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NUTRICION BACTERIANA

MICROBIOLOGIA I

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UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLAREAL FACULTAD : FIIS ESCUELA : ING. AGRO INDUSTRIAL
NUTRICIÒN BACTERIANA PRIMERA PARTE I.- CONCEPTO DE NUTRICIÓN BACTERIANA: La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman el medio donde habitan las sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se requiere para dos objetivos:  Fines energéticos (reacciones de mantenimiento).  Fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo).

La biosíntesis de nuevos componentes celulares son procesos que requieren energía procedente del medio ambiente. El estudio de la nutrición microbiana se puede desglosar en varios apartados: así, podemos considerar los tipos de nutrientes requeridos, los aspectos cuantitativos, e incluso podemos abordar los aspectos ambientales (en cuyo caso entramos dentro del campo de la Eco fisiología). Igualmente podemos estudiar la aplicación práctica de la nutrición bacteriana. Que se plasma sobre todo en el diseño de medios de cultivo para manejar los microorganismos en el laboratorio. Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de energía, las bacterias se pueden dividir en:  Litotrofas: son aquellas que solo requieren sustancia inorgánica sencilla (SH2 S0, NH3, NO2, Fe, etc.)  Organotrofas: requieren compuestos orgánicos (hidratos de carbono, hidrocarburo, lípidos, proteínas, alcoholes...).

Desde el punto de vista biosintético (o sea, para sus necesidades plásticas o de crecimiento), las bacterias se pueden dividir en:  Autótrofa: crecen sintetizando su material a partir de sustancias inorgánicas sencillas. Ahora bien, habitualmente el concepto de autotrófica
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se limita a la capacidad de utilizar una fuente inorgánica de carbono, a saber, el CO2.  Heterótrofas: su fuente de carbono es orgánica (si bien otros elementos distintos del C pueden ser captados en forma orgánica).

Otros conceptos:  Autótrofas Estrictas: son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia orgánica como fuente de carbono.  Mixotrofas: son aquellas bacterias con metabolismo energético litótrofo (obtienen energía de compuesto inorgánico), pero requieren sustancias orgánicas como nutrientes para su metabolismo biosintético. Sean autótrofas o heterótrofas, todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos químicos, que se pueden clasificar (según las cantidades en que son requeridas) como:  Macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg). Y  Micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo…)

En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados formando parte de sustancias orgánicas y/o inorgánicas. Algunos serán incorporados para construir macromoléculas y estructuras celulares: otros solo sirven para la producción de energía, y no se in corporal directamente como material celular: finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles. El mundo bacteriano, como conjunto, exhibe una gigantesca versatilidad metabólica de uso de nutrientes: desde autótrofos que obtienen su carbono por reducción del CO2 y los demás elementos a partir de fuentes igualmente inorgánicas, hasta heterótrofas capaces de usar amplia gama de fuentes orgánicas de carbono. A su vez, dentro de los heterótrofos, podemos encontrar muchos tipos de nutrición muy distintos, desde bacterias metilotrofas que solo usan el metano o metanol como fuente de carbono y energía hasta los muy versátiles

Pseudomonas, que puede recurrir a degradar a más de 100 tipos de fuente carbono, incluyendo a sustancias tan exóticas como hidrocarburos alifáticos y

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cíclicos. De cualquier modo, entre los heterótrofos, una de las fuentes más típicas de carbono consiste en glucosa. En los Heterótrofos-organotrofos, los sustratos carbonados (con un nivel de oxidación no muy distinto del material celular –CH2O-) entran simultáneamente a:  Metabolismo energético (donde la fuente de C se transforma en CO2, o en CO2 junto con otras sustancias no totalmente oxidadas).  Metabolismo plástico (anabolismo = biosíntesis de nuevo material celular). Aunque dentro del mundo de los procariontes se encuentra tanta variedad de nutriciones, las bacterias que pueden nutrir solamente de sustancias inorgánicas sencillas (H2O, CO2, N2, NO3, NH3, SO4=, fosfatos, etc.).Son minoría, pero sus procesos metabólicos son muy interesantes. De hecho existen tipos metabólicos que solo han evolucionado en procariotas Como paradigma de esto citaremos los microorganismos quimioautótrofos o (Quimiolitoautotrofos): obtienen su energía de oxidación de sustancias inorgánicas sencillas a partir de sales inorgánicas, por lo que pueden vivir sin soluciones de sales minerales. Lo habitual, sin embargo, es que muchas bacterias recurran, siempre que puedan, a tomar de los medios ciertos compuestos más complejos, ya que carecen de ciertas rutas biosintéticas.

II.- NUTRIMENTOS: Los alimentos bacterianos son considerados el material para que la célula obtenga energía, pueden abarcar compuestos desde proteínas hasta compuestos más complejos como el caucho, pero lo esencial esta que cada microorganismo asimila un determinado alimento por ello que podemos identificar a los microorganismos, también se identifica según los compuestos que se usa y que se forman de ello. La nutrición de los microorganismos es holofílica salvo los virus y protozoos.

1.- HIDRÓLISIS DE ALIMENTOS COMPLEJOS: Es un fenómeno que consiste en la transformación de componentes estructurales como proteínas, carbohidratos, grasas, etc., a sus partes más
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constituyentes, siempre con la adición de agua en sitios de desdoblamiento de la molécula.

2.- PENETRACIÓN DE LOS NUTRIMENTOS: Se da por difusión y otros por transporte activo, la difusión se realiza por osmosis, mientras el transporte activo es la capacidad del organismo para acumular sustancias en el interior de la célula en concentración mayor de la que aparece en el medio ambiente. La capacidad de un microorganismo para metabolizar el nutrimento puede traducir su incapacidad para transportarlo, por otro lado el microorganismo puede tener mecanismo de transporte pero carecer de enzimas metabólicas.

III.- NUTRIENTES UNIVERSALES: 1.- El Agua: Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua de hecho, salvo excepciones, se pueden considerar como organismos acuáticos, requieren cierto grado de humedad para crecer. Desde el punto de pista de sus posibles papeles, el agua es:  El principal constituyente del protoplasto bacteriano.  El medio universal donde ocurren las reacciones biológicas.  Un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones bioquímicas). Las fuentes de agua pueden ser:  Endógena: procedente de procesos de óxido-reducción.  Exógeno (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las membranas. Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria:  Existen determinadas sustancias y superficies que absorben y adsorben (Respectivamente), de modo más o menos intenso, moléculas de agua, dejándolas inasequibles a la bacteria.

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 Los solutos disueltos en agua (p. Ej., sales, azúcares) tiene afinidad por las moléculas de H2O que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del microorganismo. La disponibilidad de agua se mide por un parámetro llamado actividad de agua o potencial de agua, indicativo del agua libre, y que se expresa como:

aw = Ps / Pw

Donde Ps es la presión parcial de vapor de agua en la solución problema y Pw es la presión parcial del vapor del agua destilada. Todos los organismos requieren de H2O para vivir. Las sustancias absorben en mayor o menor medida de moléculas de H2O que no están disponibles para los organismos. Esta disponibilidad del H2O pura es 1; el aw de los frutos secos es 0,7; el aw de los campos de cultivo se sitúa entre 0,9 y 1,0. ¿Cómo medir el potencial de agua de un medio líquido determinado? Se mide la humedad relativa del aire que hay encima del medio (en frascos), y este valor se refiere al valor de 100, que es la humedad del aire encima del agua destilada. O sea, la aw = humedad relativa/100). Las bacterias tienen valores de aw normalmente entre 0,90 y 0,99.  Bacterias de habitad oligotróficas (como Caulobacter, Spirillum) tiene aw cercanos a 1.  Bacterias como Escherichia y Streptococcus, que viven en sangre y fluidos corporales, tienen aw de alrededor de 0,995.

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ACTIVIDAD DE AGUA Y CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS EN LOS ALIMENTOS

Rango de la aw

Microorganismos generalmente inhibidos por la aw mas baja de este rango

Alimentos generalmente comprendidos de este rango

Pseudomonas, Escherichia, Proteus Shigela, Klebstella, Bacillus, 1,00 - 0,96 Clostridium perfringens, algunas levaduras. Salmonella,Vibrio parahaemlyticus C, Botulinum, Serratia, Lactobacillus, 0,95 - 0,91 Pdiococus, algunos mohos y levaduras, (Rhodotorula, Pichia). Muchas levaduras ( Candida, Torulopsis, 0,91 - 0,87 Hansenula), Micrococcus. Mayoría de mohos ( Penicilios micotoxigénicos), Staphylococus aureus, 0,87 - 0,80 mayoría de Saccharomyces ( bailli). Debaryomyces. Mayoría de bacterias halófilas, Aspergilos 0,80 - 0,75 Micotoxigénicos. Mohos xerófílicos ( Aspoergillus chevalieri, 0,75 - 0,65 A. Candidus, Wallemia sebi). Saccharomyces Levaduras osmofilias ( Saccharomyces rouxii). 0,65 - 0,60 Pocos mohos ( Aspergillus echinulatus, Monascus bisporus)

Alimentos altamente perecederos ( frescos, frutas enlatadas, verduras, carne, pescado. Leche, salchichas cocidas pan: alimentos que contienen hasta aproximadamente 40% ( p/p) de sacarosa 75 de cloruro sódico. Algunos quesos( Cheddar, Swiss, Muenster, Provolone). Carne curada ( jamón de York). Algunos zumos de frutas concentradas. Alimentos que contienen 55% (p/p) de sacrosa2% de ClNa Embutidos fermentados ( salami )., dulces esponjosos, quesos secos, margarina, alimentos que contienen 65 % (p/p) de de sacarosa (saturados) o 15% de ClNa Mayoría de zumos de frutas concentrados. Leche condensada edulcorada, jarabe de chocolate, jarabe de arce y frutas, harina, arroz, legumbres, contenido 15 - 17 % de humedad, tarta de fruta, jamón country - style, pasta de azúcar. compota, mermelada, mazapán, frutas, glaseadas, algunos pasteles de gelatina.

Productos de avena conteniendo aprox. El 10% de humedad, nuéganos, dulce de chocolate, pasteles de gelatina, jaleas, melazas, azúcar de caña sin refinar, algunas frutas desecadas, frutos en nuez Frutas desecadas conteniendo aprox. 12% de humedad. Algunos tofes y caramelos, miel.

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0,50

No proliferación microbiana.

Patas conteniendo aprox. 12% de humedad. Especias conteniendo aprox. 10% de humedad. Polvo de huevo entero conteniendo 12 % aprox. El 5% de humedad. Galletas, bizcochos, cortezas de pan similares conteniendo 3 - 5 % de humedad. y

0,40

No proliferación microbiana.

0,30

No proliferación microbiana.

0,20

No proliferación microbiana.

Leche entera en polvo conteniendo 2 - 3 % de humedad, verduras desecadas conteniendo aprox. 5% de humedad, palomitas de maíz conteniendo aprox. 5% de humedad, galletas country style, bizcochos.

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ACTIVIDAD DE AGUA

La mayor parte de alimentos Frescos como carne, frutas, Pescado, aves, hortalizas.

Clostridium botulimun Salmonera PRODUCTOS La mayoría de las Levaduras normales

MUCHOS CARNICOS CURADOS

Satafilococus anaeróbico La mayoría de las levaduras Normales. Stafilococus aeróbico

La mayoría de los mohos Normales.

MUY ELEVADO CONTENIDO DE SAL Y AZUCAR.

Bacterias halófilas

ALIMENTOS DESECADOS

Mohos y levaduras Clorofilas

INFINITO

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 Bacterias marinas como ciertas Vibrio y pseudomonas encuentran valores de 0,980.  Ciertos bacilos Gram- positivos que resisten mejor la sequedad poseen valores de 0,950.  En el extremo de resistencia encontramos ciertas bacterias xerófilas, capaces de vivir a aw muy bajas (en torno a 0,75). Muchas de estas bacterias viven de hecho en medios acuosos, pero donde gran parte del agua no está disponible por las razones arriba citadas.  Bacterias halófilas extremas, como la Arqueobacteria, Halobacterium, que habita en lagunas hipersalinas.  Bacterias (y sobre todo ciertos microorganismos eucarióticos como levaduras) sacarófilos, que viven en jugos y zumos con altas concentraciones de azúcares

2.- EL CO2 El anhídrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias:  Las autótrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente de energía la luz (en el caso de las foto autótrofas) u oxidaciones de determinadas sustancias inorgánicas (los

quimioautolitotrofos).  Las arqueobacterias metanogénicas pueden usar el CO 2 como aceptor de los electrones procedentes de la oxidación de H2, proceso por el que obtiene su energía: CO2 + 4 H2 CH4 + 2 H2O ( 0 G’0 < 0 ) para las  Los heterótrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de electrones, necesitan pequeñas cantidades carboxilaciones en determinadas rutas anabólicas y catabólicas.

El origen del CO2 puede ser:  Endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente orgánica de carbono.  Exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas.
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Normalmente, las bacterias crecen a la concentración

de CO 2 atmosférico

(0,03 %), pero algunas bacterias (Neisseria, Brucilla) cuando se aíslan por primera vez, requieren atmósferas enriquecidas, con 5 – 10 % de CO2 parece deberse a que poseen alguna enzima con baja afinidad hacia el carbónico: sin embargo, tras varios subcultivos, suelen adaptarse a crecer a tensiones normales.

3.- FOSFORO: Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgánico o inorgánico. Las bacterias que pueden usar los fosfatos orgánicos (merced a la posesión de fosfatasas) no dependen absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos, los fosfatos orgánicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gram. – negativas) periplásmicas (p. Ej. La fosfatasa alcalina). El fósforo se usa principalmente para las síntesis de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos, pero aparece también en coenzimas y en proteínas.

4.- SALES MINERALES: Las sales minerales son las fuentes de aniones (p.ej. el Cl¨) y de cationes para la célula. Los siguientes cationes concretamente, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K+, Mg++, Ca++, Fe++. a).- El Ión K+:  Intervienen en la activación de una variedad de enzimas, incluyendo las que participan el la síntesis de proteínas.  En Gram – positivas está asociada con los ácidos teicoicos de la pared.

b).- El Ión Mg++:  Estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos.  Como cofactor en muchas reacciones, especialmente los que implican transferencia de grupos fosfatos, por ejemplo, en las reacciones que requieren ATP, el Mg++ puede unir la enzima al sustrato durante el mecanismo de acción de la primera.
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 Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintéticas. c).- El Ión Ca++:  Es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinazas. El hierro (principalmente como ión ferroso, Fe++) suele estar acomplejado en la naturaleza, formando sales insolubles. Las bacterias disponen de una serie de moléculas, denominadas sideróforos, capaces de acaparar ese hierro ( p. ej. Hidroxantas y enterobactina).  Participa en muchas moléculas implicadas en procesos de respiración, como citocromos y ferroproteínas (proteínas con Fe – S ).  Interviene como cofactor en ciertas enzimas.

Aparte de estos iones que se requieren en cantidades relativamente grandes, las bacterias necesitan minúsculas cantidades de otros elementos

(oligoelementos), a los que también se denomina como micro nutrientes o elementos traza.  El manganeso ( Mn++) es un cofactor de ciertas enzimas, y a veces puede sustituir al Mg++.  El cobalto (Co++) se requiere casi exclusivamente para la vitamina B12 (de hecho, suministramos esta vitamina, la bacteria se vuele independiente del Co++ libre).  El zinc interviene en la estabilización de complejos enzimáticos como los ADN y ARN – polimerasas.  El molibdeno participa en la s llamadas molibdoflavoproteínas, implicadas en la asimilación de nitratos. Por otro lado, participa como cofactor, junto con el Fe, en el complejo nitrogenasa de las bacterias fijadoras de N2 atmosférico.  El níquel participa en hidrogenasas, enzimas enzimas que captan o liberan H2.

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IV.- NUTRIENTES PARTICULARES: Se trata de elementos que pueden ser cubiertos de modo muy distinto, dependiendo del tipo de bacteria que consideramos. Correctamente, los elementos N y S (que requieren todos los seres vivos) pueden ser captados por las bacterias de modos muy distintos, dependiendo de sus capacidades biosintéticas. Tanto el N como el S se encuentran en la célula en estado reducido:  El radical – NH2 forma parte de los aminoácidos ( que a su ves son los sillares de las proteínas ) y de las bases nitrogenadas ( que participan en los ácidos nucleicos y en algunas coenzimas):  El radical –SH interviene en determinados aminoácidos y en coenzima como la CoA. En que formas químicas entran N y S a las bacterias? La mayoría de las bacterias fotosintéticas y muchas heterótrofas asimilan estos elementos en forma combinada inorgánica oxidada:  Como NO3++, merced a la actuación secuencial de nitrato - reductasas y nitrito – reductasas asimilatorios.  Como SO4=. Este sulfato se activa con ATP, y luego se reduce hasta sulfito y finalmente sulfhídrico, que ya tiene el estado de reducción adecuado para la incorporación de S. Muchas bacterias heterótrofas pueden usar alguna forma reducida:  De N inorgánico: amonio ( NH4+ )  De S inorgánico: sulfuros (S =, SH +).  De S orgánico: cisteína: Muchas de las bacterias que pueden usar amonio como única fuente de nitrógeno, también pueden usar nitratos.

1.- FIJACION DE NITROGENO: La atmósfera contiene enormes cantidades de nitrógeno no combinado (libre) en estado gaseoso: el nitrógeno moleculaza o dinitrógeno (N2), que procede de microorganismos desnitrificados. Sin embargo, esta gran reserva sólo puede
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servir de fuente de nitrógeno

a ciertas procariotas, las llamadas bacterias

fijadoras de nitrógeno o diazotrofos. Esta notable capacidad de bioquímica no ha evolucionado en los eucariotas. (Lo mas que llegado la evolución es a seleccionar ciertos tipos de asociaciones simbióticas entre procariótas diazotrofos y ciertos eucariotas). La fijación del N2 es un proceso de reducción que convierte el nitrógeno molecular en amoniaco, según la siguiente ecuación:

N2 + 8H + 18 ATP

2 NH3 + H2 + 18 ( ADP + Pi ).

Esta reacción esta catalizada por un complejo enzimático denominado nitrogenasa o dinitrogenasa, que consta de dos componentes:  Componente I o nitrogenasa propiamente dicha: posee un cofactor de hierro y molibdeno (FeMoCo) que forma parte del centro activo. Por ello, a este componente también se le conoce como molibdoferroproteína. (en realidad existen dos copias del cofactor, cuya estequiometría es MoFe7S9 – homocitrato).  Componente II o nitrogenasa – reductasa, que posee átomos de Fe acomplejados con S de determinadas cisternas (por lo que este componente se denomina a veces ferroproteína). Dos cosas llaman la atención de la ecuación anterior:  Obsérvese que la reacción requiere un gran aporte de energía en forma de al menos 18 ATP (en ocasiones puede llegar a 24 ATP). Ello se debe a que el dinitrógeno (N = N) es una molécula extremadamente inerte (su energía de disociación es de 940 KJ). Y su reducción precisa una gran energía de activación para transferirle 6 electrones.  Parte de la actividad nitrogenasa (así como ATP y electrones) “ se pierden “ en reducir los iones H¨ hasta H2. se desconoce la razón de este “despilfarro”, pero se sabe que es un efecto intrínseco de este complejo enzimático.
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Los electrones para la reducción llegan al complejo por medio de una ferredoxina, que los transfiere al componente II, que queda reducido al tiempo que por cada dos electrones transferidos se hidroliza una molécula de ATP. La nitrogenasa – reductasa reducida se asocia entonces con la nitrogenasa (= componente I), y el transfiere los electrones. Una vez reducida la molibdoferroproteína, esta transfiere los electrones (y los protones) al N2,

hasta en dos moléculas de amoniaco. (El centro activo es FeMoCo). Un aspecto muy importante del complejo nitrogenasa es su extrema sensibilidad al oxígeno. De modo que queda rápida e irreversiblemente inactivo por este gas. Ahora bien, esto no significa que la capacidad de diazotrofía esté relegada a bacterias anaerobias, ya que, como veremos en la sección de taxonomía, la evolución ha “inventado” distintas estrategias para proteger a la nitrogenasa en fijadores aerobios. Debido a lo “caro” que resulta fijar nitrógeno, no es extraño comprobar que este proceso este regulado de forma muy estricta ante la presencia en el medio de fuentes combinadas de nitrógeno (nitratos, amonio, aminoácidos):  La actividad nitrogenasa se ve inhibida ante la presencia de N combinado.  Ante N combinado, se reprime la transición de los genes codificadores de la nitrogenasa y demás funciones relacionadas (genes nif). La nitrogenasa es una enzima relativamente “inespecífica”, ya que puede reducir otras pequeñas moléculas provistas de triples enlaces, como cianuros (N = C-) y acetileno (HC = CH). La reducción de acetileno o etileno sirve de base al método más usual de medir la actividad nitrogenasa, el llamado ensayo de reducción de acetileno, que se registra mediante aparatos de cromatografía gaseosa. No todos los microorganismos responden de la misma manera a los factores ambientales lo que para unos puede ser beneficioso para otro perjudicial.

2.- pH:
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Debido a que los microorganismos cambian el pH del medio cuando crecen se debe añadir un tampón en el medio para mantener el pH constante. Estos tampones funcionan en un rango de pH por lo que se debe utilizar diferentes tampones dependiendo del pH que se quiera en el medio. Para pH neutros se utiliza el tampón fosfatos. Los ambientes naturales tienen un rango de pH que oscila entre 5 y 9. Los microorganismos que crecen a pH inferiores a 5 se denominan acidófilos (Thiobacillus pH: 0,5). Los microorganismos que crecen a pH superiores a 9 se denominan alcalinófilos (Bacillus pH: 11). La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales. Es un parámetro crítico en el cultivo de microorganismo ya que estos sólo pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren rápidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a ambos lados de la membrana citoplasmática.  Cada tipo de microorganismos tiene un rango de pH en el que puede vivir adecuadamente, fuera de este rango mueren.  Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, también, distintos. Hay microorganismos acidófilicos que pueden vivir a pH = 10 y otros alcalofílicos que toleran pH = 10,0.  El pH interno en la mayoría de los microorganismos está en el rango de 6,0 a 7,0.

Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. Por consiguiente, es necesario controlar el pH de los cultivos industriales para evitar que un descenso excesivo pueda producir el auto esterilización del cultivo.

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Por otra parte, la bajada del pH del medio que produce ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros

microorganismos competidores. Así, por ejemplo, las bacterias lácticas que producen grandes cantidades de ácido láctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4,5). De esta forma, las bacterias competidoras mueren y las lácticas se convierten en la población dominante. La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos orgánicos de cadena corta (fórmico, acético, láctico) por ciertas bacterias. Es este sentido, hay que tener en cuenta que la acción bactericida de estos ácidos orgánicos de cadena corta es más potente que la debida únicamente a la bajada del pH que producen. Esto es, los ácidos orgánicos de cadena corta son tóxicos para algunas bacterias por sí mismos. En resumen, es necesario controlar el pH de los cultivos y de las fermentaciones industriales para que se mantenga en los niveles adecuados para el crecimiento y metabolismo correcto del microorganismo con el que se trabaja. Un microorganismo puede alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las sustancias producidas por el propio microorganismo: por ejemplo:

Utilización de carbohidratos Acidificación.

producción de ácidos orgánicos

Catabolismo de proteínas Alcalinización.

producción de materiales nitrogenados

Estos cambios pueden llegar a ser tan grandes que inhiban el crecimiento del microorganismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampón. Uno de los más utilizados en microbiología es la combinación de KH2PO4 y K2HPO4 tamponando el medio a un pH de aproximadamente 6,8.

3.- OXÍGENO:
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Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxígeno y el dióxido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxígeno libre clasificándose en los siguientes grupos:

a).- Aerobios: Bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre y obtienen energía de las reacciones metabólicas dentro de ellas tenemos las siguientes:  Obligadas: requieren O2 para crecer (21%).  Facultativos: no requieren pero crecen mejor en presencia de O2. Microaerófilos: Bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno libre. Requieren pero a niveles mas bajos que los atmosféricos (1 – 15%).

b).- Anaerobias: Bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre.  Aerotolerantes: no requieren y crecen pro cuando el O2 está presente.  Obligados la presencia de O2 letal. c).- Anaerobias facultativos: Bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxígeno libre. Para desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitación constante o introduciendo aire estéril en el medio. Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por los que se debe evitar la exposición de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de anaerobios por los siguientes métodos:

A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato sódico, para disminuir el contenido de O2. B.- Quitando el O2 por procedimientos mecánicos y reemplazándolo por N2 o CO2. C.- Mediante reacciones químicas dentro del recipiente que contiene el medio de cultivo inoculado para combinar el oxígeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al encender una vela se transforma el oxígeno en dióxido de carbono
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4.- SALINIDAD: Concentración salina o porcentaje de sal en que podemos encontrar variedad de bacterias que viven en dichas concentraciones: Halófilas: microorganismos que viven en altas concentraciones de sales (10 – 15 % ) son aquellas bacterias aisladas del mar y ciertos alimentos. Otras bacterias como las aisladas en las fosas marinas, requieren presiones superiores a las normales.

Osmófilos: microorganismos que viven en altas concentraciones de azúcares. Xérófilos: microorganismos que viven en ambientes secos.

CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS SEGÚN SU COMPORTAMIENTO FRENTE AL CONCENTRACIÓN SALINA:

ORGANISMOS No halófilos

CONCENTRACION de ClNa (por 100). < 2 % ClNa Bacterias Marinas (la parte Gram.- negativas. mayor

Debidamente

2 - 5 ClNa

No esporulados de los géneros Pseudonomas Vibrio Achromo bacter y flavobacterium. Numerosas bacterias no pigmentadas gram+ ó

Halófilos Moderados

5 - 20 % ClNa

Halófilos externos

20 - 30 % ClNa

Bacterias muy pigmentadas Gramno esporuladas. Proteolíticas, la mayoría perteneciente ala género Halobacterium y al grupo Sarcina – Micrococcus.

V.- FACTORES EXTRINSECOS: Los factores extrínsecos son los que tienen que ver con en el ambiente donde se almacenan los alimentos. Entre ellos están la temperatura, la humedad relativa y los gases atmosféricos.

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1.- TEMPERATURA: La temperatura es uno de los factores ambientales que más influye en el crecimiento de los microorganismos. Al aumentar la temperatura aumenta la velocidad enzimático hasta una cierta temperatura a la cual las proteínas. DNA y otras macromoléculas son sensibles y se desnaturalizan. Cada microorganismo tiene una temperatura mínima, óptima y máxima de crecimiento. La temperatura óptima siempre está más cerca de la temperatura máxima que da la mínima. No todos los microorganismos crecen a la misma temperatura.

a.- Según la Temperatura Óptima de Crecimiento se Pueden Distinguir Tres Grupos: Los mesófilos, los psicrófilos y los termófilos, las cuales se explicara mas adelante.

Los microorganismos psicrotrofos y los termotrofos, son microorganismos mesófilos pero que igualmente pueden crecer a temperaturas bajas o altas, respectivamente. La temperatura a la cual se encuentra la leche después del ordeño favorece la rápida multiplicación microbiana. La mayor proporción de la flora bacteriana presente, son microorganismos mesófilos, es por ello que la inmediata refrigeración a temperaturas de 4 a 5 °C se hace fundamentalmente para asegurar la calidad de la leche. Pero su almacenamiento no debe ser prolongado (máximo 24horas) ya que favorece el aumento en número de la flora psicrotrofa. Cuando no vaya a ser procesada el mismo da de recepción debe ser sometida a un proceso de terminización.

b).- Crecimiento Microbiano a Temperaturas Extremas: Debido a que los humanos viven y trabajan sobre la superficie de la tierra donde las temperaturas son moderadas, es natural considerar a los ambientes muy fríos o muy calientes como extremos, debido a que los humanos morirían rápidamente en estos ambientes. Sin embargo los hábitat naturales para muchos microorganismos pueden ser, o bien extremadamente calientes o

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extremadamente fríos y han evolucionado adecuadamente. Para que su crecimiento sea el óptimo en estas condiciones. Cada especie o cepa bacteriana tiene temperatura cardinal distinta, de modo que una bacteria puede presentar una temperatura óptima superior a la temperatura cardinales distintas, de modo que una bacteria puede presentar una temperatura óptima superior a la temperatura máxima de otra, o inferior a la temperatura mínima de una tercera. Según el rango de temperaturas al que pueden crecer las distintas bacterias, se pueden establecer tres tipos principales.

A.- PSICRÓFILAS O CRIÓFILAS: Bacterias Psicrófilas son las que crecen a temperatura de refrigeración. Son bacterias Psicrófilas los miembros del género Speudomonas, Flaviobacterium Acinetobacter, Alcaligénes, Bacillus. Crecen a partir de entre – 5 a 5 °C.  Las Psicrófilas Obligadas : Tienen temperatura óptima a 15 – 18 °C y temperatura máxima de 19 a 22 °C; como por ejemplo: Flavobacterium. La bacteria Polaromonas bacuolata, recientemente aislada en aguas heladas de la Antártica es lo que pudiéramos llamar un psicrófilo extremo. Tiene su óptimo de crecimiento en 4 °C y es incapaz de crecer a 14 °C.  Las Psicrófilas Facultativas: También llamadas Psicrotrofas - presentan temperaturas óptimas en torno a los 20 – 30 C y máxima, a los 35 C. Entre otras que son las Pseudomonas, Alcalígenes.  Ambientes Fríos y Psicrófilos: Mucha de la superficie terrestre experimenta temperaturas bastante bajas. Los océanos que ocupan más de la mitad de la superficie terrestre, tiene una media de 5 °C y sus profundidades poseen temperaturas constantes de 1 a 3 °C una gran extensión de tierra del Ártico y del Antártico están permanentemente congeladas o descongeladas durante un periodo corto de tiempo en verano. Estos ambientes fríos son raramente estériles se pueden encontrar
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microorganismos vivos incluso a temperaturas muy bajas siempre y cuando exista agua en forma líquida incluso en materiales congelados existen determinadas zonas microscópicas donde existe agua en forma líquida y los microorganismos pueden crecer. Es importante entre medios ambientes que se mantiene fríos a lo largo de todo el año y los que están fríos en invierno. Estos últimos típicos de las zonas climáticas continentales, pueden alcanzar temperaturas veraniegas de hasta 40 °C, y las temperaturas invernales pueden ser de menos 20 °C e incluso más frías. Estos ambientes tan variables son mucho menos favorables para los microorganismos Psicrófilos que las

regiones polares, elevadas altitudes y profundidades de los océanos. Un microorganismo Psicrófilo puede definirse como aquel con una temperatura óptima de crecimiento de 15 °C o más con una máxima por debajo de 20 °C y una mínima de 0 °C o menor. Los organismos que crecen 0 °C pero cuya temperatura óptima entre 20 - 40 °C Psicrotolerantes. Por tanto, los Psicrófilos se encuentran en ambientes permanentemente fríos y mueren rápidamente si se expone a temperatura ambiente. Por esta razón el estudio de laboratorio con ellos requiere un enorme cuidado durante el muestreo, transporte, plaqueo, pipeteo y otras manipulaciones para que la temperatura no exceda de la máxima. Algunos de los de mejores estudiados son algas microscópicas que crecen en masas en las regiones polares. Las algas Psicrofílicas pueden verse también en la superficie terrestre y glaciares en cantidades tan grandes que les dan una coloración distintivas verde o roja las más común de estas algas son las Chlamydomonas nivalis, las esporas rojas son las responsables del color rojo de El alga probablemente crece dentro de la nieve en una manera vegetativa y por tanto verde; cuando las condiciones son desfavorables esporula volviéndose roja y concentran en la superficie a medida que la nieve se funde con la llegada de la primavera. Este tipo de al gas son muy frecuentemente observables en campos de nieve en fusión, durante mediados de verano en áreas secas

donde llueve poco pues de lo contrario son lavadas en su hábitat. Los microorganismos Psicrotolerantes están mucho más ampliamente distribuidos que los psicrófilos puros y pueden aislarse del suelo y aguas de climas temperados así como la carne, leche y otros productos lácteos, cidra, vegetales

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y frutas almacenadas en refrigeración (4 °C). Como se a microorganismos psicrotolerantes crecen mejor entre 20 – 40 °C.

indicado los

Debido a que las temperaturas ambientales se caldean en verano, se entiende que normalmente los psicrotolerantes excluyan a los verdaderos psicrófilos en climas temperados. Hay que enfatizar aunque los psicrotolerantes crecen a 0 °C lo hacen muy mal y hay que esperar semanas antes de que sea visible su crecimiento los psicrotolerantes incluyen géneros de bacterias, hongos, algas y protozoos.  Adaptaciones Moleculares al Psicrofilia: Los psicrófilos producen enzimas que funcionan óptimamente en frío y se desnaturalizan rápidamente a temperaturas moderadas. Otra característica de los psicrófilos si se compara con los mesófilos, es que a bajas temperaturas tiene lugar al proceso de transporte activo lo que es una clara indicación que la membrana de estos microorganismos es de distinta naturaleza pues a bajas temperaturas pueden seguir llevando a cabo su función. De hechos sus membranas contienen una mayor proporción de ácidos grasos insaturados lo que ayuda a mantener el estado semifluido de la membrana bajas temperaturas (las membranas compuestas de ácidos grasos saturados se harían poco fluidas y no funcionales a bajas temperatura).

Los lípidos y algunas bacterias psicrófilas también contienen ácidos grasos poco insaturados e hidrocarburos de cadena larga y dobles enlaces múltiples. En este sentido en diversas bacterias antárticas se ha detectado un C31- 9 B.- MESÓFILAS: Presentan temperaturas mínimas de 10 – 15 C, óptimas de 25 – 40 C y máximas entre 35 – 47 C. La mayor parte de las bacterias - incluyendo las patógenas – pertenecen a esta categoría. Algún grupo de las bacterias Mesófilas pertenece a la mayoría de la flora que se encuentra con mayor frecuencia en la leche, principalmente las bacterias lácticas.

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C.- TERMÓFILAS: Se presentan mínimo a 25 C, óptimos de 50 a 75 C y máximos de 80 – 105 C. Dentro de esta categoría se pueden distinguir las termófilas extremas – Hipertermófilas- que pueden llegar a presentar óptimos cercanos a los 100 C y, que taxonomicamente pertenecen al dominio de las Archaea: Bacterias termófilas son aquellas que crecen bien a temperaturas entre 45 a 55 C, en este grupo están las Lactobacillus bulgaricos,, L. fermenti , L.. lactis, L.. helveticus, L. acidophilus, Streptococcus, termophilus. a.- Las termófilas estrictas – estenotermófilas. Con óptimos por encima de los 80 C son de hecho incapaces de crecer a menos de 37 C, como las citadas Arqueas. Ejemplos Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium. La Arquea Pyrolobus fumarií, habitante de los húmeros termales submarinos tiene su óptimo nada menos que ah 105 C y puede llegar a aguantar 113 C y parece que detiene su metabolismo por frío a lo agradable – temperatura de 90 C -.

b.- Termófilos e Hipertermófilos: Los organismos cuya temperatura óptima de crecimiento están por encima de 45 °C se denominan termófilos y aquellos que la presentan por encima de 80 °C se llaman hipertermófilos. Temperaturas tan altas como éstas solo se

encuentran en la naturaleza en ciertas áreas. Por ejemplo, ciertos suelos con alta insolación pueden rebasar fácilmente los 50 °C a medio día e incluso llegar a lo 70 °C, aunque es cierto que unos pocos centímetros por debajo la temperatura es inferior. Materiales en fermentación tales como las pilas de compost y ensilados llegan a los 60 – 65 °C. Sin embargo, las temperaturas más extremas de la naturaleza están asociadas a procesos volcánicos. Muchos arroyos calientes se aproximan a los 100 °C y fumarolas volcánicas, rebasan fácilmente los 150 °C incluso se acercan a 500 °C. Fumarolas hidrotermales en el fondo de los océanos alcanzan temperaturas comprobadas de 350 °C e incluso mayores. Los arroyos calientes se encuentran distribuidos por todo el mundo, pero son particularmente abundantes en es oeste de USA, Nueva Zelanda, Islandia, la región
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Mediterránea, Japón, Indonesia, América Central y África Central. La zona con la concentración mayor de este tipo de causes es el parque nacional de Yellowstone, Wyoming. Aunque en algunos arroyos varié la temperatura en otros es muy constante con variaciones menores de 1 – 2 C a lo largo del año. Muchos arroyos calientes están próximos a l punto de ebullición del agua (93 C) en Yellowstone y (99 C) al nivel del mar. A medida que el agua corre, se enfrían originando un gradiente de temperatura alo largo de este gradiente crecen varios microorganismos, con diferentes especies creciendo en un amplio rango de temperatura. Estudiando la distribución de especies a lo largo de tales gradientes y en distintas partes del mundo, es posible determinar el límite superior de temperatura para cada

clase de organismo a partir de esta información concluimos que:  Los organismos procarióticos, en general son capaces de crecer a temperaturas mas altas que los eucarióticos.  Las especies mas termofílicas de los procariotas son ciertas Archaea.  Los organismos no fototróficos son capaces de crecer a temperaturas más altas que los fototrofos, sin embargo, hay que enfatizar que no todos los organismos de un mismo grupo son capaces de crecer cerca del límite superior sino solamente unos pocos.

d.- Adaptaciones Moleculares a la Termofilia: ¿Cómo pueden lo termófilos y los hipertermófilos prosperar a altas temperaturas? En primer lugar sus enzimas y otras proteínas celulares son mucho más estables al calor que los de los mesófilos, funcionado óptimamente a altas temperatura. ¿Cómo se consigue esta estabilidad al calor? Los estudios de la s enzimas termoestables indican que muy a menudo difieren en muy pocos aminoácidos de su secuencia y que unos pequeños aminoácidos en puntos clave permiten un plegamiento de la cadena polipeptídica diferente; esto sería en último término el responsable de la resistencia al calor. La estabilidad a la

temperatura de proteínas de hipertermófilos se incrementa como resultado de la formación de puentes de sal y un empaquetamiento altamente hidrofóbico
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del interior de las proteínas. Además la maquinaria sintetizadora de proteínas (esto es, ribosomas y otros constituyentes) de los termófilos e hipertermófilos son también estables al calor, lo mismo ocurre con la membrana

citoplasmática: se mencionó antes que los psicrófilos poseen membranas ricas en ácidos graso insaturados, lo que fluidifica la membrana citoplasmática a bajas temperaturas. Los termófilos poseen membranas ricas en ácidos grasos saturados, lo que hace que las membranas sean estables y funcionales a altas temperaturas. Los ácidos grasos saturados dan lugar a enlaces hidrófobos mucho más eficientemente que lo ácidos grasos insaturados. Los

Hipertermófilos, visualmente todos perteneciente a las Arquea, no contiene ácidos grasos en sus membranas; en su lugar poseen hidrocarburos de cadena larga formados por unidades repetitivas de Gitano, unido por un enlace éter alglicerofosfato. ¿Porque los eucariontes están ausentes de ambientes con temperaturas superiores a 60 °C? Presumiblemente en ello esta implicada la organización de la membrana de los orgánulos celulares que debe permanecer porosa para permitir el paso de moléculas tales como el ATP y ARN. Es probable que tales membranas porosas sean más sensibles a la temperatura que las membranas porosas sean más sensibles a la temperatura que las membranas procarióticas. Por tanto, por encima de 60° C los orgánulos de los eucariotas no sobreviven y la única forma de vida posible es la procariota. e.- Ecología y Aplicaciones Biotecnológicas de los Termófilos e Hipertermófilos: En la mayoría de los arroyos hirvientes esta presente una gran variedad de formas de vida hipertemófílicas. El crecimiento de tales organismos se puede estudiar e introduciendo portas en el agua y sacándolos después de unos pocos días. La observación microscópica revelan la presencia de colonias procarióticas que se desarrollaron a partir de bacterias únicas unidas al cristal.

D.- TERMODÚRICAS: Las bacterias termodúricas, que en su mayoría son mesófilas que resisten temperaturas de pasteurización, alguna de ellas son termófilas. Se encuentran en este grupo los Micrococcus Clostridium.
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Microbacterium, Esporas de bacillus

y

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RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS: GRUPOS Termófilos Termotrofos Mesófilos Psicrófilos Psicrotrofos MIN 40 - 45 15-25 5- 15 - 5 - +5 -5 - +5 OPTIMA 55- 75 30 -40 30- 40 12 – 15 25 – 30 MAX 60 – 90 45 – 50 40 – 47 15 – 20 30 – 35

MICROORGANISMOS PSICRÓFILOS Y TERMODÚRICOS DE LA LECHE CRUDA Géneros Termodúricos Géneros Psicrotrofos Pseudomonas Microbacterium Micrococus Esporas de Bacillus Esporas de Clostridium Alcaligenes Acinetobacter Flavo bacterium Aerobacter Alcaligenes Bacillus Artrhobacter

2.-TRATAMIENTO QUE MANIPULAN LA TEMPERATURA:

a).- Altas Temperaturas: Las temperaturas superiores a las de crecimiento óptimo procuran

inevitablemente la muerte del microorganismo o le producen lesiones subletales. Las células lesionadas pueden permanecer viables pero son incapaces de multiplicarse hasta que la lesión haya sido reparada.

b).- Radiación Ultravioleta: La radiación ultravioleta produce una disminución exponencial en el número de células vegetativas o de esporas vivas con el tiempo de irradiación. Por tanto se pueden calcular valores análogos para la irradiación.

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3.- CONGELACIÓN: A pesar de la capacidad de unos organismos de crecer a bajas temperaturas, existe un límite por debajo el cual es imposible la reproducción. El agua pura se congela a 0 °C y el agua de mar a – 2,5 °C pero la congelación no es un proceso homogéneo, de modo que a temperaturas mucho más bajas existen micro bolsas de agua no congelada. Aunque el frío previene el crecimiento microbiano, no implica necesariamente la muerte celular. A demás, el medio en el que están suspendidas las células afecta su sensibilidad al frío. Líquidos solubles en agua, como el glicerol dimetilsulfóxido, cuando se añaden al 10 % de concentración final, penetran en células y las protege previniendo la formación de cristales de hielo. De hecho, la adición llamados crioprotectores, es la forma de tales agentes, los cultivos

habitual de conservar

microbianos a temperaturas muy bajas (usualmente – 70 – 196 °C).

4.- REFRIGERACIÓN: Entendemos por refrigeración la conservación de alimentos a temperaturas inferiores a 10 °C y superiores al punto de congelación del agua. La baja temperatura es evidentemente un factor limitante del crecimiento microbiano según su comportamiento frente a la temperatura, los órganos pueden ser termófilos, mesófilos, y psicrófilos. Al tratar la refrigeración de alimentos hay que considerar varios aspectos.

5.-

LA

REFRIGERACIÓN

ES

UN

FACTOR

DE

SELECCIÓN

DE

POBLACIONES BACTERIANAS: A temperatura de refrigeración (0 – 5 °C) los organismos psicrófilos crecen más rápidamente que los mesófilos y por tanto la baja temperatura pero se supone un factor de selección de la flora del alimento de gran importancia. Este hecho unido a temperaturas inferiores a la óptima los periodos de latencia se alargan mucho especialmente en bacterias mesófilas hace que la población bacteriana esperable tras largos periodos de refrigeración este constituida

mayoritariamente por Psicrófilos. Y que por consiguiente los procesos que se produzcan a esta temperatura sean predominantemente de alteración más que de desarrollo de microorganismos patógenos.

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6.- CHOQUE DE FRÍO: Cuando se enfría rápidamente un alimento muchas de las bacterias mesófilas que normalmente resistirían la temperatura de refrigeración mueren como consecuencia del Choque de frío. En Gram – negativas que en Gram –

positivas, el frío produce alteraciones metabólicas en los microorganismos. A baja temperatura las rutas metabólicas de los microorganismos se ven alteradas, como consecuencia de su adaptación al frío. Estos cambios metabólicos pueden dar lugar a que se produzcan deteneros diferentes a los causados por los mismos microorganismos a diferentes temperaturas.

7.- HUMEDAD RELATIVA: La humedad de la atmósfera influye en la humedad de las capas superficiales de los alimentos en almacenamiento. En leche fluida no juega un papel importante, contrario al que puede jugar en quesos en almacenamiento o cavas de maduración. 8.- GASES ATMOSFÉRICOS: Al igual que la humedad relativa, los gases atmosféricos no influyen marcadamente en la calidad microbiológica de la leche cruda, salvo que la misma sea sometida a procesos de agitación fuerte donde el oxígeno del aire puede ser incorporado al alimento y favorece el crecimiento microbiano

aeróbico. Este factor debe ser considerado en el almacenamiento de ciertos derivados lácteos los cuales pueden verse alterados por una alta presión de oxígeno.

VI.- FACTORES IMPLICITPOS: Dentro de los factores implícitos se describen los relacionados directamente con las especies microbianas, su metabolismo y las relaciones que establecen. No todas las bacterias tienen la capacidad de crecer en leche, aún cuando encuentran condiciones óptimas. Esto es debido al estado como se encuentran los diferentes componentes. Por ejemplo, no todas las especies tiene la capacidad de metabolizar la lactosa, si no que necesitan que esta esté hidrolizada para así poder utilizar la glucosa o galactosa. De manera que aquellas que estén capacitadas para producir las enzimas necesarias se verán mas favorecidas en crecer. Así mismo pasa con las proteínas, muchos
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microorganismos no tienen poder proteolítico, por lo que dependen de otros que metabolizen las proteínas y así mismo pasa con las proteínas, muchos microorganismos no tiene poder proteolítico, por lo que dependen de otros que metabolizen las proteínas y así poder utilizar los aminoácidos libres. De esa manera en la leche y productos lácteos se puede observar varios ejemplos de relaciones simbióticas, siendo la más destacada la que se da entre el Streptococcus thermophilus y el Lactobacilus bulgaricus, durante la atmósfera (leche en polvo, leche evaporada, quesos, etc).

a).- Microorganismos de Importancia en Leche Cruda: A continuación se presenta una breve descripción de los principales microorganismos que pueden encontrarse en la leche cruda.

Bacterias: Dada las características de la leche cruda, los microorganismos predomínales y que se ven favorecidos para su crecimiento son las bacterias. En la leche se puede encontrar diversos géneros y especies bacterianas.

SEGUNDA PARTE:

I.- PERMEABILIDAD Y TRANSPORTE: La membrana citoplasmática controla el paso de los nutrientes dentro de la célula, así como hacia fuera de la célula. Existen 4 mecanismos que regulan el transporte de nutrientes.

1.- Difusión Pasiva: Las moléculas de H2O y algunos nutrientes liposolubles pasan libremente a través de la membrana hasta equilibrar concentraciones. No hay consumo de energía.

2.- Difusión Facilitada: los nutrientes se unen a una proteína transportadora para atravesar la membrana pasando de mayor a menor concentración. No hay consumo de energía.
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3.- Transporte Activo: La mayor parte de los nutrientes son transportados mediante este mecanismo. Este proceso permite concentrar altos niveles de nutrientes necesarios para las actividades metabólicas dentro de la célula. Hay consumo de energía. El ATP distorsionado el sitio de unión de la proteína transportadora dificultando a la molécula salir de la célula.

4.- Transporte por Translocación de Grupo: En este tipo la proteína transportadora es una enzima que añade un grupo fosfato del ácido fosfoenolpirúvico al nutriente durante el transporte. Este nutriente alterado ya no es capaz de unirse a la proteína transportadora por lo que se acumula dentro de la célula.

II.- ENZIMAS: Las actividades de las células vivas, bacterias, plantas o animales, son llevadas a cabo con la participación de enzimas. Cada célula incluye varias de ellas, y su número dependen de las capacidades genéticas del organismo. Las enzimas son proteínas y son producidas únicamente por células vivas.

1.- Carácter de las Enzimas: Una enzima es un catalizador que modifica el índice o velocidad de una reacción química y que permanece prácticamente inalterado al terminar la reacción. La enzima forma un complejo con el sustrato, que lleva acabo una redistribución energética con el mismo. La energía para iniciar una reacción se llama energía de activación. Además de las proteínas, algunas enzimas contienen un componente orgánico de poco peso molecular, unido íntimamente forma no estable (coenzima). (grupo prostético) o unido en

2.- Especificidad de Enzimas: Una enzima dada puede adsorber y actuar solamente en un substrato o quizás en substratos afines. La maltosa, por ejemplo, hidroliza la maltosa pero no lo hace con la sacarosa o la lactosa. El hecho que las enzimas sean específicas
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significa que un microorganismo que ataca varios substratos o causa gran variedad de reacciones producirá gran número de enzimas,

correspondientemente. El total quizá sea cientos de ellas.

3.- Enzimas Inductivas y Enzimas Constitutivas: Las bacterias producen ciertas enzimas solamente cuando el medio incluye sus substratos específicos. A ellas se les conoce como enzimas inductivas.

Un ejemplo de la inducción enzimática se ha logrado por experimentos con leuconostoc mesenteroides. Se hizo crecer a éste microorganismos en medio que contuviera glucosa, lactosa, arabinosa o bien en un medio sin azúcar. Después de ello fue pasado a soluciones de prueba que contenían uno de los tres azúcares. La glucosa fermentó en los tres casos, y las enzimas de las que dependió de la reacción, fueron constitutivas. Las enzimas necesarias para la fermentación de la lactosa y la arabinosa fueron inductivas: se produjeron solamente por microorganismos cultivados en medios que contenían el mismo azúcar.

Otras sustancias químicas también trastornan la actividad enzimática específica. Un compuesto que difiere poco del substrato normal será absorbido por la enzima o impedirá la absorción ulterior del substrato normal. Ello reducirá la actividad corriente de la enzima. Sustancias de este tipo que transforman la acción enzimática vital se denominan antimetabolismo. La inhibición en el sitio enzimático se conoce como inhibición competitiva.

4.- Concentración de Reactivos: La concentración de una enzima o de cofactores o de coenzima necesarias rige el grado de reacción química que ocurre siempre que haya suficiente substrato. En forma semejante, la velocidad de la reacción depende de la presencia de suficiente substrato para saturar los sitios activos en la enzima.

5.- Enzimas y Células Vivas: Se ha considerado que las enzimas son sustancias inertes aunque son componentes vitales de las células vivas. La in activación enzimática puede
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conducir a la muerte de la célula que contenga la enzima, privando a la célula de las funciones necesarias para la vida.

6.- Reversibilidad de la Acción Enzimática: Muchas reacciones enzimáticas en las células vivas parecen ser reversibles, pero la irreversibilidad aparente es atribuida a la extracción de los productos de la reacción con la misma rapidez que se forman.

7.- Factores que modifican la acción enzimática: La acción enzimática es modificada por agentes físicos o químicos que alteran las propiedades de las proteínas.

8.- Temperatura: La temperatura elevada produce un cambio poco comprendido en las proteínas, llamada desnaturalización. Muchas enzimas son inactivadas rápidamente a temperaturas mayores de 70 ° C. La actividad enzimática disminuye por debajo de la temperatura óptima y es prácticamente nula 0°C. en consecuencia la temperatura modifica la actividad enzimática de dos formas:

1.- Al elevarse la temperatura a un punto menor de la óptima se acelera la acción de la enzima, tal como la velocidad de otras reacciones químicas es mayor a temperaturas elevadas.

2.- por arriba de la temperatura disminuye la actividad.

óptima la desnaturalización proteínica

pH la actividad de ciertas enzimas es mayor en ciertos límites de pH y es menor en soluciones más activas y alcalinas. El pH óptimo de muchas enzimas bacterianas se localiza entre seis y ocho. Algunas enzimas de levadura y mohos son más activas a un pH entre tres y cinco.

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8.- Sustancias Químicas: Los metales pesados o son sus sales son coagulantes proteínicos notables; muchos de ellos inactivan “intoxican” las enzimas se combinan con los grupos SH y no los sitios específicos de actividad enzimática; a ello se ha llamado inhibición no competitiva.

III.-

NOMENCLATURA,

CLASIFICACION

Y

ACTIVIDADES

DE

LAS

ENZIMAS:

Suelen de nominarse las enzimas añadiendo el sufijo asa al nombre (o la raíz) del substrato o fenómeno que cataliza. La proteinasa actúa en las proteínas, la lipas en los lípidos y la carbohidrasa en los carbohidratos. La gelatinasa hidroliza la gelatina y la maltasa. Las enzimas que desdoblan los compuestos por hidrólisis se conocen como oxidasas y las que causan pérdida, del hidrógeno del substrato son deshidrogenasas.

1.- Enzimas Extracelulares: Las exoenzimas o enzimas extracelulares son productos de secreción celular y catalizan reacciones en el exterior de las células, por lo regular son hidrolasas y actúan en la digestión de materiales alimentarios complejos.

2.- Enzimas Intracelular: Estas enzimas son las que se encuentran en la célula y su actividad se limita al interior de la misma. Se les clasifican según el tipo de reacción o fenómeno que catalizan.

3.- Permeasas: Transportan algunos nutrientes del medio a través de la membrana celular y permite la acumulación de dichas sustancias en la célula.

4.- Hidrolasas: Las hidrolasas intracelulares llevan a cabo ciertas líneas hidrolíticas en la célula.

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5.- Enzimas de Transferencia de grupos: Las enzimas que transfieren radicales de fosfato son esenciales para el metabolismo de carbohidratos y para la formación de enlaces de fosfatos ricos en energía.

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IV.- CONCEPTO DE METABOLISMO: El termino metabolismo se utiliza cuando nos referimos a todos los procesos químicos que tienen lugar dentro de una célula. Los elementos químicos básicos que utiliza una célula provienen del medio ambiente y estos elementos químicos son transformados por la célula en los constituyentes característicos que componen dicha célula. Estos compuestos químicos se llaman nutrientes y el proceso por el cual una célula transforma estos nutrientes en sus componentes celulares se denomina anabolismo o biosíntesis. La biosíntesis es un proceso que requiere energía. Esta energía se obtiene del medio ambiente. Las células pueden utilizar 3 tipos distintos de fuente de energía: luz, compuestos orgánicos y compuestos inorgánicos. Aunque algunos organismos obtienen su energía de la luz, la mayor parte lo hacen a través de compuestos químicos. Cuando estos compuestos químicos se rompen originando

compuestos más simples se libera energía. Este proceso se denomina catabolismo. Las células también necesitan energía para otras funciones celulares como es la motilidad (movimiento celular) y transporte de nutrientes. Como hemos visto existen dos procesos básicos de transformaciones químicas en las células: anabolismo y catabolismo. El resultado colectivo de las reacciones anabólicas y catabólicas es el metabolismo.

V.- LA ENERGIA Y EL PODER REDUCTOR EN EL METABOLIMO MICROBIANO:

PAPEL DEL ATP DE LOS PIDIN NUCLEOTIDOS: La energía química liberada cuando un compuesto orgánico o inorgánico es oxidado. En biología las unidades de energía más usadas son las kilocaloría (Kcal) y el kilojulio (KJ). 1 Kcal = 4,184 KJ. La utilización de energía química en los organismos vivos está implicada con las reacciones de oxidación –reducción, llamadas REDOX ya que por cada oxidación que ocurre tiene que haber una reducción. Una oxidación se define como la adición de electrones de una sustancia y una reducción se define como la adición de electrones a una sustancia. En bioquímica, las oxidaciones
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y reducciones frecuentemente conllevan no sólo la transferencia de electrones, sino de átomos enteros de hidrógeno. La energía liberada como resultado de las reacciones redox debe de conservar para ser utilizada por la célula. En los organismos vivos. La energía química liberada en las reacciones redox se transfiere normalmente a una variedad de compuestos fosfato en la forma de enlaces fosfato de alta energía. El compuesto mas importante en los organismos vivos que contienen enlaces fosfato de alta energía es el adenosín trifosfato (ATP). El ATP contiene 2 enlaces fosfato de alta energía. Se puede considerar que el ATP tiene por objeto “atrapar” una parte de la energía libre que queda disponible en las reacciones catabólicas e impulsar reacciones biosintéticas al activar ciertos metabolitos intermediarios de la biosíntesis. Además del ATP. Existen otros compuestos de alta energía que activan intermediarios metabólicos y así impulsan ciertas reacciones de biosíntesis: Compuestos de alta energía: causa activación en la biosíntesis de: Guanina, Uridina Citidina Desoxitidimina Acetil coenzimaA Proteínas, Peptidoglicanos, Glucógeno Fosfolípidos Lipolisacáridos. Ácidos grasos.

Ya hemos dicho que cuando ocurre una oxidación tiene que haber una reducción, es decir una sustancia que acepte los electrones eliminados. En la mayor parte de los casos, cada etapa de oxidación de un metabolito implica la eliminación de dos electrones y, por ello, la pérdida simultánea de dos protones; esto equivale a al eliminación de dos átomos de hidrógeno y se denomina deshidrogenación. Inversamente, la reducción de un metabolito implica la adición de dos electrones y de dos protones y se considera una hidrogenación.

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Los compuestos que con más frecuencia llevan a cabo oxidaciones y reducciones biológicas (es decir, que sirven como aceptores de átomos de hidrógeno requeridos para las reacciones de hidrogenación) son dos piridín nucleótidos: nicotinamida adenín dinucleótido (NAD) y nicotinamida adenín dinucleótido fosfato (NADP). Estos dos piridín nucleótidos pueden fácilmente sufrir oxidaciones y reducciones reversibles en el grupo nicotinamida. La oxidación – reducción reversible del NAD y del NADP puede simbolizarse así: NAD + + 2H Oxidado NADP + + 2H NADH + H + Reducido NADPH + H +

VI.- MECANISMOS DE OBTENCION DE ATP: En el meta holismo, el ATP se genera por dos mecanismos bioquímicos fundamentalmente diferentes: fosforilación a nivel de sustrato y fosforilación oxidativa. 1.- Fosforilación a nivel de sustrato: Mediante la fosforilación a nivel de sustrato, el ATP se forma a partir de ADP por transferencia de un grupo fosfato de alta energía de un intermediario de una ruta catabólica. La siguiente reacción sirve de ejemplo: Ácido 2 fosfoglicérico + ATP Como consecuencia de la pérdida de una molécula de H2O, el enlace éster de baja energía del fosfato del ácido 2 fosfoglicérico se convierte en un enlace enólico de alta energía en el ácido fosfoenolpirúvico. Este fosfato de alta energía puede luego ser transferido al ADP con lo que se produce una molécula de ATP. Acido fosfoenolpirúvico + ADP Acido pirúvico

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2.- Fosforilación Oxidativa (transporte de electrones). En los diferentes modos de metabolismo microbiano, incluyendo la respiración y la fotosíntesis. El ATP se genera por transporte de electrones a través de una cadena de moléculas transportadoras que tienen una orientación fijada en la membrana celular. Los componentes de la cadena son moléculas

transportadoras capaces de sufrir oxidaciones y reducciones de modo reversibles de tal manera que cada miembro de la cadena es capaz de ser reducido por la molécula transportadora que le precede y oxidado por la que le sigue. En la cadena de transporte de electrones algunos miembros transportan átomos de hidrógeno (un electrón más un protón), mientras que otros transportan solamente un electrón. La orientación de los transportadores en la membrana celular es tal que los transportadores de átomos de hidrógeno realizan el transporte hacia fuera de la célula y los transportadores de electrones lo realizan hacia el interior con lo que en cada confluencia se transporta fuera de la célula un protón. La membrana celular es impermeable a los protones, como resultado, el transporte de electrones retiene una porción de energía química liberada por la reacción global de la cadena ( oxidación del donador primario de electrones por el aceptor terminal de electrones). Esta energía se utiliza en los sistemas de permeasas, movilidad celular por flagelos y en la síntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico. Esta síntesis de ATP esta catalizada por un enzima complejo unido a la membrana la ATP fosfohidrolasa (ATPasa). La fosforilación oxidativa se puede explicar aplicando el símil de la generación de energía eléctrica a través de agua embalsada. La membrana actúa como una presa que retiene el agua (en este caso los protones que se transportan fuera de la célula a través de la cadena transportadora de electrones); en el momento que se abren las compuertas (ATPasa) esta agua liberada (protones) mueve la turbina (ATPasa) que genera energía eléctrica ( síntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico). I.MECANISMOS DE OBTENCION DE ENERGIA POR

MICROORGANISMOS QUIMIOHETEROTROS:

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Como ya hemos dicho, los organismos quimioheterótrofos son aquellos que utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía. Estos organismos son los animales, protozoos, hongos y casi todas las bacterias. Las vías utilizadas por los quimioheterótrofos para la oxidación de compuestos orgánicos y la conservación de la energía en ATP se pueden dividir en dos grupos: 1.- Fermentación: Cuando las reacciones redox ocurren en ausencia de cualquier aceptor terminal de electrones. 2.- Respiración: Cuando se utiliza el oxígeno molecular o algún otro agente oxidante como aceptor terminal de electrones. Aeróbica: oxígeno; Anaeróbica: Nitrato, Sulfato, Fumarato, Oxido de Trimetilamina. 1.- FERMENTACIÓN: Existen muchos tipos de fermentaciones pero en todas ellas sólo ocurre una oxidación parcial de los átomos de carbono del compuesto orgánico y por lo tanto sólo se produce una pequeña parte de la energía disponible. La oxidación en una fermentación está acoplada a la reducción de un compuesto orgánico generado a partir del catabolismo del sustrato inicial, por lo que no son necesarios aceptores externos de electrones. El ATP en la fermentación se produce a partir de la fosforilación a nivel de sustrato. Como consecuencia de la no participación de un aceptor externo de electrones, el sustrato orgánico experimente una serie de reacciones oxidativas y reductoras equilibradas; los piridín nucleótidos reducidos en un paso del proceso son oxidados en otro.

Este principio general se ilustra en dos fermentaciones: la fermentación alcohólica (típica del metabolismo anaeróbico de la glucosa por levaduras) y la fermentación homoláctica (típica del metabolismo de algunas bacterias lácticas). Ambos procesos fermentativos utilizan la ruta Embeben-Meyerhof: las dos moléculas de NAD reducidas por esta ruta se reoxidan en reacciones que

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implican un ulterior metabolismo del piruvato .en el caso de la fermentación homoláctica, esta oxidación ocurre como consecuencia directa de la reducción del ácido pirúvico se descarboxila primero para formar acetaldehído y reoxidación del NADH ocurre en paralelo con la reducción del acetaldehído para formar etanol.

Las bacterias pueden producir productos fermentativos finales distintos al ácido láctico y al etanol debido a las diferencias en el metabolismo del ácido pirúvico. Estos productos finales pueden ser ácido fórmico, 2,3 butanodiol, isopropanol, ácido butírico, butanol. La mayor parte de las fermentaciones bacterianas pueden originar varios productos finales pero ninguna fermentación da lugar a todos los productos finales.

A.- Resultados de la Fermentación de la Glucosa: El resultado final de la glicólisis es el consumo de glucosa, la síntesis de 2 ATP y la producción de productos de fermentación. Para el organismo el producto más importante es el ATP y los productos de la fermentación son productos de desecho, sin embargo, estos productos son muy importantes para el cervecero, panadero, quesero. La fermentación anaeróbica de glucosa por levaduras produce el etanol que es el producto principal de las bebidas alcohólicas, y la producción de ácido láctico es el paso inicial en la producción de productos lácteos fermentados incluyendo el queso. Para los panaderos, la producción de CO2 por la fermentación de levaduras es el paso esencial en esponjamiento del pan.

B.- El Efecto Pasteur: Reproduce en microorganismos capaces de realizar metabolismo fermentador y respiración aerobia (anaerobios facultativos). En presencia de O2 utilizan la respiración aeróbica, pero pueden emplear la fermentación si no hay O 2 libre en su medio ambiente. Pasteur fue el primero en observar que el azúcar es convertido en alcohol y CO2 por levaduras en ausencia de aire, y que en presencia de aire se forma muy poco o nada de alcohol, siendo CO2 rendimiento energético de la respiración sobre la fermentación.
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el

principal producto final de esta reacción aeróbica. Este efecto indica el mayor

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2.- RESPIRACIÓN AEROBICA: La glucosa, tanto en metabolismo respiratorio como en el fermentativo, se transforma en ácido pirúvico por una de las siguientes rutas: a).- Embeben – Meyerhof (eucariontes y procariontes). b).- Pentosa fosfato (eucariontes y procariontes). c).- Entner Doudoroff (sólo en ciertos procariontes como alternativa a la ruta Embden – Meyerhof). En la mayor aparte de los aerobios, el piruvato sufre una descarboxilación oxidativa catalizada por un sistema enzimático llamado complejo piruvato deshidrogenasa que produce acetil-coenzima A (acetil – CoA). El acetil – CoA es un metabolito precursor que puede entrar en rutas metabólicas biosintéticas; alternativamente, puede ser oxidado completamente a CO 2 a través de una ruta conocida como ciclo de Krebs o ciclo de ácidos tricarboxílicos (TCA). Este ciclo es la principal vía de generación de ATP en los heterótrofos aeróbicos (por paso de electrones a través de una cadena transportadora de electrones desde los piridín nucleótidos reducidos). El ciclo de TCA genera además tres metabolitos precursores, a- cetoglutarato, succinil – CoA y Oxalacetato. El ciclo TAC efectúa la oxidación completa de una molécula de ATO y una

molécula de FAD reducido (flavoproteína que cede electrones a una cadena de transporte independiente de piridín nucleótidos).

a).- Reacciones anapleróticas. El ciclo TCA, además de oxidar el acetil CoA ( dentro del ciclo) genera metabolismo precursores que son utilizados en la biosíntesis ( fuera del ciclo), por lo que requieren un aporte de ácido oxalacético que reponga el utilizado en la síntesis de los meta bolitos precursores. Estas reacciones de síntesis de oxalacético se denominan anapleróticas y fundamentalmente consisten en reacciones que carboxilan el piruvato o el fosfoenolpiruvato para obtener oxalacetato. Como resultado, el carbono procedente del piruvato entra en el ciclo por dos rutas: vía acetil CoA y vía piruvato o fosfoenolpiruvato. b).- Ciclo del gioxilato: Durante la oxidación de ácido acético o ácidos grasos que se convierten en acetil-CoA sin la formación intermedia de piruvato, ocurre una modificación
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especial del ciclo TAC conocida como ciclo del glioxilato. Bajo estas circunstancias no puede generarse oxalacetato a partir de piruvato o fosfoenolpiruvato (anapleróticas ya que en los microorganismos aeróbicos no existe un mecanismo que sintetice piruvato a partir de acetato. El oxalacetato requerido para la oxidación del acetato se repone mediante la oxidación de succinato y malato, que se produce por una secuencia de dos reacciones. En la primera reacción el isocitrato, que es un intermediario normal del ciclo TCA, se rompe para dar succinato y glioxilato para formar malato, el precursor

inmediato del oxalacetato. Así el ciclo del glioxilato actúa como una secuencia anaplerótica que permite el funcionamiento normal del ciclo TCA.

c).- Balance Energético de la Respiración aeróbica: El TCA produce la completa oxidación del ácido pirúvico en 3 moléculas de CO2 con la producción de 4 moléculas de NADH y una molécula de FADH. El NADH y FADH pueden ser oxidados a través del sistema de transporte de electrones originando 3 moléculas de ATP por NADH y 2 moléculas de ATP por FADH. También se produce una molécula de ATP por fosforilación a nivel de sustrato en la oxidación de a-cetoglutarato a succinato. En total suman 15 moléculas de ATP por ciclo. Como por cada molécula de glucosa se originan 2 moléculas de ATP formadas en la glicólisis y los 2 NADH que en presencia de O2 pueden ser reoxidados en el transporte de electrones originando 6 moléculas de ATP. En total son 38 ATP por cada molécula de glucosa con los 2 ATP producidos en la fermentación.

II.-

MECANISMOS

DE

OBTENCION

DE

ENERGIA

POR

MICROORGANISMOS AUTOTROFOS: A diferencia de lo que ocurre en los heterótrofos las reacciones de mantenimiento de los autótrofos, que obtienen su carbono celular del CO2, tiene lugar en dos fases bioquímicas distintas:

1.- Síntesis de metabolitos precursores. 2.- Síntesis de ATP y piridín nucleótidos reducidos. 1.- Síntesis de Metabolitos Precursores:

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Este ciclo es compartido por la mayoría del los fotoautótrofos y los quimioautótrofos. La mayor parte de los autótrofos (aunque hay excepciones) fijan el CO2 mediante una reacción catalizada por el enzima ribulosa difosfato carboxilasa que convierte la ribulosa en 1,5 difosfato en ácido 3 – fofoglicérico, a partir del cual se sintetizan todos los metabolitos precursores. Sin embargo, la fijación de CO2 depende de la disponibilidad de ribulosa difosfato por consiguiente, parte del ácido fosfoglicérico debe de utilizar para regenerar este aceptor de CO2 (ribulosa difosfato). El ciclo de Calvin – Benson puede dividirse en 3 fases:

1.- Fijación de CO2. 2.- Reducción del CO2 fijado. 3.- Regeneración del aceptor de CO2. El ciclo de Calvin- Benson, en lugar de producir ATP y reducir piridín nucleótidos, los consume. En los autótrofos tales compuestos se sintetizan por otros mecanismos. 2.- Síntesis de ATP y Piridín Nucleótidos Reducidos: Los quimioautótrofos obtienen ATP y poder reducir mediante la oxidación de compuestos inorgánicos. Los substratos que pueden servir como fuente de energía son H2. CO. H3N, NO2-, Fe2+ y compuestos reducidos azufre (H2S, S, S2O3-). En este tipo de metabolismo respiratorio, los electrones de estos compuestos pasan a través de una cadena de transporte de electrones que genera ATP por el modo que opera en los heterótrofos (fosforilación oxidativa). El aceptor terminal de electrones de la cadena de los quimioautótrofos es normalmente el O2. Algunos de estos substratos inorgánicos (H2 y CO) son agentes reductores suficientemente potentes como para reducir directamente a los piridín nucleótidos, pero otros no lo son. Estos agentes reductores débiles (NO2-, Fe2+) reducen los piridín nucleótidos por n proceso llamado transporte inverso de electrones; en el cual parte de la fuerza motora de protones generada en el funcionamiento de la cadena normal de transporte de electrones se utiliza para impulsar electrones en una dirección inversa, que de otro modo sería termodinámicamente desfavorable de otra cadena que une el sustrato inorgánico con los piridín nucleótidos oxidados que resultan por ello reducidos.
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