelli. Diciembre 2, 2014. Brasil.

Recovery and Extraction of Polyhydroxyalkanoates (PHAs). Mitra Mohammadi &

Mansour Ghaffari-Moghaddam. Diciembre 2, 2014.
En el laboratorio, la salinidad del suelo se mide comúnmente
como la conductividad eléctrica a 25 ° C de un suelo sin filtrar
1: 5: suspensión de agua destilada (EC1: 5).

1. Prepare una suspensión de suelo / agua 1: 5. Por ejemplo, pese

20.0 g de tierra seca al aire en un vial y agregue 100 ml de agua
desionizada.
2. Agitar mecánicamente (se prefiere extremo a extremo) a 25 °
C en un sistema cerrado durante 30 minutos para disolver las
sales solubles.
3. Deje unos 15 minutos para que el suelo se asiente.
4. Calibrar la celda de conductividad y el medidor de acuerdo
con las instrucciones del fabricante.
5. Si las soluciones estándar no están disponibles, prepare una
solución de referencia de cloruro de potasio 0,010 M
disolviendo 0,7455 g de cloruro de potasio (KCl; secado a 110
° C durante 2 h) y aumente el volumen a 1,0 L con agua destilada
o desionizada sin CO2. . Esta solución tiene una conductividad
eléctrica de 1.413 dS m-1 a 25 ° C.
6. Sumerja la célula de conductividad en el sobrenadante,
moviéndola hacia arriba y hacia abajo sin perturbar el suelo
sedimentario. Tome la lectura con la celda estacionaria cuando
el sistema se haya estabilizado. Enjuague la celda con agua
desionizada entre las muestras y elimine el exceso de agua.
Completar las mediciones de EC dentro de 3-4 h de obtener el
sobrenadante acuoso
7. Si las lecturas se vuelven erráticas, limpie los electrodos
empapándolos y solución de limpieza de dicromato de ácido
durante la noche.
8. Informe EC1: 5 a 25 ° C sobre una base de secado al aire.

METODOS 2
Este extracto se obtiene haciendo un suelo saturado pegado con
agua destilada y luego extrayendo el líquido de la pasta del suelo
con una centrífuga o un dispositivo de succión después de dejar
tiempo para el equilibrio.
1. Determine el contenido de humedad del suelo secado al aire
secando a 105ºC durante 24 horas
2. pesar 200-400 g de suelo seco molido hasta <2 mm de
contenido de humedad del suelo conocido en un recipiente con
tapa.

3. Agregue agua desionizada mientras mezcla la muestra de

suelo molido a la saturación. Se dice que la saturación existe
cuando, la pasta del suelo brilla, fluye ligeramente cuando se
inclina el contenedor, se desliza limpiamente de la espátula y se
consolida fácilmente después de que se forme una zanja al
sacudir el contenedor.
4. Permita que el suelo se equilibre durante al menos 4 horas.
Compruebe para asegurarse de que los criterios de saturación
todavía se cumplen. Si se ha acumulado agua libre en la
superficie, agregue más tierra y vuelva a mezclar. Si el suelo se
ha endurecido o no brilla, agregue agua destilada y mezcle bien.
5. Deje reposar la pasta del suelo durante 4 h más o
preferiblemente durante la noche.
6. Transfiera la pasta de suelo a Buchner con filtro altamente
retentivo
7. Alternativamente, extraer la solución del suelo por
centrifugación
8. Almacenar extractos 4 C hasta su análisis por EC.
9. Calibre la celda de conductividad y el medidor de acuerdo con
las instrucciones del fabricante.
10. Si las soluciones estándar no están disponibles, prepare una
solución de referencia de cloruro de potasio 0,001 M
disolviendo 0,7455 g de cloruro de potasio y haga un volumen
de 1,0 L con agua destilada o desionizada sin CO2. Esta solución
tiene una conductividad eléctrica de 1.413 dSm a 25 ° C.
11. Sumerja la célula de conductividad en el sobrenadante,
moviéndola hacia arriba y hacia abajo ligeramente sin alterar el
suelo sedimentado. Tome la lectura con la celda estacionaria
cuando el sistema se haya estabilizado.
Enjuague la celda con agua desionizada entre las muestras y
elimine el exceso de agua. Completar las mediciones de EC
dentro de 3-4 h de obtener el sobrenadante acuoso.
12. Si la lectura se vuelve errática, limpie los electrodos
empapándolos en una solución limpiadora con ácido-ácido.
13. Informe EC a 25 C en seco.
14. Si es necesario, el porcentaje de saturación se puede calcular
a partir del peso del agua agregada, el contenido de humedad del
suelo y la masa del suelo