H1186A Student SPF

Introducción a la cromatografía
de líquidos de alto rendimiento

H1186A
Manual del Alumno
Nº de referencia del manual H1186-90000

Impreso en EE.UU. en noviembre de 2000
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Impreso en los Estados Unidos de América
ii
Contenido
INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTO
RENDIMIENTO ................................................................................................... 1
EN ESTA SECCIÓN APRENDERÁ LO SIGUIENTE ....................................................... 2
TIENE QUE RESOLVER UN PROBLEMA ................................................................... 3
TÉCNICAS DE SEPARACIÓN ................................................................................... 4
COMPARACIÓN DE LA HPLC Y LA GC ................................................................. 5
ANÁLISIS DE LA MUESTRA .................................................................................. 10
SEPARACIONES DE HPLC................................................................................... 11
EL CROMATOGRAMA .......................................................................................... 13
PARÁMETROS DE ANÁLISIS DE HPLC................................................................. 14
MODO DE CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTO RENDIMIENTO ..................... 15
APLICACIONES DE LA HPLC .............................................................................. 16
INSTRUMENTACIÓN DE LA HPLC ............................................................. 17
EN ESTA SECCIÓN APRENDERÁ LO SIGUIENTE ..................................................... 18
DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA INSTRUMENTACIÓN ............................................. 19
FILTROS DE DISOLVENTES .................................................................................. 21
DESGASIFICACIÓN AL VACÍO .............................................................................. 22
SISTEMAS DE DISTRIBUCIÓN ............................................................................... 24
SISTEMAS DE DISTRIBUCIÓN DE DISOLVENTE ..................................................... 25
PRINCIPIOS DE LAS BOMBAS DEL SISTEMA DE HPLC.......................................... 26
COMPONENTES DE UN SISTEMA DE DISTRIBUCIÓN DE DISOLVENTE..................... 33
FORMACIÓN DE GRADIENTES .............................................................................. 34
RESUMEN ........................................................................................................... 35
TÉCNICAS DE INYECCIÓN .................................................................................... 36
MUESTREADORES MANUALES ............................................................................ 37
MUESTREADORES AUTOMÁTICOS ....................................................................... 39
HORNO DE COLUMNA ......................................................................................... 42
DETECTORES DE HPLC ...................................................................................... 43
CARACTERÍSTICAS DE LOS DETECTORES............................................................. 48
DETECTORES DE UV/VIS .................................................................................... 52
DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA ......................................................................... 59
DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA ........................................................................... 65
HPLC-MS.......................................................................................................... 70
DETECCIÓN DEL ÍNDICE DE REFRACCIÓN ............................................................ 77
DETECCIÓN DE DISPERSIÓN LUMINOSA ............................................................... 79
DETECCIÓN DE CONDUCTIVIDAD ........................................................................ 83
iii
EJERCICIO DE LABORATORIO: SISTEMAS DE REPARTO DE
DISOLVENTES .................................................................................................. 85
EN ESTE EJERCICIO DE LABORATORIO:................................................................ 86
LA RUTA DE FLUJO ............................................................................................. 87
Depósitos de disolvente, desgasificador de vacío y bomba cuaternaria ...... 88
Bomba binaria............................................................................................... 89
Muestreador .................................................................................................. 90
MENSAJES DE ERROR E INDICADOR DE PRESIÓN ................................................. 91
DETECCIÓN DE FUGAS ........................................................................................ 92
SISTEMAS DE REPARTO DE DISOLVENTE ............................................................. 93
Desmontaje de la cabeza de la bomba .......................................................... 95
Montaje de la cabeza de la bomba................................................................ 96
Montaje de la cabeza de la bomba................................................................ 97
EJERCICIO DE LABORATORIO: MUESTREADOR Y DETECTOR ..... 99
EN ESTE EJERCICIO DE LABORATORIO:.............................................................. 100
MATERIALES .................................................................................................... 101
MUESTREADOR ................................................................................................ 102
CEBADO DEL SISTEMA ...................................................................................... 107
TEST DE PRESIÓN .............................................................................................. 109
DETECTORES .................................................................................................... 110
SUSTITUCIÓN DE LA LÁMPARA ......................................................................... 111
CELDA DE FLUJO .............................................................................................. 112
COMPROBAR LA CALIBRACIÓN ......................................................................... 113
HPLC PRÁCTICA............................................................................................ 115
EN ESTA SECCIÓN APRENDERÁ LO SIGUIENTE ................................................... 116
MANIPULACIÓN DE DISOLVENTES .................................................................... 117
PREPARACIÓN DE LA FASE MÓVIL ..................................................................... 121
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ........................................................................ 126
MANIPULACIÓN DE LAS COLUMNAS ................................................................. 128
RENDIMIENTO DEL SISTEMA ............................................................................. 135
RESUMEN ......................................................................................................... 138
REPASO ............................................................................................................ 139
RESOLUCIÓN CROMATOGRÁFICA Y SEPARACIÓN.......................... 141
RESOLUCIÓN .................................................................................................... 143
ECUACIÓN FUNDAMENTAL DE LA RESOLUCIÓN ................................................ 146
CAPACIDAD ...................................................................................................... 148
SELECTIVIDAD.................................................................................................. 151
EFICACIA .......................................................................................................... 159
VELOCIDADES DE FLUJO ................................................................................... 166
EFICACIA .......................................................................................................... 168
LONGITUD DE LA COLUMNA ............................................................................. 169
SIMETRÍA ......................................................................................................... 170
iv
RESOLUCIÓN .................................................................................................... 171
HOJAS DE TRABAJO .......................................................................................... 172
EJERCICIO DE LABORATORIO: PARÁMETROS DEL SISTEMA HPLC
............................................................................................................................. 175
MATERIALES .................................................................................................... 177
COMPOSICIÓN DE LA FASE MÓVIL ..................................................................... 178
ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN DE LA FASE MÓVIL............................................ 183
VELOCIDAD DE FLUJO ...................................................................................... 185
ANÁLISIS DE DATOS ......................................................................................... 186
TEMPERATURA DEL HORNO DE LA COLUMNA ................................................... 188
ANÁLISIS DE LOS DATOS DE TEMPERATURA...................................................... 189
RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS HABITUALES...................................... 191
MANTENIMIENTO DE REGISTROS ...................................................................... 193
CUIDADO DEL INSTRUMENTO ........................................................................... 194
TIEMPO DE RETENCIÓN Y ÁREA ........................................................................ 195
RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS DEL INSTRUMENTO ............................................. 196
CONSTANTES DE TIEMPO .................................................................................. 201
DETECTOR ........................................................................................................ 202
PROBLEMAS DE PRESIÓN .................................................................................. 203
PROBLEMAS CON LA LÍNEA DE BASE ................................................................. 204
PROBLEMAS CON COLUMNAS ........................................................................... 208
PROBLEMAS CON LA LÍNEA BASE ...................................................................... 213
PICOS FANTASMAS ........................................................................................... 214
FORMA DE PICO ................................................................................................ 215
TESTS ............................................................................................................... 221
HOJAS DE TRABAJO .......................................................................................... 222
ELUCIÓN DE GRADIENTES ........................................................................ 227
EL PROBLEMA GENERAL DE LA ELUCIÓN .......................................................... 229
ELUCIÓN DE GRADIENTES - UNA SOLUCIÓN ..................................................... 230
ANÁLISIS DE GRADIENTES ................................................................................ 232
¿POR QUÉ SON LOS PICOS ESTRECHOS Y TIENEN LA MISMA ANCHURA? ............ 233
DESARROLLO DE UN ANÁLISIS DE GRADIENTES ................................................ 235
MEJORA DE UN ANÁLISIS DE GRADIENTES ........................................................ 242
ELUCIÓN DE GRADIENTES ................................................................................. 244
CONSIDERACIONES ESPECIALES ....................................................................... 245
v
EJERCICIO DE LABORATORIO: ELUCIÓN DE GRADIENTES.......... 247
MATERIALES .................................................................................................... 249
ANÁLISIS DE EXPLORACIÓN .............................................................................. 250
PROCEDIMIENTO............................................................................................... 251
EXAMINAR EL ANÁLISIS DE EXPLORACIÓN ....................................................... 254
ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO........................................ 255
ANÁLISIS CUALITATIVO.................................................................................... 257
IDENTIFICACIÓN ............................................................................................... 258
ANÁLISIS CUANTITATIVO ................................................................................. 263
PATRÓN EXTERNO ............................................................................................ 271
CALIBRACIÓN ................................................................................................... 273
PATRÓN EXTERNO ............................................................................................ 275
NORM% ........................................................................................................... 277
ANÁLISIS DE PATRONES INTERNOS ................................................................... 278
PRECISIÓN Y EXACTITUD .................................................................................. 282
HARDWARE Y MATERIALES DE RELLENO DE LAS COLUMNAS .. 283
HARDWARE DE LAS COLUMNAS ........................................................................ 285
MATERIALES DE RELLENO DE COLUMNAS ........................................................ 289
TAMAÑO DE PARTÍCULA ................................................................................... 297
DIÁMETRO DE COLUMNA .................................................................................. 303
LONGITUD DE LA COLUMNA ............................................................................. 308
EJERCICIO DE LABORATORIO: HARDWARE DE COLUMNAS ....... 309
MATERIALES .................................................................................................... 311
COLUMNA ESTÁNDAR ....................................................................................... 312
CALCULAR VELOCIDADES DE FLUJO ................................................................. 315
COMPARACIÓN DE COLUMNAS ......................................................................... 316
DATOS DE LOS CUATRO PICOS PRINCIPALES...................................................... 318
PREGUNTAS ...................................................................................................... 320
EJERCICIO DE LABORATORIO: HARDWARE DE COLUMNAS
(EJERCICIO DE LABORATORIO SECO OPCIONAL)............................ 321
EN ESTE EJERCICIO DE LABORATORIO SECO SE UTILIZAN FICHEROS DE DATOS
ADQUIRIDOS ANTERIORMENTE. ........................................................................ 322
MATERIALES .................................................................................................... 323
CALCULAR VELOCIDADES DE FLUJO ................................................................. 324
COMPARACIÓN DE COLUMNAS ......................................................................... 325
DATOS DE LOS CUATRO PICOS PRINCIPALES...................................................... 327
PREGUNTAS ...................................................................................................... 329
vi
FASE INVERSA................................................................................................ 331
MECANISMO DE LA HPLC DE FASE INVERSA ................................................... 333
APLICACIONES DE LA HPLC DE FASE INVERSA ................................................ 335
ORDEN DE RETENCIÓN...................................................................................... 336
FASES MÓVILES ................................................................................................ 338
SELECCIÓN DE UNA COLUMNA.......................................................................... 343
SELECCIÓN DE UNA FASE ENLAZADA ................................................................ 345
PARÁMETROS DE COLUMNA ............................................................................. 347
ENLACE DE COLUMNAS .................................................................................... 351
SEPARACIONES DE FASE INVERSA DE MUESTRAS IÓNICAS......... 353
SEPARACIÓN DE ÁCIDOS DÉBILES ..................................................................... 355
SOLUCIONES TAMPÓN PARA EL CONTROL DEL PH............................................. 358
SOLUCIONES TAMPÓN PARA LA CONSIDERACIÓN DEL PH ................................. 359
SOLUCIONES TAMPÓN PARA EL CONTROL DEL PH............................................. 360
SEPARACIÓN DE BASES DÉBILES ....................................................................... 361
SEPARACIÓN DE ÁCIDOS Y BASES DÉBILES ....................................................... 365
HPLC DE PAR IÓNICO....................................................................................... 366
OPTIMIZACIÓN DE LA HPLC DE PAR IÓNICO .................................................... 369
EJERCICIO DE LABORATORIO: SEPARACIÓN DE COMPUESTOS
IÓNICOS DÉBILES MEDIANTE FASE INVERSA (EJERCICIO DE
LABORATORIO OPCIONAL)....................................................................... 371
MATERIALES .................................................................................................... 373
PROCEDIMIENTO............................................................................................... 374
PREGUNTAS ...................................................................................................... 375
HPLC POR INTERCAMBIO IÓNICO.......................................................... 377
MECANISMO DEL INTERCAMBIO IÓNICO ........................................................... 379
APLICACIONES DEL INTERCAMBIO IÓNICO ........................................................ 380
FASE ESTACIONARIA ........................................................................................ 381
INFLUENCIA DEL PH ......................................................................................... 383
FASE MÓVIL...................................................................................................... 384
SEPARACIÓN..................................................................................................... 385
CROMATOGRAFÍA DE IONES.............................................................................. 386
HPLC DE FASE NORMAL............................................................................. 389
MECANISMO DE FASE NORMAL ......................................................................... 391
APLICACIONES DE FASE NORMAL ..................................................................... 392
ORDEN DE RETENCIÓN...................................................................................... 393
SELECTIVIDAD DE SEPARACIÓN ........................................................................ 394
vii
FASES ESTACIONARIAS ..................................................................................... 397
FUERZA DE ELUCIÓN ........................................................................................ 398
DESACTIVADORES ............................................................................................ 402
HOJA DE TRABAJO ............................................................................................ 404
CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN DE TAMAÑO (SEC) ................ 405
CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN DE TAMAÑO ............................................... 407
APLICACIONES ................................................................................................. 408
USOS HABITUALES............................................................................................ 409
PRINCIPIOS ....................................................................................................... 410
SELECCIÓN DE FASE ESTACIONARIA ................................................................. 411
CALIBRACIÓN ................................................................................................... 412
CÁLCULOS DE LA GPC ..................................................................................... 414
SELECCIÓN DE LA FASE ESTACIONARIA ............................................................ 415
RESOLUCIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN DE TAMAÑO ................ 416
SUGERENCIAS PARA LA CROMATOGRAFÍA POR EXCLUSIÓN DE TAMAÑO........... 417
REQUISITOS DEL SISTEMA................................................................................. 418
DESARROLLO DE MÉTODOS..................................................................... 421
PASOS PARA EL DESARROLLO DE UN MÉTODO .................................................. 423
RECOGIDA DE DATOS........................................................................................ 424
SELECCIÓN DE LA FASE ESTACIONARIA ............................................................ 426
SELECCIÓN INICIAL DE LA COLUMNA................................................................ 428
CONSIDERACIONES RELATIVAS AL INSTRUMENTO ............................................ 429
TRATAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA ........................................................... 431
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ........................................................................ 434
EL PRIMER ANÁLISIS ......................................................................................... 438
OPTIMIZACIÓN ................................................................................................. 441
EJERCICIO DE LABORATORIO: DESARROLLAR UN MÉTODO
CUANTITATIVO PARA LA SEPARACIÓN DE CAFEÍNA EN BEBIDAS
(EJERCICIO DE LABORATORIO OPCIONAL) ....................................... 453
MATERIALES .................................................................................................... 455
ESQUEMA DE DESARROLLO DEL MÉTODO ......................................................... 456
DESARROLLO DE LOS PARÁMETROS DEL MÉTODO ............................................ 457
CALIBRACIÓN ................................................................................................... 459
INTEGRACIÓN ................................................................................................... 461
CONFIGURACIÓN DE LOS DETALLES DE LAS SEÑALES ....................................... 462
CREACIÓN DE UNA TABLA DE CALIBRACIÓN ..................................................... 463
COMPROBACIÓN DE LA TABLA DE CALIBRACIÓN .............................................. 465
DESCONOCIDOS ................................................................................................ 466
viii
APÉNDICE: INTRODUCCIÓN A LA VALIDACIÓN................................ 467
INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 468
VALIDACIÓN DE MÉTODOS - OBJETIVO ............................................................ 469
¿POR QUÉ ES NECESARIA LA VALIDACIÓN?....................................................... 471
¿CUÁNDO SE DEBEN VALIDAR O VOLVER A VALIDAR LOS MÉTODOS?............... 472
¿QUÉ SE DEBE VALIDAR?.................................................................................. 474
RESUMEN DE LOS REGLAMENTOS ..................................................................... 475
REGLAMENTOS DE CALIDAD - GEOGRAFÍA ....................................................... 476
TERMINOLOGÍA ................................................................................................ 477
PRUEBA/CALIBRACIÓN..................................................................................... 479
INICIO DEL DESARROLLO DEL MÉTODO ............................................................. 480
CÓMO COMENZAR… ........................................................................................ 481
Supuesto: ..................................................................................................... 481
ESTRATEGIA DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO*.................................................... 482
DEFINIR LA FINALIDAD DEL MÉTODO ............................................................... 483
PRINCIPALES PARÁMETROS .............................................................................. 484
PARÁMETROS PARA LA VALIDACIÓN DEL MÉTODO – ALCANCE DEL MÉTODO .. 485
CAMBIOS DEL MÉTODO – NECESIDAD DE REVALIDACIÓN................................. 486
REQUISITOS MÍNIMOS – CRITERIOS DE ACEPTACIÓN ........................................ 487
VALIDACIÓN DEL MÉTODO - PARÁMETROS ...................................................... 488
ESPECIFICACIONES DEL EQUIPO – REQUISITOS DEL MÉTODO ............................ 489
CUALIFICAR LOS MATERIALES .......................................................................... 490
DESARROLLO DEL MÉTODO – OPTIMIZAR LA SEPARACIÓN ............................... 491
DESARROLLO DEL MÉTODO - DOCUMENTACIÓN .............................................. 492
ESTRATEGIA DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO ...................................................... 493
SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD......................................................................... 494
TEORÍA - SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD ......................................................... 495
SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD......................................................................... 497
LÍMITE DE DETECCIÓN ...................................................................................... 498
LÍMITE DE DETECCIÓN (LOD) - DEFINICIÓN ..................................................... 499
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN ............................................................................. 500
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LOQ) - DEFINICIÓN ............................................ 501
TEORÍA - LINEALIDAD ...................................................................................... 502
EXACTITUD/VERACIDAD/PRECISIÓN ................................................................ 504
PRECISIÓN ........................................................................................................ 506
ROBUSTEZ ........................................................................................................ 509
IMPLANTACIÓN ................................................................................................ 510
UTILIZACIÓN DE UN MÉTODO VALIDADO .......................................................... 511
ix
x
Introducción a la cromatografía de
líquidos de alto rendimiento
Introducción a la cromatografía de líquidos de alto rendimiento
En esta sección aprenderá lo siguiente
En esta sección aprenderá lo siguiente:
• Las diferencias entre la cromatografía de líquidos de alto

rendimiento y la cromatografía de gases
• Sobre los componentes de la cromatografía de líquidos de alto
rendimiento (HPLC)
• Sobre el proceso de separación
• Sobre el cromatograma
• Los modos más comunes de HPLC
Figura 1
2
Tiene que resolver un problema
Necesito una separación

cuantitativa de Lo
carbohidratos en algunos conseguiré
de nuestros productos lo
antes posible.
Necesitaré una técnica

de separación.
Figura 2
A diario, los usuarios de cromatógrafos se enfrentan a la necesidad de desarrollar

una separación para satisfacer las necesidades de sus empresas. En esta sección
veremos cómo un analista elige entre dos técnicas de separación instrumental
disponibles. El análisis que se ha de realizar es la separación de carbohidratos
(azúcares simples) en algunos productos de consumo como gaseosa o cereales.
3
Técnicas de separación
Tengo dos técnicas de separación en el laboratorio,

la cromatografía de líquidos de alto rendimiento
y la cromatografía de gases. ¿Cuál debo utilizar?
4
Figura 3
Dos de las principales técnicas de separación instrumental actuales son la

cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) y la cromatografía de gases
(GC). En el caso de la HPLC, la fase móvil es un líquido. En un principio, la
técnica se denominó cromatografía de líquidos de alta presión. Este nombre
distinguía esta técnica de la cromatografía de líquidos de baja presión, que utiliza
un reparto de disolvente mediante alimentación por gravedad o bomba
peristáltica. Con la aparición de partículas de fase estacionaria más pequeñas, era
necesaria una alta presión para forzar la fase móvil a través del material de
relleno. En la GC, la fase móvil es un gas. La GC es una técnica consolidada
conocida por su facilidad de uso. Lamentablemente, tan sólo un 20%
aproximadamente de los compuestos conocidos se pueden separar mediante
cromatografía de gases. La HPLC es, en gran medida, una técnica
complementaria y se puede utilizar con éxito para la separación de una amplia
gama de compuestos.
Nuestro ejemplo requiere la separación de algunos azúcares. A continuación
evaluaremos cada uno de los instrumentos utilizados para esta separación.
4
Comparación de la HPLC y la GC
Volatilidad de la muestra Polaridad de la muestra
HPLC HPLC
• Ningún requisito de • Separa los compuestos
volatilidad polares y no polares
• La muestra debe ser • PAH (hidrocarburo
soluble en la fase móvil aromático policíclico)
iones inorgánicos
GC GC
• Las muestras son
• La muestra debe ser
polares y no polares
volátil
Figura 4
Las muestras que se analicen mediante la cromatografía de gases deben ser

volátiles. Los componentes de la muestra o sus derivados deben tener una presión
de vapor de, al menos, algunos torr a las temperaturas del puerto de inyección y
de la columna (de hasta 350-450 °C). Una vez que la muestra se encuentra en la
fase de vapor, puede ser transportada por la fase móvil, que normalmente es helio
o hidrógeno. Se pueden derivar compuestos no volátiles en el análisis de la GC.
Sin embargo, este paso exige mucho tiempo.
No existe ninguna restricción de volatilidad para las muestras de HPLC. El
cromatógrafo de líquidos se mantiene por lo general a temperaturas iguales o
cercanas a la temperatura ambiente. No obstante, todas las muestras deben ser
solubles en la fase móvil. Las fases móviles típicas con el metanol, acetonitrilo,
agua, acetato de etilo y hexano.
En general, la cromatografía de gases puede analizar muestras que sean
compuestos no polares o con polaridad moderada sin derivatización. La HPLC
puede analizar muestras no polares tales como hidrocarburos poliaromáticos,
además de muestras polares como tintes. Además, dos modos de la HPLC (par
iónico e intercambio iónico) pueden separar especies que sean iónicas.
5
Hidrófilo Iones inorgánicos

Aminoácidos
Ácidos Colorantes
carboxílicos alimentarios Azúcares
Glifosatos sintéticos Alcoholes
volátiles de azúcares
Cetonas de
Enzimas
aldehídos
PG, OG, DG
Sulfonamidas Glicoles fenoles Aflatoxinas
BHT (butilhidroxitolueno), Ácidos grasos Antibióticos

Nitrilos
BHA (butilhidroxianisol),
THBO antioxidantes
Polaridad Nitrosamina
Flavonoides
Alcohol
Pesticidas PAHs Anabólicos Colorantes alim. naturales
organofósforos
TMS Aminas aromáticas Vitaminas solubles en grasas
derivado de
azúcares PCB
Monómeros de polímero Triglicéridos Fosfolípidos

Aceites esenciales
Epóxidos
Metiléster Ésteres aromáticos

C2/C5 hidrocarburos ácidos grasos
Hidrófobo
Volátil Volatilidad No volátil
Figura 5
El diagrama anterior muestra algunos de los análisis típicos llevados a cabo

mediante la HPLC y la GC, basados en la volatilidad y la polaridad de los
compuestos. Obsérvese que los compuestos que resultan indicados para la GC
también se pueden analizar mediante la HPLC. Algunas muestras que resultan
más indicadas para la HPLC no se pueden analizar mediante la GC debido a su
falta de volatilidad o a su polaridad.
6
Labilidad térmica Peso molecular

de la muestra de la muestra
HPLC HPLC
• El análisis se puede
• En teoría no existe un
realizar a temperatura
límite superior
ambiente o por debajo
• En la práctica, la
de ella
solubilidad es el límite.
GC GC
• La muestra debe • Normalmente

resistir la temperatura < 500 amu
elevada del puerto de
inyección y de la
columna
Figura 6
El entorno de la GC es destructivo para compuestos térmicamente lábiles, es

decir, aquéllos que se descomponen a temperaturas elevadas. Las temperaturas en
el puerto de inyección y la columna pueden superar los 350 ºC. En cambio, la
HPLC se lleva a cabo normalmente a temperaturas iguales o cercanas a la
temperatura ambiente. Las muestras también se pueden almacenar en
muestreadores refrigerados.
Por lo general, los compuestos analizados mediante la cromatografía de gases
tienen un peso molecular inferior a 500 uma. Esta limitación se debe a su falta de
volatilidad. La HPLC puede analizar muestras con pesos moleculares
extremadamente elevados. En teoría, no existe ninguna limitación de peso
molecular en la HPLC. Se utilizan de manera rutinaria muestras tales como
proteínas y polímeros. En realidad, el límite superior del peso molecular parece
ser la solubilidad, ya que la muestra debe ser soluble en la fase móvil.
7
Preparación de
la muestra Tamaño de muestra
HPLC HPLC
• La muestra debe
• Tamaño de la muestra
filtrarse
basada en i.d. de la
• La muestra debe estar
columna
en el mismo
disolvente que la fase
móvil
GC GC
• El disolvente debe ser • Normalmente 1 - 5 µL

volátil y normalmente
con un punto de
ebullición menor que
los analitos
Figura 7
Las muestras de HPLC deben filtrarse antes de la inyección para eliminar

cualquier partícula. La muestra se debe disolver en la fase móvil o en un
disolvente más débil que la fase móvil para asegurar la obtención de buenas
formas de picos cromatográficos. La cromatografía de gases precisa un disolvente
que sea volátil. Las muestras de la GC no deberán disolverse en agua, y por lo
tanto son frecuentes las extracciones. Entre los disolventes de GC típicos se
encuentran el isooctano y el hexano. El operador debe tener en cuenta el volumen
de expansión del disolvente, además de la volatilidad.
En la HPLC, el tamaño de la muestra (volumen) viene determinado por el
diámetro interno de la columna, con volúmenes de inyección típicos para una
columna estándar de 2 a 50 µl. Es posible realizar inyecciones de 2 ml o más,
pero hay que procurar no provocar un ensanchamiento excesivo de bandas.
En el caso de la HPLC, el tamaño de la muestra (masa) viene determinado por la
cantidad y el tipo de fase estacionaria presente. Normalmente se puede inyectar de
1 a 10 µg de muestra por gramo de relleno de columna. La columna tiene una
sobrecarga de masa cuando disminuye el tiempo de retención de un analito.
8
Mecanismo de separación Detectores
HPLC HPLC
• Participan la fase • UV-Vis más comunes
estacionaria y la fase • Amplia gama de
móvil detectores no destructivos
• Detectores
tridimensionales
• Sensibilidad a pg
GC GC
• FID (detectores de
• La fase móvil es sólo ionización de llamas)
un portador de la más comunes,
muestra compuestos
universales hasta
orgánicos
Figura 8
El mecanismo de separación en la cromatografía de líquidos de alto rendimiento
incluye tanto la fase móvil como la fase estacionaria, mientras que en la
cromatografía de gases, la fase móvil simplemente transporta la muestra a través
de la columna hasta el detector. Por ejemplo, en la HPLC de fase inversa, el
contenido de agua en la fase móvil puede actuar para empujar la muestra
hidrófoba hasta la fase estacionaria no polar, donde se retiene. El hecho de que
ambas fases desempeñan un papel en la separación ofrece al analista una mayor
selectividad cromatográfica. De hecho, el cambio de la composición de la fase
móvil es el medio más eficaz de mejorar la resolución entre dos picos
cromatográficos. Sin embargo, la GC es más eficaz, y es más fácil desarrollar la
separación que en el caso de un método de HPLC.
Las técnicas tanto de HPLC como de GC tienen numerosos detectores sensibles y
resistentes. La selectividad y sensibilidad de los detectores varían y, por lo tanto,
antes de elegir un detector deben tenerse en cuenta la muestra, las condiciones del
método y el objetivo del análisis. La GC cuenta con un detector universal y más
sensible, el detector de ionización de llama, aunque este detector es destructivo.
La GC, en combinación con la espectrometría de masas, es una técnica más
consolidada que la HPLC con espectrometría de masas. Hay disponibles librerías
comerciales para identificar desconocidos en la GC/MS, pero no en la LC/MS.
Muchos de los detectores de HPLC, como el UV-VIS y el detector de
fluorescencia, no son destructivos; por lo tanto, tras la separación, los analitos se
pueden recoger para su uso posterior.
En resumen, si no se puede analizar la muestra a través de la columna de GC sin
utilizar una gran cantidad de preparación de muestra, entonces se recomienda la HPLC.
9
Análisis de la muestra
Análisis de la muestra
¿Cómo podemos analizar la muestra?

Glucosa
Carbohidratos
1. Fructosa.
2. Glucosa.
3. Sacarosa.
4. Palatinosa.
5. Trehalulosa.
6. Isomaltosa 5
2
3
Zorbax NH2 (4,6 x 250 mm) mAU
4
70/30 Acetonitrilo/agua 1
6
1 mL/min Detectar=índice de refracción
tiempo
10
Figura 9
Una vez repasadas las diferencias entre la HPLC y la GC, se puede observar que
la HPLC resulta más indicada para el análisis de los azúcares. Entre las razones
más importantes cabe citar el hecho de que los carbohidratos no son volátiles a
menos que se deriven. Además, son térmicamente lábiles y carbonizarán el puerto
de inyección del cromatógrafo de gases. Asimismo, si la muestra se encuentra en
un producto de consumo como la gaseosa, la muestra será en su mayor parte agua
y, después de la filtración, se podrá inyectar directamente en el cromatógrafo de
líquidos de alto rendimiento.
Se muestra un método para algunos monosacáridos y disacáridos. Se ha
especificado una columna de propilamina como método oficial para varias
matrices que contienen azúcares simples, como por ejemplo cereales endulzados
previamente. La fase móvil está formada por 70% de acetonitrilo y 30% de agua.
Los azúcares carecen de un buen cromóforo. Por lo tanto, la detección UV-VIS no
es una buena elección. Se puede utilizar un detector de índice de refracción, que
es un detector universal para la HPLC, con el fin de detectar los monosacáridos y
los disacáridos.
10
Separaciones de HPLC
Separaciones
La separación se basa en la migración
Inyector
diferencial entre las fases móviles y las
estacionarias.
Mezclador Fase estacionaria la fase que permanece
fija en la columna, por ejemplo, C18,
Sílice
Bombas Fase móvil transporta la muestra a través

de la fase estacionaria a medida que se
mueve por la columna.
Columna
Detector
Residuo
Disolventes
Cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento

11
Figura 10
El diagrama muestra los componentes de un cromatógrafo de líquidos de alto

rendimiento típico. Los depósitos de disolvente se utilizan para almacenar los
disolventes necesarios para muchas horas de funcionamiento. Un filtro de acero
inoxidable o de vidrio poroso elimina las partículas de las fases móviles, de modo
que la columna o el sistema de bombeo no sufran daños. Actualmente, los
cromatógrafos de líquidos de alto rendimiento a menudo cuentan con una unidad
de desgasificación de vacío para eliminar los gases disueltos de las fases móviles
(no mostrada). El sistema de bombeo se utiliza para ofrecer composiciones y
flujos exactos, así como la presión necesaria para forzar la fase móvil a través de
la columna densamente empaquetada. El muestreador lleva la muestra a la parte
superior de la columna sin interrumpir el flujo de la fase móvil. La columna es el
núcleo de la HPLC, ya que es aquí donde tiene lugar la separación de la muestra.
Está densamente empaquetada con una fase estacionaria que se mantiene en la
columna mediante fritas de acero inoxidable situadas a ambos extremos de la
misma. El material de relleno de la fase estacionaria puede ser sílice o un
polímero en forma de pequeñas partículas. Una funcionalidad concreta, como
aminopropilo o octadecilsililo, se adhiere a las superficies de las partículas. La
separación tiene lugar cuando la mezcla de la muestra se distribuye de forma
11
diferenciada entre dos fases en la columna, la fase móvil y la estacionaria. Tras la

separación, los componentes de la muestra fluyen hasta el detector, donde se
detecta y se mide la presencia de cada componente individual de la muestra. La
medida se registra en dos dimensiones como un cromatograma, y se puede
almacenar en un ordenador.
12
El cromatograma
El cromatograma
El cromatograma
to - tiempo de extracción de pico no retenido

tR- tiempo de retención determina la identidad
de la muestra
tR
tR
mAU El área es proporcional
a la cantidad de analito.
to
Inyección tiempo
28
Figura 11
La fase móvil transporta los componentes de la muestra hasta el detector, donde

se representa gráficamente la señal que producen los componentes de la muestra
en función del tiempo. El resultado se denomina cromatograma. Los componentes
de la muestra normalmente producen picos con forma gausiana. Se dice que los
componentes no retenidos por la fase estacionaria, pero que se transportan a
través de la columna sin interacción, eluyen en el tiempo muerto, t o, de la
columna. Aquellos componentes de la muestra que tienen alguna atracción por la
fase estacionaria eluyen en tiempos de retención más tardíos. Los tiempos de
retención ofrecen el aspecto cualitativo del cromatograma. El tiempo de retención
de un compuesto será el mismo en condiciones cromatográficas idénticas. La
altura o el área del pico cromatográfico están relacionados con la cantidad de
analito. Para determinar la cantidad real del compuesto, se compara el área o la
altura con patrones de concentraciones conocidas.
13
Parámetros de análisis de HPLC
Depósitos de Fases móviles

disolvente
Desgasificador
Composición de la
Bomba velocidad de flujo:
Muestreador
automático
Volumen de inyección
Compartimento
Temperatura del horno
de las columnas de la columna
Detector Constante del tiempo

de la longitud de onda
29
La resolución de los picos cromatográficos se puede controlar mediante la

selección de los parámetros de separación adecuados. Se elige una fase
estacionaria de columna en función de la estructura molecular de los componentes
de la muestra. La longitud seleccionada puede depender de la dificultad de la
separación. Se selecciona una composición de fase móvil que sea compatible con
las muestras y con la fase estacionaria, y se optimiza para producir la mejor
separación. La selección de la fase móvil también puede depender de los
parámetros del detector. La temperatura de la columna y la velocidad del flujo se
utilizan como ajustes secundarios, para adaptar de forma precisa el cromatograma.
El tamaño de la muestra también es un parámetro importante, ya que grandes
masas o volúmenes inyectados pueden producir una pérdida de resolución y la
degradación de la forma del pico.
14
Modo de cromatografía de líquidos de alto rendimiento
Modo de cromatografía de líquidos de alto

rendimiento
Modos de cromatografía de líquidos de alto

rendimiento
Tipos de compuestos Modo Fase Fase móvil

estacionaria
Neutros Fase inversa C18, C8, C4 Modificadores
Ácidos débiles ciano, amino orgánicos/de agua
Bases débiles
Iónicos, bases, ácidos Pareja de iones C-18, C-8 Reactivo de par de iones
orgánico/de agua
Compuestos no solubles Fase normal Sílice, Amino, Orgánicos

en agua Ciano, Diol
Iones inorgánicos iónicos Cambio de iones Resina de cambio Acuoso/tampón contra-ión

de catión o de anión
Peso molecular elevado Exclusión de Poliestireno Filtración de gel - Acuosa

Compuestos tamaños Sílice Permeación de gel-
Polímeros Orgánica
30
Figura 12
En el gráfico anterior se muestran las cinco técnicas principales de separación de

la HPLC. El modo más empleado es el de fase inversa. Esta técnica tiene una
amplia gama de aplicaciones, incluidos compuestos neutros, ácidos débiles, bases
débiles y sustancias iónicas cuando se utiliza conjuntamente con un reactivo de
parejas de iones. La cromatografía de líquidos de fase normal tradicionalmente
utilizaba sílice pura o columnas de alúmina, y se conocía como cromatografía de
absorción. Actualmente, también hay disponibles fases estacionarias polares
enlazadas. El intercambio iónico se utiliza exclusivamente para la separación de
iones en disolución. La exclusión de tamaño separa las moléculas con peso
molecular elevado en función de su tamaño.
15
Aplicaciones de la HPLC
Aplicaciones de la HPLC
Aplicaciones de HPLC
Biociencia
Química proteínas
péptidos
poliestirenos nucleótidos
colorantes
ftalatos
tetraciclinas
Fármacos corticosteroides
antidepresivos
Productos de consumo
barbituratos
lípidos
antioxidantes
az úcares
Medio ambiente
hidrocarburos poliaromáticos Clínica
Iones inorgánicos aminoácidos
herbicidas vitaminas
homocisteína
31
Figura 13
con peso molecular alto o bajo.

Por lo tanto, no es de extrañar que las aplicaciones se extiendan a numerosas
industrias. A continuación se muestran algunas de las aplicaciones en distintos
sectores.
16
Instrumentación de la HPLC
• Acerca de los sistemas de reparto de disolvente de HPLC.
• Cómo funcionan los muestreadores.
• Acerca de los detectores de HPLC habituales.
Figura 14
18
Descripción general de la instrumentación

de HPLC
El principio Un ejemplo
Muestreador
Mezclador Cabina de disolventes
Desgasificador de vacío
Bombas
Bomba cuaternaria
Columna Módulo de control
Muestreador
Compartimento
Detector
de las columnas
Detector
Disolventes
Figura 15
Un cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento consta de los siguientes

componentes:
• Bomba
• Sistema de inyección
• Horno de columna
• Detector
En el diagrama anterior se muestra la ruta de flujo de un cromatógrafo de líquidos

típico. Cada componente o módulo del sistema de HPLC está conectado mediante
tubos capilares. Los tubos están fabricados de capilares de polímeros o de acero
inoxidable. A menudo, las separaciones de biomoléculas precisan el uso de
capilares de polímeros con el fin de que las biomoléculas eviten todo contacto con
el acero inoxidable.
19
Para evitar volúmenes excesivos externos a la columna, cada componente del

sistema de HPLC debería conectarse con tubos de la longitud más corta posible.
Éste es un aspecto importante para poder realizar tareas de cromatografía de alto
rendimiento. A menudo se emplea el término "volumen muerto" para resumir
todos los volúmenes que se encuentran fuera de la columna.
20
Filtros de disolventes
Filtros de disolventes
Filtros de disolvente
Columna de protección
Muestreador
Filtro de precolumna Columna analítica
Filtro de entrada de disolvente Filtro de precolumna

• Acero inoxidable o cristal con • Se utiliza entre el muestreador
porosidad de 10 micras y la columna de protección
• Elimina las partículas del • 2 a 0,5 micras
disolvente • Elimina las partículas de la
muestra y el desgaste del
muestreador
• Debe estar bien diseñado para
evitar la dispersión
4
Figura 16
Las partículas de la fase móvil pueden causar daños en el sistema de bombeo.

Habitualmente se coloca una frita de inyección de disolvente de 10 micras en el
depósito de la fase móvil para atrapar las partículas. El filtro del inyector de
disolvente debe cambiarse o limpiarse periódicamente. Si no se hace, podrá no ser
posible alcanzar el flujo necesario a través del filtro, provocando cambios en la
composición de la fase móvil y la acumulación de aire en la bomba. Se puede
situar un filtro de precolumna entre el muestreador y la columna analítica para
atrapar las partículas de la muestra y reducir el desgaste de la válvula de
inyección. El filtro consiste normalmente en una frita de 0,5 a 2 micras contenida
en un cartucho. La frita se puede cambiar fácilmente cuando aumente la presión
del sistema.
21
Desgasificación al vacío
Circuito Bomba
Sensor
de control de vacío
Bomba
Membrana
de plástico
tubular
Disolvente
Contenedor de vacío
Figura 17
El agua y los alcoholes con menor peso molecular disuelven cantidades

relativamente grandes de aire. Por lo tanto, la desgasificación de la fase móvil es
un primer paso importante de cualquier análisis de HPLC. La desgasificación
elimina los gases disueltos, que pueden provocar la formación de burbujas en las
bombas o en la celda de flujo del detector. Los flujos inestables causan
inestabilidad en el tiempo de retención y líneas de base ruidosas. El oxígeno
disuelto puede impedir la detección de fluorescencia.
La desgasificación al vacío es una técnica en línea. El disolvente se hace pasar a
través de tubos semipermeables contenidos en una cámara de vacío antes de llegar
al sistema de bombeo. Las pruebas realizadas han demostrado que esta
eliminación de gases es superior a las técnicas convencionales.
22
Influencia en la línea de base del detector
Disolvente: metanol; señal UV: 210 nm

sin desgasificación
desgasificación de helio
Absorbencia
desgasificación en línea
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo (min)
Figura 18
En el gráfico anterior se muestra la eficacia relativa de las técnicas de

desgasificación de fase móvil. La desgasificación en línea es actualmente el
método más eficaz para eliminar los gases disueltos. Además, esta técnica afecta a
la concentración relativa de las especies volátiles y no volátiles contenidas en la
fase móvil.
23
Sistemas de distribución
Sistemas de distribución
Funciones del sistema de reparto de disolvente
El sistema de reparto de disolvente tiene tres funciones básicas:
1. Ofrecer un flujo constante y preciso.

2. Ofrecer composiciones de fase móvil precisas.
3. Ofrecer la fuerza necesaria para empujar la fase móvil a través
de la columna bien rellena.
Figura 19
Un sistema de distribución de disolvente debe proporcionar un flujo y una

composición exactos y reproducibles. También debe aportar la fuerza necesaria
para empujar la fase móvil a través de la columna densamente empaquetada. En
las diapositivas siguientes se muestran algunas maneras de realizar esta tarea.
Además, el sistema de distribución de disolvente no debería producir pulsos de
presión. Normalmente se suele añadir una unidad de amortiguamiento.
24
Sistemas de distribución de disolvente
Sistemas de distribución de disolvente
Válvula de gradiente multicanal
• Determina la composición de la fase móvil.

• El tapón de disolvente de mayor tamaño se llena
primero.
• La bomba cuaternaria 1100, 1090 PV5 y 1050.
Figura 20
Una válvula de gradiente multicanal situada entre los canales de disolvente y una
bomba de dos pistones controla la composición del disolvente en algunos sistemas
de HPLC. La composición se forma en paquetes distintos de un volumen dado
cuya composición refleja la composición necesaria. La composición viene
determinada por el tiempo que la válvula de un canal dado permanece abierta en
un paquete. La válvula de gradiente multicanal se utiliza en el sistema 1090 PV5,
en la bomba cuaternaria 1050 y en la bomba cuaternaria 1100.
Siempre se debe mantener disolvente en los cuatro canales de la válvula. La
presión positiva impedirá que las disoluciones acuosas tamponadas vuelvan a
penetrar en un canal seco. Además, deben eliminarse las soluciones tampón
lavando esta válvula antes de pararla. Si quedan cristales de solución tampón seca
en el interior, podría dañarse la válvula.
25
Principios de las bombas del sistema de HPLC
Principios de las bombas de la HPLC
Bombas de
jeringa
Bombas discontinuas
Bombas de desplazamiento
controladas por gas
Bombas de membrana
Bombas continuas
Bombas de pistones
Figura 21
Normalmente se utilizan dos tipos de diseños de bomba.

• Bombas discontinuas: estas bombas distribuyen un determinado volumen
de disolvente continuamente hasta que se agota el disolvente. A menudo
se denominan bombas de jeringa. Actualmente se suelen utilizar para
situaciones que precisan la distribución de flujos bajos muy exactos.
• Bombas continuas: éstas son las bombas más utilizadas en la actualidad.
El disolvente se distribuye continuamente. La bomba de dos pistones y la
bomba de membrana son ejemplos de este tipo de bomba.
26
Bomba de dos pistones en paralelo
Válvulas de retención
Válvula de
intercambio
rotatoria
Cabeza de bomba
Pistón
A B
Reparto de Reparto
pistón único combinado
Avance del pistón 'A' Retroceso del pistón ‘B’
10
Figura 22
Una bomba en paralelo de dos pistones está diseñada para distribuir un flujo
continuo de fase móvil a la columna, operando cada pistón 180 grados en relación
con el otro pistón. La interferencia destructiva de los pulsos alternos de la bomba,
amortigua el pulso total. Mientras un pistón de la bomba distribuye disolvente a la
columna, el otro se repliega para rellenar la cámara de disolvente. La bomba de
medida 1090 es un ejemplo de bomba de dos pistones.
27
Bomba de dos pistones en serie
El primer pistón
desplaza el disolvente
al doble de velocidad
que el segundo
pistón.
Proporciona un flujo
constante y la presión
necesaria para
desplazarse por la
columna.
11
Figura 23
Un método alternativo para distribuir una fase móvil exenta de pulsos es la bomba
en serie de dos pistones. La embolada de la primera cámara de disolvente
distribuye un volumen dos veces mayor que el de la embolada de la segunda
cámara de disolvente. Mientras el segundo pistón distribuye fase móvil a la
columna, se rellena el primer pistón. Cuando el segundo pistón está vacío, el
primero no sólo rellena la segunda cámara, sino que también continúa
distribuyendo fase móvil a la columna.
28
Bomba de diafragma
+
Válvula de
anulación de
Aceite
presión
Válvula de
retención
Pistón
Válvula de bola
de entrada Válvula de bola
Diafragma de acero de salida
inoxidable
12
Figura 24
La bomba alternativa de pistón/diafragma ofrece la ventaja de retirar el pistón y el

sello del pistón de la fase móvil perjudicial y situarlos en un entorno de
lubricación. Un lado del diafragma de acero inoxidable bañado en oro contiene
aceite, mientras que el otro lado entra en contacto con la fase móvil. Cuando el
pistón alternativo fuerza aceite contra el diafragma, se fuerza la salida de
disolvente a la columna. A medida que se repliega el pistón alternativo, se libera
la presión del diafragma, permitiendo que el disolvente llene el espacio situado
debajo del mismo. El sistema 1090 contiene este tipo de bomba para proporcionar
las elevadas presiones necesarias para forzar la fase móvil a través de la columna
densamente empaquetada. Funciona a 10 Hz.
29
Válvulas de bola para bombas de pistones

recíprocos
Sello de oro
Pieza de
inserción
de zafiro
Bola de rubí
Muelle
Pieza de
inserción
13
Figura 25
La finalidad de una válvula de bola o válvula de retención es aportar un flujo

unidireccional. Los elementos de una válvula de bola incluyen un asiento de
zafiro, una bola de rubí y un muelle para aportar tensión. Mientras un pistón
extrae disolvente del depósito de fase móvil, se tira hacia arriba de la bola de rubí
del lado de entrada para permitir que la fase móvil llene la cámara de disolvente.
La bola de rubí del lado de salida de la cámara se empuja hacia abajo contra el
asiento de zafiro para evitar que el disolvente que ya se ha desplazado a la
columna vuelva a penetrar en la cámara. Cuando el pistón se encuentra en la
posición de embolada de avance, la fase móvil empuja la bola de rubí de la salida
para alejarla del asiento de zafiro. La fuerza de la fase móvil empuja la bola de
rubí del lado de entrada para introducirla en el interior del asiento de zafiro,
impidiendo que fluya al depósito.
30
Sellos y pistones de la bomba
1. Pistón
1 2. Arandelas
de soporte
3. Protectores
2 de los sellos
4. Sellos
3 5. Arandelas
4
5
14
Figura 26
Los pistones utilizados en estas bombas están fabricados normalmente de zafiro

artificial. Deben examinarse periódicamente para asegurar que no estén rayados.
Las bombas de pistones también contienen sellos de pistón que deben cambiarse
periódicamente para mantener el tiempo de retención y la reproducibilidad de las
áreas de picos. Algunas bombas de pistones también contienen arandelas, con el
fin de que el material desgastado de los sellos quede atrapado y no cause daños a
otras partes del instrumento.
31
Tamices y filtros
1090
Filtro
Los tamices y los filtros se

utilizan para proteger otras
Flujo
Flujo
Tamiz
partes del LC de la bomba y
los materiales de sello.
Compartimentos de
válvulas de bola
15
Figura 27
La mayoría de los sistemas de distribución de disolvente contienen una frita o un

filtro de disolvente en línea antes del muestreador. Este filtro o tamiz tiene como
finalidad recoger las partículas de los sellos de la bomba para que no produzcan
daños a la válvula de inyección o a otros componentes del instrumento. Estos
filtros en línea deben cambiarse periódicamente.
32
Componentes de un sistema de distribución de disolvente
Componentes de un sistema de distribución de

disolvente
Unidades de amortiguamiento
Unidad de amortiguamiento
Onda de la bomba
2%
P/P
Presión
• Se llenan con líquido comprimible,

separado de la fase móvil por una
membrana.
• Ondulaciones de presión reducidas a < 2%
del valor original.
16
Figura 28
El objetivo de una unidad de amortiguamiento es reducir los pulsos de presión

causados por la acción de la bomba. Una unidad de amortiguamiento consta de un
diafragma que separa la fase móvil de un líquido comprimible. En la bomba en
serie de dos pistones, el diafragma está situado entre la primera y segunda
cámaras del pistón.
33
Formación de gradientes
Gradiente de baja presión Gradiente de alta presión
17
Figura 29
La elución de gradientes describe la técnica consistente en cambiar la

composición de la fase móvil durante el tiempo de análisis. Normalmente se
aumenta la fuerza del disolvente. Entre las ventajas que ofrece cabe mencionar
tiempos de análisis más cortos, menor dispersión y mejor control de la resolución.
Los sistemas de distribución de disolvente pueden utilizar una mezcla de baja o
alta presión para formar la composición de la fase móvil del gradiente.
La formación de gradientes a baja presión se consigue mezclando las fases
móviles antes de aplicar presión. En nuestro ejemplo, una válvula proporcional de
alta velocidad capaz de mezclar un máximo de cuatro disolventes forma la
composición de la fase móvil. Si se ajusta adecuadamente el volumen variable de
la embolada, podrán formarse gradientes de gran precisión.
La formación de gradientes a alta presión se puede conseguir combinando la
salida de dos bombas isocráticas, cada una dedicada a un disolvente. Este tipo de
bomba forma perfiles de gradientes nítidos, pero puede ser más costoso que la
formación de gradientes a baja presión. Tres factores aseguran la formación de
gradientes muy precisos con este tipo de bomba: volumen de retardo bajo,
máxima estabilidad de la composición y posibilidades de velocidad de flujo baja.
34
Resumen
Resumen
Resumen
La bomba es la pieza más importante del equipo para conseguir un

buen funcionamiento de la HPLC.
Parámetros de rendimiento para bombas de HPLC:

Precisión de flujo
Rango de flujo
Volumen de retardo
Pulso de presión
Precisión de la composición
18
Figura 30
El rendimiento de la separación depende en gran medida de la capacidad del

sistema de distribución de disolvente para producir velocidades de flujo exactas.
Los flujos precisos se traducen en una elevada precisión del tiempo de retención.
Sin flujos y composiciones reproducibles, no se pueden extraer conclusiones de
una cuantificación.
35
Técnicas de inyección
Técnicas de inyección
Muestreadores
Requisitos:
Introducción reproducible del volumen de la muestra en el flujo de

la fase móvil.
Dos diseños principales:

Muestreadores automáticos o muestreadores manuales
19
Figura 31
Se necesita un sistema de inyección de muestras para distribuir la muestra a la

cabeza de la columna del sistema de HPLC. La muestra debe distribuirse sin
detener ni perturbar el flujo de la fase móvil que llega a la columna. Para que el
sistema de HPLC pueda utilizarse como una herramienta de cuantificación, el
muestreador debe ser muy exacto y preciso en cuanto a su distribución. El
muestreador también debe presentar efectos de memoria reducidos (efecto de
arrastre). Hay dos tipos principales de muestreadores: los que exigen que un
operador inyecte la muestra al inicio del análisis y aquéllos que la inyectan
automáticamente. Los modernos dispositivos de inyección de muestras también
aumentan la productividad con funciones tales como la derivatización precolumna
en línea. Los dispositivos de muestreo también pueden incorporar funciones de
calentamiento o enfriamiento. Algunos fabricantes pueden suministrar
dispositivos resistentes a la corrosión cuando se necesitan disolventes tales como
1 N HCl o 60% de ácido fórmico.
36
Muestreadores manuales
Loop de muestreo
Cargar -
Inyectar
Vista frontal Vista

Conexiones de flujo
posterior
Loop de muestreo
Residuos
Tubo de ventilación
Loop de muestreo
Inyectar
A la columna
Desde la salida de la bomba
20
Figura 32
En algunos laboratorios se utilizan simples muestreadores manuales porque son
económicos y fáciles de manejar. Un muestreador manual es útil cuando los
equipos no se utilizan frecuentemente.
Una válvula de inyección manual típica dispone de un loop de muestreo de
volumen fijo. El loop de muestreo debería llenarse con cinco veces el volumen
real del loop de muestreo para asegurar que no se diluya la concentración de la
muestra en el loop. La muestra se inyecta en el puerto de inyección utilizando una
jeringa del calibre adecuado con una aguja plana o despuntada. Las jeringas con
agujas puntiagudas rayarán el rotor situado en el interior de la válvula de
inyección. Después de llenar el loop de muestreo a la presión atmosférica, se
cambia la válvula a la posición de inyección para iniciar el análisis. A
continuación, el loop de muestreo se conecta a la ruta de flujo entre la bomba y la
columna. El disolvente procedente de la bomba arrastra el contenido del loop de
muestreo hasta la columna. El lavado continuo durante el análisis impide que se
acumule contaminación en el loop de muestreo de un análisis a otro.
Este tipo de sistema de inyección es muy económico. Sin embargo, tiene algunos
inconvenientes: no admite un funcionamiento automatizado, las jeringas y los
loops de muestreo tienen que lavarse manualmente, no se puede derivar la
precolumna de manera automatizada y es poco flexible.
37
Carga de la muestra
Desde la bomba Entrada del
Muestreador
disolvente Entrada
Salida del de la
A la columna muestra
disolvente Mezclador
Bombas
Columna
Detector
Disolventes
Entrada del
Desde la bomba
disolvente
Salida del Entrada de
A la columna disolvente la muestra
Inyección de la muestra
21
Figura 33
En los diagramas anteriores se muestran las posiciones de carga y de inyección de

la muestra y las rutas de flujo. Durante la carga de la muestra, el flujo procedente
de la bomba va directamente a la columna, eludiendo el loop de muestreo. Se
inyectaría y se sobrellenaría el loop, mientras el exceso se enviaría al recipiente de
residuos. Cuando el usuario esté preparado para realizar la inyección, se gira la
válvula y el loop de muestreo se convierte en parte de la ruta de flujo, arrastrando
la muestra hasta la cabeza de la columna. La válvula permanece en la posición de
inyección para lavar el loop de muestreo.
Después de cada inyección se debe limpiar la jeringa para evitar la acumulación
de contaminantes entre análisis. En algunos muestreadores manuales, la jeringa se
introduce en un puerto de llenado del loop. Este manguito de Teflon se debe
cambiar periódicamente para evitar fugas de muestra. El rotor de la válvula de
inyección también precisa un mantenimiento rutinario.
38
Muestreadores automáticos
Paso 1 Paso 2
Paso 3
22
Figura 34
Los muestreadores automáticos contienen una versión controlada mecánicamente

de la misma válvula de seis puertos utilizada en los muestreadores manuales. Los
muestreadores automatizados normalmente se accionan mediante aire
comprimido o electrónicamente. Pueden inyectar volúmenes fijos o variables. A
modo de ejemplo se muestra la ruta de flujo del 1050 o el 1100. El dispositivo de
medida admite volúmenes de inyección de 0,1 - 1,5 µl. Con loops de muestreo de
mayor capacidad, el volumen puede ser de hasta 1,5 ml. Antes de la inyección, el
flujo de la fase móvil sigue este recorrido: a través de la válvula, el dispositivo de
medida, el loop de muestreo, la aguja, el asiento de la aguja, el capilar del asiento
de la aguja, nuevamente a la válvula y a la columna. Para realizar una inyección,
la válvula cambia de manera que el flujo de la fase móvil eluda el muestreador
automático. Se eleva el brazo de la aguja y se coloca un vial debajo de la aguja.
La aguja se fuerza hacia abajo en el interior del vial y se retira hacia atrás el
dispositivo de medida para succionar la muestra en la aguja y el loop. Una vez
succionado el volumen oportuno, se eleva la aguja y se devuelve el vial a su
posición inicial. La aguja se coloca en el asiento y se vuelve a cambiar la válvula
para permitir el flujo a través del muestreador automático, distribuyendo la
muestra a la columna.
39
Sistema de inyección automática

Tratamiento previo con sistema de inyección automática:
Muestra Reactivo
Dispositivo
Reactivo
de medida
Unidad de
muestreo
Desde la bomba
Válvula de 6 puertos
A la columna
A residuos
23
Figura 35
Una de las funciones que realizan numerosos sistemas de inyección automáticos

es el tratamiento previo de la muestra. Los muestreadores automáticos pueden
derivar la precolumna en línea, diluir pequeños volúmenes de muestra y añadir
patrones internos. Además, podría añadirse un dispositivo con el fin de aportar
calor para la derivatización. La derivatización de la columna puede utilizarse para
añadir un cromóforo a una muestra fluorescente o no absorbente del espectro de
UV para aumentar la sensibilidad.
Un brazo automatizado del muestreador automático transporta a su vez un vial
con la muestra y varios viales de reacción para colocarlos debajo de la aguja de
inyección. La muestra y los reactivos derivadores se succionan en un capilar para
su mezcla y reacción. El movimiento de vaivén del dispositivo de medida realiza
la mezcla. Una vez alcanzado el tiempo de reacción, se inyecta la muestra en la
columna.
Un ejemplo de derivatización precolumna es la derivatización de aminoácidos con
OPA (orto-ftalaldehído) y FMOC (9-fluorenilmetilo cloroformiato) descrita en la
nota técnica "Sensitive and Reliable Amino Acid Analysis in Protein
Hydrolysates using the 1100 Series HPLC", nº de publicación 5968-5658E.
40
Sellos del rotor
Sello del rotor

en el interior de
la válvula
24
Figura 36
En el interior de las válvulas del muestreador está situado un sello de rotor. El

sello es un disco con estrías que dirige la ruta de flujo de la fase móvil. Estos
sellos deben cambiarse periódicamente para evitar volúmenes de inyección
irreproducibles causados por las fugas a través de los puertos.
41
Horno de columna
Horno de columna
Horno de columnas
Tiempo de retención
Tiempo de retención con horno - temperatura constante
Tiempo de retención sin

temperatura estable
Día Día
Noche
Número de análisis
Es necesario que la columna y el disolvente tengan una temperatura

constante para conseguir resultados reproducibles.
25
Figura 37
Numerosas separaciones dependen no sólo del material de la columna y de las

fases móviles, sino también de la temperatura de la columna. En tales casos, la
estabilidad de la temperatura de la columna es el factor dominante para el orden
de elución. Un compartimento de columna termostatizado que utilice el control
Peltier, con un buen rechazo de la temperatura ambiente, asegura condiciones
cromatográficas estables. En el gráfico anterior se muestran las fluctuaciones
periódicas de la temperatura ambiente durante un periodo de 24 horas de uso con
y sin un horno de columna.
42
Detectores de HPLC
Detectores de HPLC
Detectores habituales de HPLC
Radioactividad
Conductividad
LC/IR
MS
FLD 8%
Electro 10%
RI LS 10% UV-VIS 65%
26
Figura 38
Los detectores de HPLC más habituales utilizan la absorbancia de UV-Vis. Estos

detectores se utilizan extensamente debido a su coste, resistencia, límites de
detección y facilidad de uso. Se pueden adquirir en configuraciones de longitud
de onda única, de longitudes de onda múltiples o de matriz de diodos. La
capacidad para utilizar espectros de UV con el fin de confirmar la presencia de
determinados analitos y sus metabolitos y derivados contribuye a su uso
generalizado.
Sin embargo, para problemas analíticos que precisan alta sensibilidad y
selectividad, se prefiere la detección de fluorescencia, electroquímica o espectral
de masas. La detección del índice de refracción es adecuada si los detectores
mencionados anteriormente no son aplicables o si la concentración de analitos es
elevada.
43
Detectores de HPLC
Necesidad de más de un detector - Sensibilidad
on
no
re
o
te
n
o
pi
no
ile
en
an
d)
en rile
er
or
ril
-c
i)p
pe
e
23
flu
Pe (e)p
gh
a)
k)
(1
o
o
o(
o(
o(
no
o
en
o
n
nz
nz
nz
nz
ril
de
ris
re
Be
Be
Be
Be
Pi
In
C
Señal UV
WL
248/411
WL
241/394
WL
270/388
Fluorescencia
WL
247/504
WL
302/420
Tiempo (min.)
El PAH se extrae de la tierra;

Sup. LC-PAH 159 x 4,6 mm;
Disolv.: H2O/CH3OH = 10:90
27
Figura 39
Hay una serie de detectores útiles para el sistema de HPLC. Aunque los detectores
más utilizados están basados en la absorbancia del espectro de UV-Vis, se
necesitan otros detectores. Los detectores de UV-Vis son por lo general menos
sensibles que los detectores de fluorescencia o electroquímicos. En el ejemplo
anterior, los hidrocarburos poliaromáticos no se detectaron con el detector de UV,
mientras que la detección de fluorescencia aportó una buena alternativa.
44
Detectores de HPLC
Necesidad de más de un detector - Selectividad
Flecainida en suero
Señal UV
Señal FL
Tiempo (min.)
Concentración terapéutica: 1,8 mg/l, 20 ul inyectado

Señal de fluorescencia y UV
28
Figura 40
Ocasionalmente podrá ser necesario identificar un componente de traza en una

matriz compleja. La selectividad de un sistema de detección se define como la
capacidad para seleccionar únicamente aquellos compuestos de interés en una
matriz compleja utilizando propiedades específicas de un compuesto. Un detector
es selectivo si no responde a compuestos coeluyentes que podrían interferir con la
cuantificación de los analitos. Un detector de absorbancia de UV puede
convertirse en un detector selectivo ajustando una longitud de onda adecuada con
un ancho de banda estrecho para el compuesto de interés. Sin embargo, la
selectividad de los detectores basados en una función tan universal es baja, si se
compara con la selectividad de los detectores basados en fluorescencia o
electroquímica. Puede ser necesario un instrumento como un detector de
fluorescencia, electroquímico o selectivo de masas para cuantificar eficazmente el
componente de la muestra cuando no se puede separar cromatográficamente de
otros componentes. El detector selectivo puede programarse para una propiedad
específica de un compuesto o una clase de compuestos. Los espectrómetros de
masas pueden aplicarse selectiva (modo SIM) o universalmente (en modo de
barrido). Los detectores de RI son universales por definición.
45
Detectores de HPLC
Necesidad de más de un detector Información

cualitativa
Información cualitativa
Clorotorulón Atrazina
? ?
Tomar un espectro Tomar un espectro de

de pico (UV) pico (MS)
200
58
215
44
68 172
96 104 132 138158
60 80 100 120 140 160 180 200 220
Masa/Carga
Longitud de onda (nm)
29
Figura 41
A menudo se necesita un detector que ayude a identificar compuestos

desconocidos. Para análisis cromatográficos de gases, el espectrómetro de masas
es este tipo de detector. El análisis cualitativo todavía no es rutinario en la HPLC.
Sin embargo, los detectores de matriz de diodos, de espectrómetro de masas y de
infrarrojos son cada vez más útiles para análisis cualitativos.
46
Detectores de HPLC
Características de los detectores de HPLC
Características de rendimiento del detector:

• Sensibilidad (LoD, LoQ)
• Selectividad
• Linealidad
• Información cualitativa
• Fiabilidad
• Facilidad de uso
• Universalidad
30
Figura 42
Cuando se seleccione un detector de HPLC, deberán compararse los criterios de

aceptación esperados de un método con las especificaciones y características del
detector. Podrá ser necesario utilizar dos detectores en serie.
47
Características de los detectores
LOD (Límite de detección)
El límite de detección de un detector se puede caracterizar por su

relación señal-ruido (S/N) para un analito en una serie de
condiciones determinadas.
Pico
Ruido
31
Figura 43
Una característica importante de cualquier detector es su sensibilidad a un analito

concreto en un análisis dado. La capacidad de un instrumento para distinguir entre
la respuesta real de un analito y el ruido se expresa como la relación señal-ruido.
El sistema cromatográfico en su conjunto, incluida la respuesta del analito, la
composición de la matriz de la muestra, el flujo y la temperatura, etc., influye en
el límite de detección. La sensibilidad del sistema de análisis a un compuesto
específico se denomina "límite de detección". Una definición cuantitativa del
límite de detección es la concentración de analito que produce una señal de salida
igual a tres veces la media cuadrática del ruido de fondo.
48
Ruido del detector - Deriva
• El ruido es la amplitud de todas las variaciones aleatorias de la

señal del detector.
• La deriva es la pendiente media de la envolvente del ruido
expresada en AU/h.
Ruido
A b s o rb a n c ia
D e ri v a
6 0 m in u to s
T ie m p o
32
Figura 44
Valores de un margen de tiempo seleccionado de una señal. Algunas maneras

habituales de calcular estos valores son:
1) El ruido es seis veces la desviación estándar de la regresión lineal de la
deriva.
2) El ruido se mide de pico a pico (ruido = pico máx. - pico mín.).
La deriva es la pendiente de la regresión lineal. El ruido se puede calcular

automáticamente utilizando una ChemStation y el informe de idoneidad del
sistema.
49
Límite de detección - Límite de cuantificación

Respuesta
Rango lineal
Pendiente = sensibilidad
MQL por ejemplo, RSD <10%, S/N >20
MDL Por ejemplo, S/N >3

Intersección
Cantidad
• El límite de detección (LOD) es un resultado de todo el sistema de
cromatografía, no sólo del rendimiento del detector.
• El límite de cuantificación (LOQ) es un límite definido de un método
utilizado para un fin específico.
33
Figura 45
En el diagrama anterior se muestran cuatro cifras de detección importantes: LOD,

LOQ, linealidad y sensibilidad. El LOD (límite de detección) normalmente se
define como 2 a 3 veces el nivel de ruido del sistema. El LOD absoluto se puede
determinar inyectando una muestra directamente en el detector. El LOD puede ser
de tan sólo 100 pg para compuestos de alimentos tales como antioxidantes si se
han optimizado las longitudes de onda de detección para corresponderse con los
coeficientes de extinción del máximo número posible de compuestos. Los
detectores de fluorescencia y electroquímicos funcionan en el margen de
picogramos muy bajo. El LOD de un espectrómetro de masas conectado al HPLC
dependerá del tipo de interfase utilizada. Los instrumentos provistos de interfases
de electropulverización pueden detectar hasta el margen de picogramos. Los
detectores de índice de refracción normalmente resultan indicados por encima de
500 ng.
El LOD (límite de cuantificación) se define como 10 a 20 veces el nivel de ruido.
Se puede utilizar un sistema de detección de UV para medir cantidades
cuantitativas de hasta 500 pg por inyección.
La respuesta del detector se puede expresar como margen dinámico y como
margen dinámico lineal. El margen dinámico es la relación de la concentración
máxima y mínima a través de la cual se puede registrar la propiedad medida (es
decir, la absorbancia). Sin embargo, en la práctica, se utiliza de manera más
habitual el margen dinámico lineal, es decir, el margen de concentración de
50
solutos en el que la respuesta del detector es lineal. La representación gráfica de la

respuesta de inyecciones de diferentes concentraciones de analitos en relación con
sus concentraciones debería producir una línea recta a través de parte del margen
de concentración. A menudo, la respuesta es lineal sólo para una décima parte del
margen dinámico completo. Los detectores de UV son lineales a través de un
margen de un máximo de cinco órdenes de magnitud. Los detectores de
fluorescencia y electroquímicos son lineales a través de aproximadamente dos
órdenes de magnitud. Los espectrómetros de masas son lineales a través de tres
órdenes de magnitud, y los detectores de RI son lineales a través de un máximo de
cuatro órdenes de magnitud.
La sensibilidad se define correctamente como la pendiente de la curva de
calibración. Expresa la capacidad del sistema para distinguir con exactitud las
cantidades reales presentadas. Una pendiente poco profunda es más sensible que
una pronunciada.
En el gráfico se resumen el LOD/LOQ, el margen lineal y la sensibilidad.
51
Detectores de UV/Vis
Detectores de UV-VIS
Principios: La fracción de luz transmitida a través de la celda del
detector está relacionada con la concentración del soluto, según la ley
de Beer.
Celda de flujo del detector
I0 c I
Log I0 = A = abc
I
Características: Específico, sensible a la concentración, buena

estabilidad, capacidad de gradiente.
Especial: Capacidad espectral UV-VIS (tecnología de matriz de diodos).
34
Figura 46
Los detectores de UV-Vis se encuentran entre los más utilizados. La

cuantificación es posible cuando se utiliza este detector, debido a la relación lineal
entre la absorbancia y la concentración del analito. Esta relación se conoce con el
nombre de ley de Beer. Los términos de la ecuación son los siguientes:
Io – Intensidad de la radiación antes de pasar a través de la celda de flujo
I – Intensidad de la radiación después de pasar a través de la celda de flujo
A – Absorbancia
a – Absorción, una constante de proporcionalidad característica del medio
absorbente
b – Longitud de ruta de la celda de flujo
c – Concentración del medio absorbente
Cuando se representa la señal o el área en relación con la concentración, se aplica
la ley de Beer, permitiendo al analista confeccionar una tabla de calibración y
determinar la cantidad de desconocidos. La determinación de la concentración de
un desconocido es válida en la región lineal de la curva de calibración.
52
Longitudes de onda de cromoforos
Cromoforo Estructura máx(nm)

Amina - NH2 195
Etileno -C=C- 190
Cetona -- C = O 195
Éster - COOR 205
Aldehído - CHO 210
Carboxilo - COOH 200-210
Nitro - NO2 310
Fenilo 202, 255
Naftilo 220, 275
35
Figura 47
En la detección de UV-Vis, el margen útil de longitudes de onda de detección está

comprendido entre 210 y 850 nm (con una lámpara de tungsteno). Los electrones
estrechamente enlazados en enlaces únicos de carbono/carbono o de
carbono/hidrógeno necesitan energías correspondientes a longitudes de onda
inferiores a 180 nm. Este tipo de electrón no es útil para la medida. Los electrones
exteriores no compartidos pueden mostrar picos de absorción. Esto incluiría
electrones no compartidos de azufre, bromo y yodo. Los electrones de enlaces
dobles y triples en las moléculas orgánicas se excitan con relativa facilidad
mediante la radiación de UV. Por consiguiente, los compuestos de carácter no
saturado y aromático muestran, por lo general, picos de absorción útiles. En la
tabla anterior se muestran las longitudes de onda de absorción aproximadas.
53
Detectores UV-VIS - Principios de diseño
Detector de longitud
de onda variable Lámpara Filtro de corte
de UV
Filtro de óxido de holmio
Rendija
Diodo de
muestra
Espejo 1
• Es posible la detección de longitud Red de

de onda simple o la detección de difracción
Celda de
longitud de onda múltiple. flujo
• La calibración de la longitud de
Espejo 2
onda se realiza automáticamente
utilizando un filtro de holmio. Diodo de
referencia
36
Figura 48
En la figura anterior se muestra la ruta óptica de un detector convencional de

longitud de onda variable. La luz polícroma de una lámpara de deuterio se enfoca
en la rendija de entrada de un transmisor monocromático utilizando espejos
esféricos y planos. El transmisor monocromático emite selectivamente una banda
estrecha de luz a la rendija de salida.
El haz de luz de la rendija de salida pasa a través de la celda de flujo y es
absorbida parcialmente por la disolución de la celda de flujo.
La absorbancia de la muestra se determina midiendo la intensidad de la luz que
llega al fotodiodo sin la muestra (una referencia en blanco) y comparándola con la
intensidad de la luz que llega al detector después de pasar a través de la muestra.
En muchos detectores de longitud de onda variable se puede programar el tiempo,
y pueden programarse para cada pico de un análisis cromatográfico. Para medir el
espectro de un compuesto, la muestra debe atraparse en la celda de flujo,
deteniendo el flujo de la fase móvil y, a continuación, barriendo todo el rango de
longitudes de onda.
54
Detector de UV-VIS con capacidad de espectros
Lámpara de VIS
Lentes acromáticas
Celda de flujo Matriz de diodos

del detector
Lámpara de UV
Filtro de holmio
Red de difracción
Rejilla óptica
• Gracias al detector UV-VIS de matriz de diodos, es posible realizar medidas de

espectros en línea. Rango de longitud de onda de 190 - 900 nm.
• Resolución de longitud de onda: hasta 1 nm.
• Calibración de longitud de onda con filtro de óxido de holmio.
37
Figura 49
El detector de matriz de diodos puede proporcionar una detección en una única

longitud de onda o simultáneamente en varias longitudes de onda. Este detector
también tiene la capacidad para almacenar espectros, para fines de análisis de la
pureza de picos, búsqueda en librerías y creación de señales extraídas. Éste es el
dibujo esquemático de un detector de matriz de diodos 1100. Las lámparas
combinadas de tungsteno y deuterio emiten una radiación comprendida entre 190-
850 nm. La radiación se colima a través de la celda de flujo y, a continuación, a
través de una rendija controlada mecánicamente. La radiación se dispersa en la
red de difracción holográfica en longitudes de onda de luz individuales. Cada
fotodiodo recibe una banda estrecha de longitudes de onda diferente. Se toma un
espectro completo aproximadamente cada 12 ms y se crean y se almacenan
espectros y señales.
En nuestro ejemplo, la matriz consta de 1.024 diodos, cada uno de los cuales mide
un rango diferente de longitudes de onda de banda estrecha. La medida de la
variación de la intensidad luminosa a través de todo el rango de longitudes de
onda proporciona un espectro de absorción. La rendija de la entrada se puede
programar a valores comprendidos entre 1 y 16 nm. Si se necesita alta
sensibilidad, la rendija se abre a 16 nm. Si se desea la máxima resolución
espectral, se estrecha la rendija.
55
Espectros en línea - Detector UV-VIS
Absorbancia
Espectros
Longitud de onda
Tiempo
38
Figura 50
Conjuntamente con software de evaluación de datos adecuado, el detector de

matriz de diodos es una potente herramienta de optimización de métodos. Por
ejemplo, se pueden monitorizar simultáneamente varias longitudes de onda para
detectar y cuantificar de manera óptima analitos múltiples (incluidos analitos no
resueltos). Hay disponibles herramientas de optimización de longitud de onda
para determinar las longitudes de onda máximas. Pueden crearse fácilmente
representaciones gráficas en tres dimensiones. La capacidad para adquirir y
almacenar espectros de UV permite crear librerías electrónicas de espectros que
pueden utilizarse para identificar categóricamente los compuestos de muestras.
Los espectros de un pico cromatográfico se pueden comparar para determinar la
pureza de los picos.
56
Pureza de los picos basada en espectros de UV
Pico con marcador de tiempo para selección de espectros
Diferencias espectrales en diferentes puntos

Homogeneidad de espectros en el pico
de la elución de picos
39
Figura 51
Si el analito recoge y almacena espectros adecuados durante la elución de un pico

cromatográfico, el sistema de datos podrá ayudar a determinar si el pico
cromatográfico es impuro. Los espectros se promedian a lo largo del tiempo de
elución del pico cromatográfico. A continuación, cada espectro del pico
cromatográfico se compara con el espectro promedio. Las diferencias entre los
espectros no deberían ser significativas cuando se normalizan para cambios de
concentración. Si los espectros del pico son diferentes, el pico contiene una
impureza. Si los espectros son homogéneos a través del pico cromatográfico, el
pico podrá ser puro (debe recordarse que la impureza podrá no estar relacionada
con la absorción del espectro de UV, por lo que si se está recogiendo la muestra
mediante recogida de fracciones para otro fin, deberá considerarse esa
posibilidad).
57
Representación gráfica de la isoabsorbancia

L
o
n
g
i
t
u
d
d
e
o
n
d
a
La longitud de onda de
adquisición se puede
optimizar en función de
los espectros almacenados.
40
Figura 52
Más arriba se muestra un ejemplo de representación de la isoabsorbancia. Las

representaciones gráficas de la isoabsorbancia proporcionan una matriz de datos
de la absorbancia representada en relación con el tiempo y la longitud de onda.
Esta herramienta puede ayudar al analista a determinar la longitud de onda óptima
para el método u optimizar la intensidad de uno o más picos cromatográficos.
58
Detección de fluorescencia
Principios de la detección de fluorescencia
S1
Energía de emisión
S0
S0…. Nivel de energía básica de los electrones
S1… Estado excitado de los electrones mediante energía externa, por ejemplo, luz de UV (longitud de onda
baja / longitud de onda de excitación)
41
Figura 53
La fluorescencia es un tipo específico de luminiscencia que se crea cuando

determinadas moléculas emiten energía absorbida anteriormente durante un
periodo de iluminación. Los detectores de luminiscencia tienen mayor
selectividad que los detectores de UV, por ejemplo, ya que no todas las moléculas
que absorben luz también la emiten. Las longitudes de onda de excitación y
emisión son características de cada compuesto individual.
Los detectores de fluorescencia son más sensibles que los detectores de
absorbancia debido al menor ruido de fondo. La mayoría de los detectores de
fluorescencia están configurados de modo que la luz fluorescente se registre en
ángulo (a menudo en ángulo recto) con respecto al haz de luz incidente. Esta
geometría reduce la probabilidad de que la luz incidente dispersa interfiera como
señal de fondo, y asegura la máxima relación señal-ruido para niveles de
detección sensibles.
Sólo el 10 por ciento, aproximadamente, de las moléculas orgánicas tienen
estructuras fluoróforas, lo cual les permite absorber luz a lo largo de un rango de
longitudes de onda. Esto sitúa los electrones de la molécula en un nivel de
59
excitación, como ocurre con cualquier molécula que contenga un cromóforo. La

molécula fluorescente tiene la capacidad para emitir la energía absorbida a
longitudes de onda más largas.
Si se registran las intensidades de la luz fluorescente mientras se cambia la
longitud de onda de excitación y la longitud de onda de emisión es fija, podrá
obtenerse un espectro de excitación.
O bien, la longitud de onda de excitación puede ser fija, y la longitud de onda de
emisión puede cambiarse. Este procedimiento proporciona un espectro de emisión
del analito. Los compuestos desprovistos de esta fluorescencia natural pueden
derivarse para adjuntar una molécula marcadora fluorescente en una reacción
previa o posterior a la columna. Los detectores de fluorescencia ofrecen límites de
detección hasta niveles de ppt. Las intensidades de las señales son muy bajas en
comparación con la absorción de UV e idealmente se miden en relación con un
nivel de ruido de fondo muy bajo. Esto es inherentemente más sensible que la
comparación de dos señales relativamente grandes a partir de un análisis en
blanco y una muestra, como ocurre en la espectroscopia de absorción de UV. Sin
embargo, la sensibilidad de la detección de fluorescencia depende tanto de las
propiedades del fluoróforo como del diseño y los ajustes del detector.
La respuesta de un fluoróforo se caracteriza por la absorción molar y el
rendimiento cuántico en las condiciones experimentales aplicadas. La sensibilidad
del detector de fluorescencia depende de varios factores: la intensidad de la
fuente, la eficacia del sistema óptico, el ancho de banda, etc.
60
Excitación - Emisión
Norm.
UV Emisión
Excitación DAD-espectros

Norm.
Excitación Emisión

42
Figura 54
Optimización de los límites de detección y de selectividad

Para conseguir límites óptimos de detección y de selectividad, los analistas deben
averiguar las propiedades fluorescentes de los compuestos de interés. Pueden
seleccionarse las longitudes de onda de excitación y de emisión para definir
límites óptimos de detección y la mejor selectividad. Por lo general, los espectros
de fluorescencia obtenidos con instrumentos distintos podrán mostrar diferencias
significativas, dependiendo del hardware y el software utilizados.
El proceso tradicional consiste en extraer una longitud de onda de excitación
adecuada del espectro de UV que sea similar al espectro de excitación de
fluorescencia, y registrar el espectro de emisión. A continuación, y una vez
determinada la longitud de onda de emisión óptima, se adquiere el espectro de
excitación. Estas tareas deben repetirse para cada compuesto utilizando un
espectrofotómetro de fluorescencia o condiciones de parada-flujo en el sistema de
HPLC. Normalmente, cada compuesto necesita un análisis por separado. Como
consecuencia, se obtiene un conjunto de espectros de excitación y de emisión para
cada compuesto. Puesto que se trata de un procedimiento tedioso, sólo es
aplicable cuando el número de compuestos de interés es limitado.
61
Monocromador
de emisiones
Lámpara
de xenón Lente
Espejo Lente
Fotomultiplicador
Monocromador
Muestra Fotodiodo
de excitación
43
Figura 55
Se utiliza una lámpara de flash de xenón con el fin de ofrecer las más altas
intensidades luminosas para la excitación en el margen de UV. La lámpara de
flash sólo se enciende durante unos microsegundos para aportar energía luminosa.
Cada destello provoca fluorescencia en la celda de flujo y genera un dato
individual para el cromatograma. Puesto que la lámpara no está encendida durante
la mayor parte del tiempo de funcionamiento del detector, tiene una vida útil de
varios miles de horas. No se necesita un tiempo de calentamiento para obtener una
línea de base estable. Se utiliza una red de difracción holográfica como transmisor
monocromático para dispersar la luz polícroma de la lámpara de xenón. La
longitud de onda deseada se enfoca entonces en la celda de flujo para obtener la
excitación óptima. Para reducir al mínimo la luz dispersa desde el lado de
excitación del detector, la óptica está configurada de modo que la luz emitida se
registre en un ángulo de 90 grados con respecto al haz de luz incidente. Se utiliza
otra red de difracción holográfica como transmisor monocromático de emisión.
Ambos transmisores monocromáticos disponen de una salida de luz optimizada en
el margen visible. Un tubo fotomultiplicador es la elección óptima para medir la
baja intensidad luminosa de la luz fluorescente emitida.
Puesto que las lámparas de flash presentan fluctuaciones inherentes con respecto a
la intensidad entre destellos, un sistema de referencia basado en un fotodiodo
mide la intensidad de la excitación y provoca una compensación de la señal del
detector. Debido a que la inmensa mayoría de los máximos de emisión son
62
superiores a 280 nm, un filtro obturador (no mostrado) impide que la luz dispersa
por debajo de esta longitud de onda penetre en la ruta luminosa hasta el
transmisor monocromático de emisión. El filtro obturador fijo y el ancho de banda
(2 nm) evitan las comprobaciones de hardware y el trabajo de documentación que
deben realizarse con un instrumento provisto de filtros y rendijas intercambiables.
Los transmisores monocromáticos de excitación y de emisión se pueden conmutar
entre los modos de señales y espectral. En el modo de señales se desplazan a
posiciones específicas que se codifican para las longitudes de onda deseadas,
como ocurre con un detector tradicional. Este modo ofrece los límites de
detección más bajos, puesto que todos los datos se generan a una única longitud
de onda de excitación y de emisión.
El modo espectral se utiliza para obtener información multiseñal o espectral. El
encendido de la lámpara de flash se sincroniza con la rotación de las redes de
difracción en el transmisor monocromático de excitación o de emisión. La
tecnología de motor de las redes de difracción ofrece un diseño de larga vida útil,
similar al utilizado habitualmente en las unidades de disco de alta velocidad de los
ordenadores personales. Cuando la red de difracción alcanza la posición correcta
durante una revolución, se enciende la lámpara de xenón para enviar un destello.
La duración del destello es inferior a dos microsegundos, mientras que la
revolución de la red de difracción tarda menos de 14 milisegundos. Debido al
transmisor monocromático giratorio, la pérdida de sensibilidad en el modo
espectral es mucho menor en comparación con la detección convencional de
doble longitud de onda de los detectores de UV.
63
Planteamientos prácticos respecto de la

detección de fluorescencia
• La fluorescencia es sólo lineal para las soluciones diluidas.

• Puesto que la medida de emisión se realiza a 90º y la red de
difracción sólo selecciona una longitud de onda, la medida es
muy sensible.
• Algunas sustancias químicas pueden suprimir la fluorescencia
disminuyendo la sensibilidad (es decir, O2).
• No son aceptables los disolventes que absorben en la longitud
de onda de la excitación.
• Los detectores de FLD resultan más o menos afectados por los
cambios de temperatura y flujo.
• Detector selectivo.
44
Figura 56
La detección de fluorescencia es apta para una amplia gama de aplicaciones.

Algunos analitos se derivan para la detección de fluorescencia.
Ejemplo: análisis de aminoácidos, u otras aminas que se derivan con orto-
ftalaldehído.
A continuación se enumeran otros agentes derivadores utilizados habitualmente.
Grupo funcional Reactivo

-NH2 orto-ftalaldehído
-NHR 9-fluorenilmetilo cloroformiato
-COOH p-bromofenilacil bromuro, 2-naftacil bromuro
-OH fenil-isocicante
-CHO, =C=O 2,4-dinitrofenil hidracina
-CO-COOH 2,4-dinitrofenil hidracina
64
Detección electroquímica
Principios de la detección electroquímica
• Esta técnica de detección se aplica a los compuestos que se

pueden oxidar o reducir.
• Por ejemplo:
Grupos OH en un anillo de fenilo
Grupos NH(x)
Grupos SH
• Modos de operación:
Reducción u oxidación
• Reacción electroquímica:
A B + e- (oxidación)
45
Figura 57
Las técnicas de detección electroquímica están basadas en la transferencia de

carga eléctrica que ocurre cuando una molécula libera electrones durante la
oxidación o cuando una molécula absorbe electrones durante la reducción. Esta
oxidación o reducción tiene lugar en la superficie de lo que se denomina un
electrodo activo.
El hecho de que un compuesto se reduzca o se oxide, además de la velocidad de la
reacción, depende de la diferencia de potencial entre el electrodo activo y la
disolución que contiene los compuestos. La velocidad de la reacción se puede
determinar a partir de las energías de activación y los potenciales de oxidación-
reducción expresados por la ecuación de Nernst. La corriente resultante es
proporcional al número de reacciones que ocurren en el electrodo, que a su vez es
un indicador de la concentración del compuesto de interés en la superficie.
65
Principios de la detección electroquímica

Corriente
Modo oxidativo:
Transferencia de electrones desde el
compuesto al electrodo.
Electrodo operativo = Cátodo
Potencial óptimo
0,4 0,6 0,8 1,0

Potencial (V)
Modo reductivo: Electrodo
Transferencia de electrones de referencia
desde el electrodo al Electrodo

compuesto. Contraelectrodo operativo
Electrodo operativo = Ánodo

Celda
46
Figura 58
En el proceso de detección se utilizan tres electrodos: el electrodo activo, en el

que tiene lugar la reacción; el contraelectrodo, que aplica la diferencia de
potencial entre la fase móvil y el electrodo activo; y el electrodo de referencia,
que compensa cualquier cambio en la conductividad del eluyente. Las lecturas del
electrodo de referencia se envían al contraelectrodo para mantener constante la
diferencia de potencial durante la elución de picos a medida que la corriente fluye
a través del electrodo activo.
La respuesta del detector es el resultado de la amplificación del flujo de electrones
y su conversión posterior en una señal. Con los avanzados sistemas electrónicos
de la actualidad pueden medirse corriente extremadamente bajas que representan
cantidades de analitos en el margen de picogramos, e incluso inferior. Aunque
la detección electroquímica sólo puede detectar aquellas
sustancias que se pueden electrolizar, esta limitación es en
realidad una ventaja cuando se aplica a matrices complejas de
alimentos, ya que mejora la selectividad.
Para determinar el potencial óptimo del electrodo activo, la relación entre la
respuesta del detector (corriente) y el potencial aplicado (voltaje) debe
representarse gráficamente para cada compuesto como una curva de corriente-
voltaje (CV), tal y como se muestra en la figura anterior.
A un potencial inferior a E1 , la oxidación no puede tener lugar porque el
suministro de energía es insuficiente. Si se incrementa el potencial hasta E1/2, se
66
electrolizará el 50% de todas las moléculas que se encuentran en la superficie del

electrodo. La respuesta máxima precisa un potencial justo por encima de E2. Este
potencial se denomina corriente limitadora, ya que todo aumento adicional del
voltaje limitará la detección al aumentar el ruido.
67
Detectores electroquímicos
Diseño de capa fina Diseño de surtidor Diseño poroso de

de pared paso de flujo
• Oro para hidrocarburos

• Platino para clorita, sulfato, hidracina, etc.
• Carbono para fenoles, aminas
• Plata para cloruro, bromuro, cianuro
47
Figura 59
Aspectos relativos a la celda de flujo

Se han descrito numerosos diseños de celda en publicaciones especializadas. La
mayoría de ellos se pueden clasificar en tres tipos principales: diseño de capa fina,
diseño de surtidor de pared y diseño poroso de flujo transversal. El diseño de
celda poroso de flujo transversal difiere significativamente de los otros dos tipos
en el sentido de que la detección culombimétrica asegura un rendimiento de
reacción del 100% en la superficie del electrodo. Los otros diseños permiten
conseguir una eficacia de tan sólo un 1-10% mediante la detección
amperométrica. Sin embargo, la detección amperométrica es normalmente la
técnica más sensible y es preferible a la detección culombimétrica. La mayoría de
los detectores electroquímicos pueden utilizar celdas de 1 µl y resultan indicados
para los sistemas de HPLC de calibre estrecho.
Materiales de electrodos
En los electrodos activos se utilizan varios materiales, de los que el más habitual
es el carbono vítreo. Otros materiales son el oro (para azúcares y alcoholes), el
platino (para clorita, sulfito, hidracina y peróxido de hidrógeno), la plata (para
halógenos), el cobre (para aminoácidos), el mercurio (en modo reductor para
sulfato de azufre) y una combinación de mercurio-oro (en modo reductor para
compuestos orgánicos nitrogenados).
68
Ventajas y limitaciones de la detección ECD
Ventajas:
• Altamente selectiva
• Altamente sensible
Limitaciones:
• Se ve influida por cualquier ión de metal procedente del sistema
de HPLC (Fe, Ni, etc.).
• No se pueden utilizar gradientes.
• Se ve influida por cambios de temperatura y flujo.
• No es un detector robusto. Necesita tiempo para la
estabilización y el equilibrio. Necesidades de limpieza
especiales.
48
Figura 60
Uso rutinario
Hasta hace poco, la técnica electroquímica se había considerado de difícil
aplicación e insuficientemente estable para análisis rutinarios. Sin embargo, las
recientes mejoras han permitido el uso rutinario de estos detectores, por ejemplo,
en el análisis de aminas derivadas de la tirosina en laboratorios de investigación
clínica y de pruebas rutinarias.
Cuando se aplican entre análisis, o incluso durante la elución de picos (por
ejemplo, en análisis de azúcares utilizando electrodos de oro), las rutinas
autolimpiantes basadas en la amperometría a pulsos aumentan la estabilidad.
Aunque se puede determinar un potencial óptimo para una mezcla de compuestos
evaluando los voltamogramos de cada compuesto, estos pasos de optimización se
pueden automatizar utilizando determinados detectores electroquímicos en lo que
se denomina modo de incremento automático. El equipo de HPLC analiza una
serie de inyecciones a lo largo de un margen de potenciales crecientes (definido
por los potenciales inicial y final y un parámetro de incremento). Un sensor de
deriva contribuye a asegurar que se mantenga un umbral especificado antes de
que comience el siguiente análisis.
69
HPLC-MS
HPLC-MS
LC-MS
Electropulverizador
Peso molecular
Termo-
pulverizador
Haz de
partículas
GC/MS
Polaridad/solubilidad en agua
49
Figura 61
La identificación de muestras complejas presenta un problema para el análisis de

cromatografía de líquidos. Los compuestos coeluyentes pueden identificarse por
lo general utilizando la detección de absorbancia de UV con la tecnología de
matriz de diodos, pero este método puede no ser suficientemente específico
cuando las diferencias entre los espectros son pequeñas. Técnicas de detección
tales como la fluorescencia pueden ofrecer mayor especificidad que la detección
de UV, pero si se deben analizar numerosos compuestos diferentes, estas técnicas
podrán no aportar los resultados deseados.
Con la espectroscopia de masas (MS), se pueden identificar con mayor certeza
varias clases de analitos diferentes en una amplia variedad de tipos de muestras.
Aunque la cromatografía de gases/espectroscopia de masas (GC/MS) es una
técnica bien establecida para el análisis de alimentos, la cromatografía de
líquidos/espectroscopia de masas (LC/MS) está empezando a convertirse ahora en
una herramienta útil en este área. Un análisis basado en GC sólo es adecuado para
aquellos compuestos alimenticios que sean volátiles y térmicamente estables. Sin
embargo, numerosos compuestos son no volátiles, extremadamente polares o
térmicamente lábiles. A menudo, tales compuestos se pueden separar
70
HPLC-MS
satisfactoriamente con la cromatografía de líquidos, y el desarrollo de interfases

mejoradas ha contribuido al uso más generalizado de la LC/MS.
No obstante, los espectrómetros de masas se conectan con mayor facilidad a los
equipos de GC que a los sistemas de LC. En la diapositiva se muestran las
diferentes condiciones operativas de la LC y la MS. Los primeros intentos de
agrupar la LC y la MS utilizaron inyección directa de líquidos e interfases de
correa móvil, pero estos métodos resultaron ser ineficaces y poco fiables. En la
década de los ochenta, las interfases de termopulverización y de haz de partículas
mejoraron tanto el margen de aplicación como la fiabilidad de la LC/MS. Sin
embargo, la baja sensibilidad, el estrecho margen de masa y polaridad de los
analitos, y los requisitos de mantenimiento frecuente limitaron la eficacia de estas
interfases. Más recientemente, dos interfases de ionización a presión atmosférica
(API) —la electropulverización y la ionización química a presión atmosférica
(APCI)— han reemplazado casi por completo a las técnicas de
termopulverización y de haz de partículas. Estas interfases tienen un amplio
margen de polaridades y pesos moleculares de analitos, alta sensibilidad, utilidad
mejorada y necesidades de mantenimiento reducidas. La selección de la interfase
de LC/MS adecuada para una aplicación depende de factores tales como la
polaridad, el peso molecular y la tendencia térmica del analito.
71
HPLC-MS
Ionización de presión atmosférica - Modos MS
Ionización del electropulverizador:

Proceso de ionización que utiliza un campo eléctrico para generar
gotitas cargadas e iones de analito posteriores mediante la
evaporación de iones en el análisis de MS. La nebulización
neumática permite velocidades de flujo de hasta 1 ml/min.
Ionización química de presión atmosférica o APCI:

Proceso de ionización química (CI) de fase de gas en el que el
disolvente actúa como el gas reactivo de CI para ionizar la
muestra.
50
Figura 62
Hay dos modalidades de ionización a presión atmosférica (la técnica de LC/MS

más utilizada): electropulverización e ionización química a presión atmosférica.
Estas técnicas, que a menudo son complementarias, ofrecen la posibilidad de
analizar un amplia gama de muestras.
La ionización por electropulverización es un proceso en el que se forman iones a
partir de la fase líquida mediante la expulsión de gotitas cargadas. La sensibilidad
se mejora cuando los iones se forman previamente en el eluyente. El proceso API-
ES a menudo está asistido neumáticamente, por lo que pueden tratarse con mayor
facilidad velocidades de flujo más elevadas del líquido cromatográfico. API-ES
resulta útil para el análisis de muestras de carga múltiple, como proteínas,
péptidos y oligonucleótidos. También se analizan moléculas pequeñas de carga
única.
La ionización química a presión atmosférica es una técnica que utiliza una
descarga de corona para ionizar los analitos y la fase móvil en la fase de gas.
Puesto que esta técnica precisa una cierta volatilidad, resulta más indicada para
especies con peso molecular y polaridad moderados. Esta técnica es más indicada
que la electropulverización para compuestos no polares.
72
HPLC-MS
Electropulverizador API de HPLC-MSD
Inyector de HPLC
Octopolo
Separadores
Nebulizador
Capilar
Zona de fragmentación Lentes

(CID) Cuadrupolo
51
Figura 63
En la figura anterior se muestra un dibujo esquemático de un sistema API-

LC/MSD. Independientemente de que el método de ionización sea APCI o
electropulverización, la cámara de pulverización realiza tres funciones:
• Generación de aerosol, que realiza el nebulizador.
• Ionización (posterior a la realizada en la disolución).
• Eliminación de disolvente, realizada por el conjunto de disolución.
El nebulizador ortogonal es excelente para tratar sales y soluciones tampón.

Los iones cargados se succionan en el interior del capilar que separa la zona de la
fuente de iones a presión atmosférica de la zona de alto vacío. A medida que los
iones abandonan el capilar, se aceleran hacia el separador número uno, que actúa
como una lente y también para eliminar el exceso de gas neutro y las moléculas
de disolvente.
El separador número dos también actúa para enfocar los iones y eliminar más
especies neutras antes de que los iones lleguen a la zona de gran vacío del
cuadrupolo. La guía del octopolo continúa enfocando los iones hacia el
cuadrupolo. Esta zona permite extraer una cantidad significativa de las especies
neutras mediante la bomba turbomolecular. El octopolo también sirve para
73
HPLC-MS
homogeneizar las distribuciones de energía de los iones antes de entrar en el

cuadrupolo.
El filtro de masas del cuadrupolo sólo permite que pase un m/z a la vez hasta el
detector. El detector de dinodo de alta energía cuenta los iones y amplifica la
señal. Una vez contados y amplificados los iones, se registran en el espectro de
masas y se envían a un fichero de un sistema de datos.
74
HPLC-MS
Información cualitativa del espectrómetro

de masas
684,65
Abundancia
8000 Fragmentador = 75 voltios Triglicérido
6000
4000
2000
439 467 502
m/z-->
350 400 450 500 550 600 650 700
684,65
Abundancia
8000 Fragmentador = 175 voltios
6000 467 pérdida de ácido graso C12
4000
439
2000 pérdida de ácido graso C14
411 495
m/z-->
350 400 450 500 550 600 650 700
52
Figura 64
Cuando se analiza una molécula pequeña mediante técnicas de ionización a

presión atmosférica, la especie predominante del espectro de masas normalmente
es un ion molecular protonado. En el ejemplo anterior, la masa nominal del
fenilbutazone es de 308 daltons. El pico base del espectro de masas, que es el pico
más abundante, es el ion pseudomolecular, [M + H]+, a m/z 309.
Podrán producirse, e incluso predominar, otros iones pseudomoleculares,
dependiendo de la fase móvil, los aditivos e incluso las impurezas. A continuación
se enumeran otros iones habituales para el modo positivo:
[M + Na]+ = [M + 23]+
[M + K]+ = [M + 39]+
[M + NH4]+ = [M + 18]+
[M + X]+ donde X es el catión de la solución tampón del disolvente
+
2[M + H] más débil a concentraciones altas
[M + H + S]+ aducciones de disolvente
75
HPLC-MS
Para el modo negativo:

[M – H]- condiciones básicas
[M + X]- donde X es el catión de la solución tampón o del disolvente
[M – H + S]- aducción de disolvente
El almacenamiento, la preparación, la fase móvil y los aditivos de la muestra

afectarán al resultado en su conjunto. Estos aspectos deben tenerse presentes al
desarrollar un método.
Los compuestos con elevados pesos moleculares y múltiples sitios de ionización
producen abundantes iones de carga múltiple. Un ejemplo sería proteínas cuyos
grupos de arginina y lisina pueden protonarse en condiciones ácidas. Las
relaciones masa-carga analizadas están comprendidas en el margen de masas del
espectrómetro de masas cuadrupolo.
API es una técnica de ionización relativamente suave que produce principalmente
un ion pseudomolecular. La disociación inducida por colisiones, que es el proceso
mediante el cual se producen colisiones entre iones y moléculas de gas neutro
para provocar fragmentación, es útil tanto para análisis cualitativos como para
fines de cuantificación. Cualitativamente, se revela la información estructural
acerca de la molécula. La especificidad de la cuantificación aumenta debido a la
presencia de iones confirmativos.
La elección de la energía de los iones entre la salida del capilar de transferencia
de iones y el primer separador puede controlar la disociación inducida por
colisiones. Si se cambia el parámetro denominado "fragmentador" en el software,
variará la energía de los iones. Una energía iónica más elevada produce colisiones
más enérgicas. Ocurre una mayor fragmentación. Una energía iónica menor
apenas produce fragmentación cuando se observan predominantemente iones
pseudomoleculares.
La disociación inducida por colisiones depende del compuesto. El grado de
fragmentación debería determinarse experimentalmente mediante el análisis de
inyección de flujo (FIA).
El ejemplo anterior corresponde a un triglicérido. A un voltaje del fragmentador
de 75 voltios, el espectro muestra el ion pseudomolecular, [M + NH4]+, a m/z
684,65. Una vez que se aumenta el voltaje del fragmentador a 175 voltios, el
triglicérido se puede caracterizar mediante los iones de los fragmentos.
76
Detección del índice de refracción
Detectores de índice de refracción - Principios
Referencia de eluyente
n0
Cero óptico
Línea de
Lámpara base
n
Pico
Eluyente + Analito
Se detectarán todos aquellos compuestos cuyo índice de refracción sea diferente a

la fase móvil.
53
Figura 65
El detector de índice de refracción (RI) es un detector no selectivo o universal.

Esto significa que puede detectar prácticamente cualquier compuesto, pero no a
niveles bajos. El principio de detección está basado en la comparación del índice
de refracción del eluyente y de la muestra con una disolución de referencia del
eluyente únicamente.
77
Diseño del detector de índice de refracción

Los siguientes aspectos influyen en gran medida
en la detección del índice de refracción:
ƒ Cambios de presión
ƒ Cambios de temperatura
ƒ Pulso de flujo
La elución de gradientes no es posible
Lámpara de wolframio
Lente del condensador
Elemento receptor de luz
Cristal "cero"
Intercambiadores de calor
Lente del colimador
Celdas de flujo
Espejo
54
Figura 66
La detección del índice de refracción (RI) está basada en la diferencia del RI entre
la disolución contenida en la celda de la muestra y la disolución de fase móvil
pura de la celda de referencia. Puesto que la composición de los eluyentes debe
ser fija durante el análisis, este detector no resulta indicado para el análisis de
gradientes.
Hay disponibles cuatro tipos principales de detectores de RI: deflexión de acuerdo
con la ley de Snell, reflexión de acuerdo con la ley de Fresnel, interferencia y
efecto de Christiansen. El primero, que utiliza el diseño de doble celda, es, con
mucho, el más utilizado.
Puesto que los detectores de RI carecen de sensibilidad y muestran una tendencia
a la deriva debido a los cambios de temperatura, se utilizan principalmente en el
análisis de polímeros para la cromatografía por impregnación de gel.
78
Detección de dispersión luminosa
Detector de fotodispersión
Inyector de gas del Fuente luminosa

nebulizador colimada
Penacho de gotas
nebulizadas
Penacho de
partículas
de analito
Inyector de
eluyente
Fotodetector
Cámara de evaporación del

eluyente
Drenaje de residuos de
Nebulizador termostatizado
eluyente
55
Figura 67
Hay cuatro procesos principales mediante los cuales la ruta de la luz o radiación
electromagnética puede cambiar de dirección cuando pasa a través de un medio
que contiene una fase de partículas en suspensión. Se trata de los siguientes:
• Dispersión de Rayleigh
• Dispersión de Mie
• Reflexión
• Refracción
La importancia de cada uno de estos procesos depende del radio de la partícula (r)
en comparación con la longitud de onda ( λ ) de la luz incidente. La dispersión de
Rayleigh es predominante cuando r/ λ es < 5 x 10-2. Cuando las dimensiones de
la partícula son superiores a λ /20, dejan de comportarse como orígenes de
puntos, y la dispersión de Mie se convierte en la dispersión predominante. Una
79
vez que el tamaño de la partícula se aproxima a la longitud de onda de la luz

incidente, empiezan a prevalecer la reflexión y la refracción.
Para poder decidir qué mecanismo es responsable predominantemente de la
"dispersión", debe calcularse el tamaño de las partículas en cuestión en
comparación con la longitud de onda de la luz incidente:
1.5
 1000Q 
0 , 45
585 σ  µ 
D0 = u ρ + 597 σ  
 Qa 
 = n a D 3 / na D 2
donde D0 = diámetro medio de las gotas

na = número de gotas en el margen de tamaños, con un diámetro D
σ = tensión en la superficie del líquido
ρ = densidad del líquido
µ = viscosidad del líquido
u = velocidad relativa entre la corriente de gas y la corriente de
líquido
Q = velocidad de flujo volumétrico del líquido
Qa = velocidad de flujo volumétrico del gas
El tamaño de las partículas se puede variar modificando la velocidad del gas, la

velocidad de flujo del eluyente, la temperatura del nebulizador y también la
concentración inicial de solutos. A partir de los experimentos y cálculos
realizados, es evidente que el radio de la partícula (r) es aproximadamente igual o
mayor que la longitud de onda de la luz ( λ ). Esto indica que la "dispersión" se
debe predominantemente a la reflexión y la refracción.
Los cambios realizados en la concentración de solutos y las variaciones de presión
del gas del atomizador influyen en el tamaño de las partículas del soluto. Esta
relación proporciona al instrumento una sensibilidad máxima de
aproximadamente r/ λ = 4.
La detección disminuye rápidamente cuando los valores de r/ λ son superiores a 5
o inferiores a 2,5. Cuando r/ λ < 2,5, los efectos de interferencia típicos de la
dispersión de Mie provocan que la intensidad de la luz desviada sea baja en los
ángulos de medida. A medida que aumenta el tamaño de las partículas, la
reflexión y la refracción se convierten en dominantes y aumenta la sensibilidad.
Un incremento adicional del tamaño de las partículas provoca que la relación
entre el área y el volumen disminuya, por lo que la sensibilidad también
disminuye.
80
La distribución disminuye a medida que aumenta el diámetro y, por lo general, la

partícula más grande de una distribución alcanza un tamaño dos veces mayor que
el de la media. Por consiguiente, y aunque indudablemente existe alguna
dispersión de Mie y de Rayleigh, los fenómenos observados se deben
predominantemente a la reflexión y la refracción, puesto que la mayoría de las
partículas son mayores que la longitud de onda de la luz incidente.
La importancia relativa de la refracción y la reflexión se puede comprender

examinando los efectos de la luz incidente en una única partícula esférica cuyo eje
equilátero queda en el mismo plano que el fotodetector y la fuente luminosa. Con
esta configuración, la refracción es más importante que la reflexión. La mayoría
de los compuestos orgánicos tienen índices de refracción comprendidos entre 1,3
y 1,5. Los cambios que se produzcan en este margen del índice de refracción no
afectarán demasiado a la cantidad de luz que llega al detector. Esto explica las
similitudes de la sensibilidad del instrumento a diversos compuestos.
Por tanto, este analizador evaporativo es útil como un detector de masas puras,
siempre y cuando el material objeto de la investigación sea no volátil en las
condiciones de funcionamiento del instrumento.
Principios básicos de funcionamiento

En el dibujo esquemático anterior se muestran los componentes principales, que
se describen a continuación.
Nebulización
La corriente del eluyente penetra en el detector por el fondo de la cámara de
evaporación. La salida de la columna está conectada a través de un tubo capilar de
acero inoxidable de calibre pequeño (diámetro interno de 0,25 mm). El
disolvente/soluto pasa a través del nebulizador calentado y se introduce
perpendicularmente en la corriente de gas entrante. El gas separa las gotitas de
líquido de la aguja a medida que empiezan a formarse, atomizando la disolución
en una dispersión uniforme de gotitas que pasan entonces como una corriente
continua hasta el evaporador. Las gotitas más grandes o la fracción nebulizada
ineficazmente se acumulan alrededor de la entrada del evaporador y,
seguidamente, se vacían en la botella de recogida situada en el lateral del
instrumento. La fracción completamente nebulizada continúa descendiendo por el
interior de la cámara de evaporación.
81
Evaporación
Después de la nebulización, la pulverización atomizada se impulsa a través de la
cámara de evaporación, asistida por el gas portador. En el evaporador, el
disolvente se evapora de la pulverización atomizada, dejando un penacho de
partículas secas. Un difusor situado en el evaporador asiste en el secado de las
partículas, actuando como un eficaz intercambiador de calor. Asimismo, el
difusor impide que las partículas balísticas lleguen a la cámara de dispersión y
confiere un carácter aleatorio al penacho de partículas.
Detección
La luz de una lámpara se colima y se pasa a través del instrumento en ángulo
recto con respecto a la dirección del flujo de gas. Un interceptador de luz situado
enfrente de la fuente de luz captura el haz incidente transmitido, eliminando las
reflexiones internas dentro del cuerpo del instrumento. Cuando el disolvente puro
empieza a evaporarse, sólo su vapor pasa a través de la ruta luminosa, y la
cantidad de luz dispersa que llega al fotodetector es pequeña y proporciona una
respuesta constante. Cuando hay presente un soluto no volátil, una nube de
partículas pasa a través de la ruta luminosa, provocando la dispersión de la luz.
Esta luz dispersa penetra por la abertura del sistema de detección y genera una
respuesta de señal del fotodiodo en tiempo real. La cantidad de luz detectada
depende de la concentración del soluto y de la distribución de los tamaños de las
partículas del soluto.
Puesto que el proceso de detección se ve afectado por el tamaño de las gotitas

atomizadas, la velocidad de evaporación y el flujo de gas del nebulizador, es
importante mantener las condiciones constantes tanto en el interior como en el
exterior del instrumento. Debe asegurarse un suministro de gas constante
(volumen y presión), una velocidad de flujo uniforme del eluyente y una
ventilación adecuada del escape.
82
Detección de conductividad
Detectores de conductividad
Esquema Aplicaciones
F agua
productos de jabón
r resistencia fija
celda detergentes
C Iones refrescos
ref.
A conden-
sador
D
Control de
equilibrio
E
Ácidos en
Bases
Sales
} sangre
baños chapados
tratamiento de combustibles
nucleares
ríos
B
~
resistencias
variables
56
Figura 68
Los detectores de conductividad se utilizan habitualmente para la detección de

iones inorgánicos y orgánicos, normalmente después de la cromatografía de iones.
Este detector mide la conductancia de la fase móvil. La sensibilidad del detector
depende en gran medida de la conductancia inicial de la fase móvil.
Entre las áreas de aplicación cabe citar el análisis de iones en agua, fluoruro en
dentífrico e iones en baños de chapado, entre otras.
83
84
Ejercicio de laboratorio: sistemas de
reparto de disolventes
Ejercicio de laboratorio: sistemas de reparto de disolventes
En este ejercicio de laboratorio:

Aprenderá algunos procedimientos habituales de mantenimiento del sistema
HPLC. En estos procedimientos se utiliza el 1100. Las características mostradas
son comunes a numerosos fabricantes y modelos de sistemas HPLC.
• Localizará y describirá los componentes funcionales del HPLC.
• Localizará la pantalla de presentación de la presión y simulará un error de
alta presión.
• Localizará los detectores de fugas y aprenderá su función.
• Desmontará la bomba para localizar los sellos de la bomba.
• Volverá a montar la bomba.
86
La ruta de flujo
La ruta de flujo
Utilizando los diagramas, localizar cada uno de los elementos siguientes y
describir su función. Antes de comenzar, retirar las cubiertas laterales de cada uno
de los módulos del instrumento presionando sobre los dos clips laterales de las
cubiertas.
Si tiene alguna pregunta, consulte a su instructor.
Componente Función
Depósito de disolvente
Filtro del inyector de disolvente
Válvula de gradiente multicanal *
Válvula de inyección activa
Cabeza de la bomba
Válvula de bola de salida
Unidad de amortiguamiento
Válvula de purga
Válvula Rheodyne en muestreador
Dispositivo de medida
Loop de muestreo
Asiento de aguja
Capilar de asiento de aguja
Compartimento de las columnas
Lámpara del detector
Celda de flujo del detector
* Sólo sistema cuaternario
87
La ruta de flujo
Depósitos de disolvente, desgasificador de vacío y

bomba cuaternaria
Cabeza de botella
Depósitos
Cabina de disolventes
Desg. de vacío
Entrada
Salida
Clip de tubo
Válvula de purga
Unidad de
Cabeza de la bomba amortiguamiento
Adaptador de entrada

Tubo de residuos
Salida del capilar al inyector automático
MCGV
88
La ruta de flujo
Bomba binaria
Válvula de purga
Unidad de Válvula de bola de
Mezclador amortiguamiento salida
Cabeza de la bomba
89
La ruta de flujo
Muestreador
Aguja
Dispositivo de
medida
Capilar de
asiento de aguja
Válvula Rheodyne
Lámpara y celda de flujo del detector
Lámparas Celda de flujo
90
Mensajes de error e indicador de presión
Mensajes de error e indicador de presión

Cuando se produce un error (obstrucción, fallo de un componente, etc.) en uno de
los módulos de la Serie 1100, la herramienta de GUI (interfase gráfica de usuario)
de ese componente cambiará a rojo y la ventana Run Status (Estado del análisis)
mostrará un mensaje Not Ready (No preparado). La información acerca del error
aparece en el "bocadillo" mostrado encima de la herramienta de GUI. Para
obtener más información, abrir el historial (bajo View (Vista), Logbooks
(Historiales)). En este ejercicio se simulará una obstrucción de la ruta de flujo
reduciendo el límite de presión máximo para demostrar estas características.
Normalmente, la presión máxima de la mayoría de las columnas de sílice es de
400 bar. Aquí reduciremos este límite para que el instrumento "piense" que existe
una obstrucción. De esta manera se verá lo que ocurre cuando se obstruye la ruta
de flujo.
1) Mostrar la vista Method and Run Control de la sesión en línea. Seleccionar
el menú Instrument y, a continuación, Setup Pump.... Reducir el límite de
presión Max a 50 bar. Ajustar la velocidad de flujo a 1,00 ml/min.
Seleccionar OK para aceptar los datos mostrados en el panel.
2) En el menú Instrument, seleccionar System On. Al cabo de unos instantes,
se apagará el instrumento y aparecerá el error. Obsérvense los colores rojos
y la información presentada en el bocadillo.
3) En el menú View, seleccionar Logbook, Current Logbook. La entrada
superior fue la última entrada, en este caso el error. ¿Qué información
aparece?
4) Para obtener más detalles del error, hacer doble clic en la entrada del
historial. Aparecerá la ayuda en línea. Desplazarse por la lista de errores
hasta encontrar el error anterior. La ayuda en línea puede ser un buen punto
de partida para diagnosticar un error. Cerrar la ayuda y el historial.
5) Volver a ajustar la presión máxima, Max Pressure, a 400 bar para poder
continuar.
Siempre conviene familiarizarse con la lectura de presión normal para el

instrumento y el método. Algunos instrumentos HPLC utilizan psi en lugar de bar
como unidad de medida. Un bar equivale aproximadamente a 15 psi. Las
obstrucciones ocurren habitualmente en la frita del inyector de la columna y en el
capilar del muestreador (la primera restricción después de la inyección). Para
aprender a resolver problemas de obstrucción de alta presión se puede separar el
sistema en dos mitades. Tal vez desee tratar este tema con el instructor.
91
Detección de fugas
Detección de fugas
Cada módulo 1100 está equipado con un sensor de fugas. Este tipo de mecanismo
está instalado en la mayoría de los sistemas HPLC. Cuando un sensor de fugas
detecta una fuga de disolvente, aparece un mensaje de error y se para el sistema
de reparto de disolvente. Un sensor de fugas es simplemente una pequeña
resistencia montada en un depósito. Los módulos están diseñados para dirigir las
fugas de disolvente a uno de estos depósitos. A medida que se recoge disolvente
en el depósito, cambia la temperatura de la resistencia, desencadenando un error.
Cuando se activa un sensor de fugas, el indicador luminoso de error advierte al
usuario y se para el sistema. Para localizar la ubicación de la fuga se utilizaría el
historial (View/Logbook/System Log). A continuación se comprobaría el depósito
oportuno, se seguiría la pista del disolvente hasta el origen de la fuga y se
corregiría el problema. Utilizar una pipeta pasteur para eliminar el exceso de
disolvente del depósito y secar el sensor con un paño. El sensor de fugas debe
estar seco, ya que de lo contrario se producirá un error de fuga cada dos minutos
durante el funcionamiento de la bomba.
Localizar el sensor de fugas en cada uno de los módulos 1100.
92
Sistemas de reparto de disolvente

En esta parte del ejercicio de laboratorio aprenderá lo siguiente:
• Cómo cambiar los sellos de la bomba y limpiar y evaluar el estado de los
pistones.
Descripción general de los equipos y las herramientas utilizadas:
• Bomba Serie 1100, cuaternaria, isocrática o binaria

• Llave de 1/4 de pulgada
• Llave hexagonal de 4 mm
• Lubricante PTFE
A. Sustitución de los sellos de la bomba
Los sellos de la bomba deben cambiarse si se detectan fugas en los mismos. Las
fugas probablemente no sean visibles. La imposibilidad de alcanzar tiempos o
áreas de retención reproducibles puede indicar la existencia de fugas. Un test de
presión de la bomba también permitirá evaluar el estado de los sellos de la bomba.
La frecuencia de su sustitución dependerá de las fases móviles utilizadas. Si se
lava el sistema HPLC después de utilizar soluciones tampón se prolongará la vida
útil de los sellos y pistones. El número de referencia de los sellos es 5063-6589
(paquete de 2). El número de referencia de las arandelas de los sellos es 01018-
22706 (paquete de 10). Las arandelas de los sellos no son necesarias cuando se
utilizan los sellos enumerados anteriormente.
Nota: Conviene empezar a remojar los sellos nuevos en IPA mientras se trabaja con la
cabeza de la bomba. En este ejercicio no se remojarán, ya que no será necesario
sustituir los sellos antiguos a menos que lo indique el instructor.
1) Cerrar el flujo de la bomba, seleccionando Instrument/System Off. Si el

sistema está conectado a una ChemStation, cerrar la sesión ChemStation
para este instrumento.
2) Apagar la bomba (botón situado en la parte frontal de la bomba).
3) Retirar la cubierta frontal presionando hacia dentro los dos clips laterales de
la cubierta.
93
4) Para retirar la cabeza de la bomba, desconectar los cuatro capilares

conectados a la cabeza, desconectar el tubo de residuos de la válvula de
purga y desconectar el cable de la válvula de inyección activa. Observar las
guías del cable de la válvula de inyección activa.
5) Aflojar y extraer los dos tornillos de la cabeza de la bomba (mostrados a
continuación) utilizando una llave hexagonal de 4 mm.
Tornillos
Sujetar la cabeza de la bomba mientras se desliza suavemente hacia fuera. Ya se

puede desmontar la cabeza de la bomba.
94
Desmontaje de la cabeza de la bomba
1) Posar la cabeza de la bomba sobre una superficie plana. Aflojar el tornillo de

bloqueo (dos vueltas) y, mientras se sujeta la mitad inferior del conjunto,
tirar cuidadosamente de la cabeza de la bomba para alejarla del
compartimento de los émbolos.
Cabeza de
la bomba
Tornillo de
bloqueo
2) Retirar el guardasellos del compartimento de los émbolos y levantar el

compartimento para separarlo de los pistones.
Protector de
los sellos
Compartimento
de los émbolos
Pistón
95
3) Examinar los sellos (son de color negro) en el conjunto del compartimento

de los émbolos. No se deben retirar (a menos que lo indique el instructor), ya
que se dañarían. Leer los pasos 4 - 6 (pero no realizarlos) para aprender a
cambiar estos sellos cuando sea necesario.
4) Utilizar uno de los pistones para retirar cuidadosamente el sello. Si hay una
arandela, utilizar un palillo de dientes para retirarla. Si se utiliza el número
de referencia del sello indicado anteriormente, no se necesitarán arandelas.
Los sellos muestran ahora un desgaste significativamente menor que los
sellos anteriores.
5) Limpiar las cámaras de la bomba con un paño que no suelte pelusa.
Asegurarse de eliminar todas las partículas.
6) Introducir un sello nuevo en la cabeza de la bomba. No utilizar una arandela
si se dispone de sellos con el número de referencia correcto.
Sello
Arandela
96
Montaje de la cabeza de la bomba

1) Colocar los anillos de soporte en el compartimento de los émbolos (con los
émbolos no instalados) y acoplar la cabeza de la bomba y el compartimento
de los émbolos.
Cabeza de la bomba
Arandela de soporte
Compartimento
de los émbolos
2) Comprobar la superficie de los pistones y eliminar los posibles depósitos o

capas. Se pueden limpiar con alcohol o pasta de dientes. Cambiar los
pistones si están rayados verticalmente.
Superficie
del pistón
3) Introducir los pistones y presionar cuidadosamente sobre los mismos para

introducirlos en el sello.
97
Pistón
4) Apretar el tornillo de bloqueo.

5) Deslizar el conjunto de la cabeza de la bomba en el motor de medida.
Aplicar una pequeña cantidad de lubricante PTFE a los tornillos de fijación y
las bolas del motor del eje. Apretar los tornillos paso a paso, aumentando
paulatinamente el par de torsión.
6) Volver a conectar todos los capilares, los tubos y el cable de la válvula de

inyección activa a su conector. No apretar excesivamente las conexiones.
La regla para las conexiones Swagelock es apretarlas con la mano y, a
continuación, 1/4 de vuelta con la llave.
98
Ejercicio de laboratorio: muestreador y
detector
Ejercicio de laboratorio: muestreador y detector

Aprenderá algunos procedimientos habituales de mantenimiento del sistema de
HPLC. En estos procedimientos se utiliza el 1100. Las características mostradas
son comunes a numerosos fabricantes y modelos de sistemas de HPLC.
• Desmontará y localizará el sello del rotor.
• Cambiará una aguja del muestreador.
• Comprobará la calibración del detector.
• Retirará la lámpara del detector.
• Retirará la celda de flujo del detector.
• Cebará el sistema de HPLC.
• Realizará un test de fugas.
100
Materiales
Materiales
• Un sistema de HPLC Serie 1100 equipado con desgasificador de vacío,
muestreador, bomba y detector, preferiblemente de matriz de diodos
• ChemStation
• Llave de 1/4 de pulgada
• Llave hexagonal de 2,5 mm
• Llave hexagonal de 9/64 de pulgada
• Destornillador Pozidrive nº 1
101
Muestreador
Muestreador
Hay varias piezas del muestreador que podrán necesitar su atención durante la
vida útil del instrumento. Por ejemplo, podrán producirse fugas en un asiento de
aguja o en el dispositivo de medida. En el sello del rotor podría desarrollarse una
fuga a través de los puertos, o podría obstruirse la aguja. En esta sección se
familiarizará con el muestreador.
Conjunto de la aguja
La aguja se puede cambiar cuando esté obstruida, presente rebaba o esté
despuntada o doblada.
1) Asegurarse de que la cubierta frontal está instalada.
2) Ir a la vista Diagnosis de la ChemStation. En el menú Maintenance,
seleccionar ALS Maintenance Positions….
3) Bajo Change Needle, pulsar Start.
4) Retirar la cubierta frontal del muestreador.
5) Seleccionar el botón Needle Down hasta que el tornillo de la aguja quede
alineado con el orificio de la cubierta de seguridad.
6) Retirar la conexión del loop de muestreo de la conexión de la aguja.
102
Muestreador
Conexión
del loop de
muestreo
Conexión
de la aguja
7) Aflojar el tornillo de fijación y extraer la aguja.
8) Seleccionar Needle Down. Repetir la selección hasta que el brazo de la

aguja alcance su posición más baja.
9) Introducir la aguja nueva. Alinear la aguja en el asiento y apretar el tornillo
firmemente, procurando no estropear la conexión.
10) Volver a acoplar la conexión del loop de muestreo a la conexión de la aguja.
11) Utilizar el botón Needle Up para levantar la aguja hasta una posición 2 mm
aproximadamente por encima del asiento.
12) Asegurarse de que la aguja queda alineada con el asiento. Si es necesario,
doblar ligeramente la aguja hasta que quede alineada correctamente.
103
Muestreador
13) Instalar la cubierta frontal.

14) Seleccionar End en la función de mantenimiento, Change Needle.
Sello del rotor

Quizá sea necesario cambiar el sello del rotor si se observa que existen áreas
de inyección y alturas de pico irreproducibles:
1) Retirar la cubierta frontal del muestreador.
2) Retirar todas las conexiones de capilares de los puertos de la válvula de
inyección.
3) Aflojar cada perno de fijación dos vueltas a la vez. Extraer los pernos de la
cabeza.
104
Muestreador
4) Retirar la cabeza del estator, la parte delantera del estator y el anillo del
estator.
5) Retirar el sello del rotor (y el sello aislante, si es necesario).
6) Instalar un sello de rotor nuevo (en este caso, bastará con utilizar el mismo).
Asegurarse de que el muelle metálico que hay en el interior del sello aislante
queda orientado hacia el cuerpo de la válvula.
7) Instalar el anillo del estator. Asegurarse de que el compartimento queda al
ras contra el cuerpo de la válvula.
8) Colocar la parte delantera del estator en su posición en la cabeza del estator.
9) Instalar la cabeza del estator y la parte delantera del estator. Apretar los
pernos sucesivamente dos vueltas a la vez hasta que la cabeza del estator
quede asegurada.
105
Muestreador
10) Volver a conectar los capilares de la bomba a los puertos de la válvula.
Desde la bomba
A dispositivo de medida
Al compartimento de la columna
Tapón
Tubo de residuos en
el canal de fugas
A residuos Desde el asiento de la aguja
Compartimento de la columna
11) Deslizar el tubo de residuos en el soporte de residuos de la bandeja de fugas.

12) Instalar la cubierta frontal.
106
Cebado del sistema
Cebado del sistema

El sistema de reparto de disolvente debe cebarse a diario, cuando se añada un
disolvente nuevo, cuando la línea de base cromatográfica sea ruidosa o después de
realizar procedimientos de mantenimiento. En este caso se han llevado a cabo
algunos procedimientos de mantenimiento y es necesario cebar el sistema antes de
continuar.
El procedimiento es muy habitual y debería memorizarse.
1) Si el instrumento está equipado con un desgasificador de vacío, asegurarse
de que está encendido.
2) Comprobar que el tubo de salida está conectado desde la válvula de purga al
recipiente de residuos. Abrir la válvula de purga situada en el módulo de la
bomba haciendo girar el mando varias vueltas en sentido contrario a las
agujas del reloj.
3) Para cebar el sistema de reparto de disolvente, debe bombearse un 100% a 5
ml/min desde cada canal durante varios minutos. Para realizar esta tarea,
seleccionar las siguientes opciones de menú Instrument, Set up Pump...; o
bien hacer clic en el símbolo de configuración de la bomba en el diagrama
del sistema (mostrado a continuación) y, seguidamente, hacer clic en Set up
Pump....
Hacer clic aquí
107
Cebado del sistema
4) Introducir un flujo de 5,000 ml/min y un valor B% de 100. Hacer clic en OK

para aceptar los datos del panel.
5) Para encender el sistema de reparto de disolvente podrán utilizarse las
opciones de menú Instrument, More Pump, Control; o bien, acceder a la
herramienta mostrada en el diagrama siguiente. Hágalo ahora.
6) Esperar hasta que salga una corriente continua de disolvente por el tubo de
residuos de la válvula de purga.
7) Repetir los pasos 3 a 6 para los demás canales de la bomba.
8) Apagar la bomba y cerrar la válvula de purga. Ajustar la composición y
velocidad de flujo necesarias para la siguiente aplicación. En este caso: flujo
1,5 ml/min y %B 0.
108
Test de presión
Test de presión
El test de presión es una prueba incorporada muy rápida que permite demostrar la
hermeticidad de la presión del sistema. Utilizar este test cuando se sospeche que
existen problemas con fugas pequeñas, o después de realizar tareas de
mantenimiento de los componentes de la ruta de flujo (p. ej., sellos de la bomba,
sello de inyección), para comprobar la hermeticidad de la presión hasta 400 bar.
El test monitoriza el perfil de presión a medida que la bomba realiza una
secuencia de bombeo predefinida. El perfil de presión resultante proporciona
información acerca de la hermeticidad de la presión del sistema. El test se ejecuta
utilizando isopropanol (IPA) mientras se monitoriza el perfil de presión. También
se puede utilizar agua para realizar el test:
1) Abrir la vista Diagnosis.
2) Seleccionar Diagnosis, Tests.
3) Seleccionar la ficha Pump y, a continuación, Pressure Test.
4) Pulsar el botón Start.
5) Localizar la tuerca obturadora antes de iniciar el procedimiento.
6) Pulsar Start y seguir las instrucciones.
7) La presión no debería descender por debajo de 390 bar durante un periodo
de 3 minutos. Si desciende por debajo de 390 bar, el test resultará fallido y
se diagnosticará una fuga en la ruta del flujo.
109
Detectores
Detectores
La fuente de iluminación de matriz de diodos es una combinación de una lámpara
de descarga de deuterio para el rango de longitudes de onda de UV (ultravioleta) y
una lámpara de wolframio para el rango de longitudes de onda visible (VIS) y de
SWNIR (onda corta del infrarrojo cercano). La imagen del filamento de la
lámpara de wolframio se enfoca en la abertura de descarga de la lámpara de
deuterio mediante un diseño especial de lámpara con acceso posterior que permite
combinar ópticamente ambas fuentes luminosas y compartir un eje común con
respecto a la lente de la fuente. La lente de la fuente (acromática) forma un único
haz enfocado de luz a través de la celda de flujo. Cada espacio de celda y lámpara
están separados por una ventana de cuarzo que se puede limpiar o sustituir. En el
espectrógrafo, la luz se dispersa sobre la matriz de diodos mediante una red de
difracción holográfica. Esto permite un acceso simultáneo a toda la información
de longitudes de onda.
Lámpara de wolframio Lente de

acoplamiento Lámpara de
deuterio
Lente de la fuente
(acromática)
Lente de soporte Matriz
Filtro de
Lente de
óxido de
espectro
holmio
Celda de
flujo
Rendija
Red de
difracción
110
Sustitución de la lámpara
Sustitución de la lámpara
La lámpara del detector deberá sustituirse si el ruido o la deriva supera los límites
de la aplicación o si no se enciende la lámpara.
1) Presionar los botones de liberación y retirar la cubierta frontal para tener
acceso al área de la celda de flujo.
2) Desconectar la lámpara del conector y destornillarla.
3) Retirar la lámpara. No tocar la bombilla de cristal con los dedos.

4) Volver a colocar la lámpara en el módulo del instrumento. Fijar los tornillos
y volver a conectar la lámpara al conector.
111
Celda de flujo
Celda de flujo
En esta sección se retirará la celda de flujo con el fin de examinarla:
1) Presionar el botón de liberación y abrir la puerta de la celda de flujo.
2) Retirar la celda de flujo presionando sobre su soporte.

3) Examinar la etiqueta fijada a la celda de flujo, en la que figuran la longitud
de la ruta y la presión máxima.
4) Volver a instalar la celda de flujo en el compartimento de la celda.
5) Volver a instalar la cubierta frontal.
Nota: Después de retirar la celda de flujo debe realizarse un test de óxido de holmio. La
celda de flujo forma parte de la ruta óptica.
Consultar el manual del detector para obtener más detalles del mantenimiento de
la celda de flujo.
112
Comprobar la calibración
Test de óxido de holmio
El test de óxido de holmio utiliza tres absorbancias máximas características del
filtro de óxido de holmio incorporado para verificar la precisión de la longitud de
onda. Cuando se inicia el test, la rendija de 1 nm se desplaza automáticamente a la
trayectoria del haz luminoso. Para eliminar los efectos debidos a los disolventes
absorbentes, el test se debería realizar con agua en la celda de flujo.
Evaluación del test de óxido de holmio

El instrumento evalúa el test y los máximos medidos se muestran
automáticamente. El test resultará fallido si uno o más máximos quedan fuera de
los límites.
Test fallido
Causas probables:
• Disolvente absorbente o burbuja de aire en la celda de flujo.
• Calibración incorrecta.
• Celda de flujo sucia o contaminada.
• Celda de flujo situada incorrectamente.
• Componentes ópticos sucios o contaminados (lente acromática, ventanas).
Medidas recomendadas:
• Asegurarse de que la celda de flujo está llena de agua.
• Cambiar la posición de la celda de flujo.
• Recalibrar y repetir el test.
• Ejecutar el test de la celda. Si el test resulta fallido, cambiar las ventanas
de la celda de flujo.
• Limpiar los componentes ópticos con alcohol y un paño que no suelte
pelusa.
113
Realizar el test junto con el test de intensidad para verificar la calibración e

intensidad de la lámpara:
1) Abrir la vista Diagnosis.
2) Seleccionar Diagnosis, Tests.
3) Seleccionar la ficha Detector y, a continuación, DAD Holmium Test.
4) Pulsar el botón Start y seguir las instrucciones.
5) Realizar el test de intensidad del DAD (DAD Intensity Test). ¿Cómo se
comportó el instrumento?
114
HPLC práctica
HPLC práctica
Cómo instalar un sistema de HPLC para realizar una inyección de

muestra, incluidos los siguientes aspectos:
•Manipulación del disolvente

•Preparación de la fase móvil
•Cebado del HPLC
•Manipulación de la columna - Equilibrio
•Comprobación del rendimiento del sistema
Figura 69
En este módulo se describe cómo configurar un sistema de HPLC.
116
HPLC práctica
Manipulación de disolventes
Manipulación del disolvente
Características del disolvente (especificaciones):

• Pureza
• Viscosidad
• Índice de refracción
• Punto de ebullición
• Toxicidad
• Transparencia de UV/límite de UV
• Solubilidad
Figura 70
Una de las decisiones de análisis más críticas es la selección del disolvente.
Pureza
La pureza del disolvente es importante, ya que afecta a la sensibilidad del análisis
en su conjunto. Siempre deben utilizarse disolventes de gran pureza, como
disolventes de calidad HPLC o superior. Estos disolventes están filtrados
previamente y purificados para tener una absorbancia mínima en el espectro de
UV. Para análisis de HPLC/MS, los requisitos podrán ser incluso más exigentes.
Los disolventes de calidad de gradiente (cuando están disponibles) están
garantizados para no producir picos fantasmas durante un análisis de gradientes
con detección de UV. No hay que olvidarse de cambiar el agua o la fase móvil
acuosa a diario.
117
HPLC práctica
Viscosidad
Debe considerarse la viscosidad de la fase móvil utilizada. Las fases móviles de
menor viscosidad producen picos cromatográficos más estrechos. Por ejemplo, el
acetonitrilo es a menudo el disolvente preferido para la HPLC de fase inversa
porque no sólo tiene buenas características de retención, sino también una
viscosidad menor que el metanol o el isopropanol.
Índice de refracción
Este parámetro es importante si se utiliza un detector de índice de refracción. Para
conseguir límites de detección mejores, debe seleccionarse una fase móvil cuyo
índice de refracción sea muy diferente del de los componentes de la muestra.
Punto de ebullición
Es importante considerar el punto de ebullición si existe una preocupación por la
recuperación de la muestra, especialmente en la HPLC preparatoria. Un
disolvente con un punto de ebullición bajo será más fácil de eliminar de la
muestra.
Toxicidad
En la actualidad existe una preocupación generalizada por los riesgos de
seguridad e higiene asociados a los productos químicos utilizados en los
laboratorios. Hay disponibles MSDS que deberían consultarse en caso de duda
acerca de los riesgos de seguridad e higiene que plantean los productos químicos
utilizados en el laboratorio. Hay que tener presente que el tetrahidrofurano se
puede adquirir como fase móvil estabilizada o no estabilizada. La versión
estabilizada presentará una elevada absorbancia de UV a las longitudes de onda
de UV típicas utilizadas para la detección. La versión no estabilizada puede
plantear un peligro de explosión si se deja evaporar completamente. La versión no
estabilizada también se descompone rápidamente cuando no se almacena bajo
nitrógeno.
La miscibilidad y transparencia de los disolventes se describen en las páginas

siguientes.
118
HPLC práctica
Miscibilidad del disolvente
Nombre
Inmiscible
Ácido acético Miscible
Acetona
Acetonitrilo
Benceno
Alcohol butílico 2-Propanol es un
Tetracloruro de carbono
Cloroformo excelente disolvente
Ciclohexano
Ciclopentano intermedio
Dicloroetano
Diclorometano
Dimetilformamida
Dimetil sulfóxido
Dioxina
Etilacetato
Alcohol etílico
Dietileter
Heptano
Hexano
Alcohol de metilo
Metiletilcetona
I-Octano
Pentano
I-Alcohol propílico
Dipropileter
Tetracloroetano
Tetrahidrofurano
Tolueno
Tricloroeteno
Agua
Xileno
ic f o n o
no
A l E ti i n a )
C l ete o
D etí to
na
A c A ce co
io d o
c e il o
ic h e o
C ca o
C or o rbo
EK ho e no
D en n o
c o c e i lo
A g no
p i lic
o
t il o
c na
F 4l
D pr no
C eta
d e íl i c
C lo rm
l a
r o no
H er
l o no
oh e o
et M 2
TH 2C
C 2H r
M l de an
i
ie l i c
e t to
t
D óx i
ho et
ét
M l c o H pta
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im D C l
ho no
lc P t a n
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I- A
A
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M
D
Figura 71
No todos los disolventes utilizados habitualmente en la HPLC son miscibles. Si se

mezclan disolventes inmiscibles, podrán surgir problemas tales como líneas de
base inestables, presiones fluctuantes y alta presión. Si el analista no está seguro
de cuál fue el último sistema de disolventes utilizado en el sistema de HPLC,
debería lavar la ruta de flujo con isopropanol. Este disolvente es miscible con la
mayoría de los disolventes utilizados en la HPLC. Para cambiar de una separación
de fase normal a una separación de fase inversa, retirar la columna de fase normal,
sustituirla por un tubo capilar y lavar el cromatógrafo de líquidos con isopropanol.
A continuación, se podrá continuar con los disolventes de fase inversa y los
análisis.
119
HPLC práctica
Límite de UV del disolvente/Transparencia
Disolvente Límite de UV (nm)
Acetonitrilo 190
Agua 190
El límite de UV es la longitud de
Ciclohexano 195 onda en la que la absorbancia es
igual a 1, medida en una celda de
Hexano 200 1 cm con aire como referencia.
Metanol 210
Etanol 210
Éter dietílico 220
Diclorometano 220
Cloroformo 240
Tetracloruro de carbono 265
Tetrahidrofurano 280 (220)
Tolueno 285
Figura 72
Cuando se utilice un detector de UV, deberá procurarse no usar el disolvente por

debajo o cerca de su límite de UV, ya que de lo contrario se producirá un nivel de
ruido inaceptable, limitando la capacidad de detección. Por ejemplo, si se
monitorizase un compuesto a 220 nm, se seleccionaría acetonitrilo en lugar de
metanol, porque el límite de UV del acetonitrilo es inferior al del metanol, con lo
cual se obtendría un mayor rendimiento de detección. Deben tenerse en cuenta
otros factores para detectores diferentes. Por ejemplo, cuando se utilice un
espectrómetro de masas, deberá considerarse el peso molecular de la fase móvil y
de los aditivos.
120
HPLC práctica
Preparación de la fase móvil
Pasos principales:
• Medir el volumen apropiado de cada disolvente

• Mezclar los disolventes
• Añadir los tampones y los aditivos*
• Filtrar la fase móvil
• Desgasificar la fase móvil
Figura 73
La preparación de la fase móvil se puede dividir en los siguientes pasos

principales:
• Mezcla
• Filtrado
• Desgasificación
La mayoría de las fases móviles son una mezcla de, al menos, dos disolventes.
También pueden contener soluciones tampón y otros aditivos. Cuando se utilicen
soluciones tampón para análisis de gradientes, deberá asegurarse que las
soluciones tampón sean completamente solubles en toda la gama de
composiciones de la fase móvil para evitar obstrucciones catastróficas debidas a
la precipitación de la solución tampón.
121
HPLC práctica
Ejemplo:
Disolvente A: 50 mM de solución tampón acuosa de fosfato sódico, pH = 3,0, en
agua
Disolvente B: Metanol
El gradiente necesario en el método abarca desde 95% de A hasta 95% de B. Eso
significa que al final del gradiente la mezcla está formada por 5% de solución
tampón acuosa y 95% de metanol. Debe asegurarse que la proporción de solución
tampón acuosa no se precipite a esta concentración de disolvente orgánico. Para
ello, bastará con verter 5 ml de solución tampón acuosa en 95 ml de metanol y
observar si se produce una precipitación.
Mezcla
Medir cada parte de la fase móvil por separado y, a continuación, combinarlas.
Filtrado
Para proteger el sistema de HPLC y la columna de las partículas, el fabricante
recomienda filtrar las fases móviles antes de utilizarlas. Esta tarea se puede llevar
a cabo con simples dispositivos de filtración al vacío adquiridos a través de los
catálogos de suministros para sistemas de HPLC. Deben añadirse todas las
soluciones tampón y modificadores antes de la filtración. Se aplica un vacío para
hacer pasar el disolvente a través de un filtro. Los filtros deben manipularse con
pinzas y hay que asegurar que el aparato de filtración esté limpio en todo
momento. El nylon 66 es un buen filtro para fases móviles acuosas, mientras que
el PTFE es un excelente filtro para la mayoría de los disolventes orgánicos. Las
membranas inorgánicas son resistentes a una amplia gama de disolventes
utilizados en la HPLC. Debe tenerse presente que los filtros de Teflon no se
pueden utilizar con agua debido a las características no polares del material. El
tamaño de poro típico es de 4,5 micras.
122
HPLC práctica
Desgasificación
Después de mezclar los disolventes, deberán desgasificarse las fases móviles. El
agua y los alcoholes con menor peso molecular disuelven cantidades
relativamente grandes de aire. La eliminación de gases disueltos de la fase móvil
impide la formación de burbujas en la bomba (cavitación) y en el detector. El
oxígeno disuelto puede impedir la detección de fluorescencia, y por ello su
eliminación es especialmente importante para estos análisis. Hay varias maneras
muy utilizadas de eliminar los gases disueltos:
• Desgasificación al vacío - Es la mejor manera de eliminar los gases
disueltos de la fase móvil. La fase móvil se hace pasar a través de un
serpentín permeable al gas en una cámara de vacío en camino hacia la
bomba. Además de eliminar eficazmente los gases disueltos, otras
ventajas son la desgasificación en tiempo real y el menor coste (no se
necesita helio).
• Inyección de helio - El helio, cuya solubilidad es baja en las fases móviles
utilizadas habitualmente en la HPLC, se utiliza para eliminar otros gases
disueltos en la fase móvil, como el nitrógeno y el oxígeno.
• Ultrasonidos - El depósito de la fase móvil u otro recipiente se coloca en
un baño de ultrasonidos; 15 minutos/l.
La desgasificación al vacío y la inyección de helio en línea son más eficaces que
la desgasificación al vacío y por ultrasonidos fuera de línea.
Nota: No se recomienda hervir disolventes mezclados previamente, ya que el

componente más volátil se pierde con mayor rapidez. La composición cambiará de
manera imprevisible.
123
HPLC práctica
Cebado del sistema de HPLC

Muestreador
Mezclador
Bombas
Detector
Disolventes
Figura 74
Cuando un cromatógrafo de líquidos ha permanecido inactivo durante algún

tiempo, siempre existe la posibilidad de que el aire haya conseguido penetrar en la
ruta del flujo. Para cebar el cromatógrafo de líquidos, se bombea cada canal con la
composición al 100% y a una velocidad de flujo elevada hasta que se obtengan
una presión y un flujo constantes. La fase móvil expulsará por la fuerza el aire que
haya quedado atrapado. Si se ceba a diario, cuando se cambia la fase móvil o
después de realizar trabajos de mantenimiento, se obtendrán áreas de pico y
tiempos de retención más reproducibles.
124
HPLC práctica
Cebado del HPLC
Flujo
Válvula de
purga
Capilar de residuos
17
Figura 75
Con el sistema 1090, debe desconectarse el capilar que llega a la columna e

introducir el extremo del capilar en una cubeta antes de cebarlo. Con el 1050 y el
1100, se puede abrir la válvula de purga y dirigir el flujo hasta el depósito de
residuos. La mayoría de las columnas no toleran las elevadas velocidades de flujo
necesarias para el cebado.
125
HPLC práctica
Preparación de la muestra
Como mínimo - filtrar las muestras:
• Nylon - su naturaleza hidrófila funciona con muestras acuosas y

basadas en disolventes, se puede esterilizar en autoclave a 121 ºC,
margen de pH de 3 a 12, sin ácidos concentrados.
• PTFE (Politetrafluoroetileno) - una membrana hidrofóbica altamente
resistente a disolventes, ácidos y alcalinos. Este filtro se utiliza
normalmente para muestras no acuosas. El margen de pH es de 1 a 14.
• Acetato de celulosa - buen filtro para las muestras biológicas acuosas
con una retención de proteínas muy baja. El margen de pH es de 4 a 8.
• PVDF - altamente resistente a la mayoría de los disolventes, muestra
una aglutinación de proteínas baja. El margen de pH es de 2 a 12.
• Membranas de ultrafiltro - filtros de corte de peso molecular para
muestras biológicas.
• Nitrocelulosa - muestra una alta retención de proteínas.
• Extracción de la fase sólida.
18
Figura 76
Las muestras deben filtrarse antes de la inyección. Las partículas de la muestra

provocarán obstrucciones en los tubos capilares, especialmente en el punto de
inyección, y en la frita del inyector de la columna. Numerosos proveedores de
equipos de HPLC venden una variedad de filtros que dependen de la aplicación y
la fase móvil. La lista anterior puede servir de punto de partida. No se debe
olvidar que la extracción de la fase sólida puede resultar útil para la eliminación
de componentes de la muestra fuertemente retenidos, que podrían dañar la
columna analítica. La extracción de la fase sólida también se puede utilizar para el
aislamiento y la concentración de un determinado conjunto de componentes de la
muestra.
126
HPLC práctica
• Disolver la muestra en la fase móvil o en un disolvente más débil que la fase

móvil.
• El volumen de la muestra deberá mantenerse lo más pequeño posible.
Muestra en un disolvente más fuerte

Muestra en la fase móvil
19
Figura 77
Idealmente, la muestra debería disolverse en la fase móvil o en un disolvente más

débil que la fase móvil para obtener los mejores resultados cromatográficos. Si se
disuelve la muestra en un disolvente más fuerte que la fase móvil y se utiliza un
volumen de inyección grande, se ensancharán los picos cromatográficos y
comenzarán a presentar un aspecto de doblete. El volumen de muestra debería ser
lo más pequeño posible con el fin de evitar la pérdida de resolución causada por la
sobrecarga del volumen. Las limitaciones relativas al volumen de inyección están
relacionadas con el diámetro interno de la columna. Por ejemplo, una columna
con un diámetro interno de 2,1 mm debería tener volúmenes de inyección de 5 µl
o menos.
127
HPLC práctica
Manipulación de las columnas
Almacenamiento de
la columna
Evitar causar cualquier daño físico a la

columna
Cerrar ambos extremos para evitar que

se seque
Guardar la columna bien

enjuagada con el disolvente
adecuado
Registrar el historial de la columna

20
Figura 78
Las columnas del sistema de HPLC se pueden almacenar durante largos periodos
de tiempo en las condiciones adecuadas. Debe lavarse la columna con un
disolvente adecuado para eliminar las soluciones tampón y los aditivos. Antes de
almacenar la columna se debe llenar con un disolvente recomendado por el
fabricante. Las columnas de fase enlazada basadas en sílice normalmente se
almacenan en, al menos, un 10% de metanol. El almacenamiento en agua pura
puede provocar el desarrollo microbiano y causar daños a la columna. Debe
evitarse toda tensión física, como dejar caer o golpear las columnas.
128
HPLC práctica
Instalación de la columna
• Cada columna tiene una dirección de flujo definida.

• La dirección del flujo es la que indica la flecha, o la dirección del
texto escrito en la columna.
• No cambiar la dirección del flujo, ya que disminuirá el rendimiento de
la columna. Muestreador
Mezclador
Bombas
Detector
Disolventes
21
Figura 79
La columna de HPLC se puede instalar después de haber cebado completamente

el instrumento con los disolventes del análisis. Para instalar la columna, en primer
lugar se debe localizar la flecha que aparece en la misma, que indica la dirección
del flujo. Esta flecha indica la dirección en la que se rellenó la columna con fase
estacionaria. Si se invierte el flujo, podrá reducirse el rendimiento de la columna.
129
HPLC práctica
Instalación de la columna
CARTUCHO DE
PROTECCIÓN
CARTUCHO
Qué se necesita:
PIEZA DE APRIETE
Los conectores adecuados para Columna de protección para

evitar en el futuro cualquier fuga proteger la columna principal
Las herramientas
adecuadas
22
Figura 80
Hay disponibles numerosas conexiones diferentes. A primera vista, pueden

parecer similares. Es necesario que el tipo de conexión se corresponda con la
columna. Por ejemplo, una columna Zorbax utiliza conexiones Swagelock,
mientras que una columna Waters’ utiliza conexiones Waters’.
Si es posible, debería utilizarse un salva columna, cuya finalidad es resguardar la
columna analítica de los pulsos de presión, los componentes de la muestra
fuertemente retenidos y las partículas. Se puede adquirir una columna corta o un
cartucho que encaje en el interior del soporte de la columna analítica. Ambos
tipos de columnas tienen la misma fase estacionaria, el mismo diámetro interno y
el mismo tamaño de partícula que la columna analítica.
130
HPLC práctica
Instalación de la columna (continuación)
Consejos prácticos:
• Apretar con los dedos
• 1/4 de vuelta con una
llave
23
Figura 81
Introducir las conexiones en la columna con la mano y girar la conexión en el

sentido de las agujas del reloj hasta que quede apretada. Si se utilizan las manos,
podrá notarse cualquier rugosidad o problema en las conexiones. Para el ajuste
final, apretar la conexión ¼ de vuelta con la llave. Si se aprietan excesivamente,
se dañarán las conexiones.
131
HPLC práctica
Equilibrado de la columna
Equilibrar con fase móvil

• No presionar en exceso la columna.
• De 5 a 10 volúmenes de columna para equilibrado
de fase inversa.
• Garantiza resultados reproducibles.
24
Figura 82
Antes de iniciar un análisis, se debe equilibrar la columna con la fase móvil. Las
columnas de fase inversa que utilizan una fase móvil simple sin soluciones
tampón ni modificadores sólo necesitan 5 -10 volúmenes de columna para el
equilibrado. Algunas aplicaciones podrán tardar mucho más. Una columna que no
se haya equilibrado correctamente mostrará tiempos de retención irreproducibles.
La presión inestable y la deriva de la línea de base son otros síntomas de una
columna no equilibrada. Conviene aumentar gradualmente el flujo hasta la
columna al poner en marcha el sistema. El 1100 está programado para aumentar
progresivamente el flujo en la columna cuando se enciende. También se pueden
programar gradientes de flujo más lentos.
Ejemplo:
Una columna C18 de 100 x 4 mm con fase estacionaria porosa de 5 µm debería
equilibrarse de la manera indicada a continuación.
El volumen del tubo es 100 mm x 4 mm x 3,14 mm x 1 cm3/1.000 mm3 = 1,256 ml
El 70-80% de la columna está llena de líquido ~1 ml
Por tanto, a una velocidad de flujo de 1 ml/min se necesitarían 5 - 10 minutos
para equilibrar la columna.
Nota: Éste es sólo un simple ejemplo; el tiempo de equilibrado puede ser mucho mayor
para una columna de fase normal o una columna de intercambio iónico. Los tiempos de
retención reproducibles demuestran realmente si la columna está equilibrada.
132
HPLC práctica
Comprobación de la columna
• Las columnas nuevas deben incluir un certificado de

rendimiento.
• Cada uso adicional deberá documentarse, incluyendo:
– Retropresión
– Fase móvil
– Temperatura
– Tipo de muestra
– Condición de almacenamiento (disolvente)
En base a ese historial, la columna se puede comprobar

con una mezcla de compuesto definida.
25
Figura 83
Las columnas nuevas se entregan a menudo con un registro de su rendimiento. A
menudo, la prueba mostrará la presión de la columna en condiciones dadas. Los
analistas que realicen trabajos de cromatografía deberían tener a su disposición
una mezcla de prueba fiable para poder utilizarla cuando sea necesario distinguir
entre problemas del método y del instrumento o fallos de la columna. La inclusión
de un ácido y una base débiles puede permitir comprobar la acidez de las
columnas de fase inversa.
Ejemplo:
El dimetilftalato, dietilftalato, bifenilo y o-terfenilo en metanol están disponibles
con el número de producto 01080-68704. Estos cuatro compuestos se pueden
analizar con acetonitrilo o metanol/agua (65/35). Deberían obtenerse cuatro picos
bien separados.
Debe mantenerse un registro de los parámetros siguientes:
• Resolución de la pareja de picos crítica
• Rendimiento de los picos - colas y platos
• Volumen muerto de la columna
• Presión a la velocidad de flujo, temperatura y composición de fase móvil
específicas utilizadas
Todos los resultados deben registrarse y guardarse como un historial de la
columna. De esta manera, los posibles problemas que pueda experimentar la
columna quedarán de manifiesto en las primeras fases del desarrollo.
133
HPLC práctica
Cuidado y manipulación de la columna
• Lavar la columna después de usarla con disolventes

seleccionados; eliminar de la columna los componentes
de la muestra fuertemente retenidos.
• No guardar la columna en 100% de agua. Podrán
desarrollarse microbios y obstruir la columna.
• No abrir la columna y volver a empaquetar el material si se
desea mantener el rendimiento.
• Utilizar la columna a su velocidad de flujo óptima - evitar
velocidades de flujo elevadas.
• No utilizar sílice o fases enlazadas durante largos períodos a
una temperatura elevada.
• Mantener el pH de la fase móvil en un rango apropiado para
la columna.
26
Figura 84
Las prácticas correctas prolongarán la vida útil de la columna. Siempre se deben

filtrar los disolventes y las muestras para eliminar las partículas. Antes de la
inyección se deben eliminar los componentes de la muestra fuertemente retenidos
mediante la extracción de la fase sólida. La columna se debe almacenar bien
cerrada y con disolvente adecuado. Las columnas basadas en sílice sólo deberían
utilizarse en el margen de pH comprendido entre 2 y 8, y a temperaturas inferiores
a 80 ºC. Después de utilizar la columna, deberá lavarse para eliminar las
soluciones tampón y los aditivos. La columna se debe almacenar en una fase
móvil adecuada. Una buena práctica consiste en utilizar el disolvente que usó el
fabricante para enviar la columna.
• No se debe abrir la columna, ya que se perturbaría la fase estacionaria y se
reduciría la eficacia.
• Debe evitarse someter la columna a cualquier tensión, como pulsos de
presión o grandes cambios de pH.
• La columna debe utilizarse a velocidades de flujo óptimas.
• Deben evitarse las burbujas de aire y los disolventes sucios.
Consejo: El uso de una bomba de HPLC autónoma para limpiar columnas ahorra tiempo
y es más flexible.
134
HPLC práctica
Rendimiento del sistema
Comprobación del sistema - De forma rutinaria
Principio:
El sistema de HPLC (incluida la columna) se puede comprobar utilizando una
muestra de prueba y un método definido. Utilizar al menos tres réplicas.
Preparativos para la comprobación de un sistema:

• El sistema de HPLC se ceba con fase móvil.
• La columna se equilibra.
• El detector muestra una respuesta estable.
• No se producen fugas.
• El sistema está preparado para la inyección.
27
Figura 85
Antes de verificar el sistema, es necesario asegurarse de que:

• el sistema de HPLC está cebado
• la columna está instalada y equilibrada
• el detector está preparado y muestra una señal estable
• el horno de la columna está equilibrado a la temperatura de análisis
adecuada
El objetivo de una comprobación del sistema es verificar el rendimiento de
conjunto del sistema de HPLC en condiciones específicas (método).
Los pasos prácticos que deben realizarse son los siguientes.
• Realizar varios análisis utilizando una muestra de control o una mezcla de
prueba conocida, ≥ 3 inyecciones.
• Comparar los resultados con los criterios de aceptación previstos.
135
HPLC práctica
• Si los resultados se encuentran en el margen definido, el sistema estará

preparado para utilizarse.
Este proceso se utiliza en numerosos laboratorios de control de calidad.
Los criterios de rendimiento típicos son:

• Resolución de los picos seleccionados
• Respuesta cuantitativa de los picos seleccionados
• Tiempo de retención de los picos seleccionados
• Parámetros de rendimiento de los picos
• Simetría de los picos
• Platos teóricos
• Reproducibilidad del área o la altura de los picos
Estos parámetros reflejan el rendimiento del sistema.
136
HPLC práctica
Comprobación del sistema - De forma rutinaria

(continuación)
Requisitos de la muestra de prueba:

• La muestra está bien caracterizada.
• Se conoce la respuesta del detector.
• La muestra contiene varios componentes.
Diseño de la prueba:
La muestra de prueba se analiza utilizando un método de prueba definido.
Los resultados se comparan con los resultados esperados. Si los resultados
se encuentran en el rango definido, el sistema está listo para utilizarse.
Esto no es comparable con una prueba de OQ (cualificación operacional)
o de PV (verificación del rendimiento).
28
Figura 86
• OQ - Confirmación del funcionamiento

• PV - Verificación del rendimiento
137
HPLC práctica
Resumen
Resumen
Resumen
Preparar la fase móvil

Cebar el sistema de HPLC
Instalar la columna
Encender el detector (dejar que se caliente durante al menos 20 minutos para UV)
Equilibrar la columna
Preparar las muestras
Registrar la respuesta del detector - respuesta estable
Realizar una comprobación del sistema con una muestra de prueba y un método de
prueba
Comparar los resultados con las expectativas (límites)
Documentar los resultados (Gráfico de control)
Registrar cualquier fallo/error que pueda producirse
Si el sistema supera satisfactoriamente la
comprobación,
29
Figura 87
138
HPLC práctica
Repaso
Repaso
Repaso
1. Está realizando un análisis rutinario cuando se da cuenta de que

se produce una perturbación periódica en la línea de base. La
lectura de la presión fluctúa hacia arriba y hacia abajo. ¿Qué
ocurre? ¿Cómo lo corregiría?
30
Figura 88
139
HPLC práctica
Repaso
Repaso
2. Ha decidido realizar un análisis de fase inversa en un instrumento del

laboratorio. El operador anterior no indica los disolventes utilizados
por última vez en el instrumento. Pone agua en el canal A y enciende la
bomba. No puede conseguir una línea de base estable. Plantee cuál es
la causa posible de este problema.
31
Figura 89
140
Resolución cromatográfica y separación
• Qué factores influyen en la resolución entre los componentes

de las muestras.
• Cómo influyen en la resolución el factor de capacidad (factor
de retención), la selectividad y la eficacia.
• Cómo mejorar las separaciones.
Figura 90
142
Resolución
Resolución
La principal preocupación del cromatógrafo: la

resolución entre los picos cromatográficos
R = Resolución
tRB - tRA
R=2 tRA = Tiempo de
wA + wB
retención componente A
tRB - tRA
R = 1,176
tRB = Tiempo de
w1/2A + w1/2B
retención componente B
tRB
w = Ancho en la base
mAU
tRA w1/2=Ancho a mitad de

altura
to
tiempo
Figura 91
La principal preocupación del analista es la resolución entre los picos

cromatográficos importantes de la muestra. Otro objetivo del analista es realizar
esta tarea en un periodo de tiempo mínimo. En este módulo se describen los
parámetros que afectan a la resolución entre los picos cromatográficos de la
separación.
La resolución entre dos picos se puede cuantificar matemáticamente mediante
estas ecuaciones. La primera ecuación utiliza la anchura de los picos
cromatográficos en su base. Esta anchura se determina trazando tangentes a través
de cada lado del pico cromatográfico. La segunda ecuación utiliza la anchura del
pico cromatográfica a media altura. Este valor se puede obtener en la mayoría de
los sistemas de datos cromatográficos como parte de un informe de integración o
cuantificación.
Un valor de resolución de 1,5 entre dos picos cromatográficos con
aproximadamente la misma altura de pico se considera la resolución de la línea de
base.
143
Resolución
Valores de resolución
0,4 0,5
0,6 0,7
Para áreas de picos iguales, R de 1,5

ofrece la separación de la línea base.
0,8 1,00 1,25
Figura 92
Como se indicó anteriormente, un valor de resolución de 1,5 indica la resolución

de la línea de base. A una resolución de 1,25, cada pico tiene una pureza del
99,4% y la cuantificación se puede realizar con precisión.
Cualquier separación con valores de resolución de 1,5 o mayores se puede
cuantificar fácilmente utilizando la altura o el área del pico. ¿Debería
desarrollarse la separación con valores de resolución incluso mayores? Si se desea
un método muy resistente, serán adecuados valores de entre 1,7 y 2. Sin embargo,
debe recordarse que cuanto mayor sea la resolución, mayor será el tiempo de
separación. Como analista, tendrá que sopesar los pros y los contras del deseo de
obtener separaciones resistentes, por una parte, y el tiempo y los materiales, por
otra.
144
Resolución
Calcular la resolución entre el primer y el

segundo pico cromatográfico
DAD1 B, Sig=230,4 Ref=550,100 (DEMO\005-0102.D)
0.747
mAU
1.022
300
250
200
150
100
5.849
2.569
50
0
1 2 3 4 5 6 min
Respuesta_________
Figura 93
Utilizar la ecuación que aparece en la página anterior y en este informe para

calcular la resolución entre los dos primeros picos del cromatograma.
145
Ecuación fundamental de la resolución
Ecuación de resolución fundamental para

extracción isocrática
x x k'
R = 1/4 N -1
1 + k'
Ef icacia Selectividad Capacidad
1 : Número total de placas teóricas disponibles; eficacia de la columna
Nª Factor de capacidad (factor de retención), la función de retención

del pico
α: la separación relativa de los picos; la función de selectividad
Figura 94
Como usuario de un sistema de cromatografía, ¿cómo puede controlar la

resolución entre los picos cromatográficos? Tres factores controlan el grado de
resolución entre dos picos cromatográficos: eficacia, capacidad y selectividad. La
ecuación anterior expresa el papel que desempeña cada uno de estos componentes
a la hora de determinar la resolución entre las bandas.
146
Factores de resolución
Capacidad
Eficacia
Selectividad
7
Americas' Technical Center (Centro técnico de América)
Figura 95
El parámetro de capacidad o retención refleja la interacción de las moléculas de la

muestra con las fases estacionaria y móvil. El parámetro de selectividad describe
la capacidad del sistema cromatográfico para distinguir entre dos o más
compuestos. El parámetro final, la eficacia, tiene que ver con la anchura de los
picos en la separación. Evidentemente, los picos cromatográficos más anchos
necesitarán una selectividad de separación mayor que los picos estrechos para
conseguir una resolución adecuada.
147
Capacidad
Capacidad
Capacidad-Retención
x x k'
R = 1/4 N -1
1 + k'
tR2
● El factor de capacidad (factor de retención)es
característico de un compuesto específico en una
t R1
composición de fase móvil, a una temperatura y en un
tipo de columna determinados.
tO ● El factor de capacidad compensa los efectos de las
dimensiones de la columna y la velocidad de flujo.
● El factor de capacidad es igual al número de moles en
la fase estacionaria dividido por el número de moles en
Inyectar la fase móvil.
k' = t R - t O
tO
Figura 96
El factor de la capacidad es una medida de la retención de la molécula de la

muestra en la columna. Representa la relación entre el tiempo de elución del
componente de la muestra y el tiempo vacío de la columna. Las moléculas se
desplazan con la fase móvil a menos que actúen recíprocamente con la fase
estacionaria. Una molécula que careciese por completo de afinidad con la fase
estacionaria eluiría en un volumen de columna con el frente del disolvente de la
fase móvil y tendría un valor k’ de 0, tal y como se calcula a partir de la ecuación
mostrada anteriormente. Un valor k’ elevado indica que la muestra está altamente
retenida y ha pasado un tiempo considerable actuando recíprocamente con la fase
estacionaria. A medida que se aumenta el valor k’, se aumenta la resolución entre
los picos cromatográficos.
La principal manera de cambiar la interacción de los componentes de la muestra
con la fase estacionaria consiste en cambiar la composición de la fase móvil y, por
consiguiente, el valor k’.
El valor k’ tiene un uso cualitativo práctico en la HPLC. Este valor es más fiable
que el tiempo de retención a la hora de determinar la identidad de los picos
cromatográficos. El cálculo tiene en cuenta las variaciones de la velocidad de flujo
de la fase móvil de un análisis a otro, así como las dimensiones de la columna.
148
Capacidad
Efecto de la capacidad en la resolución
Los cambios
en k' tienen
el mayor
efecto
Los cambios en k'
k'
R tienen poco efecto en la 1 + k'
resolución Capacidad
Rango
ideal de k’
0 2 4 6 8 10 12 14 16
k’
La utilización de la retención para aumentar la resolución es más eficaz
cuando k’ se encuentra entre 0 y 5.
Figura 97
En el gráfico anterior se demuestra la relación entre el factor de capacidad y la

resolución, tal y como se describe en la ecuación de resolución. Debe observarse
que la ganancia más grande de resolución se consigue cuando el valor k’ está
comprendido entre 1 y 5. Por lo general, los valores k’ inferiores a 1 son poco
fiables, ya que los componentes de la muestra podrán estar eluyendo con otros
componentes de la muestra. Además, téngase presente que la resolución es cero
cuando la retención es cero.
En el gráfico se demuestra que, por encima de un valor k’ de aproximadamente 5,
el aumento de la retención sólo produce aumentos mínimos de la resolución.
Además, con demasiada retención se desperdicia el valioso tiempo de análisis, y
la altura del pico cromatográfico disminuirá a medida que aumente el ancho de
banda de los picos. Para mezclas de muestra complejas, el margen útil de valores
k’ se puede ampliar hasta 2 ≤ k’≤ 10. Si no se consigue la resolución deseada y
los valores k’ de los componentes de la muestra son superiores a 10, se descubrirá
que es más útil aumentar la selectividad o eficacia de la separación.
149
Capacidad
Capacidad - Composición de la fase móvil

Composición de disolvente más
débil
mAU
60% Acetonitrilo
40% Agua El único y más importante modo de cambiar la
capacidad de un pico cromatográfico es cambiar la
composición de la fase móvil:
2 4 6 8 10 ■ Cuando aumenta la fuerza de la fase móvil
Tiempo (min.) disminuye el factor de capacidad de las
sustancias de extracción.
Composición de disolvente más ■ En lo que respecta a la fase inversa, un
fuerte aumento del 10% orgánico disminuyó k' en
cada pico cromatográfico en un factor de 2 o 3.
80% Acetonitrilo
mAU
20% Agua
2 4 6 8 10
Tiempo (min.)
10
Figura 98
Debe recordarse que el método más eficaz para controlar la capacidad o retención
de las moléculas de la muestra es aumentar o reducir la fuerza del disolvente. El
ejemplo mostrado corresponde a la cromatografía de líquidos de fase inversa. La
fase estacionaria es C18, que es no polar. Cuando se aumenta la polaridad de la
fase móvil, las muestras se retienen con mayor fuerza y eluyen más tarde. Si se
reduce la polaridad de la fase móvil reduciendo el contenido de agua, las
moléculas de la muestra eluyen con mayor rapidez. De hecho, un aumento del
10% del contenido orgánico de la fase móvil reduce el valor k’ de cada
componente en un factor de 2 o 3. La composición de la fase móvil es la
herramienta de separación más potente.
150
Selectividad
Selectividad
Selectividad
x x k'
R = 1/4 N -1
1 + k'
α= 1,1 α=1,4 α=1,8
k’B
α=
k’A • Composición de la • Temperatura de la columna
fase móvil • Efectos químicos - Aditivos
• Fase móvil • Fase estacionaria
• pH de la fase móvil
11
Figura 99
La selectividad es la capacidad de la fase estacionaria para distinguir entre dos

componentes distintos de la muestra, y se calcula matemáticamente como la
relación de los factores de capacidad. Es una medida de la distancia entre el
máximo de dos picos cromatográficos que deben resolverse. Un valor de
selectividad de 1 implica que no hay separación entre los componentes de la
muestra. Cuanto mayor sea la separación, mayor será el valor de selectividad.
Puesto que la selectividad depende de las estructuras física y química de los
analitos, la fase móvil y la fase estacionaria, no es de extrañar que la composición
de la fase móvil, el pH, la temperatura de la columna, los aditivos de la fase móvil
y la fase estacionaria afecten a esta parte de la ecuación de resolución.
151
Selectividad
Parámetros que afectan a la selectividad
Cambio de composición Disolventes Disolventes

de la fase móvil más fuertes más débiles
IPA/Agua ACN/Agua MeOH/Agua
DISMINUCIÓN AUMENTO
No se
Cambio de la fase Se sobrecarga sobrecarga
estacionaria fácilmente fácilmente
C-18
C-2
Fase estacionaria Fase estacionaria

orgánica baja orgánica alta
12
Figura 100
Selectividad cromatográfica
Las distintas composiciones de la fase móvil provocarán en realidad un espaciado
diferente entre el máximo de los picos cromatográficos, incluso a las mismas
fuerzas de elución. Los cambios más significativos de la selectividad
probablemente puedan conseguirse cambiando la fase estacionaria. En el ejemplo
se muestran las diferencias de selectividad posibles entre una columna C-8 y una
columna C-18. Aunque ambas columnas son fundamentalmente un hidrocarburo
de cadena recta enlazado a la superficie del gel de sílice, normalmente será mayor
la selectividad con mayor contenido de carbono.
152
Selectividad
Resolución mejorada de ?-gliadina de proteína

de trigo por cambio en la fase enlazada
Condiciones: ZORBAX 300SB, 4,6 mm ID x 150mm; Gradiente lineal, 23 - 48% B en 60
min A= 0,1% TFA en agua; B= 0,1% TFA en acetonitrilo; Temp: 50°C; Flujo: 1 mL/min;
Det.: UV-210 nm
GRADIENTE: 23-48% ACN GRADIENTE: 25-43% ACN

Absorbancia, 210 nm, mv x 103
ω-gliadinas
ω-gliadinas
Tiempo (minutos) Tiempo (minutos)
Marchylo, B.A., D.W. Hatcher, J.E. Kruger, y J.J. Kirkland.

Cereal Chemists, Inc., 69 (1992) 371-378.
13
Figura 101
Éste es otro ejemplo de selectividad. En este caso, un grupo de proteínas omega-

gliadina está mejor separado de otras proteínas en 300SB-C8 que en 300SB-CN.
La manera más significativa de cambiar la selectividad consiste en cambiar la fase
estacionaria. Normalmente ocurrirá un cambio del espaciado entre bandas y del
orden de elución. En este caso, un grupo de proteínas omega-gliadina está mejor
separado de otras proteínas en 300SB-C8 que en 300SB-CN.
153
Selectividad
Cambio de columnas para cambiar la selectividad

ZORBAX 300SB-CN
Separación de 9 péptidos
utilizando condiciones de
gradientes optimizadas.
Condiciones:
ZORBAX 300SB-C18
2 µg cada péptido inyectado,
1 mL/min, 40°C, 0-36% B en
30 minutos; A 0,1% TFA/H2O,
B 0,1% TFA/ACN
Boyes, B.E., D.G. Walker,

Journal of Chromatography
A, 691 (1994) 337-347.
14
Figura 102
En este ejemplo se utiliza un cambio de la fase enlazada para mejorar la

selectividad. Se optimizaron los gradientes para cada fase utilizando análisis de
exploración iniciales. La columna de ciano muestra una serie de mejoras de
resolución, como una separación mejorada de L6/L7 e impurezas entre L1 y L2, y
después de L8. En conjunto, la mejor separación se obtuvo utilizando la columna
300SB-CN.
En este ejemplo se muestra la potencia que supone utilizar fases enlazadas de
cadena corta, a menudo infrautilizadas en el desarrollo de métodos.
Aquí se muestra la potencia que supone utilizar fases enlazadas de cadena corta, a
menudo infrautilizadas en el desarrollo de métodos. Estas fases de cadena corta
están infrautilizadas porque a menudo son inestables. La química StableBond
permite un uso agresivo de estas fases de cadena corta hasta los 60 °C.
154
Selectividad
Cambio de fase estacionaria
1. Met Encefalina
2. Leu Encefalina
3. Angiotensina II
4. Neurotensina
5. Insulina (BOV)
6. Cadena de insulina B
7. Citocromo C
8. Mioglobina
9. Calmodulina
10. Anihidrasa carbónica
Tiempo (min)
ZORBAX® 300 SB-CN, SB-C3, SB-C8, SB-C18
(4,6 x 150 mm, P/N:883995.905, 883995.909, 883995.906, 883995.902)
Fase móvil: 15-53% en 20 min.
A: 5:95 ACN:Agua con 0,10% TFA (v/v%) B: 95:5 ACN: Agua con 0,085% TFA (v/v%)
Inyección 10 (L, 2-6 (g proteina (en 6M guanidina HCI pH 7.0), 1,0 mL/min., 35º C, Detect. UV (215 nm)
Proporcionado de Loretta A. Sandoval
15
Figura 103
La HPLC de fase inversa sigue siendo la técnica de análisis preferida para el

análisis de proteínas y péptidos. La fase móvil para estas separaciones
normalmente contiene soluciones tampón acuosas con acetonitrilo y ácido
trifluoroacético. A menudo se consiguen cambios de selectividad entre muestras
mediante el uso de diferentes fases enlazadas.
155
Selectividad
Efecto del termostato de la columna en la

separación
40º C
AB
65º C
B
A
0 5 10
Tiempo en
minutos
16
Figura 104
La selectividad de la columna se puede modificar cambiando la temperatura de la

columna. Sin embargo, esta variable no produce los cambios dinámicos asociados
a los cambios de las fases móvil o estacionaria. Si se aumenta la temperatura del
horno de la columna, aumentará la eficacia y se reducirá el tiempo de retención de
los analitos. A veces, como en el ejemplo mostrado, el orden de elución de los
picos podrá cambiar como consecuencia de un cambio de temperatura. Esto puede
ocurrir cuando las moléculas de los analitos tienen una forma o tamaño molecular
diferente. Este fenómeno también puede ocurrir con analitos parcialmente
ionizados en la fase móvil del sistema de HPLC. El grado de ionización depende
de la temperatura.
Además de mejoras de separación, el uso de un horno de columna producirá una
mayor precisión del tiempo de retención.
156
Selectividad
Ajuste de la temperatura de la columna
Citocromo C
Insulina (BOV)
’
RNase
1/T (°K)
17
Figura 105
Una temperatura más elevada no siempre mejora la resolución. Esto se debe a que
cambia la selectividad, y la dirección (es decir, si los picos se acercan o se separan
los unos de los otros) de la selectividad no es previsible. Obsérvese que hay una
temperatura a la que no se pueden separar el citocromo C y la insulina, pero sí se
pueden separar por encima o por debajo de esa temperatura.
157
Selectividad
Uso de la temperatura para mejorar la resolución
35°C 10
Mejora de la 8 10
60º C
8 resolución
300 SB-CN
9 9
8 8 10
10
300 SB-C3 9
9
18
Figura 106
Este ejemplo también demuestra cómo mejorar la resolución de proteínas

utilizando una mayor temperatura. Debe observarse que se trata de fases de
cadena corta y, debido a la química StableBond, pueden utilizarse a 60 °C. La
eficacia de los picos cromatográficos aumenta al incrementar la temperatura hasta
cierto punto y, a continuación, se estabiliza e incluso desciende ligeramente.
158
Eficacia
Eficacia
Eficacia
x k'
R = 1/4 N x -1
1 + k'
Respuesta del
detector
Baja eficacia
Inyectar
Alta eficacia
Tiempo
19
Figura 107
A partir de los cromatogramas mostrados anteriormente, es fácil ver que la

anchura del pico cromatográfico, o dispersión, es un componente importante de la
resolución. En un sistema cromatográfico ideal, un pico cromatográfico
aparecería como una línea vertical en el cromatograma. En la realidad ocurre una
dispersión, provocando que el pico adopte una forma gausiana. La eficacia, N, o
número de platos, es una medida matemática del ensanchamiento del pico a
medida que pasa a través de la columna.
159
Eficacia
Cálculo de la eficacia
t 2 tR 2 hptR 2
N = 16 wR =5,54 W =2π
B 1/2 A
tR
HETP = L
N
N = Eficacia; Número de placa

HETP = Altura equivalente a una
W i/2 placa teórica
Inyectar
L = Longitud de columna
hp= Altura de pico
A= Área de pico
WB
Tiempo
20
Figura 108
La eficacia de la columna se denomina a menudo número de platos. Esta

caracterización se debe a Martin y Synge, quienes relacionaron los equilibrios de
analitos entre las fases estacionaria y móvil con una teoría de destilación
fraccional. Utilizando este proceso, la columna se divide en platos teóricos. Cada
placa es la distancia a lo largo de la cual los componentes de la muestra alcanzan
un equilibrio entre las fases estacionaria y móvil en la columna. Por consiguiente,
cuanto mayor sea el número de platos disponibles en una columna, mayor será el
número de equilibrios y mayor será la separación. Cuanto más pequeña sea la
altura equivalente a una placa teórica, HETP, mejor será la resolución.
Más arriba se muestran algunas de las ecuaciones utilizadas para calcular la
eficacia de una columna. Se obtienen a partir de la teoría de partición y de
estadísticas aleatorias. Un número de platos típico para una columna de 4,6 x 100
mm con partículas de 5 µm está comprendido entre 5.000 y 8.000 platos.
Naturalmente, cuanto mayor sea el número de platos, menor será la dispersión de
las bandas cromatográficas.
El número de platos teóricos se utiliza a menudo para establecer la eficacia de una
columna para un método dado. El desarrollador de métodos podrá decidir que un
determinado método ya no es válido cuando el número de platos desciende por
debajo de un valor predeterminado. En ese momento se sustituiría la columna por
una nueva.
160
Eficacia
Calcular la eficacia
DAD1 B, Sig=230,4 Ref=550,100 (DEMO\005-0102.D)
0.747
mAU
1.022
300
250
200
150
100
5.849
2.569
50
1 2 3 4 5 6 min
Respuesta____________
21
Figura 109
Calcular la eficacia del pico indicado por el cuadro. ¿Piensa que esta columna es
nueva?
161
Eficacia
Dispersión - Variación de flujo
Difusión de Flujo laminar

turbulencia
Ancho de
banda inicial
H
E A = Efectos de variación del flujo
T
P
0,33
Au
Velocidad lineal
Ancho de
banda final ■ Rellenar las columnas
cuidadosamente
■ Utilizar un rango
limitado de partículas
■ Utilizar un tamaño de
partículas pequeño
22
Figura 110
Varios factores contribuyen a producir dispersión cromatográfica y a reducir la

eficacia de la columna. Las variaciones de flujo contribuyen a crear dispersión. El
término de difusión de turbulencia es el resultado de la falta de homogeneidad de
las rutas de flujo y velocidades de flujo alrededor de las partículas de la fase
estacionaria. El flujo laminar provoca dispersión porque las moléculas que se
desplazan en el centro de un tubo lo hacen a mayor velocidad que las que se
desplazan en las paredes. En este caso, las paredes son los canales entre las
partículas. Para reducir la dispersión resultante de este término, las columnas
deben rellenarse cuidadosamente utilizando un tamaño de partícula y un margen
de tamaños de partícula pequeños. Se puede minimizar este término
seleccionando cuidadosamente el fabricante de la columna y el tamaño de
partícula.
162
Eficacia
Dispersión - Difusión longitudinal
■ Poco efecto en LC
■ Significativo en velocidades
bajas de flujo
H
E
T B
P u
Velocidad
lineal
23
Figura 111
Otro factor que contribuye a que se produzca dispersión es la difusión

longitudinal. Ésta es la difusión molecular normal en los solutos de la fase móvil.
Las moléculas de los analitos se desplazan de una zona de alta concentración a
otra de baja concentración. Se puede observar este fenómeno dejando caer una
gota de colorante de alimentos en un vaso de agua. En unos instantes, y sin
necesidad de agitar, se coloreará todo el volumen del vaso. Este término sólo es
significativo en la HPLC a velocidades lineales menores.
163
Eficacia
Dispersión - Transferencia de masa
■ C y D = Transferencia de masa entre fases

➨ Reducir el efecto con una velocidad de
flujo baja
➨ Reducir el efecto con partículas
pequeñas
H
E
T
P Fase móvil
Fase móvil
estancada
Velocidad
lineal Fase estacionaria
24
Figura 112
El término de transferencia de masas es significativo a velocidades lineales
mayores. Esta dispersión surge en gran medida debido al hecho de que las
moléculas de la muestra fluyen al interior de los poros de la fase estacionaria. Una
vez que penetran en los poros, deben salir de los mismos por difusión. Mientras
tanto, otras moléculas de la muestra que no penetraron en los poros se desplazan
en sentido descendente por la columna, alejándose de las moléculas que
penetraron en los poros. Este proceso crea un ensanchamiento de bandas, el
término C. La difusión molecular fuera de los poros es más rápida con disolventes
de menor viscosidad.
Otra consideración es el componente de transferencia de masas (D) relacionado
con las interacciones de las moléculas de la muestra o la difusión en la fase
estacionaria. La muestra actúa recíprocamente con la fase estacionaria y queda
inmovilizada temporalmente en la misma. La dispersión ocurre debido a la
variación de estos periodos de inmovilización.
Para reducir los efectos de los términos C y D, deben seleccionarse partículas
pequeñas de modo que la profundidad de los poros no sea excesiva. Se han ideado
otros materiales de relleno, como los rellenos peliculares, que tienen un núcleo no
poroso inerte. Estos materiales no han conseguido una gran aceptación debido a
que son partículas grandes con un área baja para la interacción. Las partículas
perfusivas tienen poros a través de los cuales pasa el flujo, y poros estancados
poco profundos. Estas columnas están consiguiendo mayor aceptación en trabajos
de LC/MS y en HPLC preparatoria.
164
Eficacia
Dispersión - Todas las contribuciones
La ecuación de VanDeemter mejorada
A = Difusión de turbulencia (Efecto de trayectos múltiples)

B = Difusión molecular aleatoria
C = Transferencia de masa dentro de las partículas causada
por la fase móvil
D = Transferencia de masa con fase estacionaria
HETP
+ Du
C.u
B B/u +
,33 +
u u0
H =A
Du
Cu +
Au0,33
Velocidad lineal
25
Figura 113
Los tres términos son aditivos y, cuando se combinan, producen una

representación gráfica como la mostrada más arriba. La ecuación mostrada se ha
depurado a partir de la representación VanDeemter original. La línea continua
indica la relación entre una altura equivalente a la placa teórica y la velocidad
lineal. En pocas palabras, este gráfico muestra que existe una velocidad de flujo
óptima para una columna analítica concreta en lo que respecta a la eficacia
indicada por la velocidad lineal en el punto más bajo del gráfico. La mayor
eficacia se encuentra allí donde la HETP tiene el valor más pequeño.
Normalmente se utiliza la columna a una velocidad lineal justo por encima del
punto más bajo de la curva.
Más adelante se describe la manera en que el tamaño de partícula de la fase
estacionaria afecta a este gráfico.
165
Velocidades de flujo
Velocidades de flujo típicas
mm i.d.(partículas de 5um) POPLQ
4.6 1-2
3.0 0.4-0.8
2.1 0.2-0.4
1.0 0.05-0.09
2
i.d.2 velocidad
velocidad de flujo2 = de flujo1
i.d.1
26
Figura 114
Las velocidades de flujo típicas se presentan en función del diámetro de la

columna. La velocidad de flujo es una variable experimental que sólo produce
cambios pequeños de la resolución y se utiliza para realizar ajustes de precisión
en el cromatograma.
166
Rendimiento mejorado con columnas

tradicionales utilizando velocidades de flujo
aumentadas
Zorbax SB-CN
mAU G
30 T F = 1,0
20 C A
10 6 min
0
LC: HP1090
Columnas: 4,6 x 150, 5 µM mAU
Flujo: 1,0 mL / min. 30
A: 0,1% TFA
B: 97,5% MeOH: 20 F = 1,5
2,5% H2O (0,1% TFA)
Temp.: 30°C
10 4 min
0
Detec.: 254 nm
mAU
20 F = 2,0
10
3 min
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 m in
01576S1.PPT
27
Figura 115
Actualmente, numerosos usuarios de cromatógrafos están interesados en

optimizar el tiempo de un análisis. Por lo tanto, pueden realizar análisis a
velocidades de flujo superiores a las aceptadas tradicionalmente. Las velocidades
de flujo más altas aumentan el rendimiento de la muestra. Esta técnica es útil
siempre y cuando no se supere la alta presión máxima y no se necesite resolución.
Hay que tener presente que velocidades de flujo superiores a 3 ml/min en
columnas con un diámetro interno de 4,6 mm pueden provocar el desvío de
partículas y reducir la vida útil de la columna.
167
Eficacia
Eficacia
Efecto de volúmenes externos a la columna
➤ Volumen de muestra
➤ Volumen del tubo de conexión
➤ Volumen del detector
➤ Constante de tiempo del detector
10 µl electrónico
2,1 x 150 mm
20 µl F = 0,2 mL / min.
Tiempo, min.
28
Figura 116
En el tema anterior se describió el ensanchamiento de bandas que ocurre en la
columna. Hay otros factores que pueden causar dispersión y que ocurren fuera de
la columna. Se denominan efectos externos a la columna. Un factor que
contribuye a causar dispersión externa a la columna es el tubo de conexión. En un
sistema de HPLC bien diseñado, esta dispersión es insignificante comparada con
el ensanchamiento de bandas que tiene lugar en el interior de la columna. Los
usuarios de cromatógrafos deben procurar no añadir longitudes adicionales de
tubo o tubos de gran diámetro al cromatógrafo de líquidos entre el muestreador y
el detector. Un sistema de HPLC con baja dispersión utilizará tubos con un
diámetro interno de 0,12 mm. Además, hay que asegurar que el volumen de la
celda de flujo del detector sea pequeño. También debe procurarse que las
conexiones de HPLC se correspondan con la columna. Cualquier cavidad en la
ruta de flujo provocará el ensanchamiento de los picos. Asimismo, debe
procurarse ajustar constantes de tiempo adecuadas en los detectores.
Si el volumen externo a la columna es excesivo, se perderá resolución al
disminuir el término N de la ecuación fundamental de la resolución,
esencialmente con la pérdida de platos. Aquí, un cambio de tan sólo 10
microlitros de volumen externo a la columna provoca una pérdida de resolución
entre los dos primeros picos.
168
Longitud de la columna
Ajustar la longitud de la columna a la resolución

deseada
SB-C18
4,6 x 15 mm los 7 componentes se descomponen en menos de 1 min
Condiciones: LC: 1100

Columnas: Zorbax SB-C18, 3,5 µm
Fase móvil: 1 mM octano ácido sulfónico, Na sal, pH 2,5: ACN (80:20)
4,6 x 30 mm UV: 275 nm; Flujo: 2,0 mL / min.; 70°C
Vol. de inyección: 1 µl
Absorbancia
Muestra: 4. Acetanilida
1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol) 5. Aspirina (ácido acetilsalicílico)
2. Cafeína 6. Ácido salicílico
4,6 x 50 mm 3. 2-Acetoamidofenol 7. Fenacetina (acetofenetidina)
4,6 x 75 mm
1 2
4,6 x 150 mm 3 4
5 6 7
0 1 2 3 4 5 6 7 8 m in
29
Figura 117
Como se ha visto en la ecuación de resolución, el aumento de la longitud de la

columna puede proporcionar más resolución debido al incremento de la eficacia
de la columna. Para agilizar los análisis, hay que recordar que puede utilizarse una
columna más corta para reducir el tiempo de análisis si se dispone de un exceso
de resolución.
169
Simetría
Simetría
Simetría de picos
S = B/A
A B
10% de la altura de pico
Excelente Admisible Inadmisible Pésimo

S = 1,0 - 1,05 S = 1,2 S=2 S=4
30
Figura 118
Idealmente, los picos cromatográficos deberían ser gausianos o simétricos. Sin

embargo, frecuentemente, y debido a los efectos externos a la columna, a la
adsorción de la muestra en la fase estacionaria o a las irregularidades de la base de
la columna, los picos cromatográficos presentan colas. Para medir
matemáticamente el grado de formación de colas, se puede aplicar la ecuación de
simetría de picos. La ecuación mostrada anteriormente es una de varias utilizadas
para este análisis. Al igual que ocurre con la eficacia, el validador de un método
podría decidir que un análisis cromatográfico no es válido cuando los valores de
simetría superan un determinado punto. En términos generales, un pico con un
valor de simetría de 3 o superior se considera poco fiable para fines de integración
y cuantificación.
170
Resolución
Resolución
Aumento de la resolución
Aumentar k'
Aumentar la
Aumentar la eficacia selectividad
31
Figura 119
Resumiendo, los tres factores que influyen en la resolución entre picos

cromatográficos son la capacidad, la eficacia y la selectividad. Al mejorar la
eficacia, N, se obtienen picos más agudos. La longitud, el tipo y el tamaño de
partícula de la columna controlan esencialmente este factor. La mejora de la
capacidad, k’, significa trasladar picos a tiempos de retención más largos o más
cortos. La fase móvil y la temperatura controlan esencialmente este factor. La
mejora de la selectividad, α, significa acercar o alejar los picos. Este factor se
controla principalmente mediante la fase enlazada, la fase móvil y la temperatura.
171
Hojas de trabajo
Hojas de trabajo
Ejercicio
Describir qué componente de

la ecuación de la resolución
se ha cambiado en cada caso: Inicial
N, k’ o ?.
Variación
En cada uno de los casos, ?
¿qué parámetro cambiaría (es
decir, composición de fase
móvil) para mejorar la Aumento
?
separación inicial?
Aumento
?
t0 t
32
Figura 120
Responda a las dos preguntas anteriores utilizando el diagrama de la derecha.
A partir de una separación inicial, al mejorar N se obtienen picos más agudos, con
el mismo tiempo de retención; se controla principalmente mediante la longitud de
la columna y el tamaño de partícula. La mejora de k* significa trasladar picos a
tiempos de retención más largos o más cortos; se controla principalmente
mediante la fase móvil y la temperatura; en la figura se muestra una pareja de
bandas con menos retención o más retención cambiando el % de componentes
orgánicos en la fase móvil. La mejora de α* significa mejorar la selectividad,
acercando o alejando los picos; se controla principalmente mediante la fase
enlazada, y también la fase móvil y la temperatura.
172
Hojas de trabajo
Ejercicio
mAU
0
tiempo
El análisis se realizó en una columna C-8 de 100 x 4,6 mm con un d.i. de 10

um. La velocidad de flujo fue de 2 ml/min con 70/30 de alcohol IPA/agua.
Enumerar las maneras de mejorar la separación.
33
Figura 121
Responda a la pregunta anterior.
173
Hojas de trabajo
Ejercicio
1. Enumerar tres modos de aumentar la retención del componente de una

muestra.
2. Enumerar cuatro modos de disminuir el ancho de banda de los picos

cromatográficos.
3. ¿Cuáles de estos parámetros afectan a la eficacia de una columna?

– Fuerza de extracción
– Viscosidad de la fase móvil
– Tamaño de partículas de la fase estacionaria
– Longitud de columna
– Temperatura de la columna
– Volumen externo a la columna
34
Figura 122
Responda a las preguntas anteriores:
1.
2.
3.
174
Ejercicio de laboratorio: parámetros del
sistema HPLC
Ejercicio de laboratorio: parámetros del sistema HPLC

• Examinará la relación entre la resolución y la composición de la fase
móvil.
• Determinará cómo se ven afectados sus análisis por la velocidad de flujo
en columna.
• Utilizará la temperatura de la columna para cambiar la separación.
• Medirá la simetría de los picos.
176
Materiales
Materiales
• 1 columna SB-C18 de 4,6 x 150 mm, 3,5 micras, número de referencia
863953-902.
• Mezcla de prueba, número de referencia 01080-68704, con marcador de
volumen muerto añadido.
• Agua de calidad HPLC en el canal A y acetonitrilo de calidad HPLC en el
canal B.
• Un sistema 1100 con todos los módulos encendidos.
• Una ChemStation HPLC, equipada con un módulo espectral.
177
Composición de la fase móvil

En esta sección del ejercicio de laboratorio se determinará cómo influye la
composición de la fase móvil en la separación.
1) Colocar el vial de la muestra utilizada en este experimento en la posición 10
del muestreador.
2) Cebar el sistema de reparto de disolvente. Si se necesitan instrucciones,
véase el ejercicio de laboratorio de instrumentación.
3) Examinar la columna y registrar las siguientes características de la columna:
Fase estacionaria de la columna
Diámetro interior de la columna
La columna instalada es una columna HPLC de fase inversa con partículas de 3,5
micras.
4) Abrir la vista Method and Run Control de la ChemStation.

5) Ir al menú Method y seleccionar Load Method.
6) Cargar el método por defecto, def_lc.m, como punto de partida para la
creación del método, y seleccionar OK.
7) En el menú Method, seleccionar Edit Entire Method. Seleccionar
únicamente las secciones Instrument/Acquisition, Data Analysis y Run Time
Checklist para editarlas. Seleccionar OK para aceptar los datos mostrados en
esta ventana.
8) Introducir los parámetros del sistema de reparto de disolvente de la manera
mostrada a continuación:
178
Seleccionar OK para aceptar los datos mostrados en la ventana.
Empezaremos en primer lugar con la composición más fuerte de la fase móvil,

90% de acetonitrilo.
¿Qué piensa que puede ocurrir?
9) Se realizará una inyección estándar de 2,0 µl. Seleccionar OK en la ventana

Setup Injector.
10) Ajustar la temperatura del compartimento de las columnas a 40 °C.
Seleccionar OK para aceptar los datos mostrados en la ventana.
11) Cumplimentar los datos de la pantalla DAD Signals de la manera mostrada a
continuación; seleccionar OK para aceptar los datos mostrados en el panel.
Nota: Si se está utilizando un VWD, seleccionar una longitud de onda de 260 nm.
179
12) En la ventana Signal Details, seleccionar longitud de onda, 260,20;360,100 y

Add to Method. Seleccionar OK para aceptar los datos mostrados en la
ventana.
13) Seleccionar OK para aceptar los parámetros de integración por defecto.
14) Seleccionar las siguientes instrucciones para el informe y hacer clic en OK
para aceptar los datos mostrados en la ventana.
180
15) Hacer clic en OK para aceptar los datos del cuadro de diálogo Set Range
Limits.
16) En Run Time Checklist, seleccionar Data Acquisition y Standard Data
Analysis. Guardar una copia del método con el fichero de datos.
17) En el menú Method, seleccionar Save Method As…. Asignar al método el
nombre mobile.m.
18) En el menú Instrument, seleccionar System On. Dejar que se equilibre la
columna y se caliente el detector durante varios minutos.
19) En el menú View, seleccionar Online Signals, Signal Window 1. Cuando
aparezca la ventana Online Signals, seleccionar Change.
20) Introducir un rango de 20 minutos para el eje X. Seleccionar la casilla Draw
Zero Line.
181
21) Hacer clic en una de las señales disponibles y, a continuación, en la casilla

Add to the Selected Signals.
22) Ajustar el rango del eje Y a 100 mAU y la compensación a 10%. Seleccionar
OK para aceptar los datos mostrados en la ventana.
23) Cuando la línea de base y la presión sean constantes, desplegar el menú
RunControl y seleccionar Sample Info….
24) Introducir el nombre del operador, el nombre del fichero (100.d), el
subdirectorio (su nombre), el número de vial (10), el nombre de la muestra
(test mix) y cualquier información de comentario.
25) Seleccionar OK para aceptar los datos mostrados en la ventana.
26) Registrar la presión en la tabla que aparece debajo de Mobile Phase
Composition Analysis.
27) Iniciar el análisis desde la herramienta Start o desde el menú RunControl,
seleccionando a continuación Run Method.
28) Cuando se hayan eluido los picos, detener el análisis. El informe se
imprimirá automáticamente.
29) Retirar el informe de la impresora para evaluarlo más adelante.
Más datos de la composición de la fase móvil

1) En el menú Instrument, seleccionar la opción Setup Pump.
2) Cambiar la composición de la fase móvil a 80% B.
3) Volver a calibrar la columna. Registrar la presión.
4) En el menú RunControl, seleccionar Sample Info…. Asignar un nombre
nuevo al fichero de datos (80.d).
5) Volver a inyectar la muestra y obtener el informe.
6) Repetir con una inyección a 60% B.
7) Responder a las preguntas de la página siguiente.
182
Análisis de la composición de la fase móvil

Rellenar la tabla siguiente con la información que figura en los informes
impresos. to es el primer pico.
Presión Anchura Anchura

Resultados Área
de la t0 t3 t4 1/2 1/2
de los datos Pico 4
columna Pico 3 Pico 4
90% B
80% B
60% B
Resultados k’ k’ Selectividad Eficacia Resolución

de los datos Pico 3 Pico 4 α N Picos 3, 4
90% B
80% B
60% B
1) Describir cómo cambia la presión en la columna con las composiciones de

fase móvil utilizadas.
2) ¿Qué ocurre con la resolución a medida que se reduce el %orgánico y se

aumenta el contenido de agua?
183
3) Representar gráficamente los resultados para cada compuesto.
Resolución
0 10 20 40 50 60 70 80 90 100
30
%B
4) ¿Cuál es la relación entre la resolución y %B?
184
Velocidad de flujo
Velocidad de flujo
1) A continuación se inyectará la muestra en condiciones diferentes de
velocidad de flujo. Empezar con los parámetros siguientes:
Velocidad de flujo: 2 ml/min

%B 65%
No modificar los demás parámetros del análisis.
2) Realizar el análisis y recoger el informe.
3) Realizar análisis a 0,2, 0,6, 1,0 y 2,5 ml/min.
185
Análisis de datos
Análisis de datos
Rellenar las tablas siguientes y responder a las preguntas.
Presión Anchura Anchura
Resultados Área
de la t0 t3 t4 1/2 1/2
de los datos Pico 4
columna Pico 3 Pico 4
0,2
ml/min
0,6
ml/min
1,0
ml/min
2,5
ml/min

0,2
ml/min
0,6
ml/min
1,0
ml/min
2,5
ml/min
1) ¿Cambian las cuentas de área al cambiar la velocidad de flujo? ¿Qué

significa esto si el mantenimiento del sistema de bombeo es deficiente?
186
Análisis de datos
2) Representar gráficamente lo siguiente utilizando los datos obtenidos.
0 0,4 0,8 1,0 1,4 1,8 2,0 2,4
Velocidad de flujo (ml/min)
3) ¿Qué velocidad de flujo proporcionaría la mayor eficacia?
4) ¿Cuánta eficacia se pierde a velocidades de flujo más elevadas?
187
Temperatura del horno de la columna
Temperatura del horno de la columna

1) A continuación se inyectará la muestra utilizando diferentes temperaturas de
columna. Empezar con los parámetros siguientes:

%B: 65%
Temperatura: 40 °C
2) No modificar los demás parámetros de análisis.
3) Ya se ha inyectado la muestra en estas condiciones. Si se encuentran los
datos, introducir la información solicitada en la tabla. De lo contrario, volver
a inyectar la muestra y recoger el informe.
4) Realizar asimismo análisis a 60 °C y 70 °C. El horno de la columna podrá
tardar algún tiempo en alcanzar estas temperaturas. Una vez que haya
finalizado el último análisis, asegurarse de volver a ajustar la temperatura del
horno a 40 °C.
188
Análisis de los datos de temperatura

Rellenar los datos solicitados a continuación:
Resultados Presión Anchura Anchura

Área
de los de la t0 t3 t4 1/2 1/2
datos columna Pico 4
Pico 3 Pico 4
40 °C
60 °C
70 °C

40 °C
60 °C
70 °C
1) ¿Qué ocurrió con la eficacia a medida que aumentó la temperatura de la

columna?
2) ¿Qué ocurrió con la resolución a medida que aumentó la temperatura de la

columna?
189
3) Representar gráficamente el valor logarítmico de k’ en función de la

temperatura del horno de la columna para los dos componentes de la
muestra.
Log k’
40 60 80
Temperatura (°C)
4) ¿Son las mismas las pendientes de las líneas que representó gráficamente?
¿Qué le dice esto?
190
Resolución de problemas habituales
• Resolución básica de problemas del sistema de reparto de

disolvente, el sistema de inyección y el hardware del sistema
de detección.
• Cómo resolver problemas del rendimiento de la línea de base.
• Problemas habituales de las columnas.
• Causas de los problemas de rendimiento de la forma de picos.
Figura 123
192
Mantenimiento de registros
El cromatograma estándar
Pruebas para columnas de HPLC

Realizar y registrar lo siguiente en condiciones
isocráticas cuando se adquiera una
columna nueva:
Registro:
Análisis llevados a cabo • Registrar las placas teóricas, N, junto con:
Fechas de servicio – La longitud y el diámetro interno de la
El historial columna
– Compuesto de la muestra y valor k'
Fecha Servicio de historial
– Fase móvil y estacionaria
11/2/94 comprobación de válvulas – Velocidad de flujo de la fase móvil
12/1/94 sellos de la bomba – Muestra y tamaño
12/4/94 nueva columna – Temperatura
• Simetría de picos.
• Incluir, fenol y amina } para las pruebas
con ácidos y bases.
• Registro:
– Presión de la columna
– Análisis llevados a cabo
– Fechas de servicio
Figura 124
Debería llevarse un registro del mantenimiento del instrumento de HPLC con el

fin de facilitar las reparaciones y las tareas de mantenimiento. Con este registro
podrá pronosticarse con fiabilidad la necesidad de tareas de mantenimiento
preventivo tales como la sustitución de los sellos de la bomba o la válvula de bola.
Los analistas que realicen trabajos de cromatografía deberían tener a su
disposición una mezcla de prueba fiable para poder utilizarla cuando sea
necesario distinguir entre problemas del método y fallos del instrumento. La
inclusión de un ácido y una base débiles puede permitir la comprobación de la
acidez de columnas de fase inversa.
193
Cuidado del instrumento
Cuidado del instrumento
Cuidado adecuado de la HPLC para evitar

problemas
Margen de pH
■ Margen de pH del instrumento 2,3 - 9,5

■ Margen de pH ampliado 2,3 - 12,5
Corrosivos, atacan al acero

inoxidable
■ Ácido clorhídrico
■ Ácidos inorgánicos y ácidos fuertes
■ Haluros alcalinos (cloruro de sodio, ioduro de litio)
■ Tetracloruro de carbono con 2-propanol o THF
■ Agentes complejantes (EDTA, ácido cítrico, ácido acético)
Atacan al cuarzo y al vespel

■ Soluciones alcalinas, pH>11
Si se utilizan las sustancias detalladas anteriormente, el sistema de HPLC precisará un mantenimiento

más frecuente. Si se utilizan, la bomba y otras piezas del sistema de HPLC deberán enjuagarse a fondo
cuando se hayan finalizado los análisis.
Figura 125
Los fabricantes de instrumentos de HPLC especificarán el margen de pH

permisible para la fase móvil utilizada en sus instrumentos. Los márgenes
indicados aquí corresponden a la instrumentación. Debería adquirirse el kit de
margen de pH ampliado cuando se necesiten valores de pH básicos. El uso de los
aditivos de fase móvil enumerados hará necesario un mantenimiento más
frecuente. Cuando se utilicen aditivos como éstos o soluciones tampón en el
sistema de HPLC, será necesario lavar la ruta de flujo antes de apagar el
instrumento.
194
Tiempo de retención y área
Tiempo de retención y área
Tiempo de retención y reproducibilidad del área
Causas posibles de los problemas

relacionados con el tiempo de
retención: Precisión del tiempo de
retención del pico:
– Cambio de la composición ⇒ con horno: < 0,3%
de la fase móvil
– Problemas del sistema de ⇒ sin horno: < 0,7%
reparto de disolvente Precisión del área del pico: < 1,5%
– Problemas de equilibrado de
la columna
– Problemas de la columna
– Temperatura del horno de la
columna Posibles causas de los problemas
relacionados con el área:
– Problemas del muestreador

– Problemas del flujo de la bomba
– Problemas de equilibrado del detector
Figura 126
Una buena manera de evaluar el rendimiento de la bomba del instrumento

consiste en monitorizar el tiempo de retención y la precisión del área de los picos.
En esta figura se muestran desviaciones estándar relativas típicas para el sistema
1090. Si un análisis conocido parece presentar desviaciones mayores de lo
normal, podrá ser necesario realizar tareas de mantenimiento de la bomba.
195
Resolución de problemas del instrumento
Problemas habituales de la bomba
• Retención de aire
– Desgasificar la fase móvil
– Cebar la bomba
• Válvulas
• Sellos
• Pistones
• Fugas
Figura 127
Los problemas relacionados con la bomba experimentados con mayor frecuencia

tienen que ver con perturbaciones de la línea de base que pueden atribuirse a la
existencia de aire en la propia bomba. Este tipo de problema se resuelve
rápidamente desgasificando la fase móvil y volviendo a cebar la bomba. Otros
problemas que puede experimentar la bomba son fugas en los sellos de la bomba
de medida, pistones rayados, válvulas de bola dañadas y obstrucciones de los
filtros en línea.
196
Válvula de inyección manual
Válvulas del muestreador manual - Loop fijo de seis puertos
Carga
Inyectar
Jeringa
• Problemas habituales de la
muestra
• Tipo o tamaño de jeringa
A residuos
inadecuado
• Bloqueo de la válvula
• Fugas en el puerto de inyección
• Transporte de muestras
• Fugas a través de los puertos A la
columna
A la
Loop de columna
Desde la muestreo
bomba (volumen fijo)
Figura 128
Los usuarios de válvulas de inyección manual pueden experimentar varios

problemas habituales. Las obstrucciones son frecuentes a menos que el operador
aclare cuidadosamente el loop de muestreo después de utilizarlo. Podrán
acumularse restos de muestra a menos que se lave el loop de muestreo entre
inyecciones. Es necesario inyectar en la válvula manual cinco veces el volumen
del loop de muestreo con el fin de evitar gradientes de concentración en la
muestra. Con el paso del tiempo, en el sello del rotor de la válvula de inyección se
producirán fugas a través de los puertos. Cuando esto ocurra, los volúmenes de
inyección, y por tanto el área y la altura de los picos, no serán uniformes. Llegado
ese momento será necesario cambiar el sello del rotor. Las jeringas de
cromatografía de gases (punta afilada) no se deben utilizar para realizar
inyecciones de cromatografía de líquidos, ya que rayarán el sello del rotor.
197
Problemas: Mantenimiento:
Muestra Reactivo
■ Relacionados con la ■ El asiento de la aguja se
Dispositivo de
muestra cambia cuando es
Reactivo ➨ Obstrucción de la necesario
medida
aguja o del tubo ■ La aguja se cambia
Unidad de
muestreo
cuando las muestras cuando es necesario
no se han filtrado ■ El rotor o los sellos en la
previamente válvula del muestreador
Válvula de 6 puertos Desde la bomba ➨ Falta de automático se cambian
reproducibilidad de cuando es necesario
la altura de pico
A la columna cuando se forma un
gradiente de
A residuos
densidad en el vial
■ Aguja
➨ La aguja se ha
obstruido desde el
septum
➨ Agujas torcidas
Figura 129
Las tareas de mantenimiento habituales de los muestreadores automáticos son la

sustitución de la aguja y del asiento de la aguja, el cambio del sello del rotor de
las válvulas y el cambio del sello de la jeringa. Siempre deben filtrarse las
muestras para evitar que se obstruyan las agujas y los capilares. Deben observarse
los requisitos del instrumento individual en lo que respecta a los lavados de
jeringa.
198
Problemas habituales del detector
Lámparas antiguas Celda de flujo sucia
Figura 130
Hay dos tareas de mantenimiento que deben realizarse habitualmente con los
detectores de UV. En primer lugar, las lámparas se deteriorarán con el paso del
tiempo. Cuando esto ocurra, no se podrán encender. A medida que envejecen, se
reduce la intensidad de la radiación emitida. En este estado aparecerá más ruido
en la línea de base. Pueden realizarse tests para determinar la potencia de salida
de la lámpara. El otro problema es la acumulación de suciedad en la celda de
flujo. Algunos componentes de muestras se adhieren a las ventanas de la celda de
flujo, ensuciándolas. El resultado será una línea de base ruidosa y mayores límites
de detección. Las celdas de flujo se pueden limpiar o cambiar.
199
Rendimiento del detector
Determinación del ruido de la

línea de base como referencia
mAU
Tiempo
Registrar el ancho de la línea de base en unidades mAU o RI para

posteriores comparaciones.
10
Figura 131
Para realizar un seguimiento del rendimiento del detector, se puede registrar la

desviación estándar relativa de la línea de base. Un ruido excesivo en la línea de
base puede atribuirse a la degradación de la lámpara, a celdas de flujo sucias o a
otros problemas corregibles.
200
Constantes de tiempo
Constantes de tiempo
Constante de tiempo del detector -

Demasiado alta
40 puntos 100 puntos
m AU
recogidos recogidos
400 Velocidad de datos

20 Hz
200 Tiempo de res. 0,1 seg
Se necesitan al
AP <0,01 min
menos 9 0
puntos de
datos para m AU 5 puntos 12 puntos
obtener picos 400 recogidos recogidos Velocidad de datos
definidos
2,5 Hz
correctamente 200
Tiempo de res. 2 seg
AP >0,1 min
0
0 0.5 1 1.5 2 m in
Zorbax XDB-C8, 4,6 x 30 mm, 3,5 µm, F = 2 ml/min
11
Figura 132
Debe ajustarse correctamente la constante de tiempo del detector, ya que de lo

contrario ocurrirá uno de los dos problemas siguientes. Si se ajusta la constante de
tiempo del detector a un valor demasiado elevado, no habrá suficientes datos para
definir adecuadamente la forma del pico cromatográfico. Se perderá la resolución
entre picos cromatográficos. La medida de áreas también se resentirá, provocando
una cuantificación deficiente.
201
Detector
Detector
Constante de tiempo del detector -

Demasiado baja
Constante de tiempo
Demasiado
alta Información
perdida
Más
filtración
Demasiado
baja Demasiada
Menos información
filtración
Tiempo
(min.)
12
Figura 133
Si la constante de tiempo del detector se ajusta a un valor demasiado bajo, se

producirá un ruido excesivo, ya que el promediado de señales será demasiado
infrecuente.
202
Problemas de presión
Problemas de presión
Resolución de problemas de presión
Problema de presión
Presión demasiado alta Presión demasiado baja Fluctuaciones de presión
● Aflojar el capilar en la frita del ● Asegurarse de que se trata ● Desgasificar y volver a

inyector de la columna de la fase móvil correcta cebar la bomba
● Comprobar el capilar entre el ● Apretar las conexiones ● Comprobar que no haya
muestreador y el asiento de la sueltas o sustituir las conexiones flojas o
aguja conexiones colocadas
● Continuar separando el ● Cambiar los sellos de la incorrectamente
sistema en dos mitades hasta bomba de medida ● Comprobar los sellos de
que se encuentre la obstrucción ● Cambiar o limpiar la frita la bomba de medida
obstruida del inyector de ● Comprobar las fritas del
disolvente inyector de disolvente
13
Figura 134
Cuando la presión del sistema supere la presión máxima, se apagará el

cromatógrafo de líquidos. La alta presión del sistema se debe normalmente a la
acumulación de partículas en la frita del inyector de la columna, en un filtro
instalado después del muestreador o en la frita del inyector de un salva columna
(el componente que antes esté en línea). El segundo punto de obstrucción más
probable es el capilar del asiento de la aguja, la primera restricción después de la
inyección. Si no se encuentra la obstrucción, deberá desmontarse el instrumento
sistemáticamente, en una conexión o en el sello de la bomba de medida. Una frita
de inyector de disolvente obstruida también puede producir este tipo de error.
Cuando se obstruye un filtro de un inyector de disolvente, no se puede extraer
tanto disolvente del depósito. Esto ocasiona una presión inferior a la normal, junto
con perturbaciones del tiempo de retención. La fluctuación de la presión del
sistema es consecuencia de una fuga, de una frita de inyector de disolvente
obstruida o de la existencia de aire en la bomba.
203
Problemas con la línea de base
Fluctuaciones de la línea de base

Problema:
El cromatógrafo presenta fluctuaciones de línea de base.
• ¿Radica el problema en el detector o en la bomba?
• ¿Cómo podría determinarse?
14
Figura 135
Una línea de base ruidosa o con variaciones puede deberse a numerosas causas.
Una de las primeras cosas que debería hacerse es aislar la causa en el detector o el
sistema de bombeo. Esta tarea se realiza fácilmente. Se monitoriza la señal
cromatográfica con el detector y la bomba en funcionamiento. A continuación, se
apaga la bomba. ¿Sigue habiendo ruido? Si desaparece el ruido, el problema se
debe al sistema de bombeo o al método. Si persiste el ruido, el problema
probablemente se deba al detector. El cromatograma mostrado en la figura
anterior es el resultado de la existencia de aire en la bomba.
204
Problemas de mezcla
Problema:
Problema:
Una fase móvil absorbente de UV se
mezcla de forma dinámica con una fase
móvil que no absorbe UV. Se produce un
ruido de bomba residual.
Solución:
Añadir un mezclador. El inconveniente es
el volumen de retardo.
Mezclador estático
15
Figura 136
Si se mezcla una fase móvil con gran capacidad de absorción de rayos UV con
una fase móvil que es transparente al espectro de UV, podrá producirse una línea
de base ruidosa. El ruido de la línea de base es consecuencia de una mezcla
inadecuada. El mismo problema puede ocurrir cuando dos fases móviles son
ligeramente inmiscibles, como las mezclas de TFA y agua/acetonitrilo. Si se
añade un mezclador estático, se podrá reducir el ruido al producirse una mezcla
adecuada. El mezclador estático añadirá un volumen de retardo adicional que
deberá tenerse en cuenta.
205
Detectores - Intercambiadores de calor
Mejorar el rendimiento del detector garantizando una temperatura

constante de la fase móvil en la celda de flujo.
con intercambiador
de calor
sin intercambiador
de calor
Tiempo
(min.)
16
Figura 137
Puede producirse un ruido excesivo en la línea de base cuando una aplicación

utiliza una elevada temperatura de columna junto con una elevada velocidad de
flujo en columna. El ruido se produce cuando la fase móvil no alcanza el
equilibrio de temperatura antes de penetrar en la celda de flujo. Ocurren cambios
en el índice de refracción, provocando ruido a medida que se enfría la fase móvil.
Un intercambiador de calor situado antes de la celda de flujo del detector puede
corregir este tipo de ruido. El intercambiador de calor es simplemente un capilar
soldado a un bloque metálico.
206
Líneas de base ruidosas
Tiempo
(min.)
Causas posibles: Pregunta que se ha de formular:

• Celda de flujo sucia • ¿Se ha cambiado la composición de
• Fallo de la lámpara del detector la fase móvil?
• Pulsos desde la bomba si el ruido • ¿Se ha cambiado la longitud de onda
es periódico de adquisición?
• Efectos de la temperatura en el • ¿Cuál fue la última fase móvil
detector utilizada en el instrumento?
• Las burbujas de aire pasan a • ¿Hay algún problema de
través del detector miscibilidad?
• ¿Están sucios los disolventes?
17
Figura 138
Entre los problemas que pueden surgir habitualmente en el detector cabe citar una
sensibilidad deficiente, deriva y ruido de alta frecuencia. La sensibilidad
deficiente puede ser consecuencia de disolventes o celdas de flujo sucias, una
longitud de onda de detección incorrecta o el fallo de la lámpara del detector. La
deriva ocurre cuando las columnas todavía no están equilibradas o cuando la
lámpara no ha tenido suficiente tiempo para calentarse. El ruido de alta frecuencia
puede deberse a problemas en el voltaje de la línea.
207
Problemas con columnas
Reparación/regeneración de la columna -
Obstrucción física
• Comprobar el descenso de la presión con/sin la columna
instalada.
• Si la retropresión en la columna es alta, invertir la columna y

enjuagarla con la fase móvil con 10-20 volúmenes de columna.
Monitorizar la retropresión.
• Si puede haber presente un precipitado (es decir, proteína

agregada, material celular, polímero), intentar desatascar la
obstrucción con el disolvente de solubilización apropiado, por
ejemplo 0,1% de TFA / 80% de acetonitrilo, 6M guanidina HCl,
THF, HFIP.
• Si no se resuelve el problema, se puede intentar cambiar la frita.
18
Figura 139
Uno de los problemas más habituales en la HPLC es un aumento de presión como

consecuencia de una obstrucción en una frita de columna o en un filtro en línea.
Para determinar si la obstrucción se encuentra en la columna, se debe cambiar la
columna o utilizar un capilar en lugar de la columna. Si desciende la presión, la
obstrucción se encuentra en la columna. La obstrucción podrá deberse a la
existencia de partículas en la frita o a compuestos adsorbidos en la fase
estacionaria.
208
Frita del inyector
Férrula de
Frita del compresión
inyector
Utilizar guantes
de la ●
● No dejar que la base se seque

columna ● No tocar la columna - el calor
del cuerpo expulsará el relleno
No apretar en exceso
Cuerpo de la ●
columna
Conexión hembra
del extremo
Conexión macho
del extremo
19
Figura 140
Si se determina que el problema se debe a la frita, habrá dos opciones. Cambiar la

columna o la frita. Hay que tener presente que al cambiar la frita se destruirá parte
de la eficacia de la columna, ya que se dañará la base de la columna. Si se decide
cambiar la frita, deberá colocarse la columna en un aparato de la manera mostrada
en la figura anterior. Es necesario utilizar guantes cuando se desmonte la
columna.
209
Cambio de la frita de la columna
Frita antigua Frita nueva
1 Retirar la frita de la columna

con cuidado.
2 Preparar una lechadade la

4 Colocar una frita
fase estacionaria
. nueva en la parte
superiordel montón.
3 Utilizando una pipeta
pasteur, apilar la fase
5 Cambiar la conexión
estacionariaen la parte del extremode la
superior de lacolumna. columna.
20
Figura 141
Retirar la frita antigua y desecharla. Preparar una lechada de fase estacionaria. La

fase estacionaria debe ser exactamente del mismo tipo que la que ya se encuentra
en la columna. Amontonar la lechada en la parte superior de la columna de la
manera mostrada, utilizando una pipeta pasteur. A continuación, colocar la frita
en la parte superior del montón de lechada y añadir las conexiones, procurando no
apretarlas excesivamente.
210
Reparación/regeneración de la columna -
Cambios químicos de la columna
• Los cambios del material de relleno de la columna causados

por hidrólisis de la fase enlazada o por disolución de la sílice
son irreversibles.
• Los cambios de la columna causados por contaminación son
por lo general reversibles mediante lavados adecuados.
• Los esquemas de elución de gradientes (acuoso -> orgánico
fuerte) normalmente son los más efectivos.
• Las fases móviles con pH bajo, por ejemplo 0,1% de TFA o
0,01M de H3PO4, son efectivas.
• Las temperaturas elevadas (60-80 ºC) pueden ser útiles.
21
Figura 142
Ocasionalmente, la columna podrá ensuciarse debido a los componentes de

muestra adsorbidos. A veces será posible restaurar la columna lavándola
adecuadamente. El método más sencillo consiste en utilizar un gradiente de
disolvente débil a fuerte y mantenerlo durante unos minutos. Para precipitados de
proteínas, se puede utilizar una disolución caotrópica como 6M guanidina HCl,
isosulfocianato de guanidina, o urea. Con determinados materiales de relleno
(XDB, polímeros orgánicos), pueden ser útiles mezclas acuosas/orgánicas con
elevado pH, por ejemplo, 0,01 M de NaOH en 50% de isopropanol/agua. Debe
reducirse al mínimo el tiempo de contacto para la sílice (15-30 minutos). A
continuación se muestra otra secuencia de lavado para columnas de fase inversa y
normal.
Fase inversa
• 75 ml de agua + 4 inyecciones de 200 µl de DMSO
• 75 ml de metanol
• 75 ml de cloroformo
211
Gel de sílice
• 75 ml de THF
• 75 ml de ácido acético acuoso, 2%
• 75 ml de piridina acuosa, 2%
• 75 ml de THF
• 75 ml de cloruro de metileno
212
Problemas con la línea base
Problemas con la línea base
Líneas de base con deriva
• Elución de gradientes
• Temperatura inestable (detector del índice de refracción)
• Contaminación de la fase móvil
• La fase móvil no está en equilibrio con la columna
• Sangrado de contaminación en el sistema
22
Figura 143
Las líneas de base con deriva son habituales cuando se realiza un análisis de
gradiente, debido a la composición cambiante de la fase móvil. En otras
situaciones, las líneas de base con deriva indican que una columna todavía se está
equilibrando o el detector se está calentando. Los problemas de contaminación
también pueden ser un factor a tener en cuenta.
213
Picos fantasmas
Picos fantasmas
Picos fantasma
60 Picos fantasma - Picos que aparecen incluso cuando

no se inyecta ninguna muestra
15 Problema - Fase móvil sucia
30
15
0
3 7 15 17
20% - 100%
Gradiente MeOH
No hay inyección de muestra
23
Figura 144
Si durante el análisis de gradientes aparecen picos fantasmas (picos que no son el

resultado de la muestra), el problema normalmente se deberá a una fase móvil
sucia, especialmente agua. Al comienzo de un análisis de gradientes, las
impurezas del agua podrán adherirse a la columna y aumentará la concentración
de la impureza. Durante el gradiente se introduce en la columna una fase móvil
más fuerte y las impurezas comienzan a eluir, creando picos cromatográficos no
deseados.
214
Forma de pico
Forma de pico
Forma de picos - Dobletes
Volumen vacío en la columna
Normal Picos con dobletes
• Volumen vacío en la columna

• Frita parcialmente obstruida
• Sólo un pico por doblete - componentes coeluyentes
24
Figura 145
Si todos los picos del cromatograma parecen tener una cierta forma de doblete, la
causa normalmente estará relacionada con la columna o el instrumento. A medida
que se disuelve la sílice, podrá depositarse el material de relleno, creando un
vacío en la columna. El vacío de la columna puede producir formas de pico
deficientes, incluidas colas y dobletes. En columnas de diámetros pequeños y muy
pequeños, la frita del inyector podrá obstruirse sin que se produzca un gran
cambio de presión, provocando la formación de picos dobletes. Si sólo uno o unos
pocos picos del cromatograma presentan un aspecto de doblete, la causa podrá
atribuirse a un pico coeluyente.
215
Forma de pico
Forma de picos - Picos anchos
1 1. URACIL
2. NORTRIPTILINA
5 COLUMNA A • Todos los picos ensanchados
3. DOXEPINA (sílice SilGel;
4. AMITRIPTILINA
5. TRIMIPRAMINA taponada en un – Pérdida de eficacia de la columna
2 3 extremo) – Vacío en la columna
4
Inicial
– Gran volumen de inyección
– Fase móvil de viscosidad alta
COLUMNA A
Después de 1826
volúmenes de • Algunos picos ensanchados
columna
– Elución tardía respecto de la
muestra anterior
– Peso molecular elevado
– Muestra - proteína o polímero
25
Figura 146
A medida que envejece una columna de HPLC, se ensanchan los picos

cromatográficos. Cuando la resolución ya no sea aceptable, deberá desecharse la
columna. Las fases móviles muy viscosas y los volúmenes de inyección grandes
son otras causas que provocan picos cromatográficos anchos. Si en el
cromatograma sólo aparece un pico ancho, podrá haber eluido tardíamente de una
inyección anterior.
216
Forma de pico
Efecto del volumen externo a la columna
Volumen externo
a la columna
2,1 x 150 mm
F = 0,2 ml / min.
10 µl
(Inyección de 1 µl)
20 µl
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tiempo, min.
• Utilizar un tubo de diámetro interno pequeño entre el muestreador y la

columna y entre la columna y el detector.
• Asegurarse de que todas las conexiones de los tubos son adecuadas.
• Utilizar una celda de detector de volumen bajo.
• Inyectar volúmenes de muestra pequeños.
26
Figura 147
Los volúmenes excesivos externos a la columna provocarán una pérdida de

resolución. La dispersión fuera de la columna es consecuencia de demasiados
tubos o de diámetros internos demasiado grandes. La celda de flujo también
puede causar una dispersión excesiva fuera de la columna cuando tiene un gran
volumen. Los volúmenes de inyección grandes también podrán provocar una
pérdida de resolución. El volumen de inyección máximo depende del diámetro
interno de las columnas.
217
Forma de pico
Forma de picos - Colas
Simetría > 1,2

Causas:
• Algunos picos tienen colas
– Secundario - Efectos de retención
– Interacciones de silanol residual
– Picos pequeños que eluyen en la
Colas
cola de un pico más grande
Normal
• Todos los picos tienen colas
– Efectos externos a la columna
– Formación de contaminación en el
inyector de la columna
– Metales pesados
– Columna defectuosa
Normal Colas
27
Figura 148
En la cromatografía de líquidos de fase inversa, la interacción entre ácidos débiles

y bases débiles con grupos de silanoles residuales puede producir colas. La forma
de pico deficiente se puede controlar con el pH correcto o añadiendo un
modificador como trietilamina para evitar la formación de colas en bases débiles.
Si todos los picos del cromatograma presentan colas, la forma de los picos se debe
a un problema de degradación de la columna o a efectos externos a la columna.
218
Forma de pico
Forma de picos - Picos con frente
2000
1500
mAU
1000
500
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (min)
Normal Con frente
Simetría < 0,9
Causas:
• Sobrecarga de columna
• Banda pequeña que eluye antes que la banda grande
28
Figura 149
La mayoría de los picos, que presentan frentes, son consecuencia de la sobrecarga

de masas. Además de la forma del pico, un pico sobrecargado presentará un ligero
cambio de tiempo de retención hacia un tiempo de retención anterior. La
coelución de picos cromatográficos también producirá frentes cuando un pico
pequeño eluya justo antes que uno grande.
219
Forma de pico
Forma de picos - Picos negativos
Normal Negativo
Causas:
• La absorbancia de la muestra es menor que la de la fase móvil.
• Perturbación del equilibrio cuando el disolvente de la muestra
pasa por la columna.
• Normal con detectores de índice de refracción.
29
Figura 150
La presencia de picos negativos no es algo que normalmente deba causar

preocupación. Los picos negativos ocurren en la detección de UV cuando la
muestra absorbe menos que la fase móvil. También puede aparecer un pico
negativo cuando el disolvente de la muestra pasa a través del detector. Los picos
negativos son habituales con la detección del índice de refracción.
220
Tests
Tests
Parámetros de prueba de OQ (cualificación

operacional) / PV (verificación del rendimiento)
Prueba de fugas
Estabilidad y exactitud de la temperatura

Ruido/deriva de la línea de base
Precisión de las áreas de pico y TR
Precisión de la longitud de onda

Linealidad del detector
Efecto de arrastre del muestreador

Linealidad del muestreador
Precisión/exactitud de la composición
Ondulación de la composición
30
Figura 151
Si se dispone de un sistema HPLC 1100, hay varios tests incorporados al

cromatógrafo de líquidos que pueden ayudar a analizar el rendimiento del sistema.
Necesitan patrones de rendimiento conocido, que pueden adquirirse. Otra
alternativa es estudiar la finalidad de cada uno de estos tests y crear tests propios
cuya naturaleza sea similar.
221
Hojas de trabajo
Hojas de trabajo
Ejercicio
1. Indicar una posible causa del siguiente cromatograma no ideal.

mAU
Tiempo
(min)
31
Figura 152
222
Hojas de trabajo
Ejercicio
2. Indicar una posible causa del siguiente cromatograma no ideal.
mAU
Tiempo
(min)
32
Figura 153
223
Hojas de trabajo
Ejercicio
Indicar las causas de los siguientes problemas:
3. Las velocidades de flujo son correctas, las válvulas de

retención funcionan debidamente, pero los primeros picos de
la elución del gradiente no tienen tiempos de retención
reproducibles.
4. La línea de base es muy irregular - nivel de ruido general alto.
5. La línea de base tiene un ruido periódico sistemático.
33
Figura 154
224
Hojas de trabajo
Ejercicio
Indicar las causas de los siguientes problemas:
6. Con un detector de UV, la altura es reproducible, pero los

tiempos de retención y el área no lo son.
7. La altura y el área no son reproducibles, pero sí los son los

tiempos de retención.
8. La reproducibilidad es buena, la mezcla de prueba tiene

buen aspecto, pero algunos picos de la muestra son anchos
y tienen colas.
34
Figura 155
225
Hojas de trabajo
226
Elución de gradientes
• En qué consiste el proceso de elución de gradientes y cuáles son

sus ventajas.
• Cómo optimizar una separación de gradiente.
• Consideraciones prácticas para establecer separaciones de

gradientes.
Figura 156
228
El problema general de la elución
• Resolución defectuosa de los picos

que antes eluyen.
• Aumento del ancho de pico y
descenso de la altura de pico en los
picos que eluyen más tarde.
• Tiempos largos de análisis debido a
un rango amplio de valores k'.
• Contaminación de columnas con
componentes de fuerte retención.
Elución isocrática - La composición de la fase móvil permanece

constante durante el tiempo que tarda la muestra en eluir.
Figura 157
Cuando se utiliza una única fase móvil para un análisis (elución isocrática), los
analitos se pueden eluir a través de un amplio margen de valores k’. Los picos que
antes eluyen podrán no resolverse completamente desde la parte frontal del
disolvente, y los componentes que eluyen más tarde podrán tener picos anchos
que no puedan detectarse fácilmente. Algunos componentes pueden contaminar la
columna debido a su retención extrema. A menudo, el tiempo del análisis es largo
cuando los componentes difieren en cuanto a su estructura química y polaridad,
debido a valores k’ que varían considerablemente.
229
Elución de gradientes - Una solución
Elución de gradientes - Solución A
Elución de gradientes - La
composición de la fase móvil cambia
durante la separación.
• Ventajas
– Resolución mejorada
– Mayor detección
– Capacidad para separar
muestras complejas
– Tiempos de análisis más cortos
– Disminución del deterioro de la
columna debido a los
componentes retenidos con
fuerza
• Otros usos
– Limpieza de la columna
– Análisis de exploración en el
desarrollo de métodos
Figura 158
La elución de gradientes puede resolver el problema general de la elución.

Cuando se utiliza un programa de elución de gradientes, se selecciona la fuerza
inicial del disolvente para resolver los picos cromatográficos que antes eluyen. Se
aumenta la fuerza de elución de una manera predeterminada con el fin de eluir
otros picos cromatográficos de la columna con una resolución de conjunto óptima.
El resultado es una mayor altura de picos y tiempos de análisis más cortos. La
resolución se puede controlar con precisión. Los componentes retenidos con gran
fuerza se pueden lavar de la columna con cada análisis. La elución de gradientes
resulta más indicada para la HPLC de fase inversa, la HPLC de fase normal con
fases estacionarias polares enlazadas y la cromatografía de líquidos por
intercambio iónico.
Se puede utilizar un análisis de exploración (un gradiente largo y poco profundo)
para el desarrollo de métodos tanto isocráticos como con gradientes.
230
Separación de gradiente de polipéptidos

• Características de gradientes
• Se utilizan dos disolventes para desarrollar el
gradiente Columna: ZORBAX 300SB-C3
• La fuerza de elución aumenta con el tiempo 5 µm, 4,6 x 150 mm
Gradiente: 15-35% B en 19 min.
• Tener en cuenta la forma del gradiente Fase móvil: A: 95:5 H2O:ACN
• Tener en cuenta la inclinación del gradiente con 0,1% de TFA
B: 5:95 H2O:ACN
4 con 0,085% de TFA
6
12 3 5
1. Leucina Encefalina
2. Angiotensina
3. RNasa A
7 8 4. Insulina
5. Citocromo C
6. Lisozima
7. Mioglobina
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Tiempo (min.)
5
Figura 159
El cromatograma anterior es un ejemplo de una separación de gradientes de fase

inversa de polipéptidos. Normalmente se utilizan dos disolventes, según indican
los depósitos de disolvente A y B mostrados en la figura anterior. El depósito A
normalmente contiene el disolvente más débil, en este caso 95% de agua/5% de
acetonitrilo con 0,1% de TFA. El depósito de disolvente B contiene el disolvente
más fuerte, 5% de agua/95% de acetonitrilo con 0,085% de TFA. La fuerza de
elución normalmente aumenta con el paso del tiempo, tal y como se indica en la
figura anterior, donde el gradiente comienza al 15% de B y finaliza al 35% de B
durante un periodo de 19 minutos. El gradiente mostrado es un gradiente lineal
que cambia a una velocidad de 1,05% por minuto.
231
Análisis de gradientes
Análisis de gradientes
¿Qué ocurre durante el análisis de un gradiente?

% Org
Aumento del % de modificador

orgánico
100
75
k'
50
Cambio de partición a fase móvil
25
0
0 10 20 30
Tiempo (min)
Aumento de la velocidad del

compuesto
Figura 160
La elución de gradientes resulta más útil para la cromatografía de líquidos de fase

inversa y por intercambio iónico. En el ejemplo siguiente se utiliza fase inversa.
El gradiente se forma incrementando el porcentaje de disolvente orgánico. En
consecuencia, la división de un compuesto cambiará entre las fases móvil y
estacionaria. El compuesto pasará una mayor parte de su tiempo en la fase móvil a
medida que aumente el porcentaje de disolvente orgánico. Por tanto, aumentará la
velocidad lineal del compuesto. Un compuesto se acelerará a través de la
columna. Cuando el compuesto se eluye de la columna, ha alcanzado una
velocidad lineal que a menudo se aproxima a la velocidad de la fase móvil.
De ello se deduce que al duplicar la longitud de la columna no se duplica el
tiempo de migración. El tiempo que un automóvil tarda en recorrer 200 metros
desde salida parada no es el doble del tiempo que tarda en recorrer 100 metros.
No se puede asignar un valor k’ fijo a un compuesto cuando se aplica la elución
de gradientes. k’ es el coeficiente de partición y cambia durante la elución. El
cálculo de k’ utilizando la fórmula k’ = (tr-t0)/t0 sólo es correcto durante la elución
isocrática.
232
¿Por qué son los picos estrechos y tienen la misma anchura?
¿Por qué son los picos estrechos y tienen la misma

anchura?
¿Por qué son los picos estrechos y tienen la
misma anchura?
Inicio
• Dos compuestos se desplazan por una

columna a una velocidad cada vez
cm
mayor.
• Tienen diferente hidrofobicidad. Tr es
Fin de 14 y 22 minutos.
20
14 min 22 min
• El coeficiente de partición al eluir de la
columna es pequeño (es decir, la
15 velocidad es alta) y similar para ambos
compuestos.
k'
10
• En la cola del pico se produce una
5
concentración más alta del modificador
0
orgánico. La velocidad de la cola es
0 10 20 30 más rápida que la del núcleo del pico
min
que enfoca el pico.
Figura 161
En la elución isocrática, los picos son bastante anchos y su anchura aumenta con
el tiempo de retención. En la elución de gradientes, los picos son estrechos y sus
anchuras con casi idénticas. La principal razón de la forma estrecha de los picos
es la velocidad del pico a medida que abandona la columna. Durante la elución de
gradientes, todos los compuestos se aceleran a través de la columna y, por tanto,
eluyen a alta velocidad. La diferencia del tiempo de retención entre compuestos es
un resultado del porcentaje del modificador orgánico al que cada uno empieza a
acelerar. Todos los compuestos deberían tener aproximadamente la misma
velocidad cuando abandonan la columna.
Obsérvese que la ecuación utilizada para determinar el número de platos da por
sentado que la velocidad es constante y, por tanto, no se puede utilizar en la elución de
gradientes.
Otra razón menor del enfoque de los picos es el hecho de que el frente y la cola de
un pico residen en concentraciones diferentes de modificador orgánico. La cola
experimentará un porcentaje de modificador orgánico mayor que el centro de un
pico. La velocidad de la cola será, por tanto, ligeramente mayor que la del centro
del pico, y viceversa en el caso del frente. Esto provoca el enfoque de picos. Los
233
¿Por qué son los picos estrechos y tienen la misma anchura?
picos asimétricos plantean a menudo menos problemas en la elución de

gradientes. En la práctica, los picos estrechos obtenidos en la elución de
gradientes proporcionan mejores límites de detección (suponiendo que el
gradiente no provoque ruido o deriva adicional en la línea de base) y mayores
capacidades de carga.
234
Desarrollo de un análisis de gradientes
Desarrollo de gradientes - Optimizar gradiente

de disolvente
Comenzar con un análisis de exploración - Un gradiente largo
y poco profundo
5% 100%
Orgánico Orgánico
Se tendrá que determinar lo siguiente:

• Disolventes orgánicos • Forma del gradiente
• Composición inicial • Velocidad de flujo
• Tiempo del gradiente • Longitud de la columna
• Inclinación del gradiente • Tiempo de reequilibrado de la
columna
Figura 162
El análisis de exploración es un primer paso práctico del desarrollo de gradientes.

El análisis de exploración es un gradiente lineal desde el 5-10% de B hasta el
100% de B durante un periodo definido. Una vez que se encuentra al 100% de B,
se mantiene la fuerza de elución durante unos minutos para asegurar que eluyan
todos los componentes de la muestra. Para la elución de gradientes de fase
inversa, las sustancias de elución más utilizadas son normalmente el agua y el
acetonitrilo. Se examinan los resultados para determinar si la fuerza de la
sustancia de elución es adecuada. Si los componentes eluyen después del 100% de
B, deberá seleccionarse una combinación de sustancias de elución más fuerte y
empezar de nuevo. A continuación se examina el cromatograma para seleccionar
la composición inicial adecuada del gradiente y el perfil del gradiente. La elución
de gradientes utilizada de esta manera es superior a la elución isocrática para el
desarrollo de métodos. No sólo se verán los componentes que antes eluyen, sino
también aquéllos que podrían quedar retenidos en la columna a una fuerza de
elución isocrática dada.
Si se descubre que todos los componentes de la muestra eluyen dentro de un
gradiente del 15%, la elución isocrática resultará más indicada y ahorrará tiempo.
La elución isocrática no exige que se vuelva a equilibrar la columna.
235
Calcular el tiempo del gradiente para el análisis

de exploración
∆Φ = cambio de la fracción de volumen de
orgánico
S = constante determinada por el disolvente
tGF fuerte y el compuesto de la muestra
F = velocidad de flujo
k= tG = tiempo del gradiente (min.)
1,15S∆Φ Vm
Vm = volumen vacío de la columna
k - retención del gradiente - el valor k' para un analito que ha migrado hasta
la mitad de la columna
Tiempo de gradiente teórico k = 5 para separación media

Más tiempo de gradiente no mejorará S = 4 para moléculas pequeñas
considerablemente la resolución. ∆Φ (5% - 100%) 95/100 = 0,95
Vm = 1,058 ml (determinado
∆ΦVm)/F
tg= k(1,15S∆ experimentalmente para 4,6 x 100 mm)
F = 1 ml / min.
tg= 5*1,15*4*0,95*1,058/1 = 23 minutos
Figura 163
La ecuación mostrada más arriba se puede utilizar para predecir el tiempo del
gradiente. Tiempos de gradiente más largos que los previstos por la ecuación no
producirán cambios significativos en la resolución. Los términos utilizados en el
cálculo se definen más arriba. Esta ecuación puede parecer desconcertante porque
las relaciones parecen ser las opuestas de las observadas en las separaciones
isocráticas. La primera ecuación se reorganiza con el fin de producir el tiempo de
gradiente para una velocidad de flujo y un volumen vacío de columna dados. El
volumen vacío se puede calcular mediante la ecuación VM = 0,5Ld2. En esta
ecuación, "L" es la longitud de la columna y "d" es el diámetro. Para obtener una
determinación más exacta, inyectar un compuesto no retenido en la columna y
determinar el volumen vacío de la columna.
El valor "S" para moléculas pequeñas (< 500 Da) oscila entre 2 y 5. Son
necesarios tiempos de gradiente más largos para moléculas grandes, como
proteínas. El valor "S" para estas muestras puede ser de entre 50 y 100.
236
Seleccionar la inclinación del gradiente
Muy pendiente
100% B
100% B
tG = 5 tG = 20
0% B 0% B Poco profundo
100% B 100% B
tG = 10
tG = 40
0% B
0% B
0 10
0 10 20 30 min. 40
10
Figura 164
Otro aspecto a tener en cuenta es la inclinación del gradiente. En todos los

ejemplos mostrados anteriormente, el margen de gradiente permanece constante,
entre el 0% y el 100% de B. Sin embargo, el tiempo del gradiente es mayor en
cada muestra sucesiva. En el primer ejemplo, el cambio de gradiente es de
20%/minuto y en el último ejemplo es de tan sólo 2,5%/minuto. Mediante el
ajuste de la inclinación del gradiente se podrán realizar cambios significativos en
el cromatograma.
237
Forma del gradiente
Lineal Escalonado
%B
tiempo
Cóncavo Convexo
11
Figura 165
Los perfiles de gradiente no tienen que ser lineales. Un perfil de gradiente

adecuado mejorará la separación. La inclinación del perfil del gradiente se puede
ajustar según sea necesario. Se programan segmentos lineales cortos con el fin de
aproximar el gradiente a la forma necesaria para el análisis. Los gradientes
convexos son útiles si los picos que más tarde eluyen muestran menos resolución
que los picos que antes eluyen. Los gradientes cóncavos son útiles si se desea más
resolución para los picos que antes eluyen que para los picos que más tarde
eluyen. Se considera que un gradiente de pasos es muy reproducible y agiliza
considerablemente un análisis con espacios en el cromatograma.
238
¿Qué perfil se aplicaría a cada uno de estos

gradientes?
Gradiente lineal
Gradiente lineal
Gradiente lineal
12
Figura 166
Examine los análisis de exploración mostrados más arriba. Como analista, ¿qué
perfil de gradiente aplicaría a cada supuesto para mejorar la separación de los
gradientes?
239
Cambio de la velocidad de flujo
5%/min
1 ml/min
-> 5%/ml
5%/min
2,5 ml/min
-> 2%/ml
0 2 4 6 8 10 12 14
Tiempo (min)
13
Figura 167
Normalmente, la pendiente de un gradiente se expresa como "%/min". Sin

embargo, la pendiente de gradiente para una dimensión de columna dada se expresa
de manera más correcta como "%/ml". Es el flujo, y no el tiempo, lo que transporta
un compuesto a través de la columna. Por consiguiente, un aumento de la velocidad
de flujo supondrá una disminución de la pendiente del gradiente, es decir,
normalmente una mejora de la resolución, y viceversa. El cambio del número de
platos con la velocidad del flujo contrarrestará este efecto. El efecto neto depende
de cada caso. No obstante, pueden ocurrir cambios en el espaciado entre bandas,
como sucede con cualquier alteración de una pendiente de gradiente.
Los tiempos de elución no son muy sensibles a la velocidad del flujo. Esto se
entenderá mejor si se considera un caso simplificado. Consideremos una molécula
que no se desplaza cuando el porcentaje del modificador orgánico es inferior al
30%, pero que cuando es superior al 30% se mueve a la misma velocidad que la
fase móvil. El gradiente alcanza el 30% al cabo de 20 minutos. A una velocidad
de flujo de 1 ml/min, el compuesto eluye a los 22 minutos, es decir, no se mueve
durante 20 minutos y, a continuación, pasa por la columna en dos minutos. El
aumento de la velocidad de flujo a 2 ml/min dará como resultado un volumen de
elución de 21 minutos.
240
Inversiones del orden de elución - un fenómeno

de los gradientes
100
10 Relación entre k’ y el porcentaje del

modificador orgánico - condiciones
k'
% O rg
1
isocráticas (n.b. escala logarítmica para k’)
0 10 20 30 40 50
tiempo (min)
0 10 20 30
Inicio Migración durante la elución del gradiente

Distancia
recorrida Tiempos de retención (min)
Longitud de columna Compuesto A Compuesto B
10 cm 10 cm 14,2 15,3
25 cm 18,2 17,9
25 cm
14
Figura 168
La relación entre el coeficiente de partición y el porcentaje de modificador

orgánico depende de las propiedades moleculares; véase la figura anterior. Este
hecho puede provocar en realidad que un compuesto adelante a otro durante una
elución de gradiente. A modo de ejemplo, en una carrera de 1 kilómetro, un
automóvil adelanta a su competidor a la mitad de la carrera debido a las diferentes
características de los motores. Esto se muestra en el segundo diagrama anterior.
Las moléculas más grandes (p. ej., proteínas) tienden a tener curvas k’ muy
pendientes.
El espaciado entre bandas puede cambiar a medida que se cambie la longitud de la
columna. Obsérvense los tiempos de elución con una columna de 10 y de 25 cm
en el diagrama anterior. Obsérvese el pequeño cambio que se produce en el
tiempo de migración al modificarse la longitud de la columna.
241
Mejora de un análisis de gradientes
Mejora de la resolución utilizando k - Relaciones

de retención media
∆Φ = cambio de la fracción de volumen de
orgánico
tG F S = constante determinada por el disolvente
k= fuerte y el compuesto de la muestra
1,15S∆Φ Vm tG = tiempo del gradiente (min.)
Vm = volumen vacío de columna
1 / k = inclinación del gradiente
Por tanto, todos estos aspectos aumentan el valor k:
1. Más tiempo de gradiente tG

2. Columna más pequeña Vm
3. Mayor velocidad de flujo F
4. Rango orgánico más corto ∆Φ
El aumento de k podrá o no mejorar la resolución.
15
Figura 169
Volvamos a la ecuación de retención de gradientes para obtener alguna pista que
nos permita mejorar las separaciones de gradientes. En la elución de gradientes, la
resolución depende en gran medida de la retención del gradiente. Si se cambia la
retención del gradiente, podrá cambiar el espaciado entre bandas, provocando
cambios profundos en la separación cromatográfica.
El cambio del tiempo del gradiente, haciendo que el gradiente sea más o menos
pendiente, tiene efectos previsibles sobre la retención y resolución del gradiente.
Los cambios realizados en F o VM tienen efectos previsibles sobre la retención,
pero también pueden afectar a N, la eficiencia, por lo que la resolución no es algo
seguro. Un aumento de la velocidad de flujo provoca aumentos en la retención del
gradiente, pero también una disminución de N. Los efectos combinados pueden
dar como resultado un aumento o una reducción de la resolución. En la elución de
gradientes, los cambios realizados en la velocidad de flujo pueden tener efectos de
la misma magnitud que el cambio del % orgánico en la elución isocrática. Pueden
producirse reorganizaciones de picos.
En vista de lo descrito anteriormente, puede verse que, a diferencia de la elución
isocrática, los cambios realizados en la velocidad de flujo, la longitud de la columna
y la pendiente del gradiente deben utilizarse para mejorar la separación.
242
Si el gradiente está inclinado, a veces se podrá

mejorar la resolución con una columna más
corta (disminución de Vm)
300SB-C8, 3,5 µmGradiente:
Fase móvil:
2-75% B en 30 min.
A= 5:95, ACN:H2O, 0,1% TFA
4,6 x 150 mm A= 95:5, ACN:H2O, 0,085% TFA
Velocidad de flujo: 1 ml / min.
Inyección: 10 µl, 2,6 µg cada uno
k* = 2,6 Temp: 35 °C
k* = 2,53 5 67 UV: 215 nm
2 4 8 9 10
1
1. GLY-TYR
2. VAL-TYR-VAL
3. [GLU]-ß FRAGMENTO
4,6 x 50 mm AMILOIDE DE PROTEINA 1-16
4. [TYR8 ] BRADIQUININA
5. MET-ENK
6. LEU-ENK
k* = 5,9 7. ANGIOTENSINA II
8. KINETENSINA
9. RNASA
k* = 4,5 10. INS (EQUINO)
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0 4 8 12 16 min.
16
Figura 170
En el ejemplo anterior se cambió el término VM de la ecuación de retención de

gradientes utilizando una longitud de columna más corta. La separación de
gradientes original se realizó con una columna de 4,6 x 150 mm. En el segundo
ejemplo se acortó la columna a 50 mm.
243
¿Cuál es la longitud de columna correcta?
Separación máxima en un espacio de tiempo permitido:
• Espacio de tiempo corto = columna corta y alta velocidad

de flujo
• Espacio de tiempo largo = columna larga y velocidad
de flujo normal
17
Figura 171
El compromiso entre velocidad de flujo, longitud de columna y tiempo es similar

en la elución isocrática y de gradientes. Cuando el tiempo de separación es un
aspecto vital, se debe utilizar una columna corta (5-15 mm) y analizar a una
elevada velocidad de flujo. Cuando es crucial obtener la máxima resolución, es
aconsejable utilizar una columna larga (20-30 cm) a una velocidad de flujo
normal.
Los compuestos con una curva de velocidad muy pendiente (p. ej., proteínas) no
se benefician de las columnas largas. Estos compuestos alcanzan rápidamente
(después de unos centímetros de aceleración) un valor k’ = 0, es decir, no existe
interacción con la fase estacionaria.
Cuando se aplican gradientes pendientes, en realidad es contraproducente utilizar
una columna larga, ya que el componente alcanza el valor k’ = 0 (no hay
cromatografía) antes de abandonar la columna. La última parte de la columna sólo
añade entonces un ensanchamiento de bandas.
244
Consideraciones especiales
El instrumento contribuye al rendimiento del

gradiente Inyección de la muestra
Detector
Bomba
Columna
{
Volumen de
espera
Volumen externo
a la columna
Fase móvil Dispositivo

de datos
• Volumen de espera = volumen desde la formación del gradiente hasta la

cabeza de la columna.
• Si se aumenta la concentración inicial, se reduce el tiempo de separación, pero
esto hace que la separación dependa más del instrumento, debido al volumen
de espera y la etapa isocrática que produce antes de que se lleve a cabo el
gradiente.
18
Figura 172
Cuando desarrolle separaciones de gradientes, el analista deberá considerar si

otros utilizarán la separación con instrumentación diferente. Diferentes modelos
de sistemas HPLC tendrán distintos volúmenes de espera. Se trata del volumen de
los tubos de conexión y los componentes de la instrumentación desde la
formación del gradiente hasta la cabeza de la columna. Un cromatograma
generado en un instrumento podrá tener un perfil muy diferente cuando se genere
en otro instrumento, debido a los distintos volúmenes de espera. En un sistema
con un volumen muerto muy bajo, el disolvente alcanzará la columna en un
periodo muy corto. En un sistema con un volumen de espera (volumen de retardo)
más elevado, se producirá una demora en la fuerza de elución del gradiente en la
columna.
Se puede medir el volumen de espera del instrumento, así como su capacidad
relativa para realizar un gradiente, utilizando un test de indicador de acetona.
Utilizar dos depósitos, A y B, e introducir metanol en ambos depósitos. Añadir un
0,2% de acetona al depósito B. Analizar un gradiente desde 0 hasta el 100% de B.
Examinar el perfil producido.
245
Consideraciones prácticas para la elución de

gradientes
La elución de gradientes podrá no resultar indicada para:
• Aplicaciones que utilicen aditivos de fuerte retención
• Aplicaciones de parejas de iones
• Cromatografía de líquidos de fase normal con sílice pura
■ Los disolventes deben ser

puros; de otro modo, se
Picos fantasma
producirán picos fantasmas.
■ Hay que cerciorarse de que el
tampón es soluble en la
composición final de la fase
móvil del gradiente.
■ Es necesario dejar pasar un
tiempo para que la columna
se vuelva a acondicionar
0% MeOH 100% entre análisis.
Análisis en blanco que produce picos
fantasmas debido a la impureza del
agua.
19
Figura 173
En esta figura se muestran algunas consideraciones prácticas para analizar la

elución de gradientes. En primer lugar, y debido a los largos tiempo de equilibrio
de las columnas, no resultan indicadas las aplicaciones que utilizan componentes
retenidos con gran fuerza, como trietilamina. Por las mismas razones, las
aplicaciones de parejas de iones no son indicadas para la elución de gradientes.
Las aplicaciones de HPLC de fase normal que utilizan columnas de sílice pura
tampoco son indicadas. Los largos tiempos de equilibrio provocan una
imprecisión de los tiempos de retención.
Los disolventes utilizados en la elución de gradientes deben ser puros. La calidad
del agua tiene especial importancia. Las impurezas quedan retenidas en la
columna, mientras que se debilita la composición de la fase móvil. A medida que
se aumenta la fuerza de elución, las impurezas aparecen como picos en el
cromatograma. El cromatograma mostrado anteriormente es un ejemplo real de
estos picos fantasmas. El análisis mostrado es un análisis en blanco con impurezas
que abandonan la columna a medida que aumenta la fuerza de elución.
Para evitar problemas de precipitación en el instrumento, se debe someter a
prueba la solución tampón para asegurar que sea soluble en la composición final
de la fase móvil. Por último, para aumentar la precisión del tiempo de retención,
debe dejarse un tiempo de re-equilibrio adecuado entre cada análisis
cromatográfico.
246
Ejercicio de laboratorio: elución de
gradientes
Ejercicio de laboratorio: elución de gradientes

• Determinará el tiempo de análisis adecuado para un análisis inicial de
exploración.
• Realizará un análisis de exploración para una muestra con gradiente.
• Desarrollará un gradiente en el que los dos picos más próximos tienen una
resolución de, al menos, 1,25.
248
Materiales
Materiales
• 1 columna SB-C18 de 4,6 x 150 mm, 3,5 micras, número de referencia
863953-902.
• Mezcla de prueba de gradientes.
canal B.
• Diversos disolventes de calidad HPLC, metanol, THF, isopropanol (como
opción).
• Un 1100 con todos los módulos encendidos.
249
Análisis de exploración
Análisis de exploración
El análisis de exploración es una herramienta práctica para desarrollar métodos
con gradiente. Este gradiente lento y poco profundo permitirá ver los picos de la
muestra y, a continuación, ajustar el gradiente utilizando un proceso lógico.
1) El análisis de exploración tendrá las condiciones siguientes:

Velocidad de flujo 1,5 ml/min
%B inicial 5% de acetonitrilo
%A inicial 95% de agua
VM se calcula como 0,5(150)(4,6)2 = 1.587 mm3 = 1,587 cm3 = 1,587 ml
Utilizar la ecuación siguiente para calcular el tiempo necesario para el gradiente
Tg ≅ (S x k’ x VM x ∆Φ)/F
donde Tg = tiempo necesario para el gradiente
S = 3 a 5 para moléculas pequeñas; utilizar 4
k’= 5, para obtener los mejores resultados
VM = volumen muerto; VM = 0,5 Ld2, donde L = longitud
de la columna y d = diámetro de la columna
∆Φ= (%B final – %B inicial)/100
Calcular el tiempo del análisis de exploración.
250
Procedimiento
Procedimiento
1) Instalar la columna C-18 de 4,6 x 150 mm con partículas de 3,5 micras.
2) Introducir la mezcla de prueba de gradientes en la posición 1 del vial.
3) Abrir la pantalla Method and Run Control.
4) En el menú Instrument, seleccionar Set up Pump.
5) Utilizar una velocidad de flujo de 2,00 ml/min y 100%B para limpiar la
columna durante un periodo de 5 minutos.
creación del método y seleccionar Method, Load Method.
7) En el menú Method, seleccionar Edit Entire Method. Seleccionar
únicamente las secciones Instrument/Acquisition y Run Time Checklist
para editarlas. Hacer clic en OK en este panel.
8) Introducir los parámetros del sistema de reparto de disolvente. Introducir
(Insert) el gradiente del análisis de exploración. La ventana Setup Pump
deberá aparecer de la manera mostrada a continuación.
251
Procedimiento
9) Obsérvese que %B se mantendrá al 100% durante 5 minutos para asegurarse

de que se haya eluido todo en estas condiciones de disolvente. Hacer clic en
OK en la ventana.
10) Se realizará una inyección estándar de 5,0 µl. Hacer clic en OK en el panel
Setup Injector.
11) Ajustar la temperatura del compartimento de las columnas a 40 °C. Hacer
clic en OK en la ventana.
12) Cumplimentar los datos de la pantalla DAD Signals de la manera mostrada a
continuación; hacer clic en OK para aceptar los datos mostrados en el panel.
Nota: Si se está utilizando un VWD, seleccionar una longitud de onda de 260 nm.
13) En Run Time Checklist, seleccionar únicamente Data Acquisition.

14) En el menú Method, seleccionar Save Method As…. Asignar al método el
nombre scout.m.
15) En el menú Instrument, seleccionar System On. Dejar que la columna se
equilibre durante varios minutos.
252
Procedimiento
16) En el menú View, seleccionar Online Signals, Signal Window 1. Cuando

Zero Line.
18) Hacer clic en una de las señales disponibles y, a continuación, en la casilla
Add to the Selected Signals.
19) Ajustar el rango del eje Y a 100 mAU y la compensación a 10%. Hacer clic
en OK en la ventana.
20) Cuando la línea de base y la presión sean constantes, desplegar el menú
RunControl y seleccionar Sample Info….
21) Introducir el nombre del operador, el nombre del fichero (scout.d), el
(gradient) y cualquier información de comentario.
22) Iniciar el análisis desde la herramienta Start o desde el menú RunControl,
seleccionando a continuación Run Method.
23) Cuando haya finalizado el análisis, apagar la bomba haciendo clic en el
símbolo de bomba de la GUI.
253
Examinar el análisis de exploración
Examinar el análisis de exploración

1) Abrir la pantalla Data Analysis.
2) Seleccionar File, Load Signal.
3) Seleccionar el fichero de datos y cargar la señal.
4) En primer lugar, determinar si el acetonitrilo es suficientemente fuerte para
el análisis del gradiente. ¿Se eluyen todos los picos antes de los 20 minutos,
o se eluyen algunos picos entre 20 y 25 minutos?
5) Determinar si hay pérdida de tiempo al comienzo del cromatograma.
Calcular el %B necesario para eluir el primer pico cromatográfico a partir
del tiempo de retención y el valor de ∆%B/min. Por ejemplo, si el primer
pico se eluye a los 6 minutos de iniciarse el análisis:
5% + (6 x 95%/20 min) = 33,5 %B
Ésta será la nueva composición de %B inicial. Calcular el valor del análisis.

6) Determinar qué composición de gradiente final es necesaria para que se
eluyan todos los picos cromatográficos. Volver a inyectar la muestra.
7) Determinar si se puede manipular la inclinación del gradiente para mejorar
la resolución o la velocidad del análisis. También se puede cambiar el perfil
del gradiente de lineal a un gradiente de pasos múltiples.
8) Ahora que ya se dispone de un plan, volver a inyectar la muestra y
comprobar cómo se ha mejorado el gradiente. Asegurarse de dejar un tiempo
de reequilibrio adecuado para el gradiente entre cada análisis de prueba.
9) Continuar mejorando el gradiente, obteniendo una resolución mínima de
1,25 entre los dos picos más próximos. El instructor ha asignado un límite
de tiempo. Puede utilizarse cualquier parámetro del HPLC para mejorar el
análisis. Imprimir el cromatograma final y registrar el método de análisis
para presentarlo al instructor.
254
Análisis cualitativo y cuantitativo
• Los principios del análisis cualitativo.
• Los principios del análisis cuantitativo.
Figura 174
256
Análisis cualitativo
El objetivo de un análisis cualitativo es la identificación de un
compuesto en una mezcla de muestra.
Respuesta
?
?
?
?
Tiempo
Figura 175
El análisis cualitativo se puede dividir en dos situaciones diferentes. En una de

ellas se conoce lo que contiene una muestra y sólo se necesita identificar los picos
cromatográficos. En la otra situación se necesita identificar componentes
totalmente desconocidos. Cuando se conocen los picos, simplemente se puede
comparar el tiempo de retención de un patrón con el de los picos cromatográficos
analizados en las mismas condiciones. En el caso de los componentes totalmente
desconocidos, se necesitará ayuda adicional. Tal vez sea necesario recoger cada
pico mediante un colector de fracciones y, a continuación, llevar las muestras
separadas a un instrumento fuera de línea, como un IR, un NMR o un
espectrómetro de masas. El analista puede ser afortunado y disponer de una
técnica de identificación en línea, como la espectrometría de masas.
257
Identificación
Identificación
Análisis cualitativo - Identificación

Respuesta ?
• Tiempo de retención
? ?
• Respuesta
? ?
?
Tiempo
¿Cómo identificar?
Los analitos de HPLC se pueden identificar mediante los tiempos de retención y

sus características de respuesta.
Las características de respuesta dependen del detector:

• Detectores selectivos (MS, ECD, DAD, FLD)
• Detectores no selectivos (IR, detector de dispersión de la luz, detector
de UV visible)
Figura 176
Si se conoce la combinación de compuestos de la muestra y lo que se pretende es

identificar los compuestos, podrán analizarse los compuestos de referencia en las
mismas condiciones y compararse los valores k'.
Métodos de detección específicos, como la detección de fluorescencia o la
detección mediante matriz de diodos UV-VIS con capacidad de espectros, pueden
facilitar la identificación del compuesto.
258
Identificación
Análisis cualitativo - Identificación
Respuesta ?
? ?
? ?
?
Tiempo
¿Cómo identificar?
Enfoque práctico:
• Comparar el TR ( k’) de un pico desconocido (compuesto) con el TR (k’) de un

compuesto de referencia en las mismas condiciones de separación. Cambiar las
condiciones (fase estacionaria o fase móvil) e inyectar ambos (el compuesto
desconocido y el de referencia) y comparar ambos TR (k’).
• En el caso de un detector específico, comparar los resultados (espectros de masas y
UV) y los TR de los picos de referencia y del desconocido (compuesto).
Figura 177
Proceso práctico
Iniciar la separación en condiciones definidas y, a continuación, cambiar las
condiciones o los modos de separación.
Ejemplo
La primera separación se lleva a cabo en condiciones de fase inversa y el segundo
modo podría ser fase normal, exclusión de tamaño o una columna de fase inversa
diferente. Los resultados de ambas técnicas proporcionan información
característica de los compuestos (polaridad, tamaño).
El sistema HPLC debe haberse sometido a las tareas de mantenimiento adecuadas
para este tipo de análisis.
259
Identificación
Marcar la muestra
* Marcada con patrón puro de insulina
* ¿Insulina?
Identificación
0 7 10 15 20 25 30 min. 0 7 10 15 20 25 30 min.
* No es insulina
Añadir el compuesto de referencia a la
muestra desconocida y observar los
resultados de la respuesta y las
características del pico (colas, hombros,
TR, simetría, k’, etc.).
0 7 10 15 20 25 30 min.
Figura 178
En esta figura se muestra la técnica consistente en marcar la mezcla de muestra

desconocida con un patrón, con la esperanza de identificar uno de los
componentes de la muestra. El analista desearía saber si el pico cromatográfico es
insulina. Se añade insulina estándar a la mezcla desconocida y se vuelve a
inyectar. Si aumenta el tamaño del pico cromatográfico propuesto, el pico
desconocido podrá ser insulina. Si aparece un nuevo pico cromatográfico o se
encuentra un hombro en el pico en cuestión, el pico cromatográfico no será
insulina.
260
Identificación
Librerías espectrales de UV-VIS
¿Clorotorulón?
Tomar espectro de pico Imprimir el factor de coincidencia
Coincidencia: 998
Comparar con la librería
250 300 250 300

Longitud de onda (nm) Longitud de onda (nm)
Figura 179
La identificación de picos mediante el tiempo de retención únicamente, puede ser

poco fiable. Para asistirle en la identificación, el analista podrá crear una librería
espectral. El sistema de datos adquiere el cromatograma y los datos espectrales
del pico desconocido. Después del análisis, se integran las áreas situadas debajo
de los picos cromatográficos y se identifican los compuestos comparando los
espectros de los picos y los tiempos de retención con los de los patrones de una
librería del mismo disco. Si el programa encuentra una coincidencia categórica,
imprime el nombre del compuesto y el factor de coincidencia. Para la
comparación se utiliza un método estadístico.
261
Identificación
CID en fuente con moléculas pequeñas
684,65
Abundancia
Fragmentador = 75 voltios Triglicérido
8000
6000
4000
2000
439 467 502
m/z--> 350 400 450 500 550 600 650 700
Abundancia 684,65
Fragmentador = 175 voltios
8000
467 pérdida de ácido graso C12
6000
4000
439
pérdida de ácido graso C14
2000
411 495
m/z--> 350 400 450 500 550 600 650 700
Figura 180
Un espectrómetro de masas en línea puede ser muy útil para la determinación de

picos desconocidos. Las técnicas de ionización a presión atmosférica
proporcionan información del peso molecular y, a veces, también información
estructural. El segundo espectro de masas mostrado se adquirió utilizando la
disociación inducida por colisiones.
262
Análisis cuantitativo
Respuesta
2
3
4
1
6
Tiempo
¿Cantidad de compuesto 5?
Figura 181
263
El objetivo del análisis cuantitativo es determinar la cantidad de

un compuesto en función de los resultados cromatográficos.
Respuesta
2
3
1 4
6
Tiempo
10
Figura 182
¿En qué consiste la cuantificación?

Una vez integrados e identificados los picos, el siguiente paso del análisis es la
cuantificación. La cuantificación utiliza áreas o alturas de picos para determinar la
concentración de un compuesto en una muestra.
Un análisis cuantitativo engloba numerosos pasos, que se resumen brevemente a
continuación.
• Conocer el compuesto que se está analizando.
• Establecer el método para analizar las muestras que contienen este
compuesto.
• Analizar una o más muestras que contienen una o más concentraciones
conocidas del compuesto para obtener la respuesta debida a esa
concentración.
264
Como alternativa, se puede analizar una serie de estas muestras con diferentes
concentraciones de los compuestos de interés, si el detector utilizado tiene una
respuesta no lineal. Este proceso se denomina calibración multinivel.
• Analizar la muestra que contiene una concentración desconocida del
compuesto para obtener la respuesta debida a la concentración
desconocida.
• Comparar la respuesta de la concentración desconocida con la respuesta de
la concentración conocida para determinar la cantidad del compuesto que
está presente.
Para obtener una comparación válida entre la respuesta de la muestra desconocida
y la de la muestra conocida, los datos se deben adquirir y procesar en condiciones
idénticas.
265
5
Respuesta
2
3
1 4
6
Tiempo
Características de picos utilizadas para el análisis cuantitativo:

• Altura de pico
• Área de pico
Requisitos del cromatograma utilizado para la cuantificación:

• Picos bien separados (resolución)
• Respuesta del compuesto en el rango de linealidad del detector
• Sin hombros de picos ni colas (frentes) - buen rendimiento de pico
11
Figura 183
Se puede utilizar la altura de pico o el área de pico para análisis cuantitativos.

La precisión de la cuantificación se ve afectada considerablemente por la
resolución de los picos. Los picos bien separados pueden estar bien integrados,
porque otros picos no influyen en la altura ni en el área.
La simetría de los picos es asimismo una característica de rendimiento para
obtener un buen resultado cuantitativo. Los valores de simetría de picos
superiores a 3 no se pueden integrar correctamente.
Los hombros o colas/frentes de picos pueden ser el resultado de dos compuestos
no separados.
266
Altura de pico o área de pico para realizar

cálculos
Cambio del comportamiento del pico(%)
20 Área
15 • Las alturas de pico no se ven

afectadas por las variaciones del
10 flujo.
5 • El área de pico debe utilizarse para
Altura de pico picos con colas pronunciadas.
0
• Ambos son imprecisos, con un
volumen de inyección
-3 -6 -9 -12 -15
Cambio de la velocidad de flujo (%)
irreproducible.
12
Figura 184
Para la mayoría de los análisis de HPLC, la tabla de calibración se produce

utilizando áreas de pico, aunque en la mayoría de los casos pueden conseguirse
resultados equivalentes con alturas de pico. El área de pico es especialmente útil,
ya que los picos de HPLC pueden tener colas. Sin embargo, hay casos en los que
pueden ser mejores los cálculos de la altura de pico. Para análisis de trazas,
cuando el pico de interés es muy pequeño, se debe utilizar la altura de pico para
realizar los cálculos.
El diagrama anterior muestra cómo cambiarán las áreas de un pico cromatográfico
si cambia la velocidad del flujo. Hay que tener presente que si no se realizan
correctamente las tareas de mantenimiento del sistema de bombeo, la velocidad de
flujo será inestable y se producirá una pérdida de la precisión del área. Por esta
razón, siempre se debe realizar un mantenimiento rutinario de los sellos de la
bomba, comprobar las válvulas y los tamices, y asegurarse de cebar la bomba y
eliminar los gases disueltos.
267
En la cuantificación se utilizan tres

principios diferentes: 5
• Calibración de patrón externo R

• Calibración de patrón interno e
s
• Adición de patrón p 2
3
• %Área u
e
• %Norm s 4
t 1
a 6
Tiempo
13
Figura 185
El tipo de cuantificación depende de la finalidad del método. Cada método de

cuantificación tiene sus ventajas e inconvenientes.
268
Cálculo de %Área/Altura
Respuesta
2
3
1 4
6
Tiempo
En resumen, todas las alturas/áreas de pico son el 100%; el pico de interés se

calcula entonces como x%.
14
Figura 186
Área% y Altura%
El procedimiento de cálculo de Área% presenta el área de cada pico del análisis
como un porcentaje del área total de todos los picos del análisis. Área% no
necesita una calibración previa y no depende de la cantidad de muestra inyectada,
dentro de los límites del detector. No se utilizan factores de respuesta. Si todos los
componentes responden de la misma manera en el detector y se eluyen, Área%
ofrece una aproximación aceptable de las cantidades relativas de los
componentes. Área% se utiliza de manera rutinaria cuando los resultados
cualitativos son de interés, y también para producir información con el fin de
crear la tabla de calibración necesaria para otros procedimientos de calibración.
El procedimiento de cálculo de Altura% presenta la altura de cada pico del
análisis como un porcentaje de la altura total de todos los picos del análisis.
269
Ley de Beer y cuantificación
Lámpara de wolframio
Lente de
Lámpara
Io
log _____ = A = abc
acoplamiento
de deuterio
I
Lente de la
fuente (acromática)
I o = Intensidad de radiación incidente
Lente de soporte Matriz
I = Intensidad de radiación transmitida
Filtro de A = Absorbancia
óxido de
holmio Lente del
Celda de flujo espectro a = absorcividad molar
Rendija
b = longitud de paso
Red de difracción
c = concentración del soluto
La relación lineal entre la absorbancia y la concentración nos permite cuantificar

los desconocidos de forma precisa.
15
Figura 187
Uno de los detectores utilizados frecuentemente en el sistema HPLC es el detector

de absorbancia de UV. Independientemente de que adopte la forma de un detector
de longitud de onda fija, de longitud de onda variable o de matriz de diodos, la
cuantificación es posible porque la absorbancia de un componente de una muestra
es directamente proporcional a su concentración, según describe la ley de Beer.
Esta relación lineal permite al usuario crear una curva de calibración a partir de
patrones cuya concentración es conocida.
270
Patrón externo
Patrón externo
Cuantificación - Patrón externo
Principio:
• Los compuestos de referencia bien caracterizados se utilizan para
preparar disoluciones estándar de cantidades conocidas (concentración).
• Se determina la respuesta (área, altura).
• La respuesta se representa en relación con la cantidad conocida.
Respuesta Respuesta
Respuesta x
Cantidad
Cantidad x
16
Figura 188
El procedimiento ESTD es el procedimiento de cuantificación básico, en el que se

analizan muestras tanto de calibración como desconocidas en las mismas
condiciones.
Los resultados de la muestra desconocida se comparan entonces con los de la
muestra de calibración para calcular la cantidad presente en la muestra
desconocida.
El procedimiento ESTD utiliza factores de respuesta absolutos. Los factores de
respuesta se obtienen de una calibración y se almacenan. En los siguientes análisis
de muestras, se calculan las cantidades de los componentes aplicando estos
factores de respuesta a las cantidades de muestra medidas.
Una precaución que debe seguirse en este tipo de cálculo: el tamaño de la inyección de
la muestra debe ser reproducible de un análisis a otro, puesto que no existe ningún
patrón en la muestra para corregir las variaciones que se produzcan en el tamaño de la
inyección o en la preparación de la muestra.
271
Patrón externo
Curva de calibración
Una curva de calibración es una presentación gráfica de los datos de cantidad y de
respuesta para un compuesto obtenido de una o más muestras de calibración.
Normalmente se inyecta una parte proporcional de la muestra de calibración, se
obtiene una señal y se determina la respuesta calculando el área o la altura del
pico.
Con el gráfico de la curva de calibración debe proporcionarse un coeficiente de
correlación. El coeficiente de correlación es la raíz cuadrada del coeficiente de
regresión, y da una medida del ajuste de la curva de calibración entre los datos.
272
Calibración
Calibración
Calibración de patrón externo
La calibración de tres niveles es un requisito mínimo para

demostrar la linealidad de la curva de calibración
Respuesta
Calibración
de 3 niveles
Cantidad
3 concentraciones
Cantidad (Muestra ) = Respuesta x × RFx × M × D
17
Figura 189
La calibración multinivel se puede utilizar cuando no es suficientemente exacto

presuponer que un componente presenta una respuesta lineal, o para confirmar la
linealidad del rango de calibración. Cada nivel de calibración corresponde a una
muestra de calibración con una determinada concentración de componentes. Las
muestras de calibración deben prepararse de manera que la concentración de cada
componente varíe a través del rango de concentraciones esperadas en las muestras
desconocidas. De esta manera es posible tener en cuenta un cambio en la
respuesta del detector a la concentración y calcular los factores de respuesta en
consecuencia.
Esta curva de calibración multinivel tiene tres niveles y muestra un ajuste lineal a
través del origen. Este método de ajuste lineal a través del origen es similar a la
calibración de un único punto. Se presupone que la respuesta del detector a la
concentración es lineal. La diferencia entre los dos tipos de calibración radica en
el hecho de que, con el ajuste lineal, la pendiente de la respuesta del detector se
puede determinar mediante un ajuste óptimo a través de una serie de puntos, uno
por cada nivel.
273
Calibración
Cuantificación de muestras desconocidas

Una muestra desconocida es aquélla que contiene una cantidad desconocida del
compuesto que se desea cuantificar. Para averiguar la cantidad del compuesto
presente en la muestra desconocida, se debe:
• crear una curva de calibración para el compuesto,
• inyectar una parte proporcional de la muestra desconocida y ejecutar el
análisis exactamente de la misma manera que para la mezcla de
calibración,
• determinar, a partir de la señal, cuál es la respuesta, que es el área o la
altura del pico debida a la cantidad desconocida del compuesto, y
• utilizar la curva de calibración para calcular la cantidad del compuesto que
hay presente en la muestra desconocida.
274
Patrón externo
Patrón externo
Cuantificación - Calibración multinivel
Una curva de calibración multinivel asegura que la respuesta sea

proporcional a la cantidad de analito inyectado.
Parámetros influyentes:
• Respuesta de fondo (en blanco)
• Rango de linealidad del detector
• Integración del pico
Características de una calibración multinivel:

• LOD (Límite de detección) - relación señal/ruido ~ 3:1
• LOQ (Límite de cuantificación) - relación señal/ruido ~ 20:1
• Función de curva - lineal/cuadrática, etc.
18
Figura 190
Parámetros de calibración importantes

Una muestra que contenga una matriz compleja (p. ej., una muestra ambiental,
biológica) puede mostrar una respuesta con respecto a la matriz. Para determinar
la respuesta, debería analizarse en las mismas condiciones una muestra de la
matriz sin los compuestos de interés. El denominado "cromatograma en blanco"
se utiliza como punto de partida para determinar el límite de detección, LoD.
El LoD se define a menudo como una relación señal/ruido. La altura del pico se
compara con la altura del ruido del cromatograma en blanco.
El límite de cuantificación, LoQ, se define a menudo por la relación señal/ruido,
pero sus requisitos son mucho menos rigurosos. La razón radica en el hecho de
que los límites de aceptación (RSD%) del LoQ se encuentran en un margen más
pequeño que el del LoD.
También se debe determinar la linealidad de la calibración.
El margen de linealidad se define por encima del LoQ hasta el punto donde
termina la linealidad de ese método cuantitativo.
275
Patrón externo
Resumen de la calibración multinivel
Respuesta
Rango lineal
Pendiente
MQL Por ejemplo, RSD<10%, S/N > 20
MDL Por ejemplo, S/N > 3

Intersección
Cantidad
19
Figura 191
En el gráfico anterior se muestra el resumen del LoD y el LoQ con el margen de

linealidad y la intersección. La intersección es consecuencia de la respuesta de
fondo.
276
Norm%
Norm%
Cálculo de Norm%
Rfx × Área
Norm% = × 100
∑Rf Áreas
×
Requisitos:
Todos los componentes deben eluir y detectarse
Cantidad
Rf =
Respuesta
20
Figura 192
Cálculo de Norm%
En el método de normalización se aplican factores de respuesta a las áreas (o
alturas) de los picos para compensar los cambios de sensibilidad del detector para
diferentes componentes de la muestra.
El informe de Norm% se calcula de la misma manera que un informe de ESTD,
salvo que hay un paso adicional para calcular las cantidades relativas, y no
absolutas, de los compuestos.
El informe de Norm% tiene el mismo inconveniente que los informes de Área% y
Altura%. Cualquier cambio que afecte al área total del pico afectará al cálculo de
la concentración de cada pico individual. El informe de normalización sólo se
debe utilizar si se eluyen/desplazan y se integran todos los componentes de
interés. Si se excluyen picos seleccionados de un informe de normalización,
cambiarán los resultados presentados en la muestra.
La ecuación utilizada para calcular el valor Norm% de un componente "x" es la
mostrada más arriba.
277
Análisis de patrones internos
Cuantificación - Patrón interno

Principio:
Un componente bien caracterizado (patrón interno) que no está
presente en la muestra se añade en una concentración conocida a
muestras y soluciones estándar.
• Se calcula la relación de respuesta de ISTD y de analitos.

• La relación de respuesta se representa en relación con la
cantidad conocida.
ISTD Relación de
5
R respuesta
e
s
p 2
u 3
e 4
s 1
6
t
a
Tiempo
¿Cantidad de
compuesto 5? Relación de
cantidad 21
Figura 193
Cálculo de ISTD
El procedimiento ISTD elimina el inconveniente del método ESTD al añadir una
cantidad conocida de un componente que actúa como factor de normalización.
Este componente, el patrón interno, se añade a muestras tanto de calibración
como desconocidas.
El compuesto utilizado como patrón interno debe ser similar al compuesto
calibrado, tanto químicamente como en cuanto a tiempo de retención, pero debe
ser distinguible cromatográfica o electroferográficamente.
Si se utiliza el procedimiento ISTD para realizar calibraciones con una
característica no lineal, deberá procurarse que los errores resultantes del principio
de cálculo no provoquen errores sistemáticos. En calibraciones multinivel, la
cantidad del compuesto ISTD deberá mantenerse constante, es decir, igual para
todos los niveles si la curva de calibración del compuesto no es lineal.
En el análisis del patrón interno, la cantidad del componente de interés se
relaciona con la cantidad del componente de patrón interno mediante la relación
de las respuestas de los dos picos.
278
Cuantificación - Patrón interno
Requisitos de un compuesto de patrón interno:
• Las propiedades físicas y químicas deben encontrarse

próximas a las del analito.
• El compuesto debe estar bien caracterizado y ser estable
(pureza, etc.).
• El compuesto debe estar bien separado del resto de los
compuestos en el cromatograma.
22
Figura 194
A menudo es difícil encontrar un patrón interno indicado para análisis de HPLC.

El mejor patrón interno es muy similar estructuralmente a la muestra desconocida.
Por consiguiente, el patrón interno tendrá características similares de detector y de
elución/preparación de la muestra. El patrón interno debe poder obtenerse
fácilmente y resolverse a partir de otros picos cromatográficos.
279
Cálculo del patrón interno
Respuesta x
Relación de respuesta =
Respuesta ISTD
Cantidad de x = (Relación de respuesta × RFx ) ×(Cantidad ISTD) × M × D
RFx = Factor de respuesta para el compuesto x

M = Factor de multiplicador (pureza del compuesto, etc.)
D = Factor de dilución
23
Figura 195
Calibración
1) Los puntos de calibración se construyen calculando una relación de cantidad
y una relación de respuesta para cada nivel de un determinado pico en la
tabla de calibración.
La relación de cantidad es la cantidad del compuesto dividida por la cantidad
del patrón interno a este nivel.
La relación de respuesta es el área del compuesto dividida por el área o la
altura del patrón interno a este nivel.
2) Se calcula una ecuación para la curva a través de los puntos de calibración.
Muestra desconocida
1) La respuesta del compuesto en la muestra desconocida se divide por la
respuesta del patrón interno en la muestra desconocida con el fin de obtener
una relación de respuesta para la muestra desconocida.
2) Se calcula una relación de cantidad para la muestra desconocida utilizando la
ecuación de ajuste de la curva determinada en el anterior paso 2, y la
cantidad real de patrón interno contenida en la muestra.
280
Criterios de calidad de la cuantificación
• Resultados exactos
• Resultados precisos
• Robustez
• LOD definido
• LOQ definido
• Rango de cuantificación Relacionados con la finalidad del método
definido
24
Figura 196
Los criterios de calidad para los análisis de patrones internos son muy similares a
los de los análisis de patrones externos.
281
Precisión y exactitud
• Precisión
Depende de la capacidad para
definir y controlar las condiciones
instrumentales del análisis.
• Exactitud
Depende de la calibración de
patrones fiables del sistema.
Exacto
Preciso
25
Figura 197
El blanco nos ofrece un excelente ejemplo de la diferencia entre precisión y

exactitud. Los dardos negros son más exactos que los dardos blancos, ya que
están más cerca de la diana. En el caso de nuestra muestra, una medida es más
exacta si se aproxima más al valor real. Los dardos blancos son más precisos
porque están más cerca los unos de los otros. Las medidas pueden ser inexactas y,
al mismo tiempo, ser muy precisas.
En el sistema HPLC, la inexactitud está relacionada con la manera en que se
prepararon los patrones o con la eficacia del propio método analítico. Una
precisión deficiente normalmente se puede atribuir al rendimiento del
instrumento. Si se detecta una pérdida de precisión del método analítico, tal vez
haya llegado el momento de realizar un mantenimiento rutinario del sistema
HPLC.
282
Hardware y materiales de relleno de las
columnas
Hardware y materiales de relleno de las columnas
• Los diferentes usos de las columnas de HPLC.

• El hardware de las columnas.
• Los materiales de relleno de las columnas.
• Cómo seleccionar el diámetro de partícula adecuado.
• Cómo seleccionar el diámetro interno de columna adecuado.
• Cómo seleccionar la longitud de columna correcta.
Figura 198
284
Hardware de las columnas
Columnas de HPLC
Fase móvil
Columna de
desde la protección
bomba
Precolumna Muestreador
La columna de protección Columna

La precolumna actúa sobre la fase actúa sobre la muestra para analítica
móvil para preacondicionarla cuando atrapar partículas y
el pH de la fase móvil es < 3 o > 7. componentes de muestras
La columna
retenidos con fuerza.
analítica lleva
a cabo la
Las columnas varían en los siguientes aspectos:
separación.
• Hardware
• Longitud
• Diámetro interno
• Material de la fase estacionaria
• Tamaño de partícula de la fase estacionaria Al detector
Figura 199
La columna de alto rendimiento utilizada en la cromatografía de líquidos es el

elemento central del sistema de HPLC. La separación de los componentes de la
muestra tiene lugar en esta columna. Las columnas analíticas de HPLC utilizadas
habitualmente tienen una longitud de entre 200 y 300 mm y un diámetro interno
de 4-5 mm. En los últimos años ha aumentado el interés por columnas con
menores diámetros internos y longitudes mas cortas, rellenas con partículas más
pequeñas.
Para proteger la columna analítica, se recomienda encarecidamente utilizar un
salva columna, que resguarda la columna analítica (más costosa) de las impurezas
y partículas. Cualquier componente de la muestra retenido con gran fuerza, que
podría ensuciar la columna analítica, quedará atrapado en el salva columna. Las
columnas de protección se llenan con la misma fase estacionaria que la columna
analítica. Tienen el mismo diámetro interno de columna y el mismo tamaño de
partícula, pero son muy cortas. Las columnas de protección se deben situar entre
el muestreador y la columna analítica. Para eliminar cualquier volumen muerto
adicional, deben seleccionarse columnas de cartucho que admitan tanto el salva
columna como la columna analítica en un portacolumna. Las columnas de
285
protección se deben sustituir periódicamente, a saber, cuando la presión del

sistema aumente debido a una obstrucción o cuando la forma de los picos sufra
debido a componentes retenidos con gran fuerza.
Una precolumna no es tan habitual como un salva columna. Esta columna se
utiliza para acondicionar la fase móvil antes de las columnas de protección y
analítica. La vida útil de una columna analítica se puede prolongar en el caso de
las columnas de sílice. La sílice se disuelve más fácilmente a niveles de pH
extremos, a elevadas fuerzas iónicas o con polaridades de fase móvil altas. En
estas condiciones, la precolumna saturará la fase móvil con ácido silícico. Las
precolumnas se sitúan antes del muestreador.
286
Hardware de la columna - Acero inoxidable

estándar
Relleno de
columna
Frita de filtro de
acero inoxidable
Capilar
Tamaño de poro
de 2 um
Figura 200
El hardware más habitual de las columnas de HPLC está fabricado de acero

inoxidable de calidad 316, que es un acero de cromo-níquel-molibdeno. Los tubos
de acero están perforados con muy alta precisión y pulidos. Las columnas se
cierran en ambos extremos con fritas cuyo tamaño de poro varía de acuerdo con el
diámetro de la partícula de soporte. Las fritas se mantienen en su posición
mediante las conexiones de los extremos de la columna. Las columnas son
resistentes químicamente a la mayoría de los disolventes y aditivos utilizados en
la HPLC, con la excepción de los iones de cloruro, que pueden picar las
superficies de acero inoxidable. Estas columnas resisten bien las presiones típicas
del sistema de HPLC.
Hay que tener en cuenta que no todas las conexiones de los extremos de las
columnas son iguales. Por consiguiente, debe seleccionarse la conexión capilar
indicada para la conexión del extremo de la columna. Por ejemplo, algunas
columnas utilizan conexiones Swagelock.
287
Hardware de columna - Columnas de cartucho
Soporte del cartucho de protección
Cartucho de protección
Frita PEEK/Junta
Columna de cartucho
Conexión del
extremo
Figura 201
Las columnas de cartucho se utilizan extensamente debido a su reducido coste y

fácil sustitución. La columna de cartucho se mantiene en su posición en el interior
de un portacartucho y se puede sustituir sin necesidad de herramientas,
normalmente en cuestión de segundos. A menudo, los portacartuchos admiten
tanto el cartucho analítico como el salva columna. Esta disposición elimina el
volumen muerto adicional que normalmente crean los tubos de conexión. El
propio cartucho suele ser más económico que una columna estándar de acero
inoxidable, aunque la compra inicial del cartucho y el portacartucho es más
costosa. Sólo se cambia el cartucho cada vez y, por tanto, se ahorra a largo plazo.
Se recomienda utilizar columnas de cartucho para aplicaciones de gran capacidad
que no necesiten más de varios miles de platos.
288
Materiales de relleno de columnas
Materiales de relleno de columnas - Sílice
Esférico
Soles de sílice Xerogeles
Irregular
Las partículas tienen un diámetro de
3 a 10 mm en las columnas estándar.
Figura 202
Habitualmente se utilizan partículas de sílice porosas como material de soporte de

HPLC para cromatografía por adsorción, y forman la base de numerosas fases
estacionarias modificadas químicamente para cromatografía de fase inversa, fase
normal, intercambio iónico, quiral y por exclusión de tamaño. La composición
química es SiO2 x H2O. La pureza de la sílice puede afectar a la reproducibilidad
cromatográfica.
Más arriba se muestran dos tipos de partículas, soles de sílice y xerogeles (geles
de sílice). Los soles de sílice se encuentran en los materiales de relleno Zorbax
Rx-Sil. Se aglomeran pequeñas partículas no porosas para formar una partícula de
3-10 µm. En presencia de formaldehídos y de calor, estas partículas se disuelven
juntas. Se han descrito como "canicas" que se funden juntas para formar una
partícula esférica. Los soles de sílice tienen por lo general menor área, porosidad
y reactividad superficial. La experiencia demuestra que los geles de soles de sílice
pueden ser menos solubles a niveles de pH superiores a 7 que los geles de sílice.
Otro tipo de partícula habitual es el gel de sílice (xerogel). El sol de sílice se
somete a un tratamiento de calor para crear una sílice porosa rígida. Este tipo de
289
partícula tiene mayor área y porosidad. A niveles de pH 7 y superiores, los geles

de sílice se disuelven fácilmente en la fase móvil.
Las características varían de un fabricante a otro, y por ello se producen geles de
sílice con diferentes formas, áreas, tamaños de poro y químicas superficiales.
Hay disponibles dos formas básicas, irregulares y esféricas. La trituración de los
xerogeles de sílice, seguida de su tamizado para obtener la distribución y el
tamaño de partícula adecuados, produce partículas irregulares. Aunque las
partículas irregulares son algo más económicas, se sabe que su eficacia es menor
que la de las partículas esféricas. También tienden a producir partículas muy
pequeñas que pueden obstruir la frita de salida de la columna. Por lo general son
preferibles las partículas esféricas.
Las columnas analíticas tienen tamaños de partícula con diámetros comprendidos
entre 3 y 10 µm. Las partículas grandes producen un mayor ensanchamiento de
bandas, provocando una resolución deficiente. Las partículas pequeñas pueden
causar elevadas presiones de columna. Los tamaños de partículas más utilizados
son de 3,5 – 5 µm.
290
Materiales de relleno de columnas - Distribución

del tamaño de las partículas
% de número
Diámetro de partícula, µm
Zorbax Rx-Sil
, , , , ,
Tamaño, µm , , , , ,
El material de relleno debería tener una distribución de

tamaño de partícula reducida.
Figura 203
Además del diámetro de las partículas, la distribución de los tamaños de las

partículas es asimismo una característica del material de relleno. La mayoría de
los rellenos utilizados en la HPLC tienen una distribución gausiana aproximada
en torno al diámetro de partícula medio. Naturalmente, cuanto más reducida sea
esta distribución, mejor y más eficiente será la columna. Si no se controla
estrechamente la distribución, las partículas grandes podrán producir un
ensanchamiento de bandas y las partículas muy pequeñas podrán obstruir las fritas
de 2 µm.
291
Materiales de relleno de columnas - Superficie

de sílice
OH OH OH OH OH OH
Si Si Si Si Si Si
O
O O
Silanoles libres Con enlaces Hidroxilado
H
de hidrógeno
O
H
O
H
O OH OH
Si Si
Si
Si O
Enlaces de siloxano
Grupos de
Grupos de silanoles con
silanoles geminales
agua adsorbida físicamente
Figura 204
La superficie del gel de sílice está cubierta de grupos de silanoles y enlaces de

siloxano que pueden interactuar con moléculas y formar la base de retención en la
cromatografía por adsorción. La química superficial también actúa como un sitio
de reacción para el enlace químico.
Los silanoles libres, en contraposición a los silanoles enlazados de hidrógeno o
hidroxilatados, pueden interactuar con los componentes básicos de la muestra,
produciendo picos cromatográficos con grandes colas. Los enlaces de siloxano
proporcionan un soporte rígido a la partícula de sílice.
292
Materiales de relleno de columnas - Fases

enlazadas
Poros
Cadena de carbono
con forma de cepillo
H3C Si CH3
Fase enlazada monomérica O OH
R1 R1 Si Si
Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl O O O
R2 R2
Figura 205
La reacción de un clorosilano con los silanoles de la superficie produce

numerosas fases estacionarias útiles. El clorosilano puede ser monoclorosilano,
diclorosilano o triclorosilano. Los monoclorosilanos producen materiales de
relleno monoméricos, que son sumamente eficaces, pero no tan fuertes como los
producidos a partir de diclorosilanos o triclorosilanos. Estas fases enlazadas se
denominan fases poliméricas enlazadas.
Las fases enlazadas son interesantes porque cambian la química superficial,
modificando por tanto la selectividad de la columna. También protegen el
elemento principal de sílice de la fase móvil. Además, protegen los componentes
de la muestra de los grupos de silanoles de actividad variable. Las fases enlazadas
son vulnerables a niveles de pH de 2 e inferiores.
La elección de fases monoméricas o poliméricas, el tipo de enlace (Si-R, Si-O-R,
Si-O-Si-R), la integridad del enlace y otros tratamientos de enlace químico
pueden producir fases estacionarias muy diferentes para la misma fase enlazada.
La fase estacionaria enlazada más habitual es el octadecilsililo, C18, que se
muestra en la figura anterior. Casi un 80% de todas las aplicaciones de HPLC
utilizan esta fase enlazada.
293
Materiales de relleno de columnas - Fases

enlazadas extensamente utilizadas
HPLC de fase inversa CH3
•C18 |
Las columnas de HPLC más utilizadas
•C8 -0-Si- R
•C4
|
Separaciones de proteínas
•C1 CH3
•Fenilo Dipolo débil - dipolo inducido
Interacciones con analitos polares Intercambio iónico
DEAE (dietilaminoetanol)
HPLC de fase normal o inversa QAE (aminoetilo cuaternario)
Carboximetilo
• CN Polaridad intermedia
Exclusión de tamaño
• NH2
HPLC de fase normal Glicerilpropilo
• Diol Separaciones de compuestos con

polaridades muy diferentes
10
Figura 206
En esta figura se muestran algunas fases enlazadas utilizadas habitualmente.

Obsérvese que las fases enlazadas difieren considerablemente no sólo en cuanto a
su polaridad, sino también en cuanto a su modo o mecanismo de separación.
294
Materiales de relleno de columnas -

Rendimiento mejorado de desoxinucleósidos
utilizando fase enlazada óptima
m AU G Zorbax SB-C18
12 T 92% A : 8% B
8 C
A
4
LC: HP1090
0
6 min
Columnas: 4,6 x 50 mm, 3,5 µM
Flujo: 1,0 ml / min.
A: 0,1% TFA -4
B: 90% MeOH:
10% H2O (0,1% TFA)
m AU G
Temp.: 30 °C 40
Detec.: 254 nm 30
T Zorbax SB-CN
20 C A 97,5% A : 2,5% B
10 2 min
0
0 2 4 6 8 m in
11
Figura 207
En el ejemplo anterior se muestra cómo la correcta selección de la fase enlazada

puede mejorar la selectividad de la separación en su conjunto.
295
Materiales de relleno de columnas -

Soportes de polímeros
Estireno Divinil benceno Estireno-divinilbenceno
CH = CH 2 CH = CH 2
- CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -
CH = CH 2 - CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -
Admiten:
● Fase normal e inversa
● Intercambiadores iónicos
● Cromatografía por exclusión de tamaño
12
Figura 208
Los soportes poliméricos, como el poliestireno-divinilobenceno, se utilizan a

menudo como soportes para aplicaciones de HPLC, especialmente en aplicaciones
de intercambio iónico y de exclusión de tamaño. El poliestireno con enlace
cruzado es el resultado de la copolimerización del estireno y el divinilobenceno.
La cantidad de divinilobenceno determina la amplitud del enlace cruzado y la
rigidez del gel. El poliestireno-divinilobenceno puede ser muy rígido y resistir
presiones de hasta 5.000 psi. Esta fase estacionaria es muy hidrófoba. Se puede
utilizar sin derivatización como una fase estacionaria de fase inversa resistente al
pH. El margen de pH (1-13) y la durabilidad son elevados. Lamentablemente, no
ofrece la eficacia de los geles de sílice, por lo que sus aplicaciones han sido
limitadas. La forma de los picos se puede mejorar en este modo mediante el uso
de THF/acetonitrilo. Se ha afirmado que esta combinación de fase móvil desactiva
los anillos aromáticos del poliestireno-divinilobenceno.
El poliestireno-divinilobenceno se aplica a menudo a la cromatografía de líquidos
de alto rendimiento de intercambio iónico y exclusión de tamaño. Se puede
realizar una modificación química para producir la fase deseada.
296
Tamaño de partícula
Tamaño de partícula - Efecto en la eficacia
Número de placas/metro/103
Teórico
3 -µm
N
5 -µm
10 -µm
Velocidad de flujo Velocidad de flujo de la fase móvil, ml/min

Columnas Zorbax SB-C8; d.i. de columna, 4,6 mm; ciprofloxacina; 22 °C
Fase móvil, 20% ACN/80% acuosa, 0,1% TFA
13
Figura 209
Uno de los parámetros más importantes de la columna es la elección del tamaño

de partícula de la fase estacionaria. En el gráfico anterior puede verse que, a
cualquier velocidad de flujo dada, cuanto más pequeña sea la partícula de la fase
estacionaria, mayor será la eficacia. Esta mayor eficacia se traducirá en una
resolución mejorada. ¿Por qué no utilizar entonces el tamaño de partícula más
pequeño posible? La respuesta radica en la presión en columna. Las partículas
más pequeñas dan como resultado retropresiones mayores.
Debido a la mayor eficacia conseguida con partículas más pequeñas, se han
desarrollado dos tipos de aplicaciones. En primer lugar, pueden utilizarse
partículas más pequeñas, pero mantener la misma velocidad de flujo que la de la
aplicación original. Esto da como resultado una mayor resolución, incluso con
longitudes de columna más cortas. En segundo lugar, se pueden utilizar las
partículas más pequeñas en columnas cortas a velocidades de flujo mayores. Este
tipo de columna se conoce con el nombre de "columna rápida o de alta velocidad"
y está disponible para aplicaciones de gran capacidad que necesitan una eficacia
moderada.
297
Tamaño de partícula - Efecto en la eficacia

y la resolución
300SB-C8 (4,6 x 50 mm) 1. Met Encefalina

6 2. Leu Encefalina
5µm 2 7 3. Angiotensina II
4. Neurotensina
1 5 5. RNasa
9 6. Insulina
3 4 10 7. Lisozima
8. Calmodulina
9. Mioglobina
8
300SB-C8 (4,6 x 50 mm)

3,5µm
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo de retención, min.
14
Figura 210
En este ejemplo, todos los parámetros del método se mantienen constantes,

excepto el tamaño de partícula de la fase estacionaria, que se reduce de 5 a 3 µm.
Obsérvese cómo se han conseguido algunas mejoras importantes en la resolución.
La mejora es pequeña, pero puede ser bastante significativa cuando se intenta
separar contaminantes pequeños de un pico más grande.
298
Número aproximado de placas (N) y volumen

vacío (Vm) para columnas de 5 mm y 3,5 mm
Si se reducen simultáneamente la longitud de la columna (N ↓) y el

tamaño de partícula (N ↑), se podrá:
– Mantener la resolución
– Reducir el tiempo de análisis
– Reducir el uso de disolventes
Tamaño de la Número de placas Volumen vacío

columna (N) (Vm)
4,6 x 250 mm 5-µ m 20.000 2,5 ml
4,6 x 150 mm 5-µ m 12.000 1,5 ml
4,6 x 150 mm 3.5-µ m Resolución rápida 20.000 1,5 ml
15
Figura 211
En la tabla anterior se muestra cómo al reducir el tamaño de partícula se sigue

manteniendo la eficacia, incluso con una longitud de columna reducida. La
columna de 4,6 x 250 mm y 5 µm tiene la misma eficacia que la columna de 4,6 x
150 mm y 3,5 µm, con 20.000 platos. Entre las ventajas cabe citar un menor
tiempo de análisis y uso de disolvente.
Nota: Los tamaños de partícula de 3,5 µm permiten utilizar fritas de 2 µm, que son
menos propensas a obstruirse que las fritas de 0,5 µm utilizadas con tamaños de
partícula más pequeños.
299
Aumentar la velocidad de análisis mientras se

mantiene la resolución
5 mm 3,5 mm 5 mm 3,5 mm
Dimensiones 250 x 4,6 mm 150 x 4,6mm 150 x 4,6 mm 75 x 4,6 mm
40% 50%
Tiempo de 30 min Reducción18 min 18 min 9 min
análisis (min) Reducción
40% 50%
Residuo de 30 ml 18 ml 18 ml Reducción 9 ml
Reducción
disolvente
(ml)
N 20.000 20.000 12.000 10.000
Sin modificar 9% de diferencia
16
Figura 212
En las figuras anteriores se resume el ahorro de tiempo de análisis y de disolvente

que puede conseguirse si se reduce el tamaño de partícula y la longitud de la
columna mientras el resto del método de análisis permanece invariable.
300
Conseguir todo el potencial con mayor

velocidad de flujo
Presión mAU Rs2,1 = 2,2 Velocidad
300 Rs7,6 = 2,2 de flujo
200
90 bar 100
0 2 ml/min
mAU
300
200
133 bar 100
0 3 ml/min
mAU Rs2,1 = 2,1
300 Rs7,6 = 2,2
200 30 seg
181 bar 100
0 4 ml/min
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0.6 0.7 0.8 0,9 min
Zorbax SB-C18, 3,5 µm, 4,6 x 30 mm
17
Figura 213
Debido al aumento significativo de la eficacia con tamaños de partícula más

pequeños, es posible incrementar la velocidad de flujo del análisis y seguir
obteniendo números de platos y resoluciones resultantes equivalentes. Estas
columnas rápidas, de alta velocidad o de resolución rápida pueden ser bastante
útiles para agilizar las operaciones en el laboratorio. Obsérvese que la resolución
no se reduce significativamente al aumentar la velocidad de flujo de 2 a 4 ml/min.
El inconveniente es que el incremento de la velocidad de flujo produce presiones
en columna más elevadas. La presión y fricción añadidas pueden producir un
calor considerable en el interior de la columna y someter la fase estacionaria a una
degradación más rápida.
301
Consideraciones especiales con tamaños de

partícula reducidos
300SB-C8 (4,6 x 50 mm)

Celda de flujo semimicro
(5 uL)
Absorbancia
Celda de flujo normal

(13 uL)
Tiempo (min)
18
Figura 214
Una de las ventajas de utilizar columnas más cortas con un tamaño de partícula
reducido es la disminución de la dispersión de picos. El volumen de un pico es
una función tanto de la columna como del instrumento. La columna provoca
dispersión a través de procesos de difusión y de la resistencia a la transferencia de
masas. El propio volumen de inyección también puede contribuir a la dispersión
de picos. El instrumento provoca dispersión en cada uno de los volúmenes a
través de los cuales pasa la muestra mientras se desplaza desde el muestreador
hasta la salida de la celda del detector. Debe asegurarse que el cromatógrafo de
líquidos tenga tubos cortos y estrechos, con un diámetro interno de 0,12 mm,
conexiones adecuadas, y una celda de flujo de baja dispersión. En el ejemplo
anterior puede verse que la resolución obtenida de la columna se puede perder
cuando se utiliza la celda de flujo normal. Afortunadamente, ahora son habituales
las microceldas de flujo y las semi-microceldas de flujo. En el caso del sistema de
HPLC Serie 1100, la semi-microcelda de flujo es una opción.
302
Diámetro de columna
Columnas con diámetro interno pequeño

y muy pequeño Convencional
dp = 10 dµm
4,6 mm 1,00 ml/min
dp = 5 dµm
4,6 mm
0 2 4 6 8 10
Diámetro interno
muy pequeño
2,1 mm dp= 5 dµm 0,01 ml/min
o
1,0 mm 100 mm
200 mm
0 2 4 6 8 10
Ventajas:
• Consumo reducido de disolvente. Inconvenientes:
• Idóneas para análisis de trazas si la cantidad • La instrumentación debe tener un
de muestra es limitado. volumen externo a la columna muy bajo.
• Fácil conversión de velocidad de flujo para • Las fritas se deben cambiar con más
cambiar el método de columna analítica a frecuencia.
columna de diámetro muy pequeño.
19
Figura 215
Una columna convencional de HPLC tiene un diámetro interno de 4,6 mm y

partículas de 5 µm. Puede disminuirse la dispersión en el interior de la columna
reduciendo el diámetro interno de la columna del sistema de HPLC. Por ejemplo,
una reducción del diámetro interno de 4 a 2 mm dará como resultado una
disminución del volumen del pico en un factor de cuatro. Siempre y cuando se
mantenga la velocidad de flujo lineal, todos los demás parámetros, como la
eficacia de la columna, la retropresión y el tiempo de análisis, no se verán
afectados por esta reducción. Las columnas con diámetros internos pequeños
(2,1 mm) o muy pequeños (1,0 mm o menos) muestran una mayor capacidad de
detección y menor consumo de disolvente que las columnas estándar. Además, las
menores velocidades de flujo utilizadas con estas columnas resultan indicadas
para algunas técnicas concatenadas de HPLC. Las columnas con diámetros
internos estrechos resultan especialmente útiles cuando existen limitaciones en
cuanto a la muestra. Un método para una columna con un diámetro interno de
4,6 mm se puede transferir a columnas con diámetros internos menores utilizando
una sencilla conversión de velocidad de flujo. Algunos de los inconvenientes son
los requisitos de un menor volumen muerto de la instrumentación y la obstrucción
de la frita del inyector de la columna.
303
Velocidades de flujo típicas
d.i. de columna Flujo

(partículas de 5 µm ) ml/min
4,6 1 –2
3,0 0,4 - 0,8
2,1 0,2 – 0,4
1,0 0,05 – 0,09
2
Vel. flujonueva columna = d.i. nueva columna Vel. flujocolumna original
d.i. columna original
20
Figura 216
Para columnas con un diámetro interno de 4,6 mm, los números de platos se
maximizan a aproximadamente 1,5 ml/min para partículas de 5 µm. Para
mantener la misma velocidad lineal en una columna con un diámetro interno
diferente, se ajusta la velocidad de flujo en la relación de las áreas de la sección
transversal (o el cuadrado de los diámetros internos), tal y como se muestra en la
figura anterior. Por tanto, para una columna de calibre estrecho con un diámetro
interno de 2,1 mm, rellena de partículas de 5 µm, la velocidad de flujo que
corresponde a 1,5 ml/min es 312 µl/min. Esta cifra es aproximadamente el 20%
de la velocidad de flujo para la columna con un diámetro interno de 4,6 mm.
Por consiguiente, para un cromatograma con un tiempo de análisis total de unos
5 minutos, la columna con un diámetro interno de 2,1 mm sólo necesita 1,5 ml,
mientras que la columna con un diámetro interno de 4,6 mm necesita 7,5 ml.
De esta manera se abarata el uso de disolvente y su eliminación.
304
Utilización de columnas de diámetro interno

estrecho para tamaños de muestra limitados
4,6 mm d.i. 2,1 mm d.i.
0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo de retención, min. Tiempo de retención, min.
2 µl inyectado en cada columna
21
Figura 217
Los volúmenes de pico reducidos de los componentes en columnas de calibre

estrecho significan que, cuando los componentes eluyen, están más concentrados.
Esto es así sólo si se mantiene el volumen de la muestra y la dispersión externa a
la columna es insignificante. La ley de Beer establece que los detectores de
absorbancia producen señales que son proporcionales a las concentraciones de
los componentes de la fase móvil. Por tanto, las columnas de calibre estrecho
producen picos de mayor intensidad debido a las mayores concentraciones. De
hecho, el aumento de la concentración se obtiene de la relación de los cuadrados
de los diámetros de las columnas: un pico es 4,8 veces más intenso en una
columna con un diámetro de 2,1 mm que en una columna de 4,6 mm con la
misma longitud y el mismo tamaño de partícula.
305
El volumen del pico disminuye cuando

disminuyen Vm y la retención
Dimensiones Volumen Volumen de pico

de la columna vacío ( µ L)
(ml) k=1 k=3 k=5
4,6 x 150 mm 1,50 114 229 343

1,0 ml/min
3,0 x 150 mm 0,64 46 92 137
0,4 ml/min
2,1 x 150 mm 0,28 23 46 69
0,2 ml/min
22
Figura 218
Los datos anteriores muestran que los picos eluyen de columnas con un calibre
estrecho en volúmenes mucho más pequeños y con una dispersión mucho menor
y, por consiguiente, con una dilución mucho menor.
306
Separación de alta resolución utilizando una

columna de diámetro interno estrecho
Columna ZORBAX 300SB-C8, 2,1 x 150 mm, 50 pmol BSA

Tryptic Digest en 4M de urea, 50 ºC, 0,2 ml/min., UV-214 nm, A:
0,1% TFA en agua, B: 0,1% TFA en acetonitrilo/20% agua,
Gradiente: 2-62% B en 70 min.
23
Figura 219
Aunque las columnas de calibre estrecho reducen los volúmenes de los picos, no
afectan a la resolución. A pesar de ello, es posible conseguir separaciones
impresionantes utilizando las columnas de calibre estrecho. La preparación de una
proteína pura exige a menudo mucho tiempo y es muy costosa. Se puede limitar la
cantidad de la muestra. Las columnas de calibre estrecho permiten la separación
de cantidades pequeñas con una excelente capacidad de detección, debido a los
reducidos volúmenes en los que los picos eluyen de la columna. La separación
mostrada anteriormente tiene más de 100 picos. La columna de calibre estrecho
aporta una capacidad de detección aproximadamente cinco veces mayor que la de
la columna con un diámetro interno de 4,6 mm. Las alturas de pico para 50
picomoles de muestra en la columna de calibre estrecho son aproximadamente las
mismas que para 250 picomoles en la columna de calibre normal.
A pesar de que el tiempo de análisis es largo, se utiliza muy poca fase móvil. Por
tanto, el equipo de HPLC puede funcionar de manera desatendida durante largos
periodos con el contenido de un único depósito.
307
Longitud de columna - Adaptar la longitud

a la resolución deseada
SB-C18
4,6 x 15 mm los 7 componentes se descomponen en menos de 1 min
Condiciones: LC: Hewlett-Packard HP1100

Columnas: Zorbax SB-C18, 3,5 µm
Fase móvil: 1 mM octano ácido sulfónico, Na sal, pH 2,5: ACN (80:20)
4,6 x 30 mm UV:
Vol. de inyección:
275 nm; flujo: 2,0 ml / min.; 70 °C
1 µl
Absorbancia
Muestra: 4. Acetanilida
1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol) 5. Aspirina (ácido acetilsalicílico)
2. Cafeína 6. Ácido salicílico
4,6 x 50 mm 3. 2-Ac2-Acetoamidofenol 7. Fenacetina (acetofenetidina)
4,6 x 75 mm
1 2
4,6 x 150 mm 3 4
5 6 7
0 1 2 3 4 5 6 7 8 m in
24
Figura 220
La selección de la longitud de columna adecuada permite controlar la eficacia y,

por tanto, la resolución. La eficacia aumentará en proporción con la longitud de la
columna. Cuanto más corta sea la columna, más rápido será el análisis. Por ello,
debe seleccionarse la longitud de columna que aporte la resolución necesaria, pero
no más.
308
Ejercicio de laboratorio: hardware de
columnas
Ejercicio de laboratorio: hardware de columnas

• Convertirá un método de una columna estándar a una columna de
diámetro pequeño con tamaño de partícula reducido.
• Probará tanto una columna con tamaño de partícula reducido como una
columna de diámetro pequeño. Comparará los resultados con una
columna estándar.
310
Materiales
Materiales
• 1 columna SB-C18, de 4,6 x 150 mm y 5 micras, número de referencia
883975-902.
• 1 columna SB-C18, de 4,6 x 150 mm y 3,5 micras, número de referencia
863953-902.
• 1 columna SB-C18, de 2,1 x 150 mm y 5 micras, número de referencia
883700-922.
• Mezcla de prueba, número de referencia 01080-68704, diluida 1:3 por
volumen.
canal B.
• Un 1100 con todos los módulos encendidos.
Nota: Tal vez tenga que intercambiar columnas con otros grupos durante el experimento.
311
Columna estándar
Columna estándar
1) Instalar la columna C-18 de 4,6 x 150 mm con partículas de 5 micras.
2) Insertar la muestra de la mezcla de prueba en la posición de vial 1.
3) Ir a la pantalla Method and Run Control.
creación del método (Method, Load Method). En el menú Method,
seleccionar Edit Entire Method..., o bien seleccionar la herramienta Edit
Entire Method.
5) Seleccionar únicamente las secciones Instrument/Acquisition y Run Time

Checklist para editarlas. Hacer clic en OK en este panel.
6) Cumplimentar los siguientes parámetros del sistema de reparto de disolvente
y continuar con los parámetros de inyección.
312
Columna estándar
7) Cumplimentar los datos de las ventanas DAD Signals y Column Thermostat

Method de la manera mostrada a continuación. Hacer clic en OK en estos
paneles.
313
Columna estándar
8) En la lista Run Time Checklist, seleccionar únicamente Data Acquisition.

9) En el menú Method, seleccionar Save Method As.... Asignar al método el
nombre standard.m.
10) En el menú Instrument, seleccionar System On. Dejar que la columna se
11) Ir al menú View y seleccionar Online Signals, Signal Window 1. Cuando
Zero Line.
13) Hacer clic en una de las señales disponibles y, a continuación, en Add para
añadirla al cuadro Selected Signals.
14) Definir un rango de 100 mAU para el eje Y y una compensación del 10%.
Hacer clic en OK en la ventana.
15) Cuando la línea de base y la presión sean estables, desplegar el menú
RunControl y seleccionar Sample Info....
16) Introducir el nombre del operador, el nombre del fichero (standar.d), el
(columna estándar) y cualquier información de comentario.
17) Iniciar el análisis desde la herramienta Start o bien desde el menú
RunControl y, a continuación, seleccionar RunMethod.
18) Cuando haya finalizado el análisis, apagar el sistema seleccionando System
Off. Este control se encuentra en el menú Instrument.
19) Ya se dispone de datos para la columna estándar. Ahora se pueden comparar
estos datos con los de una columna de diámetro pequeño con tamaño de
partícula reducido.
314
Calcular velocidades de flujo

1) En primer lugar, calcular las velocidades de flujo necesarias para convertir
un método de una columna analítica estándar a la columna de diámetro
estrecho. Utilizar la ecuación que aparece a continuación. La columna
estándar tiene un diámetro interno de 4,6 mm y un tamaño de partícula de 5
micras.
La columna de diámetro estrecho tiene un diámetro interno de 2,1 mm con
partículas de 5 micras. Las columnas con tamaño de partícula reducido
tienen partículas de 3,5 micras.
Flujo, columna estándar X (d.i. de columna pequeño)2 = Flujo, diámetro pequeño

(d.i. de columna estándar )2
Velocidad de flujo, diámetro pequeño =_______________________________
2) A continuación, calcular la velocidad de flujo que se puede utilizar con la

columna de tamaño de partícula reducido.
Flujo, columna estándar X Diámetro de partícula, columna estándar = Flujo

Diámetro de partícula, tamaño reducido
Velocidad de flujo, tamaño de partícula reducido = ______________________
315
Comparación de columnas
1) Obtener e instalar la columna de diámetro pequeño o la columna con tamaño
de partícula reducido.
2) Configurar los parámetros de adquisición utilizando las velocidades de flujo
calculadas correctamente, sin modificar los demás parámetros. Realizar el
análisis asegurándose de utilizar nuevos nombres de ficheros de datos para
cada análisis.
Comparación de datos
1) Ir a la ventana Data Analysis.
2) En el menú File, seleccionar Load Signal.
3) Localizar el fichero correspondiente a Standard.d y hacer clic en OK en el
panel.
4) Ir al menú Report y seleccionar Specify Report.
5) Seleccionar lo siguiente:
316
6) En el menú Report, seleccionar Print Report.

7) Anotar las alturas de picos y las áreas de picos en la tabla que aparece al
final del ejercicio de laboratorio.
8) Imprimir informes para los otros ficheros de datos siguiendo las
instrucciones indicadas anteriormente. Introducir las áreas y las alturas de
picos.
9) Ir al menú File y seleccionar Overlay Signal. Seleccionar uno de los
ficheros de datos que no estén cargados ya. Repetir el procedimiento con el
último fichero de datos.
10) Seleccionar File, Print, Selected Window. Debería imprimirse una copia de
los cromatogramas superpuestos.
317
Datos de los cuatro picos principales

Altura de pico
Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4
Estándar,
5 micras, d.i.
de 4,6 mm,
150 mm de
longitud
Diámetro
estrecho, d.i.
de 2,1 mm,
150 mm de
longitud, 5
micras
Tamaño de
partícula
reducido, d.i.
de 4,6 mm,
3,5 micras,
150 mm de
longitud
Área de pico
Columna Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4
Estándar
Diámetro
estrecho
Tamaño de
partícula
reducido
318
Platos
Columna Pico 4
Estándar
Diámetro estrecho
Tamaño de partícula reducido
Tiempo de retención del cuarto pico

Estándar
Diámetro
estrecho
Tamaño de
partícula
reducido
Resolución del último pico

Estándar
Diámetro
estrecho
Tamaño de
partícula
reducido
319
Preguntas
Preguntas
¿Qué conclusiones generales se pueden deducir de los datos?
320
Ejercicio de laboratorio: hardware de
columnas (ejercicio de laboratorio seco
opcional)
Ejercicio de laboratorio: hardware de columnas (ejercicio de laboratorio seco opcional)
En este ejercicio de laboratorio seco se utilizan ficheros de datos
adquiridos anteriormente.
En este ejercicio de laboratorio seco se utilizan

ficheros de datos adquiridos anteriormente.
• Convertirá un método de una columna estándar a una columna de diámetro
pequeño con tamaño de partícula reducido.
• Comparará los datos recogidos con columnas de diámetro pequeño y con
tamaño de partícula reducido.
322
Materiales
Materiales
Ficheros de datos: 5micron.d, particle.d, narrowb.d y short.d.
Los ficheros de datos se recogieron utilizando el siguiente método:

• Velocidad de flujo para columna de 5 micras, 4,6 mm de diámetro interno
x 150 mm = 2,00 ml/min
• Tiempo de parada = 5,50 min
• Disolvente = 30% de agua/70% de acetonitrilo
• Inyección estándar de 5 µL
• DAD 230 nm, 80 nm ref. 450 nm, 100 nm
• Temperatura de columna = 40 ºC
323

1) En primer lugar, calcular las velocidades de flujo necesarias para convertir
un método de una columna analítica estándar a la columna de diámetro
estrecho. Utilizar la ecuación que aparece a continuación. La columna
estándar tiene un diámetro interno de 4,6 mm y un tamaño de partícula de 5
micras. La velocidad de flujo fue de 2,00 ml/min. La columna de diámetro
estrecho tiene un diámetro interno de 2,1 mm con partículas de 5 micras. Las
columnas con tamaño de partícula reducido tienen partículas de 3,5 micras:
Flujo, columna estándar X (d.i. de columna pequeño)2 = Flujo, diámetro pequeño

(d.i. de columna estándar )2
Velocidad de flujo, diámetro pequeño =_______________________________
2) A continuación, calcular la velocidad de flujo que se puede utilizar con la

columna de tamaño de partícula reducido.
Flujo, columna estándar X Diámetro de partícula, columna estándar = Flujo

Diámetro de partícula, tamaño reducido
Velocidad de flujo, tamaño de partícula reducido = ______________________
324
Comparación de datos
2) En el menú File, seleccionar Load Signal.
3) Localizar el fichero 5micron.d y hacer clic en OK en el panel. Éste es el
fichero de datos de la columna estándar de 5 micras, 4,6 mm de diámetro
interno con una longitud de 150 mm.
4) Ir al menú Report y seleccionar Specify Report.
5) Seleccionar lo siguiente:
6) En el menú Report, seleccionar Print Report.

7) Anotar los datos necesarios al final del ejercicio.
8) Imprimir informes para los otros ficheros de datos siguiendo las
instrucciones indicadas anteriormente. Introducir los datos solicitados.
325
• Smallb.d (columna con diámetro interno de 2,1 mm y partículas de 5

micras)
• Particle.d (columna de 3,5 micras con 4,6 mm de diámetro interno y 150
de longitud)
• Short.d (columna de 3,5 micras con 4,6 mm de diámetro interno y 75 mm
de longitud)
9) Ir al menú File y seleccionar Overlay Signal. Superponer todos los ficheros

de datos.
10) Seleccionar File, Print, Selected Window. Debería imprimirse una copia de
los cromatogramas superpuestos.
326

Altura de pico
Pico 1 Pico 2 Pico 3 Pico 4
Estándar, 5 micras,
d.i. de 4,6 mm, 150
mm de longitud
Diámetro estrecho,
d.i. de 2,1 mm, 150
mm de longitud, 5
micras
Tamaño de
partícula reducido,
d.i. de 4,6 mm, 3,5
micras, 150 mm de
longitud
Corta, tamaño de
partícula reducido,
75 mm de longitud
Área de pico
Estándar
Diámetro
estrecho
Tamaño de
partícula
reducido
Corta
327
Platos
Columna Pico 4
Estándar
Diámetro estrecho
Tamaño de partícula reducido
Corta
Tiempo de retención del cuarto pico

Estándar
Diámetro
estrecho
Tamaño de
partícula
reducido
Corta
Resolución del último pico

Estándar
Diámetro
estrecho
Tamaño de
partícula
reducido
Corta
328
Preguntas
Preguntas
¿Qué conclusiones generales se pueden deducir de los datos?
329
Preguntas
330
Fase inversa
Fase inversa
• El mecanismo de fase inversa.

• Aplicaciones de la HPLC de fase inversa.
• La retención en una columna de fase inversa.
• Cómo seleccionar una fase móvil para HPLC de fase inversa.
• Cómo seleccionar una columna de fase inversa.
Figura 221
332
Fase inversa
Mecanismo de la HPLC de fase inversa
Definición y mecanismo de la separación de

fase inversa
La fase estacionaria es menos polar que la fase móvil.
Partición del mecanismo

O
Si HO
O
• Fase estacionaria
– Octadecilsililo
O
– Sililoctilo
Si
– Ciano
O
– Amino
O HO
– C4
Si • Fase móvil
O
HO
– Agua
– Disolventes orgánicos
– Tampones
O
Si – Modificadores
O
Figura 222
El modo de fase inversa de la HPLC se caracteriza por una fase estacionaria que
es más no polar que la fase móvil. Esto es lo contrario de lo que ocurre en la
HPLC de fase normal (cronológicamente, la primera técnica de cromatografía de
líquidos), que tiene una fase estacionaria que es más polar que la fase móvil. De
ahí que se acuñase el término "fase inversa".
En la HPLC de fase inversa, la fase estacionaria es normalmente una fase
enlazada hidrófoba como el octadecilsililo, C-18. Otras fases estacionarias de fase
inversa utilizadas habitualmente son el octilsililo (C-8), el butilo (C-4), el fenilo,
el ciano y el amino. Normalmente, el grupo funcional no polar está enlazado a un
soporte de sílice. También hay disponibles fases estacionarias de polímeros para
condiciones de pH duras.
333
Fase inversa
La fase móvil contiene habitualmente agua y un modificador orgánico para

compuestos neutros. Cuando ácidos débiles, bases débiles, ácidos fuertes o bases
fuertes forman parte de la muestra, se necesitan soluciones tampón y otros
aditivos para la fase móvil con el fin de mejorar la retención y la forma de los
picos. Aunque el agua es normalmente el componente que hace que la fase móvil
sea más polar que la fase estacionaria, se utilizan fases móviles no acuosas para la
separación de componentes completamente insolubles en agua, como los
triglicéridos.
La descripción clásica del mecanismo de fase inversa es la partición. Las
moléculas se dividen entre la fase de agua y la fase estacionaria. Cada partición es
una placa teórica. Si la molécula en cuestión es insoluble en la fase móvil de
agua/orgánica, pasará más tiempo dividida en la fase estacionaria no polar.
Debido a la falta de homogeneidad de la superficie de la fase estacionaria, el
mecanismo no se limita por entero a la partición. También son evidentes
interacciones específicas entre los silanoles residuales.
334
Fase inversa
Aplicaciones de la HPLC de fase inversa

La fase inversa es la opción idónea para:
• Compuestos neutros no polares y polares con un peso molecular
de menos de 2.000.
• “Homologs” y “Benzologs”.
• Ácidos y bases débiles.
• Ácidos y bases fuertes (HPLC de par iónico).
• Proteínas y péptidos.
Más díficil con:

• Aminas
• Compuestos no solubles
• en agua
Figura 223
Para los usuarios de cromatógrafos de líquidos, la HPLC de fase inversa es lo más
parecido a una fase estacionaria universal para moléculas pequeñas. Una columna
C-18 es normalmente la primera elección de los desarrolladores de métodos, con
algunas excepciones. La HPLC de fase inversa separa satisfactoriamente moléculas
neutras tanto polares como no polares con pesos moleculares inferiores a 2.000.
Incluso los homólogos y benzólogos se pueden separar en la línea de base. Los
homólogos pueden diferir de sus contrarios en una sola molécula de carbono.
La HPLC de fase inversa se puede extender a la separación de ácidos y bases
débiles añadiendo modificadores de fase móvil y soluciones tampón para
controlar la ionización de las moléculas de la muestra o enlazarlas a silanoles
residuales. Los ácidos y las bases fuertes se pueden separar utilizando un método
análogo a la HPLC de fase inversa, la HPLC de parejas de iones. Aquí se utilizó
un aditivo para realizar el enlace con los iones de la muestra, produciendo un
compuesto neutro para la separación.
La HPLC de fase inversa es una buena elección para separaciones de péptidos
y proteínas cuando se utilizan fases estacionarias alcalinas de cadena corta.
La separación de aminas precisa más atención, pero se puede realizar fácilmente
mediante el uso de aditivos, el control del pH o la utilización de columnas tratadas
especialmente. La HPLC de fase inversa no acuosa se puede emplear con
muestras extremadamente hidrófobas.
335
Fase inversa
Orden de retención
Orden de retención
Orden de retención para la HPLC de fase

inversa
Aminas, Aldehídos, Alcoholes Ácidos
> número Cetonas
de carbonos Fenoles carboxílicos
No saturados O
H H
Ramificados C NH2 C OH C OH
H H
Más
retenido
El menos
retenido
Mayor retención
Aumento de la solubilidad en agua
Figura 224
La estructura de las moléculas de la muestra ofrecerá pistas acerca de su orden de

elución. El orden de elución se rige por la solubilidad de la molécula en agua y
por el contenido de carbono. A continuación se incluyen algunas observaciones
relativas al orden de elución de la muestra.
1) Cuanto menos soluble en agua sea una muestra, mayor será la retención.
2) El tiempo de retención aumenta a medida que aumenta el número de átomos
de carbono.
3) Los compuestos de cadena ramificada eluyen con mayor rapidez que los
isómeros normales.
4) La falta de saturación reduce la retención.
5) El orden general de elución es el siguiente:
alifáticos > dipolos inducidos > dipolos permanentes > bases débiles >
ácidos débiles > ácidos fuertes.
Los compuestos iónicos eluyen por lo general con el volumen vacío de la
columna.
336
Fase inversa
Orden de retención
Predecir el orden de elución
O
C OH CH3 OH O
1. 2. 3.
C OH O
4.
CH2 O C OH
CH2 O C OH CH2
CH2 C OH CH2 CH2
CH2 CH2 CH2 CH2
1. CH3 2. CH3 3. CH3 4. CH3
Figura 225
Predecir el orden de elución de las moléculas de la muestra.
337
Fase inversa
Fases móviles
Fases móviles
Disolventes útiles para la HPLC de fase inversa
● Agua/Tampón
● Agua )XHU]DGH
Metanol
HOXFLyQ
●
● Acetonitrilo
● Isopropanol
● Tetrahidrofurano
Figura 226
Las fases móviles de fase inversa normalmente están formadas por agua o una
solución tampón acuosa con un disolvente orgánico que es miscible con el agua.
El agua o las combinaciones de agua/solución tampón son las fases móviles más
débiles. No es necesario añadir una solución tampón al separar moléculas de
muestras neutras. Se considera que los disolventes orgánicos son más fuertes que
el agua. Si se aumenta el contenido orgánico de la fase móvil, las muestras saldrán
antes de la columna. Si se aumenta el componente de agua de la fase móvil,
aumentará la retención. El cambio de la parte orgánica de la fase móvil puede
modificar la selectividad y, por consiguiente, el orden de elución de las muestras.
338
Fase inversa
Fases móviles
¿Cuáles son los mejores disolventes orgánicos

para la HPLC de fase inversa?
• Miscibles en agua
• Baja viscosidad
• Baja detección de UV
• Buena solubilización
• No reactivos químicamente
... el acetonitrilo es la mejor opción
Figura 227
¿Cómo se selecciona la mejor fase móvil para un análisis de fase inversa? En

primer lugar, el componente orgánico elegido debe ser miscible con el agua.
Todos los disolventes enumerados en la página anterior son miscibles con el agua.
En segundo lugar, es preferible una fase móvil de baja viscosidad para reducir la
dispersión. Esto normalmente descarta el uso de isopropanol, que es sumamente
viscoso. El disolvente debe ser estable durante largos periodos de tiempo. Este
criterio descarta el uso de tetrahidrofurano que, tras quedar expuesto al aire, se
degrada rápidamente. Los dos disolventes de fase móvil restantes son el metanol y
el acetonitrilo. El uso de ambos disolventes proporciona por lo general excelentes
características de retención. Sin embargo, el acetonitrilo tiene menor viscosidad y
menor límite de UV. El límite de UV del metanol es de 210 nm, mientras que el
del acetonitrilo es de 190 nm. Por estas razones, la mayoría de los analistas
empiezan el desarrollo de métodos de fase inversa con acetonitrilo.
339
Fase inversa
Fases móviles
Efecto de la fuerza del disolvente en el

espaciado entre bandas
100% ACN
80% ACN
60% ACN
50% ACN
40% ACN
45% ACN
min.
Figura 228
Para empezar a desarrollar un método de fase inversa de componentes de muestra

neutros, comenzar con una inyección de muestra al 100% del componente
orgánico. Empezar con 100% del disolvente fuerte para asegurar que los
componentes bien retenidos eluyan de la columna. Reducir el % del componente
orgánico en 205 hasta que empiece a verse la separación deseada. Realizar ajustes
de precisión con incrementos de cambio más pequeños. Debe recordarse que la
composición de la fase móvil es la herramienta más potente para conseguir
resolución.
Una alternativa al desarrollo escalonado de métodos mostrado aquí es el análisis
de exploración de gradiente.
340
Fase inversa
Fases móviles
Fuerza del disolvente

1100
60% MeOH
1000
900
800 40% Agua

700
mAU
600
500
400
300
200
100
10 15 20
Tiempo
(min)
800 1400
700
60% 2-Propanol 60% Acetonitrilo
1200
600
40% Agua 1000

40% Agua
mAU
mAU
500
800
400
600
300
200 400
100 200
Tiempo 10 15 20
Tiempo10 15 20
(min) (min)
10
Figura 229
En esta diapositiva puede verse que la misma composición de un componente

orgánico diferente de la fase móvil cambiará la retención. El metanol es el
componente orgánico más débil, seguido del acetonitrilo y el isopropanol.
341
Fase inversa
Fases móviles
Efecto de la fase móvil en el espaciado entre

bandas
BP
65% MeOH
u N 7 mM phosphate Muestra de 7 componentes
P DPP Zorbax XDB-C8
Ac
A
50% ACN
BP 7 mM phosphate
P
u= uracil
DPP
A N P= propranolol
Ac
BP = butilparabenceno
DPP = dipropilftalato
N= naftaleno
Ac = acenafteno
A DPP & N A= amitriptilina
BP
38% THF
P 7 mM phosphate
Ac
11
Figura 230
A menudo, al cambiar el componente orgánico de la fase móvil cambiará la

selectividad y mejorará la resolución. Si no se está satisfecho con la separación
conseguida con acetonitrilo y agua, podrá probarse con metanol y agua o THF y
agua. Otra posibilidad es mezclar acetonitrilo y THF. El THF acelera las cadenas
rectas con respecto a los compuestos cíclicos. También acelera los compuestos
con grupos de metóxidos. El acetonitrilo acelera los compuestos con ésteres.
342
Fase inversa
Selección de una columna
Selección de la columna de fase inversa
Se deben considerar las siguientes

cuestiones a la hora de seleccionar una
columna de fase inversa…
• Diámetro de columna
• Tipo de material de fase enlazada • Tamaño de partícula
• Partículas esféricas o irregulares • Longitud de la columna
• Hardware de columnas • Tamaño y volumen de poro
• Área de la superficie
• Densidad de la fase de enlace
• Empaquetado monomérico o
polimérico
• Tapado de extremo u otro
tratamiento
12
Figura 231
Supongamos que un analista opta por la fase inversa para su separación. Consulta
un catálogo de fungibles para seleccionar una columna de fase inversa y descubre
que el número de opciones es abrumador.
La primera decisión, y la más evidente, es el tipo de material enlazado. C-18 es la
elección más habitual debido a su estabilidad y alta retención. Por regla general,
cuanto menor sea la cadena de álcalis, menor será la retención. Las cadenas de
álcalis muy cortas son útiles para proteínas y biomoléculas grandes. Las columnas
de ciano son útiles cuando los compuestos que se desea separar difieren en cuanto
a su funcionalidad polar.
La mayoría de los materiales de relleno utilizados en la HPLC están basados en
partículas esféricas debido a su estabilidad y eficacia de columna. Las partículas
irregulares pueden provocar una elevada retropresión y no se consideran estables.
A la hora de elegir el hardware de la columna deberá tenerse en cuenta si el
análisis se realizará a lo largo de un periodo de tiempo considerable que exija
muchos cambios de columna. ¿Existen limitaciones en cuanto al coste? Si es éste
el caso, podrá considerarse el uso de columnas de cartucho, que serán más
económicas a la larga. Si se necesita la máxima eficacia para conseguir la
separación deseada, deberá seleccionarse el hardware de columna tradicional.
343
Fase inversa
La siguiente pregunta que podría plantearse el analista es si estará limitado por la

muestra. En caso afirmativo, debería seleccionar una columna estrecha o de
calibre muy pequeño. Hay que asegurar que la instrumentación disponible puede
cumplir los requisitos de baja dispersión.
A la hora de considerar el tamaño de partícula, se recomienda seleccionar una
columna con partículas comprendidas entre 3,5 y 5 µm. Es el mejor término
medio entre la longitud de columna y la eficacia que se obtiene con un tamaño de
partícula reducido. Se evitan los problemas de las fritas de columna de 0,5 µm, ya
que estas columnas utilizan fritas de 2 µm. Sin embargo, si se necesita una
separación rápida, y no alta eficacia, podría probarse con una columna muy corta
con partículas de 3 µm.
Muchos analistas empiezan el desarrollo de un método con una columna de 15 a
25 cm. Si el análisis no precisa una columna tan larga, deberá utilizarse
únicamente la longitud necesaria para realizar el trabajo, ya que de esta manera se
agilizará el análisis.
El tamaño de poro se debe seleccionar en función del tamaño de las moléculas de
la muestra. Los tamaños de poro deben ser, al menos, tres veces el tamaño de las
moléculas de la muestra. Esto significa que para moléculas pequeñas son
adecuados poros de 70 –120 c. Para moléculas grandes, como proteínas,
seleccionar un tamaño de poro de aproximadamente 300 c. El volumen del poro
es una indicación de la capacidad de la muestra y la robustez del soporte. Cuanto
mayor sea el volumen del poro, mayor será la capacidad de la muestra, pero más
frágil será el soporte.
Cuanto mayor sea el área, más retención se obtendrá con la columna. La carga de
carbono se refiere al porcentaje de átomos de carbono por peso por unidad de
material de relleno. Probablemente, cuanto mayor sea la carga de carbono, mayor
será la retención.
La densidad de enlace es un parámetro importante que indica lo hidrófobo que es
el material de relleno. Si una columna tiene una densidad de enlace superior a 3
µmol3/m2, la mayor parte de la superficie estará cubierta y se encontrarán algunos
grupos de silanoles libres para interacciones. Sin embargo, si se desea que las
interacciones específicas cambien la selectividad, deberá seleccionarse una
columna con baja densidad de enlace.
Los rellenos monoméricos y poliméricos, así como el taponado de los extremos,
se describen en las páginas siguientes.
344
Fase inversa
Selección de una fase enlazada
Columnas de fase inversa
CH2(CH2)16CH3 C-18, La más retentiva, hidrofóbica, resistente

Basadas en sílice R= La columna preferida
CH2(CH2)6CH3, C-8, resistente, menos retentiva que C18
CH3
(CH3)3 C-3, C-4, Proteínas y péptidos, menos estables y
Si O Si R
CH2(CH2)2CH3 retentivas
CH3
CN o (CH2)3CN Ciano, bastante resistente, la fase inversa más
polar, buena para grupos funcionales mezclados
NH2 o (CH2)3NH2 Amina, intercambiador de aniones débil, columna

de azúcar
Basadas en polímeros Diferencias de selectividad
Polestireno - divinilbenceno pH estable de 1 a 13, menos eficaz
13
Figura 232
La diferencia más evidente en las columnas de fase enlazada es el tipo de material

enlazado. La fase estacionaria de fase inversa más utilizada, con mucho, es el
octadecilsililo, C-18, una fase estacionaria robusta y con gran poder de retención.
C-8 es similar, pero con menor poder de retención. A veces se percibirán algunas
diferencias en el orden de elución entre C-18 y C-8, pero no a menudo. Los
hidrocarbonos de cadena corta, C-3 y C-4, no son estables, pero se utilizan para
análisis de proteínas y péptidos.
Las columnas de fenilo, ciano y amino mostrarán selectividades diferentes entre sí
y con respecto a C-18. La columna de ciano es bastante robusta y útil para la
separación de componentes de muestras que difieren en cuando a su funcionalidad
polar. La columna de amino es menos estable y se conoce tradicionalmente como
columna de carbohidratos o "azúcares". La columna de fenilo es más polar que
C-18 o C-8. Las nubes de electrones pi proporcionan interacciones con solutos
aromáticos.
Las columnas basadas en polímeros son conocidas por su capacidad para
permanecer estables a través de un amplio margen de pH. Su eficacia podrá ser
inferior a la de las columnas basadas en sílice.
345
Fase inversa
Separación de péptidos pequeños en fases

enlazadas diferentes
300 SB-C18
300 SB-C8
Condiciones:
Columnas: ZORBAX 300SB, 4,6 x 150 mm
Fase móvil: Gradiente, 0 - 26% B en 30 min.
A = 0,1% TFA en agua
B = 0,1% TFA en acetonitrilo
300 SB-C3 Temperatura: 240 °C
Muestra: 2 µg de cada péptido
Velocidad de flujo: 1,0 ml / min.
Detección: UV-210 nm
300 SB-CN
14
Figura 233
Los cromatogramas anteriores muestran las diferentes selectividades y retenciones

obtenidas con diversas columnas de fase inversa.
346
Fase inversa
Parámetros de columna
Ejemplos de parámetros de columna
b
Designación de Sílice admitida
la columna
Tipo de Tipo de Área de la Diámetro Porosidad,
b 3
superficie sílice superficie, de poro, cm /mL
2
m /g Å
Hypersil BDS-C8 A SolGel 170 130 0,65

c
Inertsil-C8 B SilGel 320 150 ND
Supelcosil ABZ+ A SolGel 175 120 0,60
Simetría-C8 B SilGel 340 100 0,84
YMC-Básico B SilGel 325 120 1,0
Zorbax XDB-C8 B SolGel 180 80 0,50
a Datos obtenidos de documentación comercial o de fuentes del fabricante

b Consúltese el texto para obtener la descripción asignada al tipo de sílice
c ND = no disponible
15
Figura 234
Más arriba se muestran algunos parámetros de columna típicos, que podrán

aparecer en cualquier catálogo de columnas. Los geles de soles se forman
mediante la agregación de soles de sílice. Se sabe que las sílices de tipo B tienen
silanoles asociados o enlazados. Se sabe que los geles de sílice, o sílices de tipo
A, tienen más silanoles residuales libres.
El área se refiere a la superficie tanto en el interior de los poros de las partículas
como en el exterior de las mismas. En otras palabras, es el área de la partícula de
la fase estacionaria que puede tocar una molécula de la muestra. Con fases
enlazadas podrán descubrirse diferencias de selectividad entre materiales de
relleno con áreas pequeñas y grandes. También se descubrirá que los rellenos con
áreas grandes tardan más en equilibrarse. Con una fase enlazada, el área no
determina necesariamente la capacidad de la columna.
El diámetro de poro elegido está relacionado directamente con el tamaño de las
moléculas de la muestra. Los poros más grandes permiten que las moléculas
grandes tengan acceso a la fase enlazada que se encuentra en el interior de los
poros, proporcionando la máxima capacidad de separación. Seleccionar tamaños
de poro de 150 c o inferiores para moléculas pequeñas. Los poros grandes, de
347
Fase inversa
300 c o mayores, se utilizan para muestras con un peso molecular superior a

2.000 uma.
La porosidad está relacionada tanto con el tamaño de poro como con el número de
poros. Cuanto mayor sea la porosidad, menos estable será la fase estacionaria. Las
columnas de exclusión de tamaño tienen una elevada porosidad, por lo que a
menudo tienen límites de presión menores que otras columnas.
348
Fase inversa
Efecto del tamaño del poro y el tamaño

molecular en el ancho de pico
Para pesos moleculares > 4.000, seleccionar un tamaño de poro grande.
0.2
300SB-C18 (300Å)
Ancho de pico 1/2

0.18
0.16 SB-C18 (80Å)
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
II
3. a B
a
.9 a
46 a
6 n
10 in
13 m
13 a
55 ali
27
84
00
12 C
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P.
Le
16
Figura 235
Los datos anteriores demuestran que la elección del tamaño de poro es importante
con moléculas más grandes. La difusión de la molécula se limita cuando el
tamaño de poro es muy similar al tamaño de la propia molécula.
349
Fase inversa
Fases enlazadas monoméricas y poliméricas
CH3
Si OH Si O Si R
CH3
CH3 Monomérica
Si OH + Cl Si R
Si OH CH
3
CH3
Si OH Si O Si R
CH3
Si O Si R
Si OH R
O
Cl Cl Si Polimérica
Si OH + Si OH O
Cl Si R OH
H 2O
Cl Cl Si O Si R
Si OH
17
Figura 236
Hay dos métodos para unir la fase enlazada a la superficie de sílice. Los
materiales de relleno monoméricos se enlazan utilizando un único punto de unión
a la fase enlazada. Como se muestra más arriba, se utiliza un monoclorosilano
para formar la unión única. El resultado se conoce como monocapa de tipo
cepillo. Imaginemos que cada unión es la cerda de un cepillo y se extiende
perpendicularmente hasta la superficie. El otro tipo de fase enlazada es un
material de relleno polimérico en el que se utiliza un diclorosilano o un
triclorosilano para unir la fase enlazada a la superficie. Se producen varias capas y
uniones.
Se considera que los materiales de relleno monoméricos son más reproducibles y
eficaces. Los materiales de relleno poliméricos son más estables en condiciones
ácidas y tienden a ser menos eficaces. La selectividad será diferente dependiendo
del tipo de relleno seleccionado.
350
Fase inversa
Enlace de columnas
Enlace de columnas
Tratamiento de silanoles residuales - Fases

protegidas estéricamente y con extremo taponado
Protegida ODS clásica
estéricamente convencional Convencional
(sin extremo (sin extremo (sin extremo
taponado) taponado) taponado)
* Es posible una división ácida del enlace (hidrólisis)
18
Figura 237
Una vez que se haya unido la fase enlazada a la columna, el fabricante podrá
realizar un paso de enlace adicional. Más arriba se muestran tres columnas muy
diferentes, aunque empiezan como materiales de relleno monoméricos.
A la derecha se muestra un material de relleno convencional. No es posible que
todas las funcionalidades del silanol se enlacen con la funcionalidad deseada de la
fase enlazada debido a un impedimento estérico. Los grupos de silanoles
residuales (a la izquierda) pueden reaccionar con moléculas polares de la muestra,
produciendo una retención más larga en comparación con las moléculas no
polares. Las muestras básicas pueden experimentar interacciones significativas
que producen picos con colas.
El taponado de los extremos es un proceso que consiste en enlazar cadenas de
hidrocarburos cortas a los silanoles libres después de las reacciones iniciales de la
fase enlazada. Este proceso reduce la formación de colas en compuestos polares y
básicos. Deben seleccionarse columnas con extremos taponados cuando se trabaje
con moléculas básicas o se desee obtener resultados más previsibles de fase
inversa. Deben seleccionarse columnas con extremos sin taponar cuando se
necesiten diferencias de selectividad con moléculas polares.
351
Fase inversa
Enlace de columnas
El tercer tipo de tratamiento de fases enlazadas mostrado a la izquierda es la fase

enlazada protegida estéricamente. Las características estéricas de las cadenas
laterales impiden que las moléculas puedan actuar recíprocamente con los
silanoles residuales. Otra ventaja es la protección del enlace de siloxano contra la
fase móvil ácida. Se sabe que las fases móviles ácidas hidrolizan el enlace de
siloxano unido a la fase móvil. El voluminoso silano puede ser di-isobutilo con C-
18 o di-isopropilo con C8, C3, CN y fenilo. Las columnas Zorbax StableBond son
un ejemplo de este tipo de columna.
352
Separaciones de fase inversa de muestras
iónicas
Separaciones de fase inversa de muestras iónicas
• Cómo controlar la retención de muestras acídicas débiles con

supresión de iones.
• Cómo facilitar la separación de bases débiles.
• Cómo separar una mezcla de ácidos débiles, bases y compuestos
neutros.
• Cómo separar ácidos y bases fuertes mediante la HPLC de par
iónico.
Figura 238
354
Separación de ácidos débiles
O O
R C O H + H 2O R C O + H3O+
Máxima retención Poca retención
O
R C O
O y O
R C O H O
R C O
R C O H
pH bajo pH alto
pH = pKa
Figura 239
Hasta ahora nos hemos centrado en la HPLC de fase inversa de componentes de

muestras neutras. La HPLC de fase inversa también es una técnica excelente para
la separación de muestras ionizables.
Un ácido débil en disolución puede existir en forma neutra o disociada. La forma
disociada está cargada negativamente. A un pH elevado, la molécula existirá en la
forma disociada. En este estado, la molécula es principalmente hidrófila y, por
tanto, la retención de la molécula será mínima. Algunas moléculas no presentarán
ninguna retención.
A medida que se reduce el pH de la fase móvil hasta el valor pK de la muestra, la
molécula existirá en forma tanto neutra como disociada. Cuando el pH de la fase
móvil se acerca al valor pK de la molécula de la muestra, aparecerán formas de
pico anchas e irregulares. A medida que se sitúa el pH entre 1,5 y 2 unidades de
pH por debajo del valor pK, la molécula existirá en forma neutra. En esta forma,
la molécula será más hidrofóbica y la retención será máxima.
Por lo general, el usuario del cromatógrafo ajustará el pH de la fase móvil de
modo que los ácidos débiles se encuentren en su forma neutra, para obtener la
máxima retención y precisión del tiempo de retención. Para ello se utiliza una fase
355
móvil cuyo pH sea aproximadamente 2 unidades de pH inferior al valor pK del

ácido débil. Esta técnica se denomina supresión de iones.
Sin embargo, debe recordarse que el margen de funcionamiento seguro de la
mayoría de las fases enlazadas basadas en sílice es un pH de 2 a 8. A valores de
pH extremos, se reducirá la vida útil de la columna.
356
La retención como una función del pH
10
O
9
R C O H
8
7
Básico débil
6
5
k’
4 Acídico débil
3
2
O
1
R C O
0
2 4 6 8
pH = pK pH
Figura 240
En este gráfico se muestra cómo varía la retención de un ácido o una base débil
dependiendo del pH de la fase móvil. Obsérvese que la retención varía
considerablemente cuando el pH de la fase móvil se acerca al valor pK del ácido
o la base. Esto significa que incluso cambios pequeños en el pH se traducirán en
cambios a veces significativos del tiempo de retención. El funcionamiento al valor
pK de estos ácidos y bases débiles, o a valores próximos, dará como resultado
tiempos de retención irreproducibles y formas de pico deficientes.
A diferencia de los ácidos disociados, que cuando están cargados se eluyen
rápidamente en la columna, las bases protonadas a menudo tienen tiempos de
retención largos y formas de pico deficientes. Este comportamiento de retención
se debe a la interacción con los silanoles residuales. No obstante, las separaciones
de compuestos básicos normalmente no se llevan a cabo en condiciones de
supresión de iones. El analista debería elevar el pH para producir la molécula
neutra. Las fases móviles con valores pH altos pueden dañar las columnas basadas
en sílice. La disolución de la sílice ocurre rápidamente por encima de un valor pH
8. Sin embargo, hay algunas columnas basadas en sílice que rinden mejor en estas
condiciones que otras. Las columnas basadas en polímeros son otra alternativa a
esta estrategia. Una precolumna también puede servir para saturar previamente la
fase móvil con la sílice disuelta, reduciendo los daños causados a la columna.
357
Soluciones tampón para el control del pH
Tampones
Rango del Rango del
Tampón pKa tampón Tampón pKa tampón
Fosfato Formiato 3,8 2,8 – 4,8
pK1 2,1 1,1 – 3,1 Acetato 4,8 3,8 – 5,8
pK2 7,2 6,2 – 8,2 Tris (hidroxinetil)
pK3 12,3 11,3 – 13,3 aminometano 8,3 7,3 – 9,3
Amonio 9,2 8,2 – 10,2
Citrato Borato 9,2 8,2 – 10,2
pK1 3,1 2,1 – 4,1 Pirolidina 10,5 9,5 – 11,5
pK2 4,7 3,7 – 5,7
pK3 5,4 4,4 – 6,4
Otros aditivos de fase móvil habituales
• Ácido acético
• Ácido fosfórico
• Ácido sulfúrico
• Ácido trifluoroacético (TFA)
5
Figura 241
Con el fin de controlar la retención de ácidos y bases débiles, debe controlarse

con precisión el pH de la fase móvil. Debe seleccionarse y prepararse
cuidadosamente un sistema de solución tampón adecuado. En la lista anterior
se muestran algunas soluciones tampón utilizadas habitualmente en la HPLC.
Una solución tampón sólo es fiable en los márgenes de pH dados.
La concentración de la solución tampón debe ser adecuada, pero no excesiva. Por
lo general, las soluciones tampón utilizadas en la HPLC tienen concentraciones
que oscilan entre 25 y 100 mM. Deben utilizarse componentes de solución
tampón de la más alta calidad. Se debe mantener un medidor de pH calibrado para
determinar la concentración de la solución tampón al valor pH correcto, o utilizar
soluciones tampón preparadas. Es necesario filtrar las soluciones tampón para
eliminar las partículas. Es importante refrigerar las soluciones tampón o
prepararlas según se necesiten, ya que muchas promueven el desarrollo
bacteriano.
358
Soluciones tampón para la consideración del pH
Soluciones tampón para la consideración del pH
Concentración del tampón
Separación de morfina, codeína y oximorfona

Fase móvil: (a) 80 vol %, (b) 40 vol %, y (c) 40 vol %
acetonitrilo en agua, todo a pH 6 con tampón de 2 mM de
acetato de sodio.
(a) (b) (c)
Columna A Columna B Columna C

Fase móvil: (a) 16 vol %, (b) 10 vol %, y (c) 7 vol % acetonitrilo en
agua; pH menor (3,5) y mayor concentración de tampón (25 mM).
(a) (b) (c)
Columna A Columna B Columna C

LC-GC, 6 (1987) 494
6
Figura 242
Las soluciones tampón no funcionarán correctamente a menos que su

concentración sea suficiente. En el ejemplo de la parte superior, la concentración
de la solución tampón no era adecuada. Obsérvense las formas de pico anchas.
Los tiempos de retención no son estables. En el ejemplo siguiente puede verse que
la forma del pico ha mejorado al utilizar una concentración de solución tampón
adecuada. Las concentraciones típicas de las soluciones tampón oscilan entre
25 y 100 mM.
359
.
Efecto del tipo de tampón en la estabilidad de la

columna
0.010 0.010
0.008 0.008
Amitriptyline Plate Height, cm

Toluene Plate Height, cm
0.006 0.006
A Phosphate
B Phosphate
Citrate Citrate
0.004 0.004
TRIS TRIS
0.002 0.002
0.000 0.000
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000
Column Volumes of Purge Column Volumes of Purge
Columnas: Zorbax XDB-C8 de 44,6 x 150 mm; purga: 20% ACN/80% 0,25 M
tampón, pH 7, 1,0 ml/min; prueba: 60% ACN/40% 0,01 M tampón de fosfato de
sodio, pH 7, 1,5 ml/min; 22 ºC
Figura 243
Los datos anteriores muestran cómo la elección de la solución tampón puede

afectar a la vida útil del material de relleno de la columna. Aunque una solución
tampón de citrato parece afectar menos a la vida útil de la columna que una
solución tampón de fosfato, la primera puede atacar a las piezas de acero
inoxidable del instrumento.
No hay que olvidarse de purgar todas las soluciones tampón del instrumento
y de las columnas cuando no se utilicen. La parada del flujo es lo peor que puede
ocurrirle al instrumento cuando la fase móvil contiene soluciones tampón. Las
temperaturas más elevadas también aceleran el deterioro de las columnas y otros
componentes del sistema HPLC cuando quedan expuestos a las soluciones
tampón y los modificadores de la fase móvil.
Debe evitarse que las fases móviles que contienen soluciones tampón se evaporen
hasta secarse en el interior del sistema de bombeo, ya que ello provocaría daños a
las válvulas proporcionales, los sellos de la bomba y los pistones. También puede
producirse una obstrucción permanente si se introduce una fase móvil nueva. La
solución tampón podrá no ser soluble y precipitarse.
360
Separación de bases débiles
Retención secundaria de aminas en silanoles

residuales
-Si-O- + R-3NH+ -Si-O-+HNR3 Interacción fuerte
-Si-OH + R3N -Si-O-+HNR3

Fosfato de
Trietilamina sodio
Piperazina pH de tampón
TEMED demasiado bajo
DMOA
Piperazina
El agente de bloqueo
no es suficientemente
fuerte
TEMED Establecer una

competición para los
silanoles residuales
30 60 90 120 150 180
Minutos
8
Figura 244
Los grupos de silanoles libres que se encuentran en la superficie de la fase

estacionaria provocarán interacciones secundarias no deseadas con las bases. En
el cromatograma superior se muestra un perfil típico de una base débil que actúa
recíprocamente con los silanoles residuales. La muestra está fuertemente retenida
y su forma de pico es deficiente. Si se añade un compuesto cuyas interacciones
con los silanoles libres sean más fuertes que con la muestra, podrán eliminarse las
interacciones entre los silanoles y la base. Uno de los modificadores utilizados
habitualmente es la trietilamina (TEA). La TEA se ha denominado agente de
taponado de extremos o de bloqueo dinámico. Normalmente, si se añaden
10 - 30 mM se reducirán o se eliminarán las interacciones.
En el ejemplo anterior, la fase móvil del primer cromatograma simplemente
contenía una solución tampón de fosfato sódico. En el segundo cromatograma se
utilizó piperazina como agente de bloqueo, pero no es suficientemente fuerte. En
el tercer caso se utilizó con éxito TEMED, N,N,N’,N’, tetrametiletilenodiamina.
Sin embargo, la TEA se utiliza habitualmente para este fin.
361
Bases débiles - Separación con cambio de pH
1 2 • Columna: 4,6 x
0,12 Fármacos diuréticos
0,10 1 Amiloride pH 3 A 150 mm, Zorbax
XDB-C8; flujo:
2 Cafeína
0,08 1,0 ml/min.; 24
3 Benzthiazide
0,06 ºC
0,04 3 • Fase móvil: A:
0,02 55% MeOH / 45%
0,00 0,025 M tampón
de fosfato de
0,10 2 sodio, pH 3,0. B:
0,08 1
pH 11 B 55% MeOH / 45%
0,05 M tampón de
0,06 1-metilo-piridina-
0,04 HCL, pH 11,0
0,02 3
0,00
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Minutos
Figura 245
En el ejemplo anterior, cuando se aumenta el pH de la fase móvil hasta un punto

en el que la base ya no está protonada, se reduce la interacción de la base débil
con los silanoles residuales. Obsérvese que ésta no es la línea de acción
recomendada para la mayoría de las columnas. Un pH superior a 8 dañaría la
mayoría de las columnas basadas en sílice, disolviendo la sílice. Es más
aconsejable añadir trietilamina a la fase móvil o utilizar una columna con
extremos taponados.
362
Las columnas con extremo taponado reducen la

retención secundaria
Columna de Columna con
sílice convencional extremo taponado
Admite la
sílice acídica Admite menos
la sílice acídica
10
Figura 246
En la parte de la izquierda del diagrama anterior se muestra una columna

convencional de sílice con una fase enlazada. Debido al impedimento estérico, no
todos los silanoles se enlazan con la fase enlazada deseada. Los silanoles libres
que permanecen en la superficie de la fase estacionaria dan lugar a interacciones,
a menudo no deseadas, con las moléculas de la muestra. En algunos casos podrá
ser ventajoso utilizar este mecanismo de separación adicional. Una columna C-18
con silanoles libres tendrá una selectividad diferente de la de otra columna C-18
sin silanoles libres. En otras circunstancias, especialmente con bases y
compuestos muy polares, las muestras podrán adsorberse en los silanoles libres.
El resultado podrá ser una forma de pico deficiente y tiempos de retención largos.
La reproducibilidad de la retención también podría variar de una columna a otra.
Los silanoles libres se pueden neutralizar con una unión covalente de una
molécula hidrofóbica pequeña. A menudo se enlaza trimetilclorosilano con los
silanoles libres. Un inconveniente de esta solución es que los trimetilsilanos se
hidrolizan fácilmente.
363
Separación mejorada con columna con extremo

taponado densamente - Método de USP para
metotrexato
Zorbax Eclipse
XDB-C18
1
(4,6 x 150 mm)
Flujo = 1 ml/min.
2 1. Ácido fólico (patrón interno)
Rs = 15,5 2. Metotrexato
N = 6800
Condiciones: LC: Hewlett Packard Series II 1090

Tipo original de columna L1 (3,9 x Columna: Zorbax Eclipse XDB-C18, P/N: 993967-902
300 mm) Fase móvil: ACN, pH 6.0, tampón de fosfato / citrato
Flujo = 2 ml/min.
(10:90)
Tampón: 0,2 M K2HPO4 : 0,1 M ácido cítrico (63:37)
1 Temp.: 23 °C; vol. de inyección: 10 µL (0,1 µg / µl); UV:
302 nm
Rs = 10,8 2
N = 2400
11
Figura 247
Los dos cromatogramas anteriores muestran las diferencias de retención para una
molécula básica en dos columnas C-18 diferentes basadas en sílice. La columna
utilizada para producir el cromatograma de la parte inferior tenía taponados sus
extremos. La columna de la parte superior estaba enlazada densamente y sus dos
extremos estaban taponados. Este tratamiento de columnas redujo la
disponibilidad de silanoles libres y, por tanto, la formación de colas y la retención.
364
Separación de ácidos y bases débiles
Separación de ácidos y bases débiles
Condiciones experimentales iniciales para la

separación de compuestos débilmente ionizables
Variable de separación Opción inicial
Columna
Dimensiones 15 (o 25) x 0,46 cm.
Tamaño de partícula 5 o 3,5 µm
Fase enlazada C18 o C8
Fase móvil
Disolventes A y B Tampón acuoso /ACN
%B Variable (k = 0,5 - 20)
Tampón 25 mM fosfato de postasio, pH ≤ 3
Aditivos 25 – 50 mM TEA o TEA acetato, si es necesario
Velocidad de flujo 1 – 2 ml/min.
Temperatura 40 °C
Tamaño de muestra
Volumen ≤ 50 µL
Masa < 25 µg
12
Figura 248
Las condiciones anteriores resumen las recomendaciones para la separación de

mezclas de muestra que contienen tanto ácidos como bases débiles. Las
soluciones tampón y los aditivos no afectarán a la retención de los compuestos
neutros.
365
HPLC de par iónico
HPLC de par iónico
HPLC de fase inversa por par iónico para ácidos

y bases fuertes
Fase enlazada Reactivo de par iónico
+
SO3 Na+ N H2PO4
Muestra
R
+ + O
SO3 H N R N
O C R
R
Bases separadas con: Ácidos separados con:

• Sulfonatos de alquilo • Alquilotrietilaminas cuaternarias
• Ácido trifluoroacético (TFA) • Trietilamina (TEA)
• Ácido heptafluorobutírico • Fosfato de tetrametilamonio (TMA)
(HFTBA) • Fosfato de tetrabutilamonio (TBA)
• Ácido hexanosulfónico • Acetato de trietilamonio (TEAA)
• Nonilamina
13
Figura 249
También pueden separarse ácidos y bases fuertes mediante HPLC de fase inversa.
La técnica se denomina cromatografía de par iónico o cromatografía de iones
emparejados (PIC). En la cromatografía de par iónico se añade un reactivo de par
iónico a la fase móvil. Este reactivo tiene una cola hidrofóbica y un grupo
funcional cargado. La cola hidrofóbica actúa recíprocamente con la fase
estacionaria de la columna C-18. La parte iónica de la molécula señala la fase
móvil más hidrófila. Las moléculas de la muestra y de la solución tampón
compiten para actuar recíprocamente con el grupo cargado utilizando un
mecanismo de intercambio iónico. Al añadir reactivos IPC aumenta la retención.
El grado de aumento de la retención depende de la hidrofobia y la concentración
del reactivo IPC.
Cuando hay presente suficiente reactivo de par iónico y el pH de la fase móvil es
tal que se ionizan las moléculas de la muestra, el mecanismo de retención se
convierte en intercambio iónico. A valores de concentración intermedios, el
mecanismo puede ser fase inversa e intercambio iónico.
El par iónico es más eficiente y, por tanto, a menudo es preferible al intercambio
iónico para la separación de muestras iónicas.
366
HPLC de par iónico
Aniones por HPLC de fase invertida por par

iónico
• Las fases móviles A y B

contienen reactivos de
par iónico
• C y D están tamponadas
14
Figura 250
En el ejemplo anterior se analizaron tintes sintéticos utilizando la cromatografía

de fase inversa con par iónico en una columna con la base desactivada. Se optó
por este mecanismo de separación para reducir los efectos de formación de colas
de los tintes altamente polares. Más arriba se muestra un ejemplo de estructura de
tinte.
Durante el desarrollo del método se evaluaron cuatro fases móviles diferentes.
Dos fases móviles fueron simples sistemas de solución tampón (C y D) y las otras
dos fases contenían reactivos emparejadores de iones (A y B).
Las fases móviles C y D (sólo solución tampón) muestran colas para compuestos
con grupos sulfónicos. Mediante la cromatografía por emparejamiento de iones,
A y B, se consiguió la separación de tintes con grupos funcionales diferentes y
estructuras químicas distintas, con un mínimo de colas o incluso sin colas.
Condiciones
Columna: 125 x 3 mm Hypersil BDS, 3 µm
367
HPLC de par iónico
Fase móvil
• A
A = 0,01 M NaH2PO4 + 0,001M tetrabutilamonio fosfato de dihidrógeno,
pH = 4,2, B = acetonitrilo
Gradiente
• B
A = 0,01 M NaH2PO4 + 0,001 M tetrabutilamonio sulfato de hidrógeno,
pH = 4,8, B = acetonitrilo
Gradiente
• C
A = 0,01 M acetato de amonio, pH = 4,9, B = acetonitrilo
Gradiente
• D
A = 0,01 M NaH2PO4, pH = 4,3
B = acetonitrilo
Gradiente
Para obtener más detalles, véase la publicación número 12-5964-3559E de

Agilent Technologies.
368
Optimización de la HPLC de par iónico
Optimización de la HPLC por par iónico
Parámetros de optimización: 20
• pH de la fase móvil
• Concentración de par iónico
• Elección del reactivo de par iónico 15
DECILO
• Composición de la fase móvil
capacidad
OCTILO
Factor de
10
5
HEXILO
BUTILO
0
0 20 40 60
Sulfato de alquilo
[mM]
15
Figura 251
Cuando se desarrolle un método de par iónico, deberá considerarse en primer

lugar la elección del reactivo de par iónico. La longitud de la cadena hidrofóbica
en el reactivo de par iónico controla la retención, pero rara vez induciría algún
cambio en el orden de elución.
Las concentraciones más altas de reactivo de par iónico normalmente causan
mayor retención para las muestras con carga opuesta. Esto es cierto hasta
aproximadamente 50 mM. A elevadas concentraciones de reactivo de par iónico,
las muestras neutras tienen tiempos de retención menores como consecuencia del
acceso más limitado a la fase estacionaria.
Podrán producirse cambios de selectividad cuando se cambie la composición del
componente orgánico. A menudo se utiliza metanol en la cromatografía de par
iónico debido a su retención y a razones de solubilidad del par iónico.
Las separaciones de parejas de iones son más sensibles a la temperatura que las
separaciones típicas de fase inversa.
El tiempo de equilibrado para el par iónico puede ser de 20 volúmenes de
columna, e incluso mayor. A menudo es difícil eliminar completamente el
reactivo de par iónico de la columna. Por consiguiente, muchos recomiendan que,
369
una vez que se haya utilizado una columna en el modo de par iónico, siempre
debería utilizarse en este modo. Los reactivos de par iónico con pesos moleculares
elevados son más difíciles de eliminar de la columna.
Debe utilizarse una columna con extremos taponados para eliminar los efectos de
los silanoles residuales.
Las impurezas de los reactivos de par iónico pueden causar líneas de base
inestables. El exceso de reactivo de par iónico se puede eluir y producir picos
espúreos.
370
Ejercicio de laboratorio: separación de
compuestos iónicos débiles mediante fase
inversa (ejercicio de laboratorio opcional)
Ejercicio de laboratorio: separación de compuestos iónicos débiles mediante fase inversa
(ejercicio de laboratorio opcional)

• Cambiará el pH de la fase móvil y estudiará el efecto de este cambio en un
ácido débil, una base débil y un compuesto neutro.
372
Materiales
Materiales
• 1 columna Hypersil ODS de 4,6 x 100 mm, 5 micras, número de
referencia 79916OD-554, o una columna SB-C18 de 4,6 x 150 mm, 3,5
micras, número de referencia 863953-902.
• Anilina, benzaldeído, y ácido benzoico como mezcla.
• Patrones – dos de los tres.
• Acetonitrilo de calidad HPLC en el canal B.
• Cuatro soluciones tampón de fase móvil facilitadas en el área común
del laboratorio.
pH 4,0, pH 4,7, pH 5,5 y pH 4,0 + TEA
373
Procedimiento
Procedimiento
1) Obtener la muestra de prueba, así como los patrones.
2) Configurar las siguientes condiciones para el análisis:
Flujo: 1,0 ml/min

%B 65% de tampón acuoso/35% de acetonitrilo
Horno 40 °C
Tiempo de parada:Ilimitado (detener el análisis cuando se eluyan los picos)
Vol. de inyec. 5,0 µL
Detector 260,20 450,100
3) Encender la bomba y equilibrar la columna durante varios minutos. Se
tardará más en realizar el equilibrado con tampones acuosos. Un equilibrado
correcto garantiza la obtención de los resultados deseados.
4) Inyectar cada uno de los solutos individuales según las condiciones del
análisis y, a continuación, inyectar la mezcla de la muestra. Obsérvense la
forma de los picos, los tiempos de retención y los órdenes de elución.
5) Repetir el procedimiento con cada una de las cuatro fases móviles.
Asegurarse de que la columna esté acondicionada correctamente antes de
realizar las inyecciones. Utilizar el pH 4,0 con TEA en último lugar.
6) Al final de todos los análisis, enjuagar la columna y el cromatógrafo de
líquidos con agua de calidad HPLC y, a continuación, con una mezcla de
50/50 de agua y acetonitrilo.
374
Preguntas
Preguntas
1) ¿Cómo cambió el orden de elución cuando cambió el pH?
2) ¿Afectó el pH de la fase móvil al ácido débil?
3) ¿Cómo se comportó la base durante los análisis? Explicar.
375
Preguntas
376
HPLC por intercambio iónico
• El mecanismo de separación por intercambio iónico.

• Cómo seleccionar la fase estacionaria del intercambio iónico.
• Cómo afecta el pH de la fase móvil a la separación.
• Qué factores afectan a la separación por intercambio iónico.
• Principios básicos de la cromatografía de iones.
Figura 252
378
Mecanismo del intercambio iónico
Mecanismo del intercambio iónico
Mecanismo de intercambio iónico
+
N H
Cl
Cl Mecanismo:
• Unión reversible de iones de la
Cl muestra a un soporte cargado
Cl
+
N H Fases estacionarias:
• Sulfonatos (SCX)
• Amonio cuaternario (SAX)
O
H
+ • Carboximetil (WCX)
• Dietilaminoetilo (WAX)
CH2 C
+
O H
Fases móviles:
+
• Tampones
O H • Ion contrario
CH2 C
• Modificadores orgánicos
O
Figura 253
La cromatografía de líquidos por intercambio iónico es una técnica de separación

utilizada para iones orgánicos e inorgánicos. La fase estacionaria es un polímero
rígido o sílice con grupos funcionales cargados enlazados a su superficie. El
mecanismo es similar a la cromatografía por adsorción. Los iones de la muestra
compiten con iones contrarios por ocupar los sitios cargados de la fase
estacionaria. Los iones de la muestra deben desplazar a los iones contrarios para
que se produzca la retención. La retención de la muestra es elevada cuando la
concentración de iones contrarios es baja. A medida que se aumenta la
concentración de iones contrarios, disminuye la retención.
Las resinas de intercambio iónico pueden ser resinas de intercambio aniónico
o catiónico. Las resinas de intercambio aniónico tienen un grupo cargado
positivamente unido al elemento principal de sílice o de polímero. Las resinas
de intercambio catiónico tienen un grupo funcional cargado negativamente.
379
Aplicaciones del intercambio iónico
• Aplicable a la separación de moléculas cargadas: desde

moléculas pequeñas a proteínas.
– amonio y aminas de bajo peso molecular
– compuestos de amonio cuaternario
– oxihaluros
– ácidos orgánicos débiles
– silicatos
– ácidos sulfónicos aromáticos y alifáticos
– carbohidratos
– aminoácidos
– proteínas
• La cromatografía de iones permite la separación y detección de:
– especies iónicas de traza, como: F-F-, Br-, Cl-, NO2-, NO3-,
HPO4-2, SO4-2, Li+, Na+, K+, Mg+2, Ca+2, Sr+2, Ba+2
Figura 254
La cromatografía por intercambio iónico es una técnica importante de HPLC para

la separación de iones inorgánicos (cromatografía de iones) e iones orgánicos.
Entre las aplicaciones en el área de la biología cabe citar las separaciones de
aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleósidos y nucleótidos. El intercambio
iónico también se utiliza en las industrias de productos de consumo para el
análisis de vinos, refrescos y aditivos de panadería. La industria química utiliza
esta técnica para aplicaciones que abarcan desde el análisis de baños de chapado
hasta el análisis de licores de desulfuración de gases combustibles. El aspecto
clave es que la muestra debe estar ionizada en la disolución. Las separaciones se
realizan específicamente para aniones o cationes, no para ambos tipos en el
mismo análisis.
380
Fase estacionaria
Fase estacionaria
Grupos funcionales de la fase estacionaria
SCX + SAX +
SO3 N
Na
SO3 Cl Cl
+ Los intercambiadores
Na
iónicos fuertes mantienen
+
SO3 + N su carga en un amplio
Na
margen de pH.
Cl Cl
Cl Cl
WCX WAX + Los intercambiadores
N H
O iónicos débiles mantienen
CH2 C +
O
Na su carga en un margen de
pH limitado.
O
+
CH2 C Cl Cl
N H
O +
Na
Figura 255
Las resinas de intercambio iónico se pueden dividir en cuatro categorías:

1) Intercambiadores catiónicos fuertes
2) Intercambiadores catiónicos débiles
3) Intercambiadores aniónicos fuertes
4) Intercambiadores aniónicos débiles
Los intercambiadores aniónicos y catiónicos fuertes mantienen su carga y,
por tanto, su capacidad de separación en un margen de pH muy amplio. Los
intercambiadores aniónicos y catiónicos débiles conservan su capacidad de
separación en un margen de pH mucho más reducido. Por consiguiente,
normalmente se prefieren los intercambiadores aniónicos y catiónicos fuertes.
Sin embargo, en el caso de aniones o cationes fuertes en una muestra, un
intercambiador débil podría resultar más útil. La retención de ácidos y bases
fuertes podrá ser demasiado fuerte, y la elución más difícil, con los
intercambiadores fuertes. La sensibilidad de los intercambiadores débiles
al pH contribuye a provocar la elución de los iones de la muestra.
381
Fase estacionaria
Los grupos funcionales cargados pueden enlazarse a sílice o a un polímero rígido.

Los polímeros son la opción preferida por razones de durabilidad. Resisten
márgenes de pH mucho mayores, y mayores fuerzas iónicas. A menudo se
prefiere el elemento principal de sílice debido a su tolerancia a los modificadores
orgánicos, su contracción o expansión mínima, su elevada capacidad y su
disponibilidad en una variedad de tamaños de poro.
382
Influencia del pH
Influencia del pH
Influencia del pH en la muestra
H H O pH = 1
H +N C C OH
H C
CH3 CH3
pH = 6
H H O
Carga neta = +1
H +N C C O
H C
pH = 11
CH3 CH3
H O
H
pk1 = 2,29 Carga neta = 0 N C C O
pK2 = 9,72 H
C
CH3 CH3
Carga neta = -1
Figura 256
El pH de la fase móvil no sólo se selecciona para mantener la carga en la fase

estacionaria, sino también para provocar la carga correcta en los iones de la
muestra. En el diagrama anterior se ve cómo una muestra que presenta sitios
ácidos y básicos puede cambiar su carga global al cambiar el pH de la fase móvil.
A un pH bajo (pH 1), el aminoácido (valina) tiene una carga de +1. Podría
separarse en un intercambiador catiónico a un pH muy bajo. Puesto que ni
siquiera los intercambiadores catiónicos fuertes se cargan a este pH, no se
utilizaría este método de separación. A un pH de 6, la carga molecular global es
cero. La muestra no resultaría indicada para el análisis de intercambio iónico.
A un pH de 11, la muestra tiene una carga global de -1. La muestra podría
separarse en una columna de intercambio aniónico fuerte.
383
Fase móvil
Fase móvil
Fase móvil del intercambio iónico
Tampón acuoso y/o sal - cualquier tampón habitual de HPLC (de 5 mM a 200 mM)
Intercambiador aniónico fuerte pH < 9 sal (de 0 a 1 M)
Intercambiador aniónico débil pH < 6
pH para capacidad total de
Intercambiador catiónico fuerte pH > 3 intercambio
Intercambiador catiónico débil pH > 8
Parámetros de separación:
Iones contrarios • pH de la fase móvil
Intercambio catiónico • Elección de ion contrario
• Concentración de ion contrario
Mg2+ > Ca2+ > NH4+ > Na+ > K+ (fuerza iónica)
Intercambio aniónico • Modificadores orgánicos
SO4-2 > HPO4-2 > Cl- > CH3COO- • Velocidad de flujo
• Temperatura
Figura 257
El intercambio iónico se lleva a cabo en una fase móvil acuosa tamponada. Ya se

ha descrito la importancia del pH de la fase móvil para la ionización de la fase
estacionaria y los iones de la muestra. Para mantener el pH correcto de la fase
móvil, se debe elegir una solución tampón. Algunas de las soluciones tampón más
habituales son: fosfato, acetato, citrato, formiato, MES, bis-tris, PIPES, BES
MOPS HEPES, tris, amoniaco, borato y dietilamina. El ion contrario puede
proceder de la solución tampón o ser una sal como NaCl añadida a la fase móvil.
NaCl se utiliza a menudo para el análisis de proteínas. Se aumenta la fuerza iónica
para reducir la retención de los iones de la muestra.
La selectividad se puede modificar cambiando el pH de la fase móvil, los iones
contrarios y la concentración de iones contrarios. Pueden añadirse modificadores
orgánicos para reducir las interacciones de la fase móvil de la muestra (elemento
principal). Normalmente se utilizan velocidades de flujo de 1 ml/min para una
columna con un diámetro interno de 4,6 mm. La temperatura afecta más a las
separaciones en la cromatografía por intercambio iónico que en otros modos.
384
Separación
Separación
Separación de proteínas mediante intercambio

aniónico fuerte
1
• Variar la fuerza iónica para

controlar la elución.
2
• La elución de gradientes es típica.
0 5 10 15
Tiempo (min)
Condiciones:
Columna: ZORBAX Bio-SAX, 6,2 x 80 mm
Fase móvil: Gradiente: de 0 a 100% B en 20 min.
A = 0,02; BIS-TIS, pH 7.0
B = A+1,0 M NaCl
Temperatura: Ambiente
Detección: UV-280 nm
Muestra: 20 ml de líquido ascítico de ratón
Picos: 1. IgG
2. Albúmina
Figura 258
La aplicación anterior muestra la separación de proteínas mediante la HPLC por

intercambio aniónico. Las condiciones normalmente no desnaturalizantes de la
HPLC por intercambio iónico proporcionan una excelente técnica de separación
de proteínas. La mayoría de las separaciones mediante intercambio iónico, como
la mostrada más arriba, son eluciones de gradientes. Se puede cambiar la
concentración de iones contrarios, el pH o la fuerza durante el análisis. La
mayoría de las separaciones se consiguen empezando con una fase móvil de iones
contrarios diluida y aumentando la concentración durante el análisis.
385
Cromatografía de iones
Cromatografía de iones - Iones inorgánicos
1. F-
2. HCO3-
3. Cl-
4. NO2-
Aniones 5. Br -
6. NO3-
7. PO4-3
8. SO4-2
Na2CO3 Aniones Intercambiador
inorgánicos aniónico Resina-H+ + Na+HCO3- Resin-Na+ + H2CO3
Columna de Supresor
intercambio iónico o membrana Detector de
Bomba conductividad
Intercambiador Resina-OH- + H+Cl- Resina-Cl- + H2O

Cationes
HCl inorgánicos catiónico
1. Li+
Cationes 2. Na+
3. NH4+
4. K+
5. Ca2+
6. Mg2+
Figura 259
Los iones inorgánicos también se separan en resinas de intercambio iónico. Las

aplicaciones son numerosas e incluyen agua potable y aguas residuales, el flúor de
dentífricos, nitratos en alimentos e iones en tierras, por mencionar algunas. Los
iones inorgánicos no se detectan directamente mediante un espectrofotómetro de
UV-Vis. Normalmente se utiliza el detector de conductividad para llevar a cabo
la detección. De lo descrito anteriormente podría deducirse que numerosas fases
móviles de intercambio iónico son asimismo muy conductoras. Por este motivo,
la detección de la conductividad no resultaría muy sensible para los iones de la
muestra. Para evitar este problema podría instalarse una membrana o columna
supresora después de la columna de intercambio iónico. El supresor convertirá los
iones de la fase móvil altamente conductora en tipos poco conductores o no
conductores, mejorando así la detección de los iones de la muestra. El supresor
deberá regenerarse al cabo de algún tiempo.
386
Cromatografía de iones - Columna única
Columna única:
• Detector de conductividad - utilizar un
intercambiador iónico con una capacidad
muy baja
• Detector de UV - detección indirecta de
UV
BOMBA
DETECTOR DE
CONDUCTIVIDAD
VÁLVULA DE CELDA
INYECCIÓN DE COLUMNA REGISTRADOR
MUESTRA
Detector de UV
RESIDUOS
10
Figura 260
Algunas operaciones de cromatografía de iones se realizan sin membranas ni

columnas supresoras. En el caso de la cromatografía de iones con una sola
columna, se elige la fase móvil de modo que contenga iones con una conductancia
muy baja. Además, en el detector se utiliza una compensación electrónica. Los
límites de detección no son tan eficaces como cuando se utiliza un supresor.
Una técnica que ha atraído considerable interés en los últimos años es la detección
de UV indirecta. La fase móvil contiene un agente con gran capacidad de
absorción de rayos UV. A medida que los iones pasan a través del detector, la
absorbancia en realidad disminuye, creando un "agujero" o pico negativo. Esta
técnica puede ser muy sensible. Varios proveedores ofrecen kits de reactivos para
detección de UV indirecta.
387
388
HPLC de fase normal
HPLC de fase normal
• El mecanismo de separación de fase normal y sus aplicaciones.
• El orden de elución de la fase normal.
• Cómo seleccionar una columna de fase normal.
• Cómo seleccionar la fase móvil de la fase normal.
Figura 261
390
HPLC de fase normal
Mecanismo de fase normal
Mecanismo de fase normal
Cromatografía de adsorción - Fase normal
Mecanismo:
• Enlace de H
O
Si O O R • Dipolo - dipolo
O
• Enlace complejo Π
H
• El soluto desplaza al disolvente
O
Si
Fase estacionaria:
• Sílice
• Fase enlazada de ciano
O
H • Fase enlazada de amino

O O R • Fase enlazada de diol
Si
H
Fases móviles:
O
• Disolventes orgánicos
Figura 262
La cromatografía de líquidos de fase normal fue la primera que se desarrolló, de

ahí que se emplee el nombre "fase normal". Tswett separó pigmentos de plantas
en una fase estacionaria de carbonato de calcio utilizando una fase móvil de éter
de petróleo. Por definición, la HPLC de fase normal utiliza una fase estacionaria
que es más polar que la fase móvil. Las fases estacionarias habituales incluyen la
sílice pura, además de fases enlazadas de ciano, diol y amino. Las fases móviles
son disolventes orgánicos como el hexano y el acetato de etilo.
El mecanismo está basado en interacciones polares. Las funcionalidades polares
de las moléculas de las muestras actúan recíprocamente con los grupos polares de
la fase estacionaria. En el caso de la sílice pura, estos grupos polares son
silanoles. En un principio, las moléculas del disolvente ocupan los lugares de la
fase estacionaria. Si la adsorción es más fuerte para el componente de la muestra,
desplazará la molécula o las moléculas del disolvente. Los factores estéricos, o la
manera en que la molécula de la muestra puede disponerse en relación con la fase
estacionaria, también rigen la forma en que se adsorbe. Este mecanismo de
retención se denomina localización. Es este aspecto el que aporta a la sílice pura
su capacidad para separar isómeros estructurales.
391
HPLC de fase normal
Aplicaciones de fase normal
Aplicaciones de fase normal
HPLC de fase normal
La fase estacionaria es más polar que la fase móvil
La HPLC de fase normal resulta indicada para:

• Mezclas de isómeros.
• Compuestos que no sean inmediatamente solubles en fases móviles
de agua/orgánicas.
• Compuestos de polaridad intermedia a moderada.
Figura 263
La HPLC de fase normal resulta útil para separar compuestos cuyas diferencias
radican en las funcionalidades polares. Es especialmente eficaz para separar esos
compuestos de polaridad intermedia. Sin embargo, la fase normal no ofrece la
selectividad que proporciona la HPLC de fase inversa para compuestos de una
serie homóloga. La fase normal también es útil para compuestos que son
totalmente insolubles en agua. Las columnas de sílice pura son especialmente
eficaces para separar isómeros estructurales.
392
HPLC de fase normal
Orden de retención
Orden de retención
Orden de retención
Cetonas
Aldehído
Ésteres
O
O
C NH2
C Halógenos Hidrocarburos
Ácidos Amidas Nitro CH3
O F, Cl Aromáticos
O Alcoholes C H C NO
Aminas 2 Éteres
C OH O
OH
NH2 R O R
C OR
Polaridad
Mayor retención
El grupo funcional más polar determina la retención.
Figura 264
El orden de retención en la HPLC de fase normal es por lo general el opuesto del

que se da en la HPLC de fase inversa. La fase estacionaria es muy selectiva en
cuanto al número, tipo y orientación de los grupos funcionales polares. En el
diagrama se muestra un orden de elución general. Al añadir más grupos
funcionales polares a una molécula, aumenta la retención.
393
HPLC de fase normal
Selectividad de separación
Grupos Isómero
funcionales k' s k'
OCH3 Br
0,6
3,8
NO2 Br
Br
1,8
C=N 6,9
Br
2,7
o
C-H
5,5
Figura 265
Los datos anteriores muestran la enorme selectividad de funcionalidades polares

en el modo de fase normal. La única diferencia en las moléculas de la izquierda
radica en la funcionalidad polar y, sin embargo, sus valores k’ oscilan entre 0,6 y
5,5. El ejemplo de la derecha muestra la selectividad para isómeros estructurales
en sílice pura. Los compuestos únicamente difieren en cuanto a la ubicación de
los componentes polares, uno en la posición meta y otro en la posición para. La
selectividad para los isómeros estructurales está limitada principalmente a las
columnas de sílice pura.
394
HPLC de fase normal
Separación de fase normal de isómeros

Condiciones de
fase inversa:
Flujo: 0,4 ml/min

Agua/acetonitrilo
O CH CH2 CH=CC
Columna: C-18, 3 micras
O
2 l2
45% agua, 1 min
90 % ACN a 15 min
100% ACN a 15 min
Barrido de 50 a 500 uma
F CH3 CH3
Inyección de 20 microlitros
Baythroide
4 isómeros
Fase inversa
Isómeros no separados
4 ISÓMEROS
BAYTHROIDES
Fase normal
4 isómeros separados
IMPUREZA
DESCONOCIDA
Figura 266
Este ejemplo muestra la potencia de resolución única de la sílice pura para

isómeros estructurales. Hay cuatro isómeros baythroides. El flúor estará situado
en diversas posiciones en el grupo de los fenilos. En el primer cromatograma, la
separación se probó utilizando fase inversa y las condiciones siguientes:
Flujo: 0,4 ml/min

Agua/acetonitrilo
Columna: C-18, 3 micras
45% de agua, 1 min
90% de ACN a 15 min
100% de ACN a 15 min
Barrido: 50 a 500 uma
Inyección de 20 microlitros
395
HPLC de fase normal
Obsérvese que los isómeros no se separan en el modo de fase inversa. La

separación se realizó en una columna de sílice en modo de fase normal con las
condiciones siguientes:
2,1 x 250 mm, sílice, 5 micras

Zorbax-Sil
A = 25% de etanol en iso-octano
B = 0,5% de etanol en butilcloruro
La columna de sílice fue capaz de separar los cuatro isómeros.
396
HPLC de fase normal
Fases estacionarias
Fases estacionarias
Fases estacionarias
CH3
Si O Si (CH2)n C N Opción más idónea para el desarrollo de métodos de fase normal
CH3
CH3
Si O Si CH2 CH CH2 OH Más polar
CH3 OH
H Ventajas de las fases enlazadas:

Si O La mejor para isómeros • No se tiene que controlar el agua
• Es posible la elución de gradientes
• La columna se equilibra rápidamente
CH3 • Amplia variedad de polaridades,
Si O Si (CH2)n NH2 Selectividad alternativa selectividad
CH3
• Gran capacidad
• Los picos no tienen cola, como ocurre
con la sílice pura
Figura 267
Las fases estacionarias enlazadas ofrecen varias ventajas en comparación con la

sílice pura en aplicaciones de HPLC. En primer lugar, se equilibran con mayor
rapidez que las columnas de sílice, por lo que es posible la elución de gradientes.
En segundo lugar, están disponibles en una amplia variedad de polaridades para
permitir una mejor selectividad. También disponen de una capacidad de muestra
mayor que la de las columnas de sílice. El contenido de agua de la fase móvil no
tiene que controlarse rigurosamente, a diferencia de lo que ocurre con las
columnas de sílice (más adelante se abordará este tema). Como consecuencia de
todas estas ventajas, se recomienda que el desarrollo de métodos en el modo de
fase normal comience con columnas enlazadas, concretamente con columnas de
ciano, que tienen polaridad intermedia y una buena estabilidad. Las columnas de
diol son las más polares y similares a las de sílice. Sin embargo, y al igual que las
columnas de amino, no son tan estables. Si la selectividad no es adecuada en las
columnas de fase enlazada, deberá utilizarse sílice pura. No obstante, la sílice
pura se recomienda para la separación de isómeros estructurales.
397
HPLC de fase normal
Fuerza de elución
Fuerza de elución
Fuerza de elución
Disolvente Fuerza de elución

Sílice
Flouroalcanos -0,20 Cloruro de metileno
Cloroformo
n-pentano 0,00 Cloropropano
n-hexano 0,01 Sin localización
1-clorobutano 0,20
benceno Disolvente débil
0,20 Hexano, fluoroalcanos
xileno 0,24
cloroformo 0,26
tolueno Localización Localización
0,28 no básica
básica
cloruro de metileno 0,32 Acetato de etilo
MTBE
acetato de etilo Acetonitrilo
0,38 THF
tetrahidrofurano 0,44 Éter etílico
acetonitrilo 0,50
metanol 0,70
Figura 268
Más arriba se muestran disolventes de fase normal habituales junto con sus
fuerzas de elución. Los datos mostrados corresponden a disolventes en columnas
de sílice pura. En obras tales como Practice of HPLC Method Development de
Snyder, Glajch y Kirkland hay disponibles datos de columnas de fase enlazada.
Los disolventes débiles, como los fluoroalcanos y el n-hexano, tienen fuerzas de
elución negativas o bajas. Los disolventes más fuertes se pueden dividir en tres
grupos: sin localización, localización básica y localización no básica. Cuando se
desarrolla un método de fase normal, debe seleccionarse en primer lugar un
disolvente débil, como hexano o 1,1,2-trifluoro-1,2,2-tricloroetano, y uno de los
disolventes más fuertes, como cloruro de metileno o acetato de etilo, y variar la
concentración de la compensación de la fase móvil más fuerte a la más débil.
Téngase presente que la retención no variará de manera lineal al cambiar la
composición de la fase móvil, como ocurre en la HPLC de fase inversa. Si la
combinación de disolventes no proporciona la selectividad correcta, cambiar a
una de las otras categorías de disolventes fuertes y probar las combinaciones. Tal
vez sea necesario incluso utilizar los tres disolventes fuertes en combinación con
el disolvente débil para conseguir la selectividad deseada.
398
HPLC de fase normal
Fuerza de elución
Principios de la separación
H3 C CH3
X+T+B
X = Xileno
CH3
T = Tolueno
B = Benceno
Cloruro de metileno n-pentano

= 0,32 = 0,0
10
Figura 269
En este ejemplo se muestra la naturaleza del mecanismo de fase normal. Los tres
componentes de la muestra son xileno (0,24), tolueno (0,28) y benceno (0,20). El
cloruro de metileno es más fuerte que los tres componentes de la muestra, con una
fuerza de elución de 0,32. Por consiguiente, los componentes de la muestra no son
suficientemente fuertes como para desplazar el cloruro de metileno de los sitios
activos. Todos los componentes de la muestra eluyen como un pico en el volumen
muerto. Cuando se cambia la fase móvil a n-pentano, se descubre que las
muestras son más fuertes que la fase móvil y tiene lugar la retención.
399
HPLC de fase normal
Fuerza de elución
Fuerzas de elución iguales
Para cambiar la selectividad, intentar diferentes combinaciones de disolvente

con la misma fuerza de disolvente.
AB
(C2H5)2NH/C5H12
.60
Acetato de metilo/C5H12
.50
.40 CH2Cl2/C5H12
.30
.20
.10
20 40 60 80 100% B A = pentano
11
Figura 270
Anteriormente se indicó que podrían probarse disolventes diferentes para cambiar

la selectividad en fase normal. Hay muchos diagramas y gráficos que pueden
servir de ayuda al respecto. Más arriba se muestra un ejemplo. Quizá se descubra
que todos los componentes de la muestra eluyen en el rango k’ correcto cuando se
utiliza 92% de n-pentano con 8% de acetato de metilo. Sin embargo, algunos de
los picos cromatográficos no están bien separados. Podría consultarse un
diagrama o gráfico contenido en una obra o un informe para encontrar
combinaciones que aportasen una fuerza de elución equivalente. En este caso
podría probarse con 62% de n-pentano y 38% de cloruro de metilo. Consúltense
obras como Introduction to Modern Liquid Chromatography, de Snyder y
Kirkland.
400
HPLC de fase normal
Fuerza de elución
Fuerza de disolvente para diversas clases de

compuestos
Tipo de compuestos Disolvente seco 50% H2O Disolvente sat.
Aromáticos 0,05 -0,25 -0,2-0,25

Haluros 0,0-0,3 -0,2-0,1
Mercaptanos 0,0 -0,2
Éteres 0,1 0,0
Nitros, ésteres, 0,2-0,3 0,1
nitritos, carbonilos
Alcoholes 0,3 0,2
Fenoles 0,3 0,2
Aminas 0,2-0,6 0,0-0,4
Ácidos 0,4 0,3
Amidas 0,4-0,6 0,3-0,5
12
Figura 271
Los investigadores también han publicado datos que indican la fuerza de elución
aproximada necesaria para separar una determinada clase de compuestos. Más
arriba se muestra un ejemplo. En la siguiente página se muestra un ejemplo de
disolventes secos y fases móviles saturadas con 50% de agua.
401
HPLC de fase normal
Desactivadores
Desactivadores
Desactivadores - Para columnas de sílice
Las columnas de sílice pura pueden Método:

presentar los siguientes problemas: Método saturado al 50% con agua
• Variación en el tiempo de retención • Mezclar fases móviles
• Colas de banda • Dividir en dos partes iguales
• Tiempos de equilibrado largos • Guardar dos componentes de disolvente seco
sobre un tamiz molecular
Causa: • Preparar un componente saturado de agua
• Puntos de fuerte adsorción • Mezclar el disolvente saturado de agua y el seco
polar en la sílice en proporción de 1 a 1
• Mezclar 0,1-1% de agua con disolventes miscibles en agua

Solución:
• 0,05% de acetonitrilo en hexano, pentano, heptano.
• Añadir pequeñas cantidades de
disolvente polar a la fase móvil, Enjuagar las columnas con disolventes
es decir, agua o acetonitrilo. intermedios para reducir los tiempos de
• Crea una superficie más uniforme equilibrado.
13
Figura 272
Las columnas de sílice pura presentan una serie de problemas que no

experimentan las columnas enlazadas, como colas de picos, tiempos de retención
irreproducibles y tiempos de equilibrio prolongados. Los problemas se deben a
grupos de silanoles, que tienen fuerzas diferentes en la superficie de la fase
estacionaria y pequeñas cantidades de agua en disolventes. El nivel de las
pequeñas cantidades de agua no se puede controlar fácilmente, produciendo
diferentes concentraciones de agua en distintos momentos. El agua se puede
recoger de las superficies de vidrio y del aire. Las pequeñas cantidades de agua se
adsorberán a los grupos de silanoles más fuertes. Si se controla el contenido de
agua, será posible controlar la cobertura relativa de estos sitios altamente
adsorbentes y mitigar los problemas.
Snyder y Kirkland han publicado el método de saturación del 50% para
disolventes utilizados con columnas de sílice. Implica la mezcla de los
disolventes. Se divide el volumen por la mitad, se almacena parte del disolvente
como disolvente seco, pasándolo a través de un tamiz molecular adecuado, y se
mezcla la otra mitad con agua. Los disolventes se mezclan en una relación de 1 a
1 y el resultado es una fase móvil saturada al 50%. Si todos los disolventes para la
402
HPLC de fase normal
Desactivadores
columna de sílice se preparan de esta manera, serán isohídricos y se reducirá el

tiempo de equilibrio de la columna y se aumentará la precisión del tiempo de
retención. Otras técnicas incluyen la combinación de una determinada cantidad de
agua en disolventes miscibles en agua. Los disolventes inmiscibles, como el
hexano, el pentano y el heptano, se pueden mezclar con 0,05 de acetonitrilo para
conseguir el mismo efecto. Para ahorrar tiempo, se puede considerar que una
botella nueva de disolvente orgánico es un disolvente seco.
403
HPLC de fase normal
Hoja de trabajo
Hoja de trabajo
Ejercicio
5% Tetrahidrofurano
95% Isooctano
Ftalato dibutílico
Ftalato de dimetilo
Ftalato de dinonilo
Ftalato de dietilo
• ¿En qué orden cabe esperar que los ftalatos eluyan en una columna de fase
normal?
• ¿Cómo se espera que sea el cromatograma si la fase móvil se cambia a 5%

de tolueno, 95% de isooctano?
14
Figura 273
Responder a las preguntas anteriores.
404
Cromatografía por exclusión de tamaño
(SEC)
Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC)
• Las diferentes aplicaciones de la cromatografía por exclusión

de tamaño.
• El mecanismo de separación.
• Sugerencias de optimización.
Figura 274
406
Principios de la cromatografía por exclusión

de tamaño
Mecanismo:
• El orden de elución es una función del
tamaño molecular.
Fases estacionarias:
• Geles entrelazados con tamaño de poro
definido.
• No deben ser interactivas con la
muestra.
Fases móviles:
• Disolventes acuosos - Filtración de gel
• Disolventes orgánicos - Impregnación
de gel
Figura 275
El mecanismo de separación de la GPC

El modo del sistema HPLC más previsible y más fácil de comprender es la
cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). Esta técnica también se conoce
con el nombre de cromatografía por impregnación de gel (GPC) y
cromatografía por filtración de gel (GFC), dependiendo del área de aplicación
y de la fase móvil.
Por lo general, la GPC utiliza geles polímeros como fases estacionarias para
separar moléculas orgánicas como polímeros, de acuerdo con su tamaño. Puesto
que los polímeros sólo son solubles en compuestos orgánicos como el
tetrahidrofurano, los disolventes son por lo general no polares.
La GFC utiliza materiales basados en sílice como fases estacionarias y se emplea
normalmente para aplicaciones bioquímicas. Los disolventes son soluciones
tampón acuosas.
Los compuestos se separan de acuerdo con su tamaño. Las partículas de la fase
estacionaria están formadas por materiales rígidos o semirrígidos (orgánicos o
inorgánicos) con tamaños de poro definidos. A efectos de esta ilustración,
supondremos que su forma es cónica. Naturalmente, en la realidad su forma es
irregular.
407
Aplicaciones
Aplicaciones
Aplicaciones
Impregnación de gel: Filtración de gel:

• Productos lácteos, espesantes • Péptidos
• Productos cosméticos, • Proteínas
estabilizadores • Enzimas
• Preparados galénicos, control • Ácidos nucleicos
de distribución de medicamentos • Lípidos
• Productos de construcción, pinturas,
aditivos de hormigón
• Gasolina, aditivos
• Neumáticos de vehículos,
deformulación de caucho
• Productos de impresión, tecnología
de tóner
• Tarjetas electrónicas, resinas de
litografía
Figura 276
La GPC es una técnica rutinaria que se utiliza frecuentemente como una

herramienta fiable y económica para la caracterización de pesos moleculares. Esto
se hace principalmente en el control de calidad de la fabricación de polímeros y
en numerosos campos en los que se aplican polímeros como parte de un producto
terminado. Puesto que es aplicable tanto a biopolímeros como a polímeros
sintetizados químicamente, tiene una amplia gama de aplicaciones industriales.
Las separaciones están basadas en columnas de fase acuosa y de fase orgánica y
en los disolventes adecuados.
408
Usos habituales
Usos habituales
Usos habituales de la cromatografía por

exclusión de tamaño
• Se utiliza a menudo para determinar el peso molecular promedio
o la distribución del peso molecular de los polímeros.
• Aporta “huellas digitales” de muestras complejas que ayudan a
distinguir entre materiales “buenos” y “malos”.
• Método de limpieza de muestras.
• Análisis cuantitativo y cualitativo de biomoléculas.
• Separación de moléculas pequeñas.
Norm.
200 Granulado
175
150
125
100
Señal UV de DAD
75
50
Señal del índice
25
de refracción
0
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Tiempo
[min]
5
Figura 277
La cromatografía por exclusión de tamaño se utiliza de varias maneras. Si se

compara el volumen de elución de patrones con los materiales de interés, será
posible determinar pesos moleculares. A menudo, en los procesos de fabricación
se comparan perfiles cromatográficos por exclusión de tamaño para fines de
aseguramiento/control de calidad. La exclusión de tamaño también se emplea a
menudo como un procedimiento de limpieza para eliminar moléculas pequeñas o
grandes no deseadas. En el campo de la biología se utiliza a menudo la GFC para
realizar análisis cualitativos y cuantitativos. Aunque la exclusión de tamaño se
considera por lo general una técnica para moléculas con un peso molecular
superior a 2000, actualmente pueden encontrarse columnas para la separación de
moléculas más pequeñas.
409
Principios
Principios
Principios de la cromatografía por exclusión

de tamaño (SEC)
A
Relleno de
columna
B Poros
C
Respuesta
A B C
Tiempo
Figura 278
Consideremos una mezcla de 3 muestras con 3 tamaños moleculares diferentes,

donde A es el más grande y C el más pequeño.
Las moléculas del componente A, que no caben en ninguno de los poros, se
eluyen en primer lugar. Se excluyen por completo. Su volumen de retención se
denomina "volumen de exclusión total", y es característico de un gel.
Las moléculas del componente B entran aproximadamente hasta la mitad de los
poros, con lo cual se retrasa la elución, y se eluyen después de las moléculas del
componente A.
El componente C, que es capaz de impregnar toda la partícula hasta el fondo de
los poros y, por tanto, pasa más tiempo en la fase estacionaria, se eluye en último
lugar.
Todas las moléculas más pequeñas que las del componente C se eluyen en el
tiempo de retención denominado "volumen de impregnación total". Por tanto, el
análisis real tiene lugar entre la exclusión total y la impregnación total.
410
Selección de fase estacionaria
Selección de fase estacionaria
Selección de la fase estacionaria
Tamaño de poro
demasiado pequeño
Tamaño de poro
demasiado grande
Tamaño de poro
adecuado
Impregnación selectiva
Exclusión total Impregnación total
Tiempo de retención
Figura 279
Tal y como se describió anteriormente, una separación está relacionada con el

tamaño molecular de las moléculas de la muestra. Eso significa que existe una
correlación entre el volumen de retención y el peso molecular de una muestra, o
entre el tiempo de retención y el peso molecular si se parte de la base de que el
flujo es perfectamente constante.
411
Calibración
Calibración
Calibración - Determinar el peso molecular
V VOLUMEN DE FASE MÓVIL DE LA COLUMNA

M
V VOLUMEN INTERSTICIAL
Z
TIEMPO (min)
Log(Peso molecular *Viscosidad)
Vp
2.610.000 VOLUMEN DE PORO DE FASE ESTACIONARIA
P.M.:
111.000 Ve
VOLUMEN DE ELUCIÓN DE POLÍMERO
39.000
19.500 K VOLUMEN ACCESIBLE AL POLÍMERO
GPC
15.300
V 10.900
z
1.500
65
V p
TIEMPO (min)
Figura 280
La relación entre volumen de retención y peso molecular queda ilustrada por la

curva de calibración.
Los pasos para determinar el peso molecular son los siguientes:
1) Realizar análisis cromatográficos con muestras cuyo peso molecular sea
conocido (pueden contener una mezcla de patrones diferentes).
2) Con estos datos es posible crear una tabla de calibración y mostrar los
resultados de la calibración en una representación gráfica.
3) Se realiza un análisis de la muestra. Se puede calcular la distribución del
peso molecular.
412
Calibración
Condiciones cromatográficas
Como ocurre con la cromatografía normal, la altura de la placa de la columna es
crecientemente proporcional al diámetro de las partículas. Esto significa que, para
la separación de muestras macromoleculares, es preferible una columna con
partículas muy pequeñas. Estas partículas deberían ser completamente porosas.
Hay disponibles para la GPC o GFC geles orgánicos semirrígidos, basados en
gran medida en rellenos de poliestireno, y geles orgánicos rígidos basados en
sílice.
Es posible utilizar rellenos de poliestireno (que son los más importantes en la
GPC) con la mayoría de los disolventes orgánicos no polares, como el THF (pero
no con acetona, alcoholes ni agua). En la mayoría de los casos, el fabricante
facilita una lista de disolventes compatibles.
La elución de gradientes no realiza ninguna función y es, por tanto, innecesaria,
ya que no hay ningún efecto de adsorción o partición en la cromatografía por
exclusión de tamaño.
Es bastante importante saber que una molécula cambia de tamaño de acuerdo con
su entorno. Esto significa que una molécula en un disolvente específico podría
caber en un poro de una partícula de poliestireno, mientras que si se disuelve en
una sustancia de elución diferente podrá no ser capaz de introducirse en el mismo
poro.
Por tanto, no es importante conocer el radio absoluto de una molécula, sino el
radio hidrodinámico, es decir, el tamaño de la molécula en una solución.
Es importante no sólo el tamaño, sino también la forma geométrica de una
molécula. Para el mismo peso molecular existe una amplia variedad de formas
diferentes, es decir, moléculas que se ramifican de manera distinta, en cuyo caso
los resultados cromatográficos dependerán en gran medida de las formas
conocidas o supuestas de las moléculas en cuestión.
413
Cálculos de la GPC
Cálculos de la GPC
Cálculos de GPC
∑ Área i ∑ (Área i x M )i2

Mn= M z=
∑ (Área i / M ) i ∑ (Área x M )
i i
Número, peso molecular promedio Z, peso molecular promedio
∑ (Área i x M ) i ∑(Área i x M ih )1/h

Mw = Mv=
∑ Área i ∑ Área i
Peso, peso molecular promedio Viscosidad, peso molecular promedio
Área i / Pendiente
D = Mw / M n Wi = i
∑(Área i / Pendiente )
Polidispersidad i
Distribución del peso molecular
Figura 281
Más arriba se muestran algunos cálculos típicos de la GPC. En los análisis de

GPC, los promedios de los pesos moleculares y la distribución de los polímeros
proporcionan información importante acerca de las características de los
polímeros, como su resistencia y fluidez.
Referencia: Wu, Handbook on Size Exclusion Chromatography, 1997

Marcel Dekker (Ed.), Nueva York
414
P.M.
Log Una base mezclada tendrá
un mayor rango lineal. 1.000.000 •
100.000 •
10.000 •
Rango lineal
1000 •
500 •
100 •
Volumen (ml) 10 102 103 104 105 106 107 108

Peso molecular
Selección de la fase en función del tamaño de poro ( )
10
Figura 282
Una columna seleccionada debería tener una elevada linealidad en el margen en el

que se realice la aplicación. Si se debe ampliar el margen lineal, es decir, si la
distribución del peso molecular de la muestra supera el margen lineal, será posible
situar diferentes columnas en serie o utilizar columnas bimodales (base mixta)
(columnas que contienen partículas con dos tamaños de poro diferentes).
La separación se puede optimizar mediante la optimización de la temperatura, ya
que la temperatura influye en gran medida en la viscosidad de la fase móvil y en
la solubilidad de la muestra en la fase móvil. Esto es muy importante para separar
macromoléculas. Los detectores típicos son de UV y de RI. El detector de UV es
más selectivo que el detector de RI utilizado habitualmente.
415
Resolución de la cromatografía por exclusión de tamaño
Resolución de la cromatografía por exclusión de

tamaño
Optimizar la resolución de GPC
Ecuación de la resolución:
X X
x x k'
R = 1/4 N -1
1 + k'
Eficacia Selectividad Capacidad
• Disminuir la velocidad • Sin partición, pero • Sin retención

de flujo puede afectar en la fase
• Aumentar la longitud de mediante la estacionaria
la columna selección del
tamaño de poro
adecuado
11
Figura 283
Es importante observar que la resolución de la línea de base entre dos compuestos

en la cromatografía por exclusión de tamaño sólo puede ocurrir si sus pesos
moleculares difieren, al menos, en un 10%. Para maximizar la resolución, podría
recurrirse a la ecuación de resolución. En la cromatografía por exclusión de
tamaño no se separan las moléculas en función de su interacción con la fase
estacionaria. De hecho, no debería producirse ninguna interacción con la fase
estacionaria. Por consiguiente, no se puede utilizar este término para mejorar la
separación. Sólo se puede influir ligeramente en la selectividad mediante la
selección del tamaño del poro. El factor número uno es la eficiencia. Para mejorar
la eficiencia, se puede reducir la velocidad del flujo en columna, o aumentar la
longitud de la columna. La longitud de la columna se puede aumentar utilizando
columnas más largas o usando columnas en tándem. Dos inconvenientes son la
mayor retropresión y el mayor tiempo de análisis. El material del relleno de la
columna debe ser lo suficientemente fuerte para resistir la presión sin aplastarse.
416
Sugerencias para la cromatografía por exclusión de tamaño
Sugerencias para la cromatografía por exclusión de

tamaño
Consejos sobre la exclusión de tamaño
• Grandes volúmenes de inyección de muestra causarán una pérdida de

resolución. Mantener el volumen de muestra al 5-10% del volumen de
pico.
• Un cambio de 0,5% en la velocidad del flujo produce un cambio de
0,7% en el peso molecular.
• Un cambio de temperatura de 1º produce un cambio del peso molecular
de 0,1%.
• El análisis finaliza por completo después de dos volúmenes de columna.
• La viscosidad del analito no debe ser más del doble de la del disolvente.
• El rendimiento aumenta con una velocidad de flujo menor (además, se
evita la desviación de polímeros con gran peso molecular).
• Puede que sean necesarias varias columnas, y la interconexión debe
mantenerse reducida.
• Para obtener resolución entre compuestos, el peso molecular debe variar
al menos un 10%.
12
Figura 284
Más arriba se muestran algunas sugerencias generales para análisis por exclusión
de tamaño.
417
Requisitos del sistema
Requisitos del sistema de GPC
• Hardware • Software
– flujo de bomba preciso con una – fácil de utilizar en el trabajo
precisión de TR < 0,1% rutinario
– desgasificación en línea – integrado con software de
– columna termostatizada con HPLC estándar
precalentamiento de disolvente – compatible con las normas de
– el menor ruido de detector a GPC, por ejemplo ISO/EN/DIN
largo y a corto plazo – diversas rutinas de calibración
(desviación) – análisis e informe de datos
– alta reproducibilidad del interactivos y automatizados
sistema a largo plazo – informes personalizados
– inyector automático con bajo (%masa, distribuciones de peso
mantenimiento molecular, gráficos, resultados
calculados)
13
Figura 285
Para obtener resultados de GPC fiables, se necesita una precisión del tiempo de
retención superior al 0,1%. Esto es posible con un sistema de bombeo adecuado y
(si resulta indicado para el disolvente) un sistema de desgasificación en línea. La
termostatización óptima de las columnas de GPC (normalmente con un diámetro
interior de más de 4,0 mm y una velocidad de flujo de 1-2 ml/min) se consigue
con un compartimento de columnas que ofrezca la posibilidad de calentar
previamente el disolvente. De esta manera se reducen los gradientes de
temperatura en el interior de la columna. También se necesita una línea de base de
detector estable. Esto significa que los detectores deberían ofrecer un ruido muy
bajo a corto y largo plazo. Por último, el sistema completo debe proporcionar una
elevada estabilidad a largo plazo para permitir la comparación de las formas de
los picos a lo largo de semanas, meses o incluso años, si es posible.
418
Para terminar, la GPC es una técnica rutinaria con una gran carga de muestras. Un
muestreador que apenas precise mantenimiento es una herramienta adecuada para
mejorar la productividad en lo que se refiere al hardware. El software debería ser
fácil de utilizar. Éste será el caso si se utiliza un proceso estándar como un
paquete de software de HPLC rutinario y se combina con el algoritmo más
adecuado para el análisis de datos de GPC. De esa manera, apenas se necesitará
un aprendizaje adicional. Debería asegurarse el cumplimiento de estándares
nacionales e internacionales para evitar trabajo adicional. Dependiendo de la
solicitud analítica, podrán utilizarse diferentes procedimientos y patrones de
calibración (p. ej., limitados, amplios o universales).
Puesto que los clientes tienen necesidades distintas, una combinación de análisis y
presentación de datos automatizados e interactivos es de interés general.
419
420
Desarrollo de métodos
Cómo desarrollar un método de HPLC de manera estructurada:
• Recoger datos
• Seleccionar la fase estacionaria
• Preparar la muestra
• Llevar a cabo el análisis
• Optimizar
Figura 286
En este apartado se abordarán los principios del desarrollo de métodos y se verán

los resultados de un proceso sistemático con una muestra de barbitúricos.
422
Pasos para el desarrollo de un método
Pasos para el desarrollo de un método
Principales fases del desarrollo de un nuevo

método de HPLC
Recogida Preparación Selección del Instrumentación

de datos de la sistema de
muestra fase
Primer
análisis Validación
de HPLC Optimización
Figura 287
El desarrollo de un método puede dividirse en siete pasos principales. En el

primer paso, la recogida de datos, se recopila toda la información disponible
acerca de la muestra y los objetivos del análisis. En función de esa información
y de la selección de la fase, se determina la técnica de preparación de la muestra.
Se estudian los requisitos del instrumento y se prepara un sistema HPLC para
satisfacer las necesidades del análisis. A continuación, se pueden intentar los
primeros análisis, seguidos de su optimización. Por último, debe validarse el
método.
423
Recogida de datos
Recogida de datos
Recoger información sobre la muestra
• Solubilidad
• Posibilidades de detección
• Carácter iónico
• Masa molar
• Datos de la muestra / Matriz
Análisis cualitativo: Análisis cuantitativo:

• Compuestos estándar • Límite de detección esperado
• Matriz en blanco • Límite de cuantificación esperado
• ¿Compuesto para patrón interno?
• Compuestos estándar
• Matriz en blanco
Recogida
de datos
4
Figura 288
La recogida de datos del proceso de desarrollo de métodos quizá sea el paso más
importante de todos. Cuantos más datos se obtengan, mayor será la probabilidad
de producir un análisis satisfactorio. Entre los aspectos que deben determinarse,
pueden citarse los siguientes:
• Estructura y peso molecular de los componentes de la muestra.
• Carácter iónico o ausencia de carácter iónico.
• Solubilidad de los componentes de la muestra - Deben ser solubles en la
fase móvil seleccionada.
• Expectativas de detección y características del detector - ¿Se absorberá
este compuesto en el espectro de UV? ¿Es necesario derivar la muestra?
• Matriz de la muestra.
• ¿Es necesario desarrollar un método cuantitativo o cualitativo?
• ¿Es necesario aislar y recuperar parte de la muestra?
• Número de muestras.
• ¿En cuántos tipos diferentes de sistemas HPLC se utilizará el método?
424
Recogida de datos
Recogida de datos
Recogida
Barbitúricos de datos
+
H H H H H Na
O N O O N O O N O O N O O N O
N N N N N
H H H H H
O O O O O
Barbital Alobarbital Aprobarbital Fenobarbital Butabarbital

PM = 184,19 PM = 208,21 PM = 210,23 PM = 232,23 PM = 234,23
H H O H H
O N O O N O O N H O N O O N O
N N N N N
H H H H
O O O O O
Ciclopentabarbital Butalbital Hexobarbital Amobarbital Metil-fenobarbital

PM = 234,24 PM = 224,25 PM = 236,26 PM = 226,27 PM = 209,24
Figura 289
El ejemplo presentado en este módulo es la separación de barbitúricos. Estudie las

estructuras de los barbitúricos mostradas en la figura anterior. ¿Qué tienen en
común las estructuras? ¿En que se distinguen las estructuras? ¿Cuál es el peso
molecular?
425
¿Qué parámetro de compuestos se puede

utilizar para la separación?
Recogida Selección del

de datos Datos estructurados sistema de fase
• Diferencias de tamaño molecular / • Impregnación de gel/Filtración de gel

peso molecular > 2000 • Par iónico/Intercambio iónico
• Moléculas iónicas • Fase inversa / de adsorción
• Diferencias de polaridad • Fase inversa
• Homólogos/Benzólogos • Afinidad/HIC/GF/RP
• Mezclas de neutros, ácidos, bases • Adsorción
• Para biomoléculas • Cromatografía quiral
• Isómeros estéricos
• Compuestos quirales
6
Figura 290
Plantéese las siguientes preguntas para determinar la fase estacionaria. ¿Son las
muestras superiores o inferiores a 2.000 uma? Las moléculas no se pueden separar
por tamaño a menos que su peso molecular difiera en, al menos, un 10%. Si el
peso molecular de las muestras es superior a 2.000, la exclusión de tamaño podría
ser la respuesta.
¿Son ionizables las muestras? Si son iones en una disolución, ácidos fuertes o
bases, seleccione la cromatografía por parejas de iones o por intercambio iónico.
¿Radican las diferencias entre las moléculas en la funcionalidad polar? Pruebe en
primer lugar con fase inversa. Si eso no funciona o no son solubles en la fase
móvil, pruebe con una columna normal de fase enlazada.
¿Difieren las moléculas en cuanto a sus funcionalidades de carbono? En caso
afirmativo, serán candidatas idóneas para la fase inversa.
¿Es la muestra una mezcla de ácidos, bases y sustancias neutras débiles? Si es éste
el caso, la fase móvil con modificadores de fase móvil será el mejor plan.
426
Si está separando biomoléculas, ¿necesita recuperar la actividad de una proteína?

En caso afirmativo, utilice la HIC (cromatografía por interacción hidrofóbica) o la
filtración de geles (sin modificadores orgánicos). La fase inversa también es una
técnica de separación útil. La cromatografía por afinidad es muy específica.
Para compuestos quirales, seleccione columnas quirales especiales con el fin de
separar los estereoisómeros.
427
Selección inicial de la columna
Selección inicial de la columna
Seleccionar la columna inicial
Seleccionar la columna:
• Fase estacionaria
Selección del
• Diámetro sistema de fase
• Longitud
• Tamaño de partícula
• Tamaño de poro
Un punto de partida típico para separaciones normales a difíciles:

4,0 - 4,6 x 150-250 mm, partículas de 3,5 - 5 µm, tamaño de poro de
80-120 • (moléculas pequeñas)
Figura 291
Cuando se seleccione inicialmente la columna, no sólo deberá decidirse la fase

estacionaria, sino también otros parámetros de la columna. El diámetro es
importante. Para una separación estándar, seleccionar un diámetro de columna
de 4,0 - 4,6 mm. Si existen limitaciones en cuanto a la muestra, seleccionar
diámetros de columna más pequeños. Seleccionar diámetros de columna mayores
para separaciones preparatorias cuando el aislamiento y la recuperación de la
muestra sean importantes.
Si tiene motivos para pensar que la separación va a ser compleja, > 15
componentes, elija para empezar una columna de 250 mm. Para separaciones
simples, seleccione una columna más corta. Al final, debería utilizar la columna
más corta posible para reducir el tiempo de análisis.
Normalmente se seleccionarían partículas comprendidas en un margen de
3,5 - 5,0 micras. Para separaciones de HPLC rápidas, podría seleccionarse una
columna de partículas de 3 micras, si bien la capacidad de separación podrá verse
limitada debido a la longitud de la columna.
428
Consideraciones relativas al instrumento
Consideraciones sobre la instrumentación
Bomba
• De gradiente o isocrática pH 10
• Se necesita precisión de composición y de
flujo
• Rango de la velocidad de flujo (analítico o
Absorbancia relativa
preparatorio)
Tubos de conexión pH > 10

• Materiales especiales o de metal
• Dispersión baja
Horno de columna o válvula de intercambio
Detector pH 2,0
• Sensibilidad
• Selectividad 230 250 270 290
• Cualititativo Longitud de onda (nm)
Recuperación Obsérvese que las características de

UV pueden cambiar con el pH de la
fase móvil
8
Figura 292
Los objetivos del análisis dictarán los requisitos del instrumento. Tal vez esté
desarrollando un método de aseguramiento/control de calidad para otro
laboratorio que utiliza un tipo de sistema HPLC diferente. Debido a los diferentes
volúmenes de retardo, quizá no se desee desarrollar métodos con gradientes. Si la
muestra es compleja, probablemente se necesite un instrumento provisto de un
control preciso del flujo y la composición para poder reproducir correctamente
perfiles de gradiente complejos. ¿Está llevando a cabo la separación con fines
preparatorios? Si es éste el caso, necesitará una bomba capaz de aportar
velocidades de flujo superiores a 5 ml/min.
¿Va a separar proteínas? En caso afirmativo, tal vez necesite equipar su sistema
HPLC con tubos PEEK. ¿Va a utilizar columnas estrechas o de calibre muy
pequeño porque está limitado por la muestra? Para este método necesitará un
sistema HPLC con cualidades de baja dispersión, como un tubo de conexión de
diámetro estrecho y celdas de flujo de volumen pequeño.
¿Necesitará precisión de tiempo de retención para análisis cualitativos? Si es éste
el caso, necesitará un horno de columna. ¿Necesitará la selectividad adicional que
puede proporcionar un horno de columna? Una válvula de intercambio puede
429
resultar útil para análisis muy complejos que incluyan la limpieza de la muestra o
la eliminación del elemento central.
El detector es una de las consideraciones más importantes. En primer lugar se
debe determinar el límite de detección necesario. Además, se debe determinar lo
específico que debería ser el detector. ¿Se necesitará una prueba de identidad
cualitativa aparte del tiempo de retención? En caso afirmativo, tal vez se necesite
un LC/MS. ¿Se necesitarán límites de detección bajos? Quizá deba considerarse
la detección por fluorescencia o electroquímica.
430
Tratamiento previo de la muestra
Muestra - Tratamiento previo

Disolver y
filtrar
Muestra sólida
Dilución
? Matriz Datos de Muestra Filtración
desconocida la matriz líquida Microdiálisis*
Liofilización*
Matriz compleja
Extracción líquido-líquido*
Extracción de fase sólida (SPE)* Preparación
Precipitación-centrifugación* de la muestra
Filtración
Figura 293
Todas las muestras deben tratarse de alguna manera antes de su inyección.

El tratamiento mínimo es la filtración simple. En los catálogos de suministros
para los sistemas HPLC se muestran diferentes materiales para la filtración de
muestras con descripciones que ayudan a seleccionar el filtro correcto para cada
muestra y disolvente.
Si la muestra de interés es un sólido, tal vez pueda disolver simplemente la
muestra y filtrarla. Para una muestra líquida, debe diluirse con fase móvil o con
un disolvente más débil que la fase móvil esperada. Para matrices complejas es
necesario realizar un paso inicial de limpieza antes de la separación en la
columna. Los procedimientos habituales son la elución líquido-líquido y la
elución de fase sólida.
431
La finalidad de la preparación de la muestra es limpiar la

muestra para inyectarla.
Modos de realizarlo:
• Filtración - Materiales disponibles con diferentes tamaños
de poro.
Consejo: Los compuestos pueden absorberse en filtros, lo cual

puede afectar a la cuantificación.
• Centrifugación - Puede eliminar partículas presentes en la

muestra.
Preparación
de la muestra
10
Figura 294
La filtración de la muestra es el requisito mínimo absoluto para el tratamiento

previo de la muestra. Si se está realizando un procedimiento cuantitativo, habrá
que asegurar que la recuperación de la muestra sea adecuada.
La centrifugación puede ser útil para separar los componentes solubles de los
componentes insolubles de la muestra.
432
Tratamiento de la muestra - Extracción de la

fase sólida (SPE)
El objetivo de la SPE es separar los analitos de los compuestos

de la matriz.
El líquido pasa a través de una fase sólida (principio de LC),

lo que elimina de forma selectiva los analitos o los compuestos
de la matriz.
La matriz o los analitos pueden eluir con diferentes disolventes,

mientras que el otro se retiene.
Preparación
de la muestra
11
Figura 295
La elución de fase sólida se rige por los mismos principios que la cromatografía
de líquidos. Un cartucho SPE es un tubo pequeño relleno de fase estacionaria. Un
proceso consiste en aislar la muestra en el cartucho con un disolvente adecuado
mientras se limpian las impurezas del cartucho. A continuación, se utiliza otro
disolvente para eliminar los componentes deseados de la muestra del cartucho.
Las muestras también se pueden concentrar en cartuchos de elución de fase sólida
y después eluirse.
433
Tratamiento de la muestra - Extracción de la

fase sólida (SPE)
Pasos de SPE:
• Acondicionar el cartucho
• Añadir la muestra
• Enjuagar
• Eluir
• Recoger
• Concentrar
• Filtrar
Preparación
de la muestra
12
Figura 296
Para utilizar un cartucho SPE, seguir los pasos enumerados a continuación:

1) Acondicionar el cartucho de la manera recomendada por el fabricante.
2) Añadir la muestra. Evitar sobrecargar la masa.
3) Añadir el disolvente adecuado para limpiar la mayor parte de la matriz.
4) Añadir el segundo disolvente para eluir los compuestos de interés.
5) Recoger el disolvente eluidor.
6) Retirar parte del disolvente para concentrar los componentes de la muestra.
7) Inyectar la muestra.
434
Tratamiento de la muestra - Extracción líquido-

líquido
Se utilizan dos disolventes inmiscibles para separar los

compuestos de la muestra.
La separación se consigue mediante las diferencias de
solubilidad.
Preparación
de la muestra
13
Figura 297
La elución líquido-líquido es una forma más económica de aislar y purificar las

muestras. El soluto de interés se distribuye entre dos disolventes inmiscibles. La
distribución de la muestra en los dos disolventes está basada en su solubilidad en
esos disolventes. A menudo, un disolvente es agua y el otro un líquido orgánico.
Las especies inorgánicas, iónicas y polares se encontrarán en la capa de agua,
mientras que los compuestos orgánicos no polares se distribuirán en la fase
orgánica. Procurar no formar una emulsión. Separarlos añadiendo sal. Asegurarse
de identificar la muestra después de aislarla.
435
Tratamiento de la muestra - Dilución -

Evaporación
• Dilución
Diluir la muestra con un disolvente que sea miscible y más
débil que la fase móvil, o con la misma fase móvil.
• Evaporación
El disolvente se elimina mediante la formación de burbujas
en gas inerte a través del mismo o mediante la aplicación
de un vacío.
Preparación
de la muestra
14
Figura 298
A menudo, las muestras líquidas se pueden diluir con un disolvente adecuado a

una concentración conveniente, filtrarse y, a continuación, inyectarse
directamente. El disolvente utilizado para la dilución debería ser más débil o igual
que la fase móvil del método de HPLC. Si el disolvente es más fuerte, podrán
producirse picos de forma deficiente, especialmente con volúmenes de inyección
superiores a 25 µl.
Para concentrar una muestra, hacer borbotear un gas inerte a través de la muestra.
Debe evitarse hacer borbotear el gas con demasiada rapidez a través de la
muestra, ya que de lo contrario podrán perderse componentes de la muestra,
además del disolvente.
436
Tratamiento de la muestra - Microdiálisis -

Liofilización
Diálisis:
• Se coloca una membrana semipermeable entre la disolución
de la muestra y un volumen grande de disolvente acuoso.
• Los compuestos de la muestra se transfieren de un líquido
a otro en función de la concentración diferencial.
Liofilización:
• Se congela la muestra acuosa; se elimina el agua mediante
sublimación al vacío.
Preparación
de la muestra
15
Figura 299
La diálisis está asociada a menudo a componentes biológicos. Esta técnica utiliza

una membrana semipermeable situada entre la muestra y un gran volumen de
disolvente acuoso. Los componentes difusibles pasan a través de la membrana
hasta la fase acuosa. La cantidad que se difunde es proporcional a la
concentración, pero también depende del componente de la muestra.
La liofilización consiste en la congelación de una muestra acuosa, seguida de su
sublimación en vacío. La liofilización resulta indicada para analitos no volátiles,
pero las sustancias inorgánicas se pueden concentrar.
437
El primer análisis
El primer análisis
Preparación del primer análisis
Seleccionar la fase móvil: • Preparar el patrón

• Normalmente es agua/ACN en • Filtrar la muestra
modo de fase inversa • Instalar la columna
• Enjuagar la columna - acondicionar
Seleccionar un método estructurado: • Equilibrar el detector
• Desarrollo • Inyectar
• Comenzar isocráticamente con • Revisar los resultados
eluyentes fuertes y disminuir la
fuerza de los eluyentes en cada
análisis
• Análisis de exploración de
gradientes Primer
análisis
de HPLC
16
Figura 300
Una vez que se haya preparado la muestra, podrá realizarse el primer intento
cromatográfico. Debe intentarse preparar la muestra de modo que la concentración
de cada uno de sus componentes se encuentre dentro del margen lineal del detector.
Si se sabe con certeza que la muestra contiene compuestos ionizables, véase el
diagrama de flujo presentado más adelante en esta sección para obtener ideas sobre
el desarrollo de métodos. Instalar la columna y acondicionarla.
Decidir si el método se va a desarrollar utilizando el método de análisis de
exploración o isocrático. Para el método isocrático, empezar con 100% de
disolvente fuerte e inyectar. Normalmente sólo se verá un pico. Reducir la cantidad
de disolvente fuerte al 90% y volver a inyectar. Realizar inyecciones a medida que
se reduce sucesivamente la fuerza de la fase móvil. Cuando se haya encontrado
la mejor fuerza general de disolvente, refinar la composición de la fase móvil con
intervalos más cortos. El otro proceso consiste en el análisis de exploración descrito
en el capítulo en el que se aborda la elución de gradientes. El análisis de
exploración se puede utilizar para desarrollar un método isocrático o un método
con gradientes.
438
El primer análisis
Primeros pasos de separación
8,23
Análisis de exploración Primer
análisis
de HPLC
4,70
2,61
COMPOSICIÓN DEL 45
DISOLVENTE (%B)
3,86
7,89
40
7,43
35
5,70
6,04
4,40
5,31
30
1,95
25
Columna: C18, 4,6 x 200 mm, partículas de 5 µm

Velocidad de flujo: 2,00 ml/min
Disolvente A: agua
Disolvente B: acetonitrilo
Temp. de la columna: 40 °C
17
Figura 301
En este ejemplo, los barbitúricos se analizaron utilizando un análisis de

exploración como primer paso. El análisis de exploración se realizó entre el 5%
de acetonitrilo y el 100% de acetonitrilo. Todos los picos eluidos entre el 28% de
acetonitrilo y el 38% de acetonitrilo se muestran en la figura anterior. Obsérvese
la selección de la columna y de la fase móvil, que es típica para separaciones de
fase inversa de compuestos neutros. Se seleccionó una columna de 4,6 x 200 mm.
439
El primer análisis
Primer resultado
El resultado del primer análisis puede ser:
No hay picos/respuesta Picos separados deficientemente

• Concentración demasiado baja
• Tipo de detección erróneo
Inyectar una concentración mayor Cambiar la fase móvil

o un volumen pequeño sin columna
Respuesta positiva - sí
- no Primer
Optimizar el sistema
análisis
Comprobar el sistema de HPLC de HPLC
18
Figura 302
Tal vez surja algún problema durante el primer análisis, como la falta de
detección o la ausencia de retención. Si no se ven los compuestos de interés,
inyectar una concentración mayor. Si no se resuelve el problema, retirar la
columna e inyectar. ¿Se ven ahora picos de la muestra? Si esto no funciona,
volver a evaluar la detección. Verificar la técnica de preparación de la muestra.
Por último, tal vez sea necesario comprobar el sistema HPLC para asegurarse de
que está funcionando correctamente.
Si apenas hay retención en fase inversa, posiblemente haya iones en la disolución.
Modificar el pH o añadir un reactivo adecuado de emparejamiento de iones.
440
Optimización
Optimización
Descripción general de la optimización
La optimización debe ser sistemática, lo que significa

que cada parámetro se debe cambiar paso a paso.
SÓLO se podrá cambiar UN PARÁMETRO POR ANÁLISIS.
El objetivo es conseguir la mejor separación en el menor tiempo de análisis.
• Optimizar la fuerza del disolvente

• Flujo
• Temperatura
• Longitud de columna
• Fase estacionaria*
Optimización
19
Figura 303
Cuando se disponga del primer análisis, optimizar la fuerza del disolvente.

Si hay picos separados deficientemente, cambiar la selectividad probando con
una combinación de disolvente diferente. Cuando se haya hecho, optimizar otros
parámetros del sistema HPLC, como el flujo y la temperatura.
Si los picos cromatográficos están bien separados, debería seleccionarse una
columna más corta para reducir el tiempo de análisis. Para picos que no estén bien
separados, probar con una columna más larga o con una fase estacionaria
diferente.
441
Optimización
¿Separaciones de gradientes o isocráticas?
Optimización
Si el cambio de %B desde el primer pico hasta el último
es < 15%B, la elución isocrática ahorrará tiempo.
8,23
COMPOSICIÓN DEL DISOLVENTE (%B)
Primer pico = 28%
4,70
Último pico = 38%
2,61
40 3
Cambio = 10%
3,86
8
7,89
7,43
35
5,70
La elución isocrática 30
4,40
2
6,04
5,31
8
es posible utilizando
7,11
1,95
25
agua/acetonitrilo
20
Figura 304
Todos los barbitúricos se eluyen a un cambio del 10% de %B (orgánico). Si el

cambio de %B entre el primer pico y el último es inferior al 15% de B, será
preferible crear un método isocrático. Los métodos con gradientes siempre
necesitan un tiempo de reequilibrio entre análisis, lo cual ralentizará los análisis
en su conjunto. Por consiguiente, si surge una situación como ésta, seleccionar la
elución isocrática.
442
Optimización
Optimización del método isocrático
3 -
Optimización
10 Resolución media óptima para todas
las parejas de solutos
2 -
10
1
Log k'
-
10
-
- 10 Metilfenobarbital
7 - 9 Amobarbital
8 Hexobarbital
6 -
5 - 7 Butalbital
6 Ciclopentobarbital
4 - 5 Butabarbital
4 Fenobarbital
3 -
3 Aprobarbital
2 Alobarbital
2 -
1 Barbital
-
-
-
20 30
% Acetonitrilo
21
Figura 305
Una manera práctica de determinar la fuerza adecuada de la fase móvil para una
elución isocrática consiste en realizar dos análisis de HPLC diferentes a dos
combinaciones de fase móvil distintas. En el ejemplo anterior, los barbitúricos se
analizaron al 20% y al 30% de acetonitrilo. El valor logk’ de cada compuesto se
representó seguidamente en relación con la composición de la fase móvil. Los dos
puntos determinarán una línea para cada componente. La composición de la fase
móvil correspondiente a la mejor separación entre las líneas es la composición de
fase móvil que mayor resolución aporta. Esta técnica se utiliza en algunos
paquetes de software de desarrollo de métodos disponibles en el mercado.
443
Optimización
Análisis isocrático
Optimización
6 CICLOPENTOBARBITAL
3 APROBARBITAL
12,63 10 METILFENOBARBITAL
10,76 8 HEXOBARBITAL
25% ACETONITRILO
3,14 1 BARBITAL
4,55 2 ALOBARBITAL
5,74 4 FENOBARBITAL
6,44 5 BUTABARBITAL
ABSORBANCIA
11,79 9 AMOBARBITAL
RELATIVA
7,74 7 BUTALBITAL
7,11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
TIEMPO (min)
22
Figura 306
El resultado de los dos experimentos fue un 25% de acetonitrilo. La muestra se

volvió a analizar en estas condiciones mientras todos los demás parámetros
permanecían invariables.
444
Optimización
Influencia de la temperatura del horno

en la selectividad
Óptima
-
Optimización
2
10
10 Metilfenobarbital
1
- 9 Amobarbital
10 8 Hexobarbital
-
-
7 - 7 Butalbital
6 -
Log k'
6 Ciclopentobarbital
5 - 5 Butabarbital
- 4 Fenobarbital
4 3 Aprobarbital
3 - 2 Alobarbital
2 - 1 Barbital
-
-
25 35 45 55 65 75
Temperatura del horno en ºC
23
Figura 307
Una vez que se haya determinado la composición adecuada de la fase móvil, se

podrán optimizar los parámetros secundarios de flujo y temperatura. Una vez más,
se realizaron dos análisis con un 25% de acetonitrilo, uno a 25 °C y otro a 75 °C.
Se representaron los resultados. Obsérvese que la pendiente de cada una de las
líneas resultantes no es la misma. Esto significa que el cambio de la temperatura
puede provocar cambios significativos en el espaciado entre bandas, e incluso
picos de cruce. En este caso se determinó que la mejor temperatura era 40 °C.
Debe recordarse que las temperaturas elevadas reducirán la vida útil de la
columna debido a la disolución del material de relleno. Las columnas de sílice no
deben utilizarse a más de 80 °C.
445
Optimización
Optimización de la fase móvil - Separaciones

difíciles
• Comenzando con metanol/agua, optimizar la
MeOH composición del disolvente de manera que todas
1 las bandas eluyan en un rango de valores k’
razonable.
• Elegir una fase móvil de agua/ACN con fuerza
4 6 de disolvente equivalente para la siguiente
inyección.
7 • Repetir con una fase móvil de THF/agua.
2 3 THF • Las cuatro inyecciones siguientes deben
ACN
5 realizarse mezclando las fases móviles que
tengan la misma fuerza, tal y como se establece.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
ACN/H20
0 20 40 60 80 100
Metanol/ H20
Optimización
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 THF/H20
24
Figura 308
Para muestras muy complejas, tal vez sea necesario probar otras combinaciones
de fase móvil. En el experimento anterior se determinó que un 25% de B era la
mejor composición de fase móvil de acetonitrilo. Con esa información,
seleccionar la fuerza de elución equivalente de otro disolvente adecuado, como
metanol, e intentarlo de nuevo. Este tipo de gráficos están disponibles en libros de
texto de HPLC. Si el cambio entre los tres disolventes no funciona, probar con los
experimentos representados por 4 - 7 en el triángulo de experimentos mostrado en
la figura anterior.
446
Optimización
Comparación de tres fases móviles
Optimización
25% 38% 21%
Acetonitrilo Metanol Isopropanol
1 B a r b it a l 1 1
1 ,8 1 ,6
2 A lo b a r b it a l 2 2
1 ,2 1 ,1
3 A p r o b a r b it a l 3 4
1 ,1 1 ,1
4 F e n o b a r b it a l 4 3
1 ,2 1 ,4
5 B u t a b a r b it a l 5 5
1 ,1 1
6 C ic lo p e n t o b a r b it a l 6 6
1 ,1 1 ,1
7 B u t a lb it a l 7 7
1 ,5 1 ,2
8 H e x o b a r b it a l 8 9
1 ,1 1
9 A m o b a r b it a l 9 1 0
1 ,1 1 ,4
1 0 M e t ilfe n o b a r b it a l 1 0 8
Orden de elución Selectividad

25
Figura 309
En el ejemplo de los barbitúricos, el desarrollador también probó con metanol e

isopropanol con la misma fuerza de elución. Los números que aparecen en la
segunda columna son los valores de selectividad entre los dos picos. ¿Cuál de los
disolventes elegiría usted?
447
Optimización
Optimización de la fase estacionaria
3 Optimización
C-18
6
8
1
10
2
4
5 7 9
0 2 4 6 8 10 12
C-8
3 6
1 8 10
2
4
5 7 9
0 2 4 6 8 10 12
26
Figura 310
En este ejemplo, el desarrollador decidió que la resolución conseguida era

adecuada, pero no así la velocidad del análisis. El desarrollador probó con una
columna C-8 y ganó, quizá, dos minutos en la separación. Una alternativa sería
probar con una columna más corta.
448
Optimización
Estrategia de desarrollo de métodos para la

HPLC de fase inversa de compuestos ionizables
Mezcla de ácidos y/o
compuestos básicos
Compuestos básicos que
son sensibles al pH bajo
Separación inicial
[1]
[1a]
a. Columna C18 o C8 (A)
b. pH ≤ 3, 20-50 mM tampón fosfato
c. Ajustar % ACN para k'=0,5-20:
Picos
en cola
Agregar 20 mM de TEA
o acetato de TEA
Optimización
1,0 ml/min
Compuestos Problemas de espaciado

básicos retenidos entre bandas
de forma
[2] Problemas de [2a]
deficiente
espaciado
entre bandas Aumentar o disminuir el %
Variar la temperatura de la columna
de ACN en ~5% (v/v)
Problemas de espaciado
[1b] entre bandas
Compuestos básicos [3]
Problemas Problemas de [3a]
a. Utilizar modificador orgánico de de espaciado espaciado
metanol, tampón de fosfato, pH ≤ 3 entre bandas
Cambiar a MeOH o THF, k'=0,5-20 entre bandas Variar la temperatura de
b. Añadir 25-50 mM de ácido la columna
sulfónico de hexano
c. Ajustar a k' = 0,5-29 con %
metanol, 1,0 ml/min. Problemas de espaciado
entre bandas
[4]
Cambiar la funcionalidad de la fase

Problemas de espaciado enlazada a CN, o fenil (B)
entre bandas Repetir [1c], [2], [2a], [3], [3a]
entre bandas
[5]
Problemas de [5a]
a. Columna C18 o C8 de sílice de SolGel
espaciado
con extremo taponado (C)
entre bandas
b. Optimizar pH 4-8, 20-50 mM tampón Repetir [2], [2a], [3 ], [4]
orgánico + 20 mM TEA
[5b] c. Ajustar a ≤ 40 ºC, constante
Problemas de
Compuestos acídicos Problemas de espaciado
espaciado
entre bandas entre bandas
a. Utilizar modificador orgánico de
[6]
metanol, tampón de fosfato, pH ≤ 3
b. Añadir 25-50 mM de fosfato de
a. Columna C18 de sílice de SolGel con Problemas de [6a]
tetrabutilamonio
extremo taponado (D) espaciado
b. pH 9-10, 10-50 mM de glicina, o entre bandas
metanol, 1 ml/min. Repetir [2], [3]
tampón de borato
Problemas de c. Ajustar a ≤ 40 ºC, constante
espaciado d. Ajustar % ACN para k'= 0,5-20
entre bandas
¿Problemas de espaciado entre bandas?.... Intentar otro método de HPLC.
A- Zorbax SB-C18 o SB-C8

B- Zorbax SB-CN o SB-Fenyl
C- Zorbax XDB-C18 o XDB-C8
D- Zorbax XDB-C18
Adaptado con permiso de: J.J. Kirkland,LC-GC, 14(1996)486

JK9508D.CFL
27
Figura 311
Más arriba se muestra un procedimiento de desarrollo de métodos para muestras

ionizables por fase inversa. El diagrama de flujo se repite en la fase siguiente para
que pueda leerse adecuadamente.
449
Optimización
Mezcla de ácidos y/o

compuestos básicos
Compuestos básicos que
son sensibles al pH bajo
Separación inicial
[1]
[1a]
a. Columna C18 o C8 (A)
b. pH ≤ 3, 20-50 mM tampón fosfato Picos Agregar 20 mM de TEA
c. Ajustar % ACN para k'=0,5-20: en cola o acetato de TEA
1,0 mL/min
Compuestos Problemas de espaciado

básicos retenidos entre bandas
de forma
deficiente [2] Problemas de [2a]
espaciado
entre bandas Aumentar o disminuir el %
Variar la temperatura de la columna
de ACN en ~5% (v/v)
[1b] entre bandas
Compuestos básicos [3]
Problemas Problemas de [3a]
a. Utilizar modificador orgánico de de espaciado espaciado
metanol, pH ≤ 3 tampón de entre bandas
Cambiar a MeOH o THF, k'=0,5-20, entre bandas Variar la temperatura de
fosfato la columna
b. Añadir 25-50 mM de ácido
sulfónico de hexano
c. Ajustar a k' = 0,5-29 con % Problemas de espaciado
metanol, 1,0 mL/min. entre bandas
[4]
Cambiar la funcionalidad de la fase

enlazada a CN, o fenil (B)
entre bandas
Repetir[1c], [2], [2a], [3], [3a]
entre bandas
[5]
Problemas de [5a]
a. Columna C18 o C8 de sílice de SolGel
espaciado
taponada en el extremo (C)
entre bandas
b. Optimizar pH 4-8, 20-50 mM tampón Repetir [2], [2a], [3]
orgánico + 20 mM TEA
c. establecer en ≤ 40 ºC, constante
[5b]
Compuestos acídicos Problemas de
espaciado Problemas de espaciado
a. Utilizar modificador orgánico de entre bandas
metanol, pH ≤ 3 tampón de fosfato entre bandas
[6]
b. Añadir 25-50 mM de fosfato de
tetrabutilamonio
a. Columna C18 de sílice de SolGel Problemas de [6a]
taponada en el extremo (D) espaciado
metanol, 1 mL/min.
b. pH 9-10, 10-50 mM glicina, o tampón entre bandas
de borato Repetir [2], [3]
Problemas de c. establecer en ≤ 40 ºC, constante
espaciado d. ajustar % ACN para k'=0,5-20
entre bandas
¿Problemas de espaciado entre bandas?.... Intentar otro método de HPLC.
A- Zorbax SB-C18 o SB-C8

B- Zorbax SB-CN o SB-Fenyl
C- Zorbax XDB-C18 o XDB-C8
D- Zorbax XDB-C18
Adaptado con permiso de:J.J. Kirkland, LC-GC, 14(1996)486
450
Optimización
Dependencia de la resolución a partir de k’, N y

alfa
Inicial
Variación
k' Rango de gradiente, pendiente
Aumento
N Velocidad de flujo,
tamaño de partícula,
longitud de la columna
Aumento
α
Temp., fase
estacionaria, pH
Optimización
28
Figura 312
El diagrama anterior le ayudará a recordar qué parámetros deben variarse con el

fin de conseguir los resultados de separación deseados.
451
Optimización
Desarrollo sistemático de métodos

• Elegir columna inicial (diámetro, longitud, tamaño de partícula -
4,6 x 250 mm, 5 µm
– Utilizar un tamaño de poro adecuado
– Utilizar condiciones de fase móvil de consenso cons pH bajo en los
análisis iniciales
• Optimizar k’ (retención)
– Rango de gradiente, tiempo, pendiente
– Fase móvil - cambio mínimo
• Optimizar la recuperación
– Solubilización de la muestra
– Efectos de la temperatura
– Efectos de la fase enlazada
– Modificadores orgánicos
• Optimizar µ (selectividad)
– Temperatura
– Fase enlazada
– pH (último recurso)
• Optimizar N (condiciones de la columna)
– Velocidad de flujo
– Longitud
– Tamaño de partícula
29
Figura 313
El diagrama anterior le ayudará a recordar qué parámetros deben variarse con el

fin de conseguir los resultados de separación deseados.
452
Ejercicio de laboratorio: desarrollar un
método cuantitativo para la separación de
cafeína en bebidas (ejercicio de
laboratorio opcional)
Ejercicio de laboratorio: desarrollar un método cuantitativo para la separación de cafeína
en bebidas (ejercicio de laboratorio opcional)

• Desarrollará las condiciones de análisis para la separación de cafeína en
bebidas.
• Diseñará una tabla de calibración para el método.
• Analizará bebidas.
454
Materiales
Materiales
• 1 columna SB-C18 de 4,6 x 150 mm y 3,5 micras, número de referencia
863953-902.
• Bebidas con cafeína.
• Patrones de cafeína.
• Acetonitrilo de calidad HPLC en el canal B.
• Agua en el canal A.
455
Esquema de desarrollo del método
Esquema de desarrollo del método

El desarrollo de un método puede realizarse del siguiente modo:
1) Recoger datos sobre la muestra.

2) Recoger datos sobre las necesidades del análisis, LOD (límite de detección),
LOQ (límite de cuantificación), número de muestras, etc.
3) Seleccionar la instrumentación.
4) Seleccionar el modo y la columna inicial.
5) Seleccionar las fases móviles iniciales.
6) Desarrollar el esquema de preparación de la muestra.
7) Desarrollar la separación inicial.
8) Optimizar los parámetros de HPLC.
9) Analizar los patrones.
10) Analizar la matriz.
11) Marcar la matriz para determinar el rango de concentración adecuado.
12) Crear una curva de calibración de 3 puntos con patrones en la cantidad
esperada y en más o menos el 50%.
13) Realizar el estudio de linealidad.
14) Hallar el límite de detección.
15) Hallar el límite de cuantificación.
16) Inyección múltiple de una muestra conocida para determinar la varianza.
17) El mismo método con un analista diferente.
18) El primer analista con un instrumento diferente.
Debido a limitaciones de tiempo, no se pueden realizar todos estos pasos. Sin

embargo, realizaremos un experimento estrechamente relacionado.
456
Desarrollo de los parámetros del método

El objetivo es desarrollar un método para la cuantificación de la cafeína en
bebidas (como cola, café o té). Seguir los siguientes pasos:
1) Obtener las muestras de prueba, así como los patrones.
2) Configurar un análisis de exploración estándar (consúltese el ejercicio de
laboratorio de gradientes). Utilizar los siguientes parámetros generales:
• 1,00 ml/min
• Proporción de 10/90 de acetonitrilo/agua al 100% de acetonitrilo.
• Volumen de inyección 5 µl
• Temperatura de columna de 40 ºC
• Longitud de onda, Señal de muestra 250, 40, Referencia 360,100
• Almacenar espectros, Todos, 190-800 nm, ancho de pico >0,05
Asegurarse de utilizar un nombre de fichero de datos único para cada inyección.

3) Inyectar la bebida que contiene cafeína.
4) Determinar las condiciones isocráticas adecuadas para el método a partir del
análisis de exploración. Volver a equilibrar la columna en estas condiciones.
A partir de ahora, cada inyección será isocrática.
5) Inyectar la bebida para comprobar las condiciones.
6) Inyectar el patrón de cafeína.
8) Cargar el análisis del patrón de cafeína y determinar el tiempo de retención.
9) Anotar aquí el tiempo de retención: ________________.
10) Cargar el análisis de la muestra.
11) En el menú Spectra, seleccionar 3D Plot.
12) Visualizar el cromatograma en 3D.
13) Ir al menú Spectra y seleccionar Isoabsorbance Plot.
14) Utilizar el cursor horizontal con el fin de hallar la mejor longitud de onda
para el cromatograma. Optimizar el cromatograma en negro.
15) Anotar aquí la mejor longitud de onda. __________________________.
16) Anotar aquí la resolución entre los picos críticos.
457
Resolución entre los picos críticos: ___________________
Valor k’ mínimo: _______________________
¿Es importante la velocidad? ___________________
¿Y la presión máxima? _______________________
Cuando haya finalizado la optimización, guardar el método isocrático como:

methdev.m.
Asegurarse de que el método tiene un tiempo de análisis (no definido como
ilimitado) y la adquisición de datos está seleccionada en la lista Run Time
Checklist.
458
Calibración
Calibración
1) En la ventana Method and Run Control, seleccionar el menú Sequence y, a
continuación, Sequence Parameters. Seleccionar los siguientes parámetros:
459
Calibración
2) En el menú Sequence, seleccionar Sequence Table e introducir los

siguientes parámetros. Asegurarse de que los viales de muestra se
encuentran en las posiciones adecuadas en el muestreador automático.
3) En el menú Instrument, seleccionar System On. Dejar que el sistema se

4) En el menú Run Control, seleccionar Start Sequence.
Cuando hayan finalizado los análisis, se creará una curva de calibración de tres
niveles y se evaluará el coeficiente de correlación.
460
Integración
Integración
En esta sección se optimizarán los parámetros de integración para el análisis y se
guardarán en el método.
2) En el menú File, seleccionar Load Signal…. Localizar el fichero de datos
que representa el patrón de bajo nivel y cargarlo. El fichero de datos se
integra inicialmente utilizando los parámetros de integración por defecto.
3) Después de cargar el fichero de datos, ir al menú Integration y seleccionar
Auto Integrate. Ir al menú Integration y seleccionar Integration Results.
Cuando se muestren los resultados, enviarlos a la impresora. Seleccionar
Close para cerrar esta ventana.
4) Examinar la integración actual. Si se tiene la impresión de que la integración
no se ha realizado correctamente, preguntar al instructor para que ayude a
optimizar los parámetros de integración.
5) Una vez que se considere satisfactoria, guardar la integración en el método,
seleccionando File/Save/Method.
461
Configuración de los detalles de las señales
Configuración de los detalles de las señales

El cuadro de diálogo Signal Details muestra qué señales se evaluarán durante un
análisis de método. Las señales que no aparecen en el cuadro de lista no se
integrarán ni se presentarán si todas las señales definidas se pueden hallar en el
fichero de datos actual. Cuando no se encuentran las señales definidas, el sistema
carga todas las señales disponibles desde el fichero de datos e intenta generar el
informe.
En el menú Calibration, seleccionar Signal Details. Desplegar las señales

disponibles en Available Signals y seleccionar la señal de adquisición del DAD.
Tal vez sea necesario consultar la ventana de parámetros del DAD. A
continuación, seleccionar el botón Add to Method.
462
Creación de una tabla de calibración

Ya se ha cargado e integrado el patrón de más bajo nivel. El primer paso para
crear la tabla de calibración será seleccionar los valores de calibración.
En la ventana Data Analysis:
1) En el menú Calibration, seleccionar Calibration Settings.
2) En Title, introducir el título de la tabla de calibración, por ejemplo, Class.
3) Se utilizará Sample Data From Data File.
4) Escribir µg/mL en Amount Units.
5) Las ventanas de tiempo de retención por defecto (Default RT Windows)
deberán ajustarse al 5%.
6) Seleccionar No en Calculate Uncalibrated Peaks.
7) En el menú Calibration, seleccionar New Calibration Table….
8) Seleccionar Automatic Setup Level 1. Introducir la cantidad por defecto
(Default Amount) de 500. Hacer clic en OK en el panel.
9) A continuación aparecerá la tabla de calibración. Se va a calibrar el pico de
cafeína.
10) Hacer clic en la columna Compound y escribir Caffeine, seleccionando la
señal que ofrece el mayor número de cuentas de área. En la columna Amt
[µg/ml], asegurarse de que el valor es 500. Desplazarse hacia la derecha y
convertirlo en un pico de referencia. Si el pico de referencia no aparece
como una opción, asegurarse de que el cursor se encuentra en ese momento
en la parte Overview de la tabla de calibración. Esta selección se encuentra
en el cuadro desplegable que aparece en la esquina superior derecha de la
pantalla
11) A continuación, cargar el fichero de datos para el patrón medio. La
integración se realizará de forma automática utilizando los parámetros de
integración elegidos para el último fichero de datos.
12) En el menú Calibration, seleccionar Add Level, o seleccionar Add new level
en la herramienta del cromatograma actual. Esta vez, seleccionar Level 2.
Hacer clic en OK en el cuadro.
13) Rellenar sólo los campos de cantidad. Para el nivel 2, la cafeína es 250
µg/mL.
14) A continuación, cargar el patrón de alto nivel. Seleccionar Add Level. Este
fichero de datos es para el nivel 3.
15) La cantidad para el tercer nivel es de 50 µg/mL.
463
16) Se puede hacer clic en el pico cromatográfico en el cromatograma para ver

la curva de calibración en la esquina inferior derecha. Se puede cambiar el
ajuste de la curva seleccionando la opción Peak Details en el cuadro
Overview en la esquina superior derecha de la pantalla. Ahora, la tabla de
calibración contiene una columna de tipo de curva (Curve Type) y de origen
Origin.
464
Comprobación de la tabla de calibración
Comprobación de la tabla de calibración

1) Cargar el fichero de datos del patrón medio. Ir al menú Report y, a
continuación, a Specify Report…, o bien seleccionar la herramienta Specify
Report Calculation and Print Style.
2) Realizar las siguientes selecciones:

Destination = Printer and Screen
Calculate = ESTD
Based on = Area
Report Style = Detail
Seleccionar la salida del cromatograma.
3) Hacer clic en OK para aceptar las especificaciones del informe y guardarlas
en el método.
4) En el menú Report, seleccionar Print Report, o seleccionar la herramienta
Identify Peaks, calculate Results & print Report.
5) Si se está satisfecho con el estilo del informe, guardarlo en el método.

6) Examinar los resultados y el coeficiente de correlación. Si son satisfactorios,
continuar.
465
Desconocidos
Desconocidos
Configurar una secuencia de la manera descrita anteriormente, pero esta vez
utilizando las muestras proporcionadas por el instructor. Se podrán estar probando
Coca-Cola, Pepsi, café, té u otros refrescos.
466
Apéndice: introducción a la validación
Introducción
Introducción
Validación - Introducción
Qué es la validación
La validación es un proceso de evaluación de

productos o métodos analíticos para garantizar el
cumplimiento de los requisitos de productos o
métodos.
Figura 314
Los requisitos para llevar a cabo estos procesos son que los instrumentos
(hardware y firmware), el ordenador (hardware y software) y los métodos
analíticos validados funcionen correctamente y estén bien documentados. Si se ha
seleccionado un equipo y un método en particular y ambos se consideran
validados, el equipo para ese método se somete a una prueba de idoneidad del
sistema con anterioridad a los análisis de muestras y entre los propios análisis de
muestras.
(ISO 8402:1994)
Validación – Confirmación, mediante examen y aportación de pruebas objetivas,

de que se cumplen los requisitos concretos para un uso previsto específico.
468
Validación de métodos - Objetivo
Validación de un método - Objetivo
El objetivo de la validación de un método es ofrecer pruebas de

que el método realiza todo aquello para lo que se ha concebido,
con la exactitud y precisión necesarias.
Figura 315
Los métodos de ensayo son necesarios para determinar el contenido y la

estabilidad de los principales ingredientes contenidos en diversos productos. Se
confía en gran medida en los datos analíticos durante la formulación, el desarrollo
y la producción para garantizar la integridad de estos productos.
Por lo tanto, es importante establecer, en la medida de lo posible, que los métodos
analíticos elegidos son lo suficientemente precisos para aportar confianza en los
datos obtenidos de las muestras de prueba.
Los métodos analíticos para productos formulados pueden comprender un
procedimiento de extracción que separe el componente sometido a examen de la
muestra de prueba, y un procedimiento de medida para determinar la cantidad de
ese componente que hay presente en la muestra de prueba.
Este conjunto de instrucciones da por sentado que los detalles del método
analítico se han establecido con anterioridad a la validación.
469
Durante el desarrollo del método, el analista debe haber optimizado las

condiciones operativas, como la concentración, el procedimiento de extracción, el
empaquetado de columna, la longitud de columna, las velocidades de flujo, las
longitudes de onda, las temperaturas, los tiempos, etc., además de haber estudiado
las posibles variaciones en estos parámetros críticos, de manera que se puedan
prever y minimizar los problemas con precisión, mediante la modificación del
método o la inclusión de términos precisos y advertencias adecuadas en el
procedimiento escrito.
La validación se utiliza entonces para determinar que el método se adaptará a su
finalidad cuando se utilice dentro de los límites establecidos durante su desarrollo.
470
¿Por qué es necesaria la validación?
¿Por qué es necesaria la validación?
¿Por qué se debe realizar la validación?
Para garantizar que un procedimiento/equipo/software o método

analítico cumple como es debido las funciones para las que se
concibió, con la exactitud y precisión necesarias.
El objetivo de un método validado es aportar confianza en los

resultados obtenidos con dicho método.
Figura 316
Fundamentalmente, la validación no es algo nuevo. Desde el desarrollo de la

instrumentación y los métodos analíticos, se ha utilizado la estadística para
demostrar el correcto funcionamiento, la fiabilidad y la precisión de los equipos y
métodos. Lo realmente novedoso en la mayoría de los procedimientos de
validación existentes es la planificación rigurosa y disciplinada de la validación y
documentación de todos los experimentos de prueba.
Transferencia de métodos analíticos (un motivo). La validación del equipo
también es importante si es necesario transferir los métodos analíticos de un
laboratorio a otro, por ejemplo, la transferencia de un método de elución de
gradientes en HPLC. Los volúmenes de retardo de gradientes pueden influir en el
tiempo de retención y, lo que es más importante, en la selectividad de la
separación.
Por lo tanto, la validación aporta pruebas de que los cambios que tienen lugar en
los parámetros principales del método, dentro de los límites establecidos, no
impedirán que el método se adecue a su finalidad.
471
¿Cuándo se deben validar o volver a validar los métodos?
¿Cuándo se deben validar o volver a validar los

métodos?
Validación de un método
¿Cuándo se deben validar o revalidar los métodos?
Validar:
• Antes de presentarlos para su uso rutinario
• Siempre que cambien las condiciones para las que se haya
validado el método, como un cambio en las características del
instrumento o en la matriz de la muestra, un cambio en la
concentración de analitos, un cambio de analista…
Revalidar:
• Siempre que se cambie el método, y el cambio se encuentre
fuera del alcance original del método
Figura 317
Los métodos analíticos deben validarse antes de su uso rutinario y después de que
cambien los parámetros del método o el operador.
¿Cuándo es necesario volver a validar el método?

Una pregunta que se formula con frecuencia es:
“¿Hasta qué punto puedo cambiar un método antes de tener que volver a
validarlo?”
La respuesta de un inspector fue la siguiente:

“Sea cual sea el cambio, se tiene que demostrar que el método sigue
funcionando tal y como se definió.”
472
¿Cuándo se deben validar o volver a validar los métodos?
Shaw y otros han afirmado:

(Eur.J.Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 1991,16(4),249-255)
“…si se realizara cualquier modificación en un método analítico, sería
necesario volver a validar el procedimiento.”
Si el nuevo valor del parámetro se encuentra dentro del margen de tolerancia del
método, tal y como se ha especificado durante la prueba de robustez de la
validación del método, no será necesario volver a validar el método. Si se
encuentra fuera de este margen, el método debería volver a validarse.
473
¿Qué se debe validar?
¿Qué se debe validar?
Qué se debe validar

Todos los componentes que influyan en los resultados analíticos.
Instrumento + Método analítico

hardware y software
Cualificación Validación del método
del equipo
Idoneidad del sistema

Comprobación rutinaria
Figura 318
El hardware del instrumento se debe validar antes de su uso rutinario, después

de haberse reparado y a intervalos periódicos. Los sistemas informáticos deben
validarse durante y al final del proceso de desarrollo, y tras realizar
actualizaciones de software.
Es frecuente que los sistemas informáticos con software complejo tarden muchos
años en desarrollarse. Es fundamental tener presente que no se puede comprobar la
calidad de un producto o sistema en las fases de prueba finales. Para garantizar la
calidad durante el proceso de desarrollo, se ha desarrollado el concepto de ciclo de
vida. Al añadir este concepto a la definición de validación, el concepto completo de
la validación incluye la verificación de las actividades de desarrollo a medida que
se llevan a cabo, y la prueba formal del producto final.
Aviso: Si los analistas agregan macros, etc., o cambian el software, se deberá volver a
validar dicho software.
Los métodos analíticos deben validarse antes de su uso rutinario y después de

cambiar los parámetros del método.
En el caso de los sistemas analíticos, se deberá probar la idoneidad del sistema
con anterioridad a su uso rutinario y durante su utilización, prácticamente a diario.
474
Resumen de los reglamentos
Resumen de los reglamentos
Directrices reglamentarias - Descripción general
Es probable que las directrices reglamentarias para fines diferentes

en el área analítica sean distintas en las diversas regiones del
mundo y que tengan diferentes objetivos analíticos.
A continuación se indican algunos organismos que ofrecen pautas
para la validación de métodos:
ISO/IEC Guía 25
ICH
U.S. EPA
U.S. FDA
USP
cGMP
Figura 319
ISO/IEC - La Guía 25 de la serie de normas EN 45000 incluye un capítulo

dedicado a la “validación de métodos”.
ICH - "Validation of analytical procedures: definition and terminology”
(Validación de procedimientos analíticos: definición y terminología), Ginebra
(1996).
EPA (EE.UU.) - "Guidance for method development and method validation for
the Resource Conservation and Recovery Act (RCRA) Programme” (Guía para el
desarrollo y la validación de métodos para el programa de la ley de conservación
y recuperación de recursos - RCRA), Washington, D.C. (1995).
FDA (EE.UU.) - "Technical review guide: Validation of chromatographic
methods” (Guía de revisión técnica: validación de métodos cromatográficos),
Center for Drug Evaluation and Research (CDER) (Centro de evaluación e
investigación de fármacos), Rockville, MD, EE.UU. (1993).
USP - General Chapter 1225, Validation of compendial methods, United States
Pharmacopoeia 23, National Formulary 18, (Capítulo General 1225, Validación
de métodos sintetizados, Farmacopea de Estados Unidos 23, Formulario nacional
18), Rockville, MD., EE.UU., The United States Pharmacopoeia Convention,
Inc., pág. 1982-1984 (1995).
475
Reglamentos de calidad - Geografía
Reglamentos de calidad - Geografía
Normas reglamentarias de calidad - Geografía
ICH (International Conference on Harmonization) es la

conferencia internacional sobre armonización de requisitos
técnicos para el registro de productos farmacéuticos destinados al
uso humano.
Esta conferencia reúne a las autoridades encargadas de diseñar las

normas en Europa, Japón y EE.UU. para tratar y trabajar en el
desarrollo de directrices.
Figura 320
476
Terminología
Terminología
Reglamentos - Terminología
GLP (Good Laboratory Practice) Prácticas correctas de laboratorio

GMP (Good Manufacturing Practice) Prácticas correctas de fabricación
cGMP (current Good Manufacturing Practice) Prácticas correctas de fabricación actuales
ISO (International Organization for Standardization) Organización Internacional de
Normalización; la serie 9000 contiene estándares de calidad muy conocidos
USP (US Pharmacopoeia) Validación de métodos sintetizados (23) 1982-1984)
UKAS (United Kingdom Accreditation Service) Servicio de Acreditación del Reino
Unido
IEC (International Electrotechnical Commission) Comisión Internacional Electrotécnica
ICH (International Conference on Harmonization) Conferencia Internacional sobre
Armonización; validación de los procedimientos analíticos: definiciones y terminología,
1996
EURACHEM/WELAC (Western European Laboratory Accreditation Conference)
Conferencia de Acreditación de Laboratorios de Europa Occidental
LGC (Laboratory of the Government Chemist) Laboratorio de Químicos de la
Administración Pública
CITAC (Co-operation on International Traceability in Analytical Chemistry)
Cooperación para el Seguimiento Internacional en Química Analítica
Figura 321
GLP (prácticas correctas de laboratorio) es necesario para:

• Estudios de seguridad no clínicos de desarrollo de fármacos
• Desarrollo de pesticidas agrícolas
• Desarrollo de sustancias químicas tóxicas
• Control alimentario
• Prueba del peligro explosivo de sustancias
GLP no es necesario para:

• Investigaciones básicas
• Estudios para desarrollar nuevos métodos analíticos
• Pruebas químicas utilizadas para obtener las especificaciones de productos
alimentarios comercializados
477
Terminología
GLP - ISO 9000

Los requisitos de GLP tienen como objetivo garantizar la seguridad pública y el
cumplimiento de los reglamentos nacionales.
GLP resume los requisitos de organización, rendimiento y registro de los estudios

sobre la toxicología de fármacos, alimentos y sustancias químicas autorizados
para su uso humano.
ISO 9000 es un estándar de amplia aplicación para sistemas de gestión de calidad.

ISO 9000 tiene un ámbito mucho más amplio, se aplica a cualquier producto y
abarca aspectos de fabricación, compra y distribución
Estándar para la acreditación de laboratorios
ISO/IEC - Guía 25, Requisitos generales para la competencia de laboratorios de

pruebas y calibración.
EN45001 - Estándar europeo que cumple con los requisitos de ISO 25.
Criterios generales para el funcionamiento de laboratorios de pruebas.
NAMAS MIO - Estándar del Reino Unido que cumple con los requisitos de ISO
25.
Estándares de acreditación: criterios generales de competencia para laboratorios
de prueba y calibración.
478
Prueba/Calibración
Prueba/Calibración
Cualificación/Calibración/Comprobación/
Validación/Verificación
Cualificación: La acción de demostrar que un equipo funciona correctamente y
produce los resultados esperados. (DQ, IQ, OQ, PQ - Cualificación del diseño,
la instalación, el funcionamiento y el rendimiento).
Calibración: El conjunto de operaciones que establecen, en condiciones
especificadas, la relación entre los valores indicados por un instrumento de
medida y los valores conocidos correspondientes a los patrones utilizados.
Comprobación: Identificación de errores (diferencias entre los resultados
obtenidos y los esperados).
Validación: La validación es un proceso de evaluación de productos o métodos
analíticos para garantizar el cumplimiento de los requisitos de productos o
métodos.
Verificación: La confirmación, mediante el examen y la aportación de pruebas,
de que se han cumplido unos requisitos específicos.
Figura 322
"La validación no es lo mismo que la verificación."
La verificación se define como la identificación de errores (diferencia entre los

resultados previstos y reales) en un sistema.
La validación consiste en establecer pruebas documentadas que aporten un alto

nivel de seguridad de que un proceso específico producirá de forma consistente un
producto que cumpla sus especificaciones predeterminadas y atributos de calidad.
(Estados Unidos: FDA, General principles of validation (Principios generales de
validación), Rockville, MD., EE.UU., Center for Drug Evaluation and Research
(CDER) (Centro de evaluación e investigación de fármacos) (mayo de 1987)).
479
Inicio del desarrollo del método
Inicio del desarrollo del método
Cómo comenzar a desarrollar un método

con un enfoque de validación de métodos
Figura 323
480
Cómo comenzar…
Cómo comenzar…
Supuesto:
Comenzar a desarrollar y validar un método desde el principio.
Un enfoque práctico consiste en definir un plan con un desglose del trabajo.
Plan de ejemplo:
• Definir la aplicación, la finalidad y el alcance del método
• Definir los parámetros de rendimiento y los criterios de aceptación
• Verificar las características de rendimiento pertinentes del equipo
• Cualificar materiales (por ejemplo, patrones y reactivos)
• Desarrollar el método
• Documentar el método (aspectos críticos)
• Desarrollar un protocolo de validación
• Definir los experimentos de validación
• Llevar a cabo experimentos previos a la validación
• Ajustar los parámetros del método y/o los criterios de aceptación si fuera
necesario
• Llevar a cabo experimentos completos de validación internos (externos)
• Desarrollar SOPs (procedimientos estándar de operación) para ejecutar el
método en uso rutinario
• Definir los criterios de revalidación
• Definir el tipo y la frecuencia de las pruebas de idoneidad del sistema y/o
comprobaciones de control de calidad analítica (AQC) para el uso
rutinario del método
• Documentar los experimentos de validación y los resultados en el informe
de validación
Cada fase deberá estar bien documentada, ya que esto resultará útil de cara al
futuro.
481
Estrategia de validación del método*
Estrategia de validación del método*
Estrategia de validación del método

• Verificar las características de rendimiento relevantes del equipo y otras
etapas del método
• Desarrollar y optimizar el método (separación)
• Documentar el método (parámetros críticos)
• Desarrollar un protocolo de validación o un procedimiento de operaciones
para la validación
• Llevar a cabo los experimentos previos a la validación
• Realizar completos experimentos de validación internos (externos)
• Definir el tipo y la frecuencia de pruebas de idoneidad del sistema y/o de
comprobaciones de control de calidad analítica (AQC) para uso rutinario
• Documentar los experimentos de validación y los resultados en el informe de
validación
Figura 324
Para obtener los resultados más exactos, se deberán tener en cuenta todas las
variables del método, incluido el procedimiento de muestreo, la preparación de la
muestra, la separación cromatográfica, la detección y evaluación de datos,
utilizando la misma matriz que la de la muestra prevista. El procedimiento
propuesto debe someterse a un riguroso proceso de validación. Sólo los estudios
de laboratorio pueden verificar la validez de un método analítico. Todos los
experimentos de validación utilizados para presentar afirmaciones o conclusiones
sobre la validez de un método han de estar documentados en un informe.
Ref.: Interpharm Press, Inc. "Validation and Qualification in Analytical
Laboratories" (Validación y cualificación en laboratorios analíticos); Ludwig
Huber, 1998 ISBN: 1-57491-080-9
482
Definir la finalidad del método
Definir la finalidad del método
Definir el alcance y la finalidad del método
Éstos son algunos ejemplos de la finalidad del método:
• Pruebas de identificación
• Pruebas cuantitativas del contenido de impurezas
• Principales compuestos cuantitativos
• Pruebas de límites para el control de impurezas
• Principales compuestos y trazas - cuantitativo
• Trazas cualitativas
• Trazas cuantitativas
• Prueba cuantitativa de la mitad activa en muestras del
ingrediente activo, impurezas de productos de degradación
• Pruebas cuantitativas de los componentes seleccionados en
muestras del ingrediente activo, impurezas de productos de
degradación
Figura 325
La definición de la finalidad y el alcance es necesaria para obtener una imagen

clara del método.
Una definición clara influye directamente en la siguiente fase de definición de los
parámetros de rendimiento y criterios de aceptación.
Preguntas importantes que deben responderse en esta fase:

• ¿Qué se debe analizar?
• ¿Cuál es la matriz?
• ¿Cuáles son las expectativas de rendimiento?
• ¿Qué tecnología se debe utilizar?
• ¿Cuál es la finalidad del método?
• ¿Cuál es el alcance del método?
(Qué debe analizarse, en qué concentración y en qué matriz)
483
Principales parámetros
Principales parámetros
¿Cuáles son los parámetros clave para un

método?
Para responder a estas preguntas, son útiles las siguientes definiciones:

• Cómo podemos asegurarnos de que estamos midiendo el componente o los
componentes adecuados (Especificidad/Selectividad)
• Qué exactitud deben tener los resultados (Exactitud)
• Cómo podemos asegurarnos de que la cuantificación a través de un rango es
exacta (Linealidad)
• Cuál es el límite de detección aceptado (Límite de detección)
• Cuál es el límite de la cuantificación exacta - rango más bajo y más alto
(Límite de cuantificación y rango de funcionamiento)
• Qué precisión deben tener los resultados al utilizar el método en laboratorios
diferentes (Reproducibilidad)
• Qué precisión deben tener los resultados al utilizar el método en el mismo
laboratorio (Repetitividad)
• Qué precisión deben tener los resultados al utilizar el método con equipos
diferentes, o cuando lo utilicen diferentes operadores (Precisión intermedia)
Figura 326
484
Parámetros para la validación del método – Alcance del método
Parámetros para la validación del método –

Alcance del método
Parámetros que deben validarse - Alcance del

método
Principales
Principales compuestos y Trazas Trazas
compuestos -
trazas – cuantitativo cualitativas cuantitativas
cuantitativo
Especificidad Sí Sí Sí Sí
Linealidad Sí Sí no Sí
Exactitud Sí Sí no Sí
Precisión Sí Sí no Sí
R ango Sí Sí no no
Límite de detección mínimo no no Sí no
Límite de cuantificación
no Sí no Sí
mínima
R esistencia/Robustez Sí Sí no Sí
Figura 327
485
Cambios del método – Necesidad de revalidación
Cambios del método – Necesidad de revalidación
Elementos de datos necesarios para revalidar

métodos cromatográficos modificados
Parámetro Preparación de la Componentes del Condiciones
analítico muestra (1) sistema cromatográficas (3)
cromatográfico (2)
Precisión del ! Sí !
sistema
Precisión del Sí Sí *
método
Exactitud Sí * Sí
LOD (Límite de Sí * *
detección)
LOQ (Límite de Sí * *
cuantificación)
Especificidad Sí * Sí
Rango Sí * Sí
Linealidad Sí * Sí
Resistencia Sí * Sí
Figura 328
! Como parte de la prueba de idoneidad del sistema

* Puede ser necesario, dependiendo de la naturaleza de la prueba específica
1) Incluye cambios en las condiciones y los disolventes de extracción

2) Incluye cambios en la geometría de la celda de flujo del detector, el tipo de
detector, el muestreador
3) Incluye la velocidad de flujo en columna (proveedor, empaquetado,
geometría)…
486
Requisitos mínimos – Criterios de aceptación
Requisitos mínimos – Criterios de aceptación
Requisitos mínimos - Criterios de aceptación
• Definir los requisitos mínimos y los criterios de aceptación

esenciales:
• Especificidad
• Exactitud
• Precisión
• Linealidad
• Límite de detección mínima (MDL)
• Límite de cuantificación mínima (MQL)
• Rango de cuantificación
• Resistencia/Robustez
• Estabilidad
Figura 329
Requisitos mínimos y límites de aceptación:

Por cada parámetro necesario se debe definir un límite de aceptación – está
relacionado con la finalidad y el alcance del método.
Nota: Después de realizar la primera validación, o al final del desarrollo del método,
puede que no se puedan alcanzar algunos límites con este método, por lo que el método
(o los límites) deberá cambiarse o modificarse.
Si se cambian los límites, deberá asegurarse que el método sigue siendo válido para su
uso previsto.
487
Validación del método - Parámetros
Validación del método - Parámetros
Parámetros para la validación del método
• Selectividad/Especificidad (1,2)
• Linealidad (1,2)
• Límite de detección (LoD) (1,2)
• Límite de cuantificación (LoQ) (1,2)
• Rango (1,2)
• Exactitud (1,2)
• Precisión (1,2)
– Repetitividad (1)
– Precisión intermedia (1)
– Reproducibilidad (3)
• Robustez (2,3)
• Resistencia (2)
• Incluido en ICH
• Incluido en USP
• Incluido en ICH pero no es un requisito
Figura 330
488
Especificaciones del equipo – Requisitos del método
Especificaciones del equipo – Requisitos del

método
Especificaciones del equipo - Requisitos del

método
• Verificar la especificación del equipo - comparar con los

requisitos del método:
• Calificar y resumir toda la información necesaria para

desarrollar el método de separación:
– Propiedades de la matriz
– Pasos de la preparación de la muestra - IStd (patrón interno) o
EStd (patrón externo)
Figura 331
El equipo que se utilice deberá cumplir los criterios de rendimiento del método.
Ejemplo:
Si el criterio de aceptación de la reproducibilidad del método es %RSD ≤ 1,0
pero el muestreador ofrece una reproducibilidad de inyección de %RSD ≤ 1,5, tal
vez no resulte útil emplear este equipo.
• Para desarrollar un método cuantitativo, es importante cualificar patrones
de referencia y todos los compuestos que se espere encontrar en la matriz,
etc.
489
Cualificar los materiales
Cualificar los materiales
Patrones químicos - Patrón de referencia

(certificado)
• ISO/ICE Guía 33 Bureau Communautaire de Reference
– Material de referencia (RM) (BCR) - Oficina Comunitaria de
– Material de referencia certificado
(CRM)
Referencia
• NIST (National Institute of Standard United States EPA (Environmental
and Technology) - Instituto Nacional de Protection Agency) - Agencia de
Normas y Tecnología Protección del Medio Ambiente de
– Material de referencia estándar EE.UU.
(SRM) NIMC (Japan National Institute of
– Material de referencia externo
(ERM) Materials and Chemical Research) -
– Material de referencia interno (IRM) Instituto Nacional de Materiales e
• IUPAC (Analytical Chemistry Section) Investigación Química de Japón
- Sección de química analítica CITI (Japanese Chemicals Inspection
– Patrón primario (certificado) and Testing Institute) - Instituto Japonés
– Patrón secundario (verificado)
– Patrón de trabajo (preparado por el de Inspección y Verificación Química
usuario) LGC (Laboratory of the Government
Chemist) Laboratorio de Químicos de la
Administración Pública
Figura 332
Las sustancias de referencia tienen suma importancia, ya que normalmente se

utilizan para calibrar el instrumento. La exactitud de las sustancias de referencia
normalmente determina la exactitud del método analítico. De ahí el interés en la
certificación y el tratamiento de los artículos de control.
Por lo tanto, es muy importante la manipulación y la documentación de las
sustancias de referencia.
• Patrones primarios (certificados por NIST/BCR).
• Patrones secundarios de los que se puede realizar un seguimiento hasta
los patrones primarios certificados por el fabricante y verificados mediante
un método independiente.
• Patrones de trabajo preparados por el usuario, de los que se puede
realizar un seguimiento hasta el patrón primario o secundario, o
verificados mediante un método independiente.
490
Desarrollo del método – Optimizar la separación
Desarrollo del método – Optimizar la separación
Desarrollo del método - Validación del método
• Desarrollar y optimizar la separación mediante una mezcla

de prueba (incluidos todos los componentes de muestras
potenciales):
• Demostrar que los componentes de interés de la muestra están
bien separados.
• Evaluar la recuperación del analito de interés (resultados en
contraposición al valor conocido).
Observación: No olvidar el requisito del método en los pasos de

optimización.
Figura 333
Esta fase del plan se centra en el desarrollo de un método (separación) y su

optimización.
Durante esta fase deben documentarse todos los parámetros críticos y su impacto,
para su futuro uso.
La recuperación deberá evaluarse en función de una sustancia cuya cantidad se
conozca.
491
Desarrollo del método - Documentación
Desarrollo del método - Documentación
Desarrollo del método - Validación del método
• Documentar el método optimizado:

• Cada paso deberá describirse con Muestreo
todos los parámetros.
• No olvidar los parámetros críticos que
influyen en el método.
Análisis
Calibración
Evaluación de los datos

Informe
Validación
Figura 334
Documentar un método no es una tarea sencilla.

Una buena documentación deberá ofrecer toda la información y en el orden en el
que espere encontrarla otro usuario.
Deben aclararse todos los términos técnicos.
Una manera útil de probar la documentación de un método consiste en entregarla
a otro analista que tenga que seguir la documentación del método exactamente de
la manera descrita.
Esta manera muestra claramente los puntos débiles en la documentación del
método.
492
Estrategia de validación del método - Resumen

de los pasos de validación del método
• Verificar las características de rendimiento relevantes del equipo
• Desarrollar y optimizar el método (separación)
• Documentar el método (parámetros críticos)
• Desarrollar un protocolo de validación o un procedimiento de operaciones
para la validación
• Llevar a cabo los experimentos previos a la validación
• Realizar completos experimentos de validación internos (externos)
• Definir el tipo y la frecuencia de pruebas de idoneidad del sistema y/o de
comprobaciones de control de calidad analítica (AQC) para uso rutinario
• Documentar los experimentos de validación y los resultados en el informe de
validación
Figura 335
Aquí se resumen las fases relacionadas con el trabajo de desarrollo del método.
493
Selectividad/Especificidad
Figura 336
494
Teoría - Selectividad/Especificidad
Especificidad (Selectividad):
• Capacidad para evaluar de forma inequívoca el analito en
presencia de componentes que se puede esperar que estén
presentes.
• Normalmente, pueden incluir impurezas, degradantes, matrices,
etc.
• (ICH Q2A, CPMP/ICH/381/95)
Figura 337
La especificidad se puede definir como la capacidad de un método de ensayo

para distinguir un analito de otros materiales que pueden estar presentes en la
muestra de prueba, como excipientes o productos de descomposición. Algunos
datos se pueden deducir de las comprobaciones de linealidad y de exactitud. Sin
embargo, para garantizar que un método discrimina los productos de
descomposición, es necesario llevar a cabo estudios de muestras descompuestas y
productos de descomposición.
495
• ICH
– Especificidad: Este término se aplica a un método que ofrece
una respuesta sólo para un único analito.
– Selectividad: Este término se aplica a un método que ofrece
respuestas para más de un analito.
• USP
– Selectividad: Un método analítico es selectivo si tiene la
capacidad para medir con exactitud un analito en presencia de
interferencias y productos de degeneración conocidos que se
pueden esperar que estén presentes en la matriz de la muestra.
Figura 338
Selectividad (Especificidad)
A menudo se utilizan indistintamente los términos selectividad y especificidad.
Sin embargo, el término específico hace referencia a un método que produce una
respuesta sólo para un único analito.
El término selectivo hace referencia a un método que ofrece respuestas para una
serie de entidades químicas que pueden o no distinguirse. Si la respuesta se
distingue de todas las demás, se dice que el método es selectivo.
Puesto que existen muy pocos métodos que responden únicamente a un analito,
normalmente es más apropiado emplear el término selectividad.
La monografía de USP define la selectividad de un método analítico como su
capacidad para medir exactamente un analito en presencia de interferencias que
pueden estar presentes en la matriz de la muestra: precursores sintéticos,
excipientes y productos de degradación conocidos (o probables) que puedan estar
presentes. En la cromatografía de líquidos, la selectividad se obtiene eligiendo las
columnas y las condiciones cromatográficas óptimas, como la composición de la
fase móvil, la temperatura de la columna y la longitud de onda del detector. La
selectividad de un método analítico se verifica comparando los resultados de las
muestras que contienen impurezas con los resultados de las muestras sin las
impurezas.
496
Repercusiones:
• Identificación: para garantizar la identidad del analito.
• Prueba de pureza: para garantizar que todos los procedimientos

analíticos llevados a cabo permiten una declaración exacta del
contenido de impurezas de un analito.
• Ensayo (contenido o potencia): para obtener un resultado que

permite una declaración exacta del contenido o la potencia del
analito en una muestra.
Figura 339
Hay una variedad de maneras de validar la selectividad:

Karnes* sugiere que la forma más sencilla de probar el análisis cromatográfico es
demostrar una falta de respuesta a la matriz biológica en blanco.
Conviene examinar los blancos cromatográficos de diversas fuentes en la ventana
de tiempo de retención esperada del mayor pico de analito. El mismo autor ha
sugerido un segundo enfoque: comprobar si la intersección de la curva de
calibración es significativamente diferente de cero.
497
Límite de detección
Límite de detección (LoD)
Figura 340
498
Límite de detección (LoD) - Definición
Límite de detección (LoD) - Definición
• El límite de detección de un procedimiento analítico individual

es la menor cantidad de analito en una muestra que se puede
detectar, pero no necesariamente cuantificar como el valor
exacto.
• Normalmente es tres veces el nivel de ruido.
• Se recomienda que el límite de detección se pruebe con equipos
diferentes. La medida debería realizarse cuando la señal esté
próxima al LoD.
Relación señal/ruido (N/S)
Magnitud de señal *) N (RMS) puede ser 1/5

N/S = 
N (RMS)* del nivel de ruido de pico a
pico
Figura 341
Observación:
El rendimiento del detector influye en gran medida en el LoD.
El ruido del detector es uno de los criterios de rendimiento del detector que
influye en el LoD.
499
Límite de cuantificación (LoQ)
Figura 342
Es el punto por debajo del cual los resultados no son fiables.

El límite de cuantificación es la cantidad inyectada que da como resultado una
medida precisa y repetible de las áreas de picos (equivalente a cantidades). Las
alturas de picos generalmente deben ser de 10 a 20 veces mayores que el ruido de
la línea de base.
500
Límite de cuantificación (LoQ) - Definición
Límite de cuantificación (LoQ) - Definición
• El límite de cuantificación de un procedimiento analítico

individual es la menor cantidad de analito en una muestra que se
puede determinar de forma cuantitativa con una precisión y
exactitud adecuadas.
• El límite de cuantificación es un parámetro de ensayo
cuantitativo para los niveles más bajos de compuestos en las
matrices de muestra, y se utiliza concretamente para la
determinación de impurezas y/o productos de degradación.
Figura 343
501
Teoría - Linealidad
Linealidad
La linealidad de un procedimiento analítico es su capacidad

(dentro de un rango determinado) para obtener resultados de
prueba que sean directamente proporcionales a la concentración
(cantidad) de analito en la muestra.
Figura 344
La mayoría de los métodos de ensayo de productos formulados se basan en la

comparación de la respuesta de una disolución que contiene una concentración
conocida del componente que se va a medir (disolución patrón analítica) con la de
un extracto de la muestra de prueba (la misma disolución); el disolvente en cada
caso debe ser idéntico. La concentración en la disolución patrón se elige de
manera que sea aproximadamente igual que la concentración teórica en la
disolución de la muestra, si se conoce. En la práctica, la concentración en la
disolución de la muestra podrá no ser la esperada; por ejemplo, la respuesta de la
disolución de la muestra podrá ser la mitad de la disolución patrón, y en tales
casos es importante establecer que la respuesta de las disoluciones patrón y de la
muestra es directamente proporcional a la concentración del componente en el
margen de estudio probable. Este parámetro se conoce como la LINEALIDAD
de la respuesta del analito.
Las disoluciones se deben preparar independientemente.
La linealidad del analito en presencia de los ingredientes de la formulación se
examina mediante la adición de cantidades crecientes de analito a un peso fijo de
un placebo de formulación, igual al peso de la muestra normal (es decir, un
placebo con respecto al analito). Estas mezclas, junto con el propio placebo, se
502
tratan exactamente como muestras, y se determinan las respuestas de las

disoluciones resultantes.
El rango de cada estudio depende de la naturaleza del analito y de su función en
las formulaciones; por ejemplo, en el caso del agente o los agentes activos y los
conservantes, el margen de estudio debería incluir al menos 5 puntos en el rango
comprendido entre 0 y 150% de los resultados esperados de la prueba. En el caso
de los disolventes residuales, las impurezas y los productos de descomposición, el
margen de estudio debería incluir al menos de 0 a 150% del límite de
especificación propuesto.
503
Exactitud/Veracidad/Precisión
Exactitud - Veracidad (Sesgo) - Precisión
La exactitud* de un proceso analítico expresa la cercanía de un resultado a

un valor verdadero.
Precisión* es la medida de la cercanía entre los resultados.
Veracidad (Sesgo)* expresa la cercanía de una media de un

conjunto de resultados al valor verdadero.
“Incertidumbre de medida” se utiliza como una expresión de la

exactitud que combina precisión y veracidad.
* Guía EURACHEM "The fitness for Purpose of Analytic Methods" ("Idoneidad para métodos
analíticos") Edición 1.0 - 1998
Figura 345
La veracidad o desviación de los resultados del método y la precisión de los

resultados afectan a la exactitud, como la expresión de la cercanía del resultado a
un valor verdadero.
La exactitud es la propiedad de un resultado, y tiene componentes de desviación
y precisión (cuando se aplica a un conjunto de resultados - ISO 5725 o ISO 3534).
La veracidad es el nivel de conformidad entre el valor promedio obtenido de un
gran conjunto de resultados de pruebas y el valor de referencia aceptado.
La desviación es el error sistemático de un método.
Determinación práctica de la veracidad y la precisión:
• Comparar la media de los resultados del método con valores conocidos de
un material de referencia (patrón).
• Determinar, para la precisión, el RSD de la media de un conjunto de
resultados.
504
Patrón de referencia:
La situación ideal es utilizar un material de referencia certificado
internacionalmente para marcar la matriz de la muestra.
Si no es posible, se puede utilizar un material bien caracterizado cuya estabilidad
se haya comprobado internamente.
En la comprobación que se realice con un método alternativo (independiente), se
deben analizar la misma muestra o muestras para comparar los resultados y
obtener la veracidad (desviación).
505
Precisión
Precisión
Precisión
La precisión de un procedimiento analítico expresa la cercanía de la

conformidad (grado de dispersión) entre una serie de medidas obtenidas a partir
de muestreos múltiples de la misma muestra homogénea en condiciones
establecidas.
La precisión se puede considerar a tres niveles:

– Repetitividad
– Precisión intermedia
– Reproducibilidad
La precisión de debe investigar utilizando muestras auténticas y

homogéneas.
No obstante, si no es posible, se puede investigar mediante pruebas preparadas

artificialmente o disoluciones de muestras.
Figura 346
La repetibilidad se obtiene si el análisis lo lleva a cabo un operador en un

laboratorio, utilizando un mismo equipo en un lapso de tiempo relativamente
corto.
ICH requiere al menos 6 reproducciones al 100% de la concentración objetivo
de la prueba, o 9 réplicas que cubran todo el rango de trabajo (3 concentraciones/
3 réplicas).
Se debe aportar el %RSD.
La precisión intermedia (ICH) es una variabilidad a largo plazo del proceso
de medida. El método lo llevan a cabo diferentes analistas, con diferentes equipos
y diferentes columnas o sustancias químicas de diferentes proveedores durante
varias semanas en el mismo laboratorio.
La reproducibilidad (ICH) se define como la precisión de los resultados
obtenidos utilizando el mismo método en diferentes laboratorios. Debe verificarse
que el método funciona en diferentes laboratorios.
506
Precisión
Observación:
La precisión de los tiempos de retención y de las áreas y alturas de pico es un
criterio fundamental de un sistema de separación. La precisión del tiempo de
retención es importante porque el tiempo de retención es el medio principal para
la identificación de picos. También es un criterio importante del rendimiento y un
diagnóstico para una bomba y una columna de cromatografía de líquidos.
La precisión de las áreas de pico es importante porque estas áreas se utilizan
para calcular las cantidades de sustancia durante la cuantificación. También es
el criterio de rendimiento más importante para un sistema de inyección de
cromatografía de líquidos. La precisión se deberá determinar utilizando un
mínimo de cinco cromatogramas repetidos. La precisión de muestras
bioanalíticas se estudia, al menos, en concentraciones bajas, medias y altas. Este
proceso se repite a lo largo de varios días para calcular la precisión en el mismo
día y en días diferentes.
507
Precisión
Precisión (continuación)
La precisión de un procedimiento analítico normalmente se

expresa como la varianza, la desviación estándar o el coeficiente de
variación de una serie de medidas.
– Repetitividad
Expresa la precisión en las mismas condiciones de
funcionamiento y en un intervalo corto de tiempo.
– Precisión intermedia
Expresa variaciones dentro de laboratorios en días diferentes, con
diferentes analistas, instrumentos, etc.
– Reproducibilidad
Expresa la precisión entre laboratorios (estudios de colaboración,
normalmente aplicados a la estandarización de metodologías) y
también si el método se utiliza en diferentes ubicaciones
Figura 347
508
Robustez
Robustez
Robustez
La robustez de un procedimiento analítico es una medida de su

capacidad para no verse afectado por pequeñas variaciones
deliberadas en los parámetros del método, y ofrece una indicación
de su fiabilidad durante el uso normal.
La USP definió este término como el grado de reproducibilidad de

resultados obtenidos en una variedad de condiciones, de un
laboratorio a otro y de un analista a otro.
Figura 348
Las pruebas de robustez examinan el efecto que tienen las condiciones operativas
y del entorno en los resultados del análisis. Es el grado de variación de los
resultados de las pruebas obtenidos mediante el análisis de las mismas muestras
en una variedad de condiciones de prueba diferentes.
Un método robusto es aquél que tiene protecciones incorporadas contra los abusos
típicos que se cometen, es decir, las diferencias en el cuidado, la técnica, el equipo
y las condiciones. La robustez de un método analítico se determina mediante el
análisis de alícuotas de lotes homogéneos en laboratorios diferentes, realizados
por diferentes analistas y utilizando condiciones operativas y ambientales que
pueden diferir, pero que se encuentren todavía dentro de los parámetros
especificados del método (pruebas en distintos laboratorios). Para determinar la
robustez de los métodos en un laboratorio se cambia una serie de parámetros
cromatográficos, como por ejemplo la velocidad de flujo, la temperatura de la
columna, la longitud de onda de detección o la composición de la fase móvil, en
un rango realista, y se determina la influencia cuantitativa de las variables. Si la
influencia del parámetro se encuentra dentro de un rango de tolerancia
especificado anteriormente, se dice que el parámetro se encuentra dentro del
rango de robustez del método.
509
Implantación
Implantación
Implantación de un método validado
Caso: Implantación de un método validado en un laboratorio

rutinario.
• Es necesario garantizar que los analistas comprendan
perfectamente los factores críticos del método.
• Se deberá facilitar un procedimiento de validación bien
documentado y documentación sobre el método.
• Es necesario que exista una buena comunicación entre el
desarrollador y los analistas encargados de las operaciones.
• En este laboratorio, y en este entorno, es necesaria la
verificación del método.
• Se deberán contrastar los resultados de rendimiento del
laboratorio con los criterios de rendimiento.
Figura 349
El método no se debería utilizar hasta que el analista pueda cumplir los criterios
de rendimiento y haya documentado esta prueba.
510
Utilización de un método validado
• Se deben realizar con frecuencia comprobaciones de los

criterios de rendimiento del método, tal y como se define en la
prueba de idoneidad del sistema.
• Es útil utilizar gráficos de control para determinar las
tendencias.
• También es útil informar al desarrollador del método la primera
vez que se utilice.
• Se debe volver a realizar una validación si cambia el alcance
definido del método.
Figura 350
511
512

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Introducción a la cromatografía

de líquidos de alto rendimiento

Manual del Alumno

Nº de referencia del manual H1186-90000

Agilent Technologies, Inc.

 2000 by Agilent Technologies, Inc.

En esta sección aprenderá lo siguiente

En esta sección aprenderá lo siguiente:

• Las diferencias entre la cromatografía de líquidos de alto

Tiene que resolver un problema

Tiene que resolver un problema

Necesito una separación

Necesitaré una técnica

A diario, los usuarios de cromatógrafos se enfrentan a la necesidad de desarrollar

Tengo dos técnicas de separación en el laboratorio,

Dos de las principales técnicas de separación instrumental actuales son la

Volatilidad de la muestra Polaridad de la muestra

Las muestras que se analicen mediante la cromatografía de gases deben ser

Hidrófilo Iones inorgánicos

BHT (butilhidroxitolueno), Ácidos grasos Antibióticos

Monómeros de polímero Triglicéridos Fosfolípidos

Metiléster Ésteres aromáticos

Volátil Volatilidad No volátil

El diagrama anterior muestra algunos de los análisis típicos llevados a cabo

Labilidad térmica Peso molecular

• La muestra debe • Normalmente

El entorno de la GC es destructivo para compuestos térmicamente lábiles, es

• El disolvente debe ser • Normalmente 1 - 5 µL

Las muestras de HPLC deben filtrarse antes de la inyección para eliminar

Mecanismo de separación Detectores

¿Cómo podemos analizar la muestra?

Bombas Fase móvil transporta la muestra a través

Cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento

El diagrama muestra los componentes de un cromatógrafo de líquidos de alto

diferenciada entre dos fases en la columna, la fase móvil y la estacionaria. Tras la

to - tiempo de extracción de pico no retenido

La fase móvil transporta los componentes de la muestra hasta el detector, donde

Parámetros de análisis de HPLC

Parámetros de análisis de HPLC

Depósitos de Fases móviles

Detector Constante del tiempo

La resolución de los picos cromatográficos se puede controlar mediante la

Modo de cromatografía de líquidos de alto

Modos de cromatografía de líquidos de alto

Tipos de compuestos Modo Fase Fase móvil

Compuestos no solubles Fase normal Sílice, Amino, Orgánicos

Iones inorgánicos iónicos Cambio de iones Resina de cambio Acuoso/tampón contra-ión

Peso molecular elevado Exclusión de Poliestireno Filtración de gel - Acuosa

En el gráfico anterior se muestran las cinco técnicas principales de separación de

con peso molecular alto o bajo.

En esta sección aprenderá lo siguiente

En esta sección aprenderá lo siguiente:

• Acerca de los sistemas de reparto de disolvente de HPLC.

• Cómo funcionan los muestreadores.

• Acerca de los detectores de HPLC habituales.

Descripción general de la instrumentación

Descripción general de la instrumentación

Mezclador Cabina de disolventes

Columna Módulo de control

Un cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento consta de los siguientes

En el diagrama anterior se muestra la ruta de flujo de un cromatógrafo de líquidos

Para evitar volúmenes excesivos externos a la columna, cada componente del

Filtro de precolumna Columna analítica

Filtro de entrada de disolvente Filtro de precolumna