Manual Microbiologia

Facultad de Ciencias
Químicas e Ingeniería
Químico
Farmacobiólogo
Manual de
Microbiología
General
Dra. Lilia Angélica Hurtado Ayala

MSP Luis Alberto Alcántara Jurado
MC María del Carmen Jáuregui Romo
REV.01 OCTUBRE 2017

Laboratorio de Microbiología General QFB
EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL
El objetivo general del laboratorio de Microbiología General es que el alumno se inicie con
el conocimiento de la biología básica de los microorganismos, en sus características
morfológicas, nutricionales, de crecimiento, control y que adquiera las habilidades
necesarias para su manipulación en el laboratorio.
En cada práctica se presentan las competencia y una breve introducción para facilitar la
comprensión de los mismos, después se indican los materiales necesarios y
procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se complementan
con figuras y esquemas.
Posteriormente en cada práctica se proponen formas de presentación de los resultados en
cuadros, para que el alumno recopile sus observaciones. También se incluyen preguntas
en forma de cuestionario que el estudiante deberá resolver consultando los materiales
bibliográficos sugeridos al final de este manual.
Facultad de Ciencias Químicas e Ingenieria. UABC

REGLAS DE LABORATORIO
NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
1. Siempre deberá usar bata de algodón, de manga larga, abotonada, que deberá
quitarse antes de abandonar el laboratorio
2. Se prohibe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún
otro objeto. Se deberá lavar meticulosamente las manos con agua y jabón antes de salir del
laboratorio.
3. Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la
práctica de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la
zona especificada por el académico.
4. No se admiten visitas personales que distraigan la atención y pongan en riesgo la
seguridad en el trabajo que se realiza.
5. Limpiar su mesa, antes y después de trabajar , con jabon y esponja, posteriormente
con solución desinfectante.
6. Tener en cuenta que el cultivo con el que se trabaja puede ser patógeno, razón por
la cual hay que manejarlo siempre como si lo fuera.
7. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá
notificarlo inmediatamante al académico. En el caso de derrame de cultivos o rotura de
recipientes con cultivos activos, deberá conservar la calma y además de informar al
académico, seguir inmediatamente el procedimiento:
A) Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión.
B) Poner abundante solución desinfectante sobre las toallas.
C) Dejar transcurrir por lo menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el recipiente
destinado a la eliminación de materiales contaminados.
8. En caso de heridas por accidentes durante el manipuleo del material infectado, debe
prevenirse la posibilidad de infección. Comunique el hecho al maestro.
9 Realice las técnicas bacteriológicas al abrigo de las corrientes de aire, con
movimientos pausados, poco amplios y sin brusquedad. Evite hablar mientras realiza
maniobras microbiológicas a fin de evitar que se contaminen los cultivos.
10. Debe siempre llevarse el asa al rojo antes y después de toda operación que se
realice con ella.
11. No deben depositarse los tapones sobre la mesa, para evitar contaminaciones de y
con los cultivos de trabajo.
12. Los tubos con medio de cultivo, ya sean líquidos o sólidos, sembrados o no, deben
colocarse siempre sobre una gradilla y nunca sobre la mesa.
13. Los cultivos de descarte deben colocarse siempre en recipientes adecuados para
luego ser esterilizados.
14. Tanto las cajas petri como los tubos deben ser identificados con marcas o rótulos.
15. Los papeles de envoltura de material de vidrio deben arrojarse en los cestos
destinados a tal fin.

16. Anotar concisamente todo lo nuevo que se observe en cada experiencia,

completando con dibujos.
17. Al abandonar el laboratorio, debe controlar que los mecheros y llaves de gas, agua,
así como las luces estén apagados.
21. REQUIERA LA PRESENCIA DEL DOCENTE PARA QUE LO ASESORE
CORRECTAMENTE TODA VEZ QUE TENGA DUDAS SOBRE LA REALIZACIÓN DE UNA
TÉCNICA.

PRÁCTICA NO. 1
Normas de trabajo. Presentación del material de laboratorio y de los elementos de
Bioseguridad
COMPETENCIA.
Aplicar las normas y medidas de seguridad para trabajar en el laboratorio de manera segura cuidando su salud el entorno.
FUNDAMENTO TEÓRICO.
Revisar la guía de Bioseguridad en el laboratorio. Organización Mundial de la salud
Revisar el check list de la Guia
OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES.
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CUESTIONARIO.
1.- Ejemplos de microorganismos tratados en cada nivel de Bioseguridad.

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2.- Propuestas para el mejoramiento del laboratorio de microbiologia
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PRÁCTICA NO. 2
PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO
COMPETENCIA.
Conocer las técnicas de preparación de diferentes medios de cultivo, su esterilización y pruebas de calidad, a través de su
aplicación en el laboratorio, para adquirir la destreza en la elaboración de estos, observando las medidas de bioseguridad que
marca el laboratorio, y condiciones de saneamiento y esterilidad
En general la muerte de todos los organismos se llama esterilización y se efectúa mediante calor, radiación, o sustancias
químicas. La esterilización significa la completa destrucción de todas las células microbianas presentes; una vez que se
esterilizó un producto, permanecerá estéril indefinidamente si está sellado en forma apropiada.
Un agente antimicrobiano es una sustancia química que mata o inhibe el desarrollo de los microorganismos, Esa sustancia
puede ser sintética o natural. La distinción entre un agente que mata o inhibe, es a menudo arbitraria, pues un agente mata a
altas concentraciones y puede inhibir a concentraciones menores.
Comúnmente se hace uso de los siguientes términos en relación con los agentes antimicrobianos y su empleo.
Bacteriostático: Que tiene la propiedad de inhibir la multiplicación bacteriana; ésta se reanuda en cuanto se retira el agente.
Bactericida: Que tiene la propiedad de matar a las bacterias. La acción bactericida difiere de la bacteriostasis únicamente en
que es irreversible: es decir, el organismo “muerto” no puede reproducirse más, aun cuando sea retirado del contacto con el
agente. En algunos casos el agente causa lísis (disolución) de las células, en otros casos las células permanecen intactas e
inclusive pueden continuar metabólicamente activas.
Estéril: Excento de vida de cualquier clase. La esterilización puede realizarse por filtración (en el caso de líquido o aire) o por
tratamiento con agentes microbicidas. Dado que el criterio de muerte para los microorganismos es su incapacidad para
reproducirse, el material estéril puede contener células microbianas metabólicamente intactas.
Desinfectante: Una substancia química empleada para matar microorganismos sobre superficies, pero demasiado tóxica para
aplicarla directamente a los tejidos.
Séptico: Caracterizado por la presencia de microorganismos patógenos, por ejemplo el tejido vivo.
Aséptico: Caracterizado por la falta de microorganismos patógenos.
Antiséptico: Toda sustancia que se opone a la sepsis o impide el desarrollo o acción de los microorganismos, ya sea por
destruirlos o inhibir su crecimiento y actividad. Generalmente se refiere a sustancias aplicadas al cuerpo.
Saneamiento: Consiste en reducir la población microbiana a niveles no peligrosos por medio de un agente. según los
requerimientos de salud pública. Por lo regular, es un agente químico que mata el 99.9% de las bacterias en crecimiento. Los
agentes para el saneamiento se aplican casi siempre a objetos inanimados, generalmente para el cuidado diario de equipos,
utensilios en lecherías, plantas de alimentos, vajillas y cubiertos de los restaurantes.
La aplicación de calor es el método más simple para esterilizar material, a condición de que éste no sufra daño en si mismo por
el calor. Una temperatura de 100°C matará a todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos. excepto a las esporas; para matar
a éstas se requiere de una temperatura de 121°C durante 15 minutos. Generalmente se usa el vapor, tanto porque las
bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir
el calor uniformemente en todas las partes del recipiente de esterilización. El vapor debe conservarse a una presión de 15
lb/plg2 sobre la presión atmosférica para obtener una temperatura de 121°C; con este propósito se utilizan las autoclaves o las
ollas de presión. Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos eléctricos por los que circula
aire caliente; en vista de que el calor es menos efectivo en materiales secos, se acostumbra aplicar una temperatura de 160 a
170°C durante una hora o más.
En las condiciones descritas anteriormente (es decir, temperaturas excesivas aplicadas por largos períodos de tiempo), el calor
actúa desnaturalizando las proteínas celulares y fragmentando las membranas celulares.
Como la esterilización es un método utilizado en microbiología para la reutilización de cualquier material que pueda y deba
emplearse como material aséptico. Esto puede ser por dos métodos diferentes:
A) Métodos físicos.

B) Métodos químicos.
Métodos Físicos
1. Calor Seco.
Para material que no puede ser humedecido, son tres técnicas diferentes.
A) Flameado; Exposición de un objeto o parte del material a la llama de un mechero durante 1 o más
minutos. Se emplea para esterilizar el asa, la boca de los tubos y matraces.
B) Incineración: Destrucción en hornos crematorios del material de un solo uso. Ej. Jeringas, guantes, catéteres, etc.
C) Horno seco: O estufa Pasteur puede ser eléctrica o de gas , a temperatura de 160 C por 3 horas. Para material
impermeable, aceites, vidrio, instrumental médico, etc.
2. Calor Húmedo.
Su efectividad se debe probablemente a la participación del agua en la coagulación y desnaturalización de proteínas. Son
dos los mecanismos:
A) Ebullición: Utilizado poco, no muy fiable, destruye solo patógenos no formadores de esporas, se introduce el
material en agua hirviendo a 100 C durante 10 minutos.
B) Autoclave: Es un aparato muy utilizado y sus propiedades esterilizadoras dependerán de las condiciones de
presión y temperatura elegidos., se puede utilizar para material metálico, cristal paños y algunos plásticos
reutilizables.
3. Radiación.
Se utiliza rayos ultravioleta y rayos gamma, la luz ultravioleta se utiliza para mantener superficies o recintos estériles con
una  desde 335 nm. Los rayos gamma se utilizan para esterilización en frío, por medio de isótopos radioactivos, este
último método es más utilizado a nivel industrial para materiales sensibles al calor y material utilizado en medicina.
4. Filtración.
Se utiliza para esterilizar diversas soluciones que no pueden tolerar las alas temperaturas. Se utilizan filtros de membrana,
de vidrio, de flujo laminar (quirófanos, campanas).
Métodos Químicos
Son desinfectantes que se aplican a objetos y superficies y antisépticos que se aplican sobre piel y mucosas.
Ejemplos:
Desinfectantes: detergentes catiónicos, clorofenoles, compuestos clorados.
Antisépticos: alcoholes, mercuriocromo, derivados de yodo.
Gas: Oxido de etileno, glutaraldehído, vapor de formol.
MEDIOS DE CULTIVO
Para el estudio de los microorganismos se necesita cultivarlos en condiciones de laboratorio, en base a los requerimientos
nutricionales que dicho microorganismo necesite, así como las condiciones físicas que sean necesarias para llevar a cabo
su crecimiento y funciones normales. Los medios de cultivo están formulados de acuerdo a estos requisitos nutricionales, a
pesar de la gran diversidad de tipos de nutrición que se han encontrado entre las bacterias, los nutrientes se han clasificado en
dos grandes grupos: Energéticos y no energéticos.
REQUERIMIENTOS ENERGETICOS Y NO ENERGETICOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

ENERGETICOS:
FUENTE DE CARBONO: Azúcares como glucosa, lactosa, maltosa, etc.
FUENTE DE NITROGENO: Nitrógeno, nitratos y amonio.
NO ENERGETICOS;
FUENTE DE AZUFRE: Sulfatos aminoácidos, como metionina, cisteína y tiamina.
FUENTE DE FOSFORO: Fosfatos.
IONES METALICOS: Sodio, potasio, magnesio, fierro, etc.
FACTORES DE CRECIMIENTO: Algunos aminoácidos, factor específico X o V, vitaminas, bases
puricas y pirimídicas.
FACTORES DE ARRANQUE: Son sustancias que permiten a la bacteria de estudio salir de su fase
latencia y comenzar su fase de crecimiento exponencial

FACTORES INHIBIDORES: Compuestos que impiden el crecimiento de algún tipo de microorganismo

por bloqueo de sus procesos metabólicos.
Existe una gran variedad de medios de cultivo, elaborados de acuerdo para propósitos especiales que facilitan la identificación,
aislamiento y cuantificación de ciertos tipos de bacterias. Por lo cual existe una clasificación de los medios de cultivo en base a
sus diferentes características..
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
SEGUN PROPORCION DE AGUA
• MEDIO SÓLIDO: La proporción de agar es mayor del 15 % , sirve para aislamiento, purificación y
visualización de su crecimiento en colonias, identificación por medios específicos y diferenciales , así como la elaboración
de antibiogramas.
• MEDIOS LÍQUIDOS O CALDOS: No contienen agar, solo agua, fuente de carbono, sales minerales, factores de
crecimiento, vitaminas, peptonas, aminoácidos, etc. También para las pruebas bioquímicas , identificación de bacterias,
recuento bacteriológico, para inóculos, así como para obtener productos metabolitos primarios y secundarios.
• MEDIOS SEMISÓLIDOS; La concentración de agar es menor del 5%, se utiliza para pruebas bioquímicas, Ej.
Oxidación -Fermentación, motilidad, etc.
POR SU USO
• PARA AISLAMIENTO: Se utilizan para obtener colonias aisladas, son de tres diferentes tipos.
A) ENRIQUECIDOS: Contienen otro componente aparte de los necesarios para facilitar el crecimiento de algún tipo de
microorganismo. Ej., Caseína, soja, triptófano, etc.
B) SELECTIVOS: Contienen componentes que impiden el crecimiento de algún tipo bacteriano. Ej. Medio Rothe, EMB, 110,
Sulfito bismuto.
C) DIFERENCIALES: Inhiben el crecimiento de algunas bacterias y contienen sustancias que al ser utilizadas o no, por las
bacterias que van a crecer en dicho medio, dan una información suplementaria y específica. Ej. Medio Levine, EMB, Verde
brillante y McConkey;
• PARA CRECIMIENTO EN GENERAL: Pueden ser líquidos o sólidos, se utilizan para la mayoría de
las bacterias y su composición esta formada por una fuente de Carbono, fuente de Nitrógeno ,
sales y agua.
• PARA IDENTIFICACION: Tienen características de los medios diferenciales y sirven para identificar el
crecimiento y las características de algún tipo de microorganismos . Contienen componentes especiales,
Ej. Peptona, urea, glucosa.
• PARA MANTENIMIENTO DE CEPAS: Contiene nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas
durante periodos de tiempo relativamente largos.
POR SU COMPOSICION
• NATURALES: Son muy raros. Los componentes orgánicos e inorgánicos se encuentran en la naturaleza, y
están constituidos por tejidos, líquidos, órganos, etc. Ej. Leche, papa, huevo y suero de sangre .
• SEMISINTÉTICOS: Parte de sus componentes corresponden a extractos naturales como levaduras, malta,
papa, sangre, huevo y leche, los cuales son añadidos a los constituyentes sintéticos o químicamente
definidos . Ej. Agar sangre, Lowenstein-Jensen.

• SINTÉTICOS: Estructura sintéticas, más o menos puras y químicamente definidas, son los más usados
para aislamiento, identificación, crecimiento, vitaminas, aminoácidos, aminas, componentes minerales,
oligoelementos. Factores de crecimiento, bases puricas y pirimídicas.
• COMPLEJOS: Son los primeros que se utilizaron, actualmente se usan para parasitología y virología,
contienen tejidos animal y rara vez vegetal. Ej. Carne de músculo, hígado, corazón, clara o yema
de huevo, azúcar, etc.
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL.
2 Matraces Erlenmeyer de 250 ml. Algodón. Pipeteador o perilla.
10 Tubos para cultivo de 16x150 mm. Papel de estraza. Pizeta
8 Tubos para cultivo de 13x100 mm. Gasa Medios de cultivo deshidratados:
Pipetas Mohr de 10 ml. Masking tape. A consideración del maestro
Pipetas Mohr de 5 ml. Tijeras.
Pipetas Mohr de 1 ml. Plumones indelebles
1 Caja Petri de vidrio. Cajas de Petri de plástico esteriles
2 Mecheros Meker. desechables
1 Mechero bunsen Gradilla
Probeta
TÉCNICA
A) Saneamiento de las mesas de laboratorio.
1. Lavar la mesa con jabón y retirar con suficiente agua destilada.
2. Aplicar con un atomizador solución desinfectante (MICRO) diluida al 2% con agua destilada. Retirar con servilletas húmedas
después de 5 minutos.
3. Después de haber retirado perfectamente la solución desinfectante; aplicar con la ayuda de un atomizador, alcohol
isopropílico al 70%, extender de manera uniforme y dejar que se seque.
4. Inmediatamente coloque dos mecheros Mecker en los extremos de la mesa y un mechero Bunsen en el centro.
5. Inicie su trabajo de laboratorio después de 5 minutos de haber encendido los mecheros.
B) Preparación de tubos para cultivo con rosca de 16 X 150 mm con agua destilada para esterilizar con
calor húmedo.
1. Colocar 9 ml. de agua destilada en cada uno de los 10 tubos para cultivo con rosca de 16 X 150 mm.
2. Tapar cada uno girando el tapón hasta el primer tope de la rosca (no apretar).
3. Colocar los tubos en una canastilla y protegerlos con papel.
4. Esterilizar en autoclave u olla de presión a 15 lb/plg2 por 15 minutos. Siguiendo las instrucciones del profesor sobre el
manejo de la olla .
C) Preparación de pipetas Mohr para esterilizar con calor húmedo.

1. Poner en la boquilla un filtro de algodón, de tal manera que el aire pase a través de él.
2. Flamear el extremo de la pipeta para quemar el exceso de algodón.
3. Envolver con papel cada pipeta siguiendo las instrucciones del profesor.
4. Marcar el volumen de la pipeta en la envoltura.
manejo de la olla .
D) Preparación de cajas de Petri para esterilizar con calor húmedo.

1. Envolver con papel de estraza las cajas de Petri en grupos de 3 ó 4.
2. Colocarlas con la tapa abajo.
3. Anotar en el papel el número de cajas y la fecha de preparación.

manejo de la olla.
E) Preparación de Medios de cultivo

1. Preparación de los medios de cultivo:
A). Leer cuidadosamente las instrucciones del fabricante para cada uno de los medios a preparar.
B). Pesar la cantidad de medi deshidratado de acuerdo a las especificaciones y vaciar en matraces Erlenmeyer.
C). Hidratar, y colocar al fuego, agitando constantemente para evitar que se queme. Hervir por un minuto.
D). Esterilizar a 15 lbs. durante 15 minutos.
E). Vaciar en las cajas de Petri a una temperatura aproximada de 45o C. Dejar solidificar.
2. Preparación del Agar sangre.

A). Seguir las instrucciones de preparación del fabricante.
B). Esterilizar a 15 lb. De presión por 15 minutos.
C). Dejar enfriar a 45oC y agregar la sangre estéril al 5%, homogenizar perfectamente cuidando de no
causar hemólisis.
D). Vaciar en cajas Petri
3. Preparación de medios que no se esterilizan:

A). Preparar según las instrucciones del fabricante.
B). No esterilizar.
C). Vaciar en cajas Petri, y dejar solidificar.
4. Preparación de los tubos con medio sólido (inclinado).

A). Preparar según las instrucciones del fabricante.
B). Vaciar 5 ml del medio a cada tubo, tapar el tubo sin apretar.
C). Esterilizar a 15 lbs de presión durante 15 min.
D). Apretar la rosca dl tubo e inclinar, dejar solidificar.
5. Preparación de los tubos con medio semisólido (recto).

A). Preparar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
B). Esterilizar a 15 lbs de presión durante 15 min.
C). Dejar enfriar en posición recta.
6. Preparación de los tubos con caldo.

A). Preparar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
B). No calentar.
C). Esterilizar a 15 lbs de presión durante 15 minutos.
D). Dejar enfriar.
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CUESTIONARIO.
1.- Comparar la eficiencia de los calores seco y húmedo como medios de esterilización.
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2.- ¿Qué significado tiene la presión per se en la efectividad del proceso de esterilización con el autoclave para lograr esta
operación?
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3.- ¿Cuál es el principio de esterilización por tindalización?

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4.- De una lista de materiales que se deben esterilizar preferentemente en un horno de aire caliente en vez del autoclave.
Indicar, en el caso de cada material, ¿por qué el aire caliente es el método elegible para esterilizar?
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5.- ¿Para qué cubrimos con papel de estraza los matraces y los tubos que vamos a esterilizar por el método de calor húmedo?
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6.- ¿Con qué finalidad se les pone a las pipetas un filtro de algodón?
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7. ¿ Qué necesidades nutricionales en términos de sustancias químicas necesita toda forma de vida para su
desarrollo y funcionamiento?
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8. ¿ Cuáles son las ventajas del uso de medios de cultivo sintéticos ?
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9. ¿ Qué pasos se deben seguir en la elaboración de un medio de cultivo?

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10. ¿Escriba la clasificación de los medios de cultivo por su uso, y de un ejemplo de cada uno. (No mencione los que se usaron
en la práctica).
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PRÁCTICA NO. 3
TÉCNICAS DE INOCULACIÓN.
COMPETENCIA
Utilizar las diferentes técnicas de inoculación microbiana en medios de cultivo, a través de la práctica de las diversas técnicas de
sembrado, para la correcta selección de estas técnicas según se requiera en los estudios microbiológicos, así como conocer e
identificar la morfología colonial de los microorganismos, cuidando su propia seguridad y la del entorno.
FUNDAMENTO TÉORICO.
En el laboratorio de Microbiología la técnica más usada es la inoculación de los medios de cultivo, o sea, la transferencia de
microorganismos de un medio ambiente a otro con el propósito de cultivarlos y aislarlos de otros, para poder estudiarlos
debidamente y posteriormente identificarlos.
Un inóculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de un microorganismo problema. Así pues se debe partir de
un cultivo puro en una concentración adecuada.
TÉCNICAS DE INOCULACIÓN.
El paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo, ya sea sólido o líquido, se denomina siembra o inoculación
o inoculación. Los medios de cultivo, ya sea en placa o en tubo, se pueden inocular con la muestra mediante varios métodos.
PLACAS DE AGAR (CAJA PETRI).
1. TÉCNICA DE SEMBRADO EN ESTRÍA. El inóculo primario efectúa mediante un asa, Una vez hecho el inóculo primario se
puede emplear un asa o alambre de picadura para diseminar la muestra en los cuatro cuadrantes de la placa de agar. El inóculo
se disemina sucesivamente en estrías con un movimiento de arriba hacia abajo en cada cuadrante, dando vuela a la caja en
ángulos de 90o. El asa se debe esterilizar con fuego entre las sucesivas estrías. El objetivo de esta técnica es diluir el inóculo
suficientemente sobre la superficie del agar para así poder obtener colonias bacterianas bien aisladas a partir de unidades
formadoras de colonias. Existen varios métodos para inocular con estría, como son: técnica de los cuatro cuadrantes, por
agotamiento (estría múltiple), por aislamiento en estría y técnica de los tres giros.

2. TÉCNICA DE SEMBRADO CON UN APLICADOR DE ALGODÓN (HISOPO) : Es un técnica muy usada en medicina, la cual
consiste en obtener una muestra con un hisopo estéril de un cultivo mixto, y trazar en la placa de agar unas cuantas estrías
inoculando una pequeña zona en el borde de la placa. Posteriormente se pasa con un asa estéril la zona inoculada, y se
procede como la anterior técnica.
3. TÉCNICA PARA RECUENTO SEMICUANTITATIVO DE COLONIAS: Para esta técnica se utiliza un asa de platino, calibrada
para inocular 0.01 o 0.001 ml. de líquido, se sumerge en la muestra y se practica una sola estría que cruce el centro de la placa
de agar. Posteriormente el inóculo se disemina uniformemente en ángulo recto respecto de la estría primaria, luego la placa se
gira en 90o y se disemina el inóculo hasta cubrir toda la placa de agar.

5. TÉCNICA DE LA VARILLA ACODADA DE VIDRIO. Otro método de aislar microorganismos y cultivarlos requiere el uso
de una varilla doblada en ángulo. Con un asa o pipeta Pasteur colocar una gota del cultivo bacteriano y depositarla cerca
del borde de la superficie del agar, y con la varilla estéril dispersar uniformemente la gota de microorganismos sobre toda la
superficie de la placa de agar. Este procedimiento sirve para que en algunas partes de la superficie de agar se aíslen
organismos individuales que formarán colonias puras.
5. TÉCNICA DE SIEMBRA POR DILUCIÓN. Se dispondrá de un grupo de tubos con agua ésteril, enumerados, al primer tubo
se le adicionará una cantidad conocida de muestra microbiana, se homogeniza, y se pasa una cantidad específica al segundo
tubo, se repite el proceso anterior para el tercer tubo, y así sucesivamente hasta obtener la dilución deseada. Dicha dilución se
inocula 1 mililitro en las placas de agar, y se extiende con varilla acodada.
TUBOS CON CALDO Y AGAR.
Los medios de cultivo se pueden distribuir también en tubos, ya sea en caldo o en agar, estos últimos sólidos o semisólidos.
1. TÉCNICA PARA INOCULAR CALDOS DE CULTIVO: Los tubos con caldo se inoculan inclinando el tubo y acercar el asa
con la muestra a la superficie del vidrio justo sobre el punto donde hace ángulo el caldo, así cuando se regresa a su posición
original el inóculo queda sumergido debajo de la superficie del medio.

2. TÉCNICA PARA INOCULAR TUBOS CON AGAR EN “PICO DE FLAUTA”: Se puede inocular sola la superficie con asa
desde abajo hacia arriba con movimiento en “S”. O bien se inocula primero atravesando el agar en profundidad con un
alambre de picadura, y se continúa sembrando por estrías la parte inclinada desde abajo hacia arriba con un movimiento en
“S”.
3. TÉCNICA PARA INOCULAR TUBOS CON MEDIO SEMISÓLIDO: Por lo general este tipo de medios se utilizan para
pruebas de movilidad, por lo que se inoculan en forma recta, atravesando en profundidad al medio, es importante que el
alambre de picadura se retire siguiendo el mismo trayecto utilizado para atravesar el medio ya que si se hacen movimientos en
abanico durante la inoculación se desarrollaría un crecimiento sobre este dando un resultado falso positivo sobre movilidad.
INTERPRETACIÓN DE LOS CULTIVOS.

La interpretación de los cultivos después de una incubación de 24 a 48 horas requiere de tres procedimientos
importantes:
1. MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA O COLONIAL.
2. TINCIÓN DE GRAM Y MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA.
3. CARACTERÍSTICAS METABÓLICAS.

MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA O COLONIAL.
La evaluación de los resultados en las placas de agar, se hacen primeramente mediante la observación directa de los cultivo,
generalmente los tubos con cultivo no se utilizan para observar la morfología colonial, más bien son para enriquecer el
desarrollo de las bacterias, para que se puedan aislar mayor cantidad de colonias.
Para su examen las placas de agar se deben inclinar en distintas direcciones con iluminación brillante directa, de modo que la
luz sea reflejada desde diversos ángulos.
CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS USADAS EN LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
1. TAMAÑO. Diámetro en mm.

2. FORMA. Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme.
3. ELEVACIÓN. Plana, elevada, convexa, monticular, umbeliforme, umbilicada.
4. MARGEN. (Borde de colonia). Entero, ondulado, lobulado, aserrado, filamentoso, rizado.
5. COLOR. Blanco, amarillo, negro, naranja, etc.
6. SUPERFICIE. Brillante, mate, etc.
7. DENSIDAD. Opaca, translúcida, transparente, etc.
8. CONSISTENCIA. Butirosa, viscosa, membranosa, quebradiza, etc.

REACCIONES EN MEDIOS DE AGAR USADOS EN LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS.
1. HEMÓLISIS EN AGAR SANGRE.
Alfa ( ). Aclaramiento parcial de la sangre alrededor de las colonias con coloración verde del medio.
Beta ( ). Aclaramiento completo de la sangre alrededor de las colonias debida a la lisis de los glóbulos rojos.
Gamma ( ). No hay cambio en el medio .
2. PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS EN MEDIOS DE AGAR.
A). Pigmentos hidrosolubles, que colorean el medio.

B). Piocianina.
C). Pigmentos fluorocrómicos (fluoresceína).
D). Pigmentos no difusibles confinados a las colonias.
3. OLOR. Es difícil describir esta característica, pero algunos ejemplos de bacterias con olores característicos, son :
Pseudomonas spp. Olor a zumo de uvas.
Proteus spp. Olor a chocolate quemado.
Streptomyces spp. Olor a sótano enmohecido.
Clostridium spp. Olor fétido, nauseabundo.
PARTE EXPERIMENTAL.
MATERIAL.
Asa de nicromo
Alambre para picadura
Hisopos
Varilla acodada
Mechero Meker
Mechero Bunsen
Solución de Alcohol isopropílico 70%
Placas de Agar
Tubos con caldo, agar, y agar semisólido
Cepas de Bacterias.
TÉCNICA.
1. TÉCNICA DE SEMBRADO EN ESTRÍA POR AGOTAMIENTO.
A). Tomar una muestra del caldo con una asa de siembra estéril y depositarla en un extrema de la placa de
agar EMB.
B). Realizar estriado con movimientos de zig zag de un extremo al otro de la placa.
C). Cuidar de no levantar el asa de la placa hasta con concluir.
D). Rotular la caja e incubarla a 37 o C por 24 a 48 horas.

2. TÉCNICA DE SEMBRADO EN ESTRÍA MULTIPLE.
A). Tomar una muestra con asa estéril y depositarla en un extremo de la placa de agar Nutritivo.
B). Extender la muestra de un extremo al otro de ésta, solo en la parte superior.
C). Flamear el asa, y girar un poco la caja y repetir el estriado.
D). Repetir est proceso una 4 a 5 veces.
E). Rotular e incubar a 37oC por 24 a 48 horas.
3. TÉCNICA DE SEMBRADO EN ESTRÍA DE LOS TRES GIROS.
A). Tomar una muestra con asa estéril del cultivo y depositarla en un extremo de la paca de agar sangre.
B). Extender la muestra hasta la mitad superior de la caja.
C). Sin flamear el asa girar la caja 90o y volver a sembrar en estría.
D). Girar la placa nuevamente y repetir hasta completar toda la caja.
C). Rotular la caja e incubar a 37o por 24 a 48 horas.
4. TÉCNICA DE SEMBRADO CON HISOPO.
A). Impregnar el hisopo estéril en la muestra y en condiciones asépticas colocarla en un extremo de la caja
de agar MSA.
B). Estriar con asa estéril por el método de estría múltiple.
C). Rotular e incubar a 37o C por 24 a 48 horas.
5. TÉCNICA DE SEMBRADO CON VARILLA ACODADA.
A). Colocar 0.1 ml. de la muestra con una pipeta estéril en un extremo de la placa de agar de Mac Conkey .
B). Con una varilla previamente flameada con alcohol y enfriada, distribuir la muestra en toda la placa, según las
indicaciones de su maestro.
C). Reposar por 15 minutos la caja con tapa hacia arriba e incubar a 37oC por 24 a 48 horas.
5. TÉCNICA DE SEMBRADO SEMICUANTITATIVO.
A). Con un asa estéril tomar una muestra del cultivo y sembrar en una sola estría a lo largo de la caja de agar SS.
B). El inóculo se disemina en ángulo recto respecto a la estría primaria.
C). Se gira la caja en ángulo de 90o y se disemina el inóculo hasta cubrir toda la caja.
D). Rotular e incubar a 37o C por 24 a 48 horas.
6. TÉCNICA DE SEMBRADO EN TUBO CON MEDIO LÍQUIDO.
A). Inclinar el tubo con caldo en un ángulo de aproximadamente 30o .

B). Tomar con asa estéril una muestra del cultivo y depositarla justo en donde hacen ángulo el caldo y la pared del
tubo.
D). Regresar el tubo a su posición original y mezclar el inóculo con movimientos ligeros.
E). Rotular e incubar en posición recta a 37oC por 24 a 48 horas.
7. TÉCNICA DE SEMBRADO EN TUBO CON MEDIO SEMISÓLIDO.
A). Tomar una muestra del cultivo con alambre para picadura.
B). Inocular el tubo atravesando en profundidad el medio semisólido, cuidando de seguir el mismo trayecto al
retirar el alambre, para evitar falsos positivos.
C). Rotular e incubar a 37o C por 24 a 48 horas. Incubar en posición recta.

7. TÉCNICA DE SEMBRADO PARA TUBOS EN “PICO DE FLAUTA”.
A). Tomar una muestra del cultivo con asa estéril.

B). Estriar en forma de zig zag sobre el pico de flauta.
C). Rotular e incubar a 37oC por 24 a 48 horas. Incubar en forma horizontal.
NOTA: Todas las caja se incuban invertidas

Entre cada siembra siempre flamear el asa o alambre para picadura.
Todo material desechable se depositará en bolsa para material contaminado para su posterior esterilización y
destrucción.
RESULTADOS.
Escriba las características que haya observado en cada placa con medio de cultivo inoculado.
CEPA.______________________________ CEPA:_______________________________
MEDIO DE CULTIVO:_______________ MEDIO DE CULTIVO:_________________
TÉCNICA DE INOCULACIÓN:_______ TÉCNICA DE INOCULACIÓN:__________
CARACTERÍSTICA RESULTADO CARACTARÍSTICA RESULTADO

TAMAÑO TAMAÑO
FORMA FORMA
ELEVACIÓN ELEVACIÓN
MARGEN MARGEN
COLOR COLOR
SUPERFICIE SUPERFICIE
DENSIDAD DENSIDAD
CONSISTENCIA CONSISTENCIA
OLOR OLOR
HEMÓLISIS HEMÓLISIS
PIGMENTACIÓN PIGMENTACIÓN
CEPA.______________________________ CEPA.______________________________

TAMAÑO TAMAÑO
FORMA FORMA
MARGEN MARGEN
COLOR COLOR
DENSIDAD DENSIDAD
OLOR OLOR

CEPA.______________________________ CEPA.______________________________

TAMAÑO TAMAÑO
FORMA FORMA
MARGEN MARGEN
COLOR COLOR
DENSIDAD DENSIDAD
OLOR OLOR
Escriba y dibuje las características observadas en los tubos con medio de cultivo inoculados.
CEPA:__________________MEDIO DE CULTIVO:________________
CEPA:__________________MEDIO DE CULTIVO:________________
CEPA:__________________MEDIO DE CULTIVO:_________________
CUESTIONARIO.
1. ¿ Por qué las cajas se deben incubar en forma invertida?
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2. ¿ Por qué se debe quemar el asa entre cada grupo de estrías en aislamiento por estría múltiple?
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3. De las técnicas de inoculación utilizadas en las placas de agar, ¿Con cuál de ellas cree usted que obtendría mejor
aislamiento de microorganismos ? ¿Por qué?
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4. ¿ Con que fin se inocula atravesando el medio semisólido, y que prueba es?
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5. En la técnica de sembrado con hisopo, solo la muestra se coloca con el hisopo, pero se estría con asa. ¿Por qué?
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6. ¿ Cuáles son los procedimientos para analizar los resultados del cultivo?
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7. ¿ Para qué es necesario revisar la morfología colonial de todas las colonias que crecieron en el medio de cultivo?
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8. ¿ Por qué no es recomendable revisar la morfología colonial de un crecimiento en tubo?
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9. ¿ Cuál es la diferencia en cuanto al crecimiento colonial entre un agar inclinado en tubo y una placa de agar?
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10. Después de revisar y describir sus observaciones en los cultivos, ¿ Qué haría para identificar de que bacteria se tra?
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OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES
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Laboratorio de Microbiología
Facultad de Ciencias Químicas. UABC

PRÁCTICA NO. 4
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA.
COMPETENCIA.
Caracterizar los diversos microorganismos así como sus estructuras internas y externas realizando diferentes preparaciones
húmedas y fijas para la observación y clasificación de los microorganismos por sus propiedades tintorales y su morfología
microscópica, con apego a las normas de bioseguridad.
FUNDAMENTO TÉORICO.
Para el estudio de las características morfológicas de los microorganismos, es necesario observarlas al microscopio, y así mismo,
hacer contrastes con colorantes para poder observar con claridad sus diferencias, a esta técnica se le denomina tinción, las
cuales pueden ser de diversos tipos.
CLASIFICACION DE LAS TINCIONES SEGÚN EL NÚMERO DE COLORANTES USADOS.
TINCIONES SIMPLES : Son aquellas en las que sólo se adiciona un colorante, en preparaciones fijas y teñidas. El frotis fijo se
inunda con la solución colorante durante un periodo de tiempo establecido, después del cual se lava con agua, y se coloca en
papel secante. Ej. Negrosina y Azul de Metileno.
TINCIONES DIFERENCIALES: Es cuando dos o más colorantes son aplicados para impartir color a la célula o a sus partes
específicas. Y son coloraciones que proporcionan diferencias entre las células bacterianas o entre sus partes. Ej. Tinción de
Gram.
TINCIONES POSITIVAS Y NEGATIVAS: Según se tiña el microorganismos sobre un fondo claro (Positiva) o el fondo oscuro y la
estructura del microorganismos transparente (Negativa)
TINCIONES ESPECIALES O ESTRUCTURALES: Son aquellas que ponenen de manfiesto alguna de las estructuras de
microorganismo (Esporas, Flagelos, Cuerpos de inclusión, etc.)
Los procedimientos de coloración que ponen de manifiesto diferencias entre células bacterianas o en partes de una célula
bacteriana se conocen como técnicas de tinción diferencial. Las técnicas diferenciales más usadas son: la tinción de Gram y la
tinción de Ziehl -Neelsen. Ambas tinciones se emplean para distinguir entre un grupo de organismo y otro. Usando cualquiera de
estas dos tinciones es posible clasificar todas las células en por lo menos dos categorías, ya que una célula dará positiva o
negativa con respecto a la tinción empleada.
TINCIÓN DE GRAM.
La tinción de Gram es de gran valor taxonómico, ya que se utiliza para demostrar las propiedades tintorales de todos los tipos de
bacterias. Al utilizarla automáticamente se divide el reino de los microorganismos en dos categorías (Gram positivo y Gram
negativo), además observando la forma de la célula se puede hacer dos o más subdivisiones bien definidas. Esta tinción constituye
el punto inicial de identificación de una bacteria.
La tinción de Gram se compone de 4 reactivos diferentes con un fin cada uno de ellos.
1. Cristal Violeta: Colorante primario imparte color a todos los microorganismos en frotis.
2. Yodo o Lugol: El segundo reactivo es una solución diluida de yodo que actúa como mordente.
3. Alcohol-Acetona: El tercer reactivo es un decolorante porque disuelve y arrastra fuera el colorante primario de las células que
no lo retienen con fuerza.
4. Safranina: Es un colorante usado como contratinción, aquellos organismos que se destiñeron con el decolorante quedaron
incoloros, por lo tanto toman el color de la safranina.

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN.
También se le conoce como tinción ácidorresistente, llamada así debido a la naturaleza ácida del agente decolorante empleado
(Solución de HCl al 3% en alcohol 95%). Los organismos ácidorresistentes son capaces de retener el colorante primario debido a
que este colorante es más soluble en las substancias lipoides presentes en el microorganismo, que la solución decolorante. Otra
de las características de la tinción es el empleo de calor como agente intensificador del colorante primario.
La tinción ácidorresisitente encuentra gran aplicación en medicina, debido a que algunos miembros del género Mycobacterium se
asocian con infecciones y que por ser de las pocas bacterias que son ácidorresistentes.
PARTE EXPERIMENTAL.
MATERIAL.
Asa de nicromo.
Mecheros Meker.
Mechero Bunsen.
Portaobjetos.
Puente de coloración.
Microscópio.
Solución MICRO al 5%.
Solución de Alcohol isopropílico al 70%.
Agua destilada.
Colorantes de Tinción de Gram
Cultivos de microorganismos.
TÉCNICA.
1. TÉCNICA DE TINCIÓN DE GRAM.
A). Hacer 1 frotis de cada una de las cepas proporcionadas y dejar secar al aaire.
B). Fijar el frotis con calor.
C). Cubrir con cristal violeta y dejar actuar 1 minuto. Escurrir y lavar con agua corriente en chorro suave.
D). Cubrir el frotis con lugol y dejar actuar 1 minuto. Escurrir y lavar con agua.
E). Decolorar con alcohol-acetona de 5 a 15 segundos. Escurrir y lavar con agua.
F). Cubrir el frotis con safranina y dejar actuar 1 minuto. Escurrir y lavar con agua.
G). Secar al aire. Observar al microscópio con objetivo de inmersión.
2. TÉCNICA DE GRAM, PASO POR PASO.

A). Hacer 4 frotis de cada una de las cepas proporcionadas.
B).Teñir los cuatro frotis como se indica en la tabla siguiente.
FROTIS
REACTIVOS
1 CRISTAL VIOLETA
2 CRISTAL VIOLETA + LUGOL
3 CRISTAL VIOLETA+ LUGOL + ALCOHOL-ACETONA
4 CRISTALVIOLETA+LUGOL+ALCOHOLACETONA+SAFRANINA
C). Lavar los frotis después de cada adición de los reactivos como se indicó en la técnica de Gram.
D). Dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

RESULTADOS.
1. TINCIÓN DE GRAM.
PREPARACION NO. 1 PREPARACION NO. 2
COLONIA:__________________ COLONIA:___________________
GRAM:_____________________ GRAM: ______________________
FORMA:____________________ FORMA:______________________
2. TÉCNICA DE GRAM PASO A PASO.
CRISTAL VIOLETA CRISTAL VIOLETA
COLONIA:__________________ COLONIA:__________________
OBSERVACIONES:__________ OBSERVACIONES:__________
____________________________ ____________________________
____________________________ ____________________________
OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES:
INVESTIGACIÓN:
Tipos de morfología microscópica que existen, con dibujo y explicación, y de ejemplos de ellas.

BIBLIOGRAFÍA DEL MANUAL
1.Madigan M., Martinko J, Dunlap P, Clark D, Brock Biologia de los Microorganismos, Ed. Pearson, 12va. edicion, 2009.
2.Harvey R. Microbiologia, Ed. Barcelona, 2da. edición, 2008
3.Romero Cabello Raul. Microbiologia y parasitología humana: Bases etiológicas de las enfermedades infecciosas y parasitarias,
Ed. Medica panamericana, 3ra. Edición, 2007
4.Arenas Guzman Roberto, Micologia medica ilustrada, McGraw-Hill Interamericana, 3ra edición, 2008
5.Becerril Marco Antonia, Parasitolgia Medica Ed. McGraw-Hill Interamericana 2da. Edición, 2007.
6.Kenneth J. Ryan Microbiologia medica, Ed. McGraw-Hill 4ta edición, 2004
7.Murray-Drew Microbiología médica Ed. Mosby-Year 6ta edición, 2009
8.Rodriguez Perez, Atlas de Parasitologia Médica Ed. Cuellar, 1ra edición, 2005
9.Velasco Castrejon Oscar. Introduccion a la micología medica Ed. Mendez 2da. Edición, 2004.
10.Morrison K. Labotatorio clínico y pruebas de diagnóstico Ed. Manual moderno, 2009
11.Prats, G. Microbiologia medica, Ed. Panamericana, 2007
12.Spicer J, Microbiologia clínica y enfermedades infecciosas, Ed. Elsevier, 2da. Edición, 2009
13. Brock, Biología de los Microorganismos. Madigan, Michael T., Martinko Gohar M. y Parker Jack. Ed. Pretice Hall. 12ª edición.
2009.
14.Manual de Bioseguridad en Laboratorio. Organización Mundial de la Salud.
15. Mac Faddin Pruebas Bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica.. Editorial Panamericana. 1984.
16. Koneman, Allen, et al. Diagnóstico microbiológico Editorial Panamericana 1989.
17. L. Jack Bradshaw Microbiología de Laboratorio.. Editorial El manual moderno S.A. 1989.

PRÁCTICA NO. 5
PREPARACIÓN DE CULTIVOS PUROS.
COMPETENCIA
Obtener cultivo puros de microorganismos estudiando y aplicando las diferentes técnicas de aislamiento de un microorganismo a
partir de la inoculación de una población mixta para identificar y cuantificar la carga microbiana de una muestra, cuidando su
seguridad, con orden y limpieza.
La población microbiana de nuestro ambiente es grande y compleja. Existen muchas especies microbianas que habitan
normalmente las diferentes partes de nuestro cuerpo, como también nuestro medio ambiente que nos rodea. Debido a esta
compleja mezcla de microorganismos es muy difícil estudiarlos en su propio habitat, por lo que es necesario aplicar técnicas que
ayuden a aislar las poblaciones mixtas y complejas de microorganismos o cultivos mixtos y obtener cultivos puros de especies
distintas y separadas.
En términos generales deben emplearse técnicas especiales para obtener cultivos puros, en pocos casos se puede lograr
obtenerlos por aislamiento directo o transferencia directa del cultivo primario, solo en caso como la fiebre tifoidea o paratifoidea,
septicemia estreptocócica y otras semejantes, puede ocurrir de manera natural cultivos puros.
DESARROLLO DE MÉTODOS DE CULTIVO PURO.

Desde los estudios de Pasteur y Koch se observó que los microorganismos crecían en cultivos mixtos, por lo que se creyó que
estos tenían la capacidad de variación tanto en su aspecto morfológico como su función fisiológica, a este tipo de razonamiento se
le denominó Pleomorfismo, mientras que la creencia contraria, relativa a que los microorganismos presentan una constitución y
especificidad de forma y función, se designó Monomorfismo. Hacia 1870 se empezó a aclarar que el estudio de las poblaciones
mixtas era complicado y solo se podría aclarar con el uso de cultivos puros, los primeros en usar este tipo de cultivos fueron los
micólogos A. De Bary y O. Brefeld. El trabajo inicial se debe prácticamente a Brefeld que trabajando con hongos logró producir
cultivos puros utilizando placas de agar, pero esto no resultó adecuado para bacterias por lo que se ideó el Método de diluciones.
El primero en utilizarlo fue Lister en 1875 aisló el “Fermento láctico” de Pasteur.
Posteriormente en base a las observaciones de J. Schroeter, quien había encontrado que sobre papas, pasta de almidón, pan, etc.
se desarrollaban microorganismos aislados, Koch desarrollo cultivos sobre papa colocadas en vasijas de vidrio y luego las
inoculaba con bacterias. Este método resultaba difícil para observar el crecimiento por lo que a los medios líquidos les agregó
gelatina para solidificarlos y con una aguja de platino, previamente esterilizada en la llama, inoculaba el medio pasándola varias
veces rápida y suavemente sobre la superficie del gel a lo que se le llamó Método de siembra por estría para aislamiento de
bacterias. Koch descubrió que en lugar de sembrar las bacterias sobre la superficie de la gelatina ya solidificada podía mezclarla
con la gelatina fundida y cuando solidificaba las bacterias quedaban inmovilizadas dentro del gel y ahí se desarrollaban dando
colonias aisladas, a este procedimiento se le llamó Método de siembra en masa o placa vertida..
MÉTODOS PARA AISLAR CULTIVOS PUROS.
1. TÉCNICA DE SEMBRADO EN ESTRÍA O ESTRIA CRUZADA. El inóculo primario efectúa mediante un asa, Una vez hecho el
inóculo primario se puede emplear un asa o alambre de picadura para diseminar la muestra en los cuatro cuadrantes de la placa
de agar. El inóculo se disemina sucesivamente en estrías con un movimiento de arriba hacia abajo en cada cuadrante, dando
vuela a la caja en ángulos de 90o. El asa se debe esterilizar con fuego entre las sucesivas estrías. El objetivo de esta técnica es
diluir el inóculo suficientemente sobre la superficie del agar para así poder obtener colonias bacterianas bien aisladas a partir de
unidades formadoras de colonias. Existen varios métodos para inocular con estría, como son, técnica de los cuatro cuadrantes, por
agotamiento (estría múltiple), por aislamiento en estría y técnica de los tres giros.
2. TÉCNICA POR DIFUSIÓN O DE LA VARILLA ACODADA DE VIDRIO. Otro método de aislar microorganismos y cultivarlos
requiere el uso de una varilla doblada en ángulo. Con un asa o pipeta Pasteur colocar una gota del cultivo bacteriano y
depositarla cerca del borde de la superficie del agar, y con la varilla estéril dispersar uniformemente la gota de microorganismos

sobre toda la superficie de la placa de agar. Este procedimiento sirve para que en algunas partes de la superficie de agar se
aíslen organismos individuales que formarán colonias puras.
Estas dos técnicas de aislamiento son procedimientos de rutina que se efectúan para aislar bacterias en cultivo puro, su
limitación principal es que sólo una pequeña cantidad de la muestra puede ser esparcida sobre la superficie del medio de cultivo.
3. TÉCNICA DE LA PLACA VERTIDA. El principio de esta técnica es la dilución (adelgazamiento) de la muestra en tubos con
agar fundido y enfriado. Se necesita hacer diluciones en más de un tubo para obtener colonias bien aisladas, si es que no se
conoce la magnitud de la población bacteriana de la muestra antes de manejarla. Una vez inoculado el medio se vacía en cajas
Petri y se deja solidificar y posteriormente se incuba. Como algunos microorganismos se quedan atrapados entre el agar, se
observarán colonias tanto en la superficie como entre el medio cuando este se solidifica. Esta técnica se hace en forma cuantitativa
o cualitativamente.
4.
TÉCNICA DE SIEMBRA POR DILUCIÓN. Se dispondrá de un grupo de tubos con agua estéril, enumerados, al primer tubo se le
adicionará una cantidad conocida de muestra microbiana, se homogeniza, y se pasa una cantidad específica al segundo tubo, se
repite el proceso anterior para el tercer tubo, y así sucesivamente hasta obtener la dilución deseada. Dicha dilución se inocula 1
mililitro en las placas de agar, y se extiende con varilla acodada.
PARTE EXPERIMENTAL.
MATERIAL.
Asa de nicromo.
Varilla de vidrio acodada.
Mecheros Meker.
Mechero Bunsen.
Tubos de ensaye con rosca de 16 x 150 mm con 9 ml. de agua estéril.
Pipetas de 10 ml (1/10) estériles.
Pipetas de 1 ml. (1/100) estériles.
Cajas de Petri con agar nutritivo.
Cajas de Petri con YMA.
Cajas de Petri con Agar Sabourand o agar Micológico.
Cajas de Petri con EMB.
Cajas de Petri con MSA.
MATERIAL BIOLÓGICO.
Muestra de suelo.
Muestra de agua.
Muestra de alimentos y bebidas.
TÉCNICA.
1. Aislamiento por el método de las diluciones.

A). Marque una serie de 10 tubos de 16x150 mm. del 1 al 10.
B). Agregar al primer tubo 1 gr o 1 ml. de la muestra. En el caso de suelo homogenizar la suspensión y dejar
sedimentar las partículas gruesas.
C). Efectuar diluciones decimales de cada muestra, como se indica en la siguiente tabla.
TUBO CONTENIDO DILUCIÓN

1 1 gr. o 1 ml. de muestra + 9 ml. de agua destilada estéril 10-1
2 1 ml. del tubo 1 + 9 ml. de agua destilada estéril 10-2
NOTAS:
1. Homogenizar la suspensión en cada tubo antes de transferir el volumen indicado al siguiente tubo.
2. Cambiar la pipeta al efectuar cada dilución.
3. Introducir la pipeta usada en la envoltura original.
D). Seleccionar cinco diluciones según instrucciones del profesor.

E). Colocar 0.1 ml. de cada dilución en la superficie de cada una de las cinco placas de agar nutritivo,
previamente marcadas con la dilución correspondiente.
F). Homogenizar el inóculo en la placa de agar con una varilla de vidrio acodada.
G). Incubar a 37 o C por 24 a 48 horas.
2. Aislamiento por el método de estría cruzada.
A). Esterilizar el asa de nicromo por incineración.

B). Dejar enfriar el asa a un lado del mechero Bunsen.
C). Tomar una asada de la muestra (tubo No. 1 de la serie de diluciones) y colocarla en los bordes de la
placa, haciendo estrías continuas hacia el centro de la caja.
D). Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla.
E). Hacer una segunda serie de estrías tocando la porción final de la anterior.
F). Esterilizar el asa nuevamente y enfriar.
G). Repetir los pasos (D y E) para hacer las otras series de estrías.
H). Esterilizar el asa y enfriar. Incubar el material a 37oC durante 24 horas.
3. Aislamiento por el método de la placa vertida.
A). Seleccionar 5 diluciones, indicadas por su profesor.

B). Tomar 1 ml. de la dilución en condiciones estériles y mezclar con 25 ml. de agar fundido y estéril.
(Temperatura del agar fundido : 49 a 57oC).
C). Verter en placas de agar solidificado y distribuir el medio de manera uniforme, dejar solidificar.
D). Incubar a 37oC por 24 a 48 horas.
RESULTADOS.
1. AISLAMIENTO POR EL MÉTODO DE LAS DILUCIONES.
A). Indicar hasta que dilución encontró colonias aisladas a partir de las muestras estudiadas.
Muestra:___________
Dilución:___________
B). Llene la tabla indicando la cantidad de colonias encontradas en cada dilución.
DILUCIÓN COLONIAS HONGO COLONIAS LEVADURA COLONIAS BACTERIA
C). Escribir en la tabla siguiente, el número de las colonias encontradas en cada una de las diluciones indicadas por
el profesor.
DILUCIÓN No. DE COLONIAS / 0.1 ml. No. DE COLONIAS/ ml. TIPO DE COLONIA

D). En base a los datos de la tabla anterior diga usted cual es el número de microorganismos por gramo o mililitro de
muestra estudiada.
Hongos:________gr/ml Levaduras_________gr/ml Bacterias__________gr/ml
2. AISLAMIENTO POR ESTRÍA CRUZADA.

A). Escriba sus observaciones sobre el crecimiento de colonias en los medios de cultivo empleados.
MEDIO DE CULTIVO OBSERVACIONES
AGAR NUTRITIVO
YMA
A. MICOLOGICO
B). ¿Qué ventajas y desventajas encuentra entre este método y el anterior?
MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS
DILUCIONES
ESTRÍA CRUZADA
C). Escriba la cantidad de colonias que obtuvo con este método.
Hongos__________gr/ml. Levaduras__________gr/ml Bacterias____________gr/ml

3. MÉTODO DE LA PLACA VERTIDA.
A). Escriba en la tabla siguiente la cantidad de colonias que encontró en las diluciones que sembró.
DILUCIÓN COLONIAS HONGO COLONIAS LEVADURA COLONIAS BACTERIA
B). Obtenga el número de colonias por mililitro de muestra que utilizó.
Hongos__________gr/ml. Levaduras__________gr/ml Bacterias____________gr/ml

C). De los tres métodos de aislamiento que trabajó en la práctica, diga cual es el más conveniente. Explique.
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PRÁCTICA NO. 6
OBTENCIÓN DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE MUESTRAS BIOLÓGICAS
COMPETENCIA
Obtener microrganismos a partir del cultivo y aislamiento de muestras biológicas, para diferenciar entre microbiota
normal y patógena del ser humano, y apoyar al diagnóstico, todo bajo normas de bioseguridad que garanticen la
calidad de los resultados.
La principal función de un laboratorio de microbiología clínica, es la de ayudar al médico en el diagnóstico y tratamiento de

pacientes con enfermedades infecciosas. El trabajo llevado a cabo por los microbiológos debe orientarse hacia la producción de
resultados clínicamente útiles a la brevedad posible.
Es responsabilidad del médico presumir enfermedades infecciosas en sus pacientes e iniciar estudios a fin de confirmar o
descartar esta presunción.
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS.
La correcta recolección de muestras biológicas para su cultivo es posiblemente la etapa más importante en el aislamiento de
microorganismos responsables de enfermedades infecciosas.
PASOS PARA UNA CORRECTA RECOLECCIÓN DE MUESTRAS
1. La muestra para cultivo debe ser material del verdadero sitio de infección y debe recogerse con un mínimo de contaminación de
tejidos, órganos o secreciones adyacentes.
2. Establecer períodos óptimos para la recolección de muestras a fin de tener la mejor oportunidad de aislar los microorganismos
causantes.
3. Obtener suficiente cantidad de muestra para llevar a cabo las técnicas de cultivo solicitadas.
4. Utilizar dispositivos de recolección, recipientes para las muestras y medios de cultivo adecuados para asegurar el óptimo
aislamiento de microorganismos.
5. Obtener la muestra de preferencia antes de la administración de antibióticos.
6. El envase recolector de la muestra debe estar correctamente rotulado.
RECOLECCIÓN Y CULTIVO DE MUESTRAS DE DIFERENTES SITIOS.
1. ORINA.
El estudio microbiológico de la orina, se hace cuando los signos y síntomas son sugestivos de infección de la vías urinarias,
insuficiencia renal o hipertensión, además en recomendado en el primer trimestre del embarazo.
A). Recolección del espécimen: La recolección es el paso más importante en un urocultivo. En los hombres, por lo
general se obtienen especímenes satisfactorios aseando el meato con jabón y agua, y recolectando en un envase estéril la porción
media de la orina expulsada. En las mujeres, se tendrá que separar los labios mayores y asear con agua y jabón la vulva,
procediendo de la misma manera que en los hombres. Se deberá examinar inmediatamente o refrigerar por un período no mayor
de 8 horas.
B). Examen microscópico: Se coloca una gota de orina en un portaobjeto con cubreobjeto y se observa al microscopio
con poca luz y con objetivo seco-fuerte. Si se encuentra más de 105 microorganismos por ml es una prueba de infección activa de
las vías urinarias.
C). Cultivo: Para que el cultivo de la orina sea significativo es necesario hacerlo de forma cuantitativa, esto se hace
esparciendo 0.1 ml. de orina en un medio sólido, se incuba a 37 oC por 18 horas, y se compara el número de colonias obtenidas
con las de fotografías de diferentes densidades de proliferación bacteriana.
D). Medios de cultivo utilizados para cultivo de orina: Agar sangre, EMB, 110 (o MSA), MacConkey y BHI.
E). Flora normal y Patógena de la orina.

FLORA NORMAL FLORA PATÓGENA

Staphylococcocus spp.(coagulasa -) Enterobacterias.
Streptococcus viridans Enterococos.
Lactobacillus spp. Staphylococcus saprophyticus.
Difteroides Pseudomonas aeruginosa.
Neisseria spp (no patógena). Candida albicans.
Cocos anaeróbicos. Staphylococcus aureus.
Levaduras (algunas). Streptocuccus Beta-hemolítico.
Otros Neisseria gonorrhoeae.
2. OIDO.
Es poco frecuente el estudio microbiológico de muestras del oído, pueden existir tres lugares de infección en el oído
(otitis externa, media , y mastoiditis).
A). Recolección de la muestra: Para muestras del oído externo, primero se limpia con un desinfectante suave, y se
colecta la muestra con un hisopo estéril que se coloca en un tubo estéril para su transporte. Para el examen del oído medio y la
región del mastoideo es necesario una punción del tímpano que se realiza con una pequeña cirugía.
B). Examen directo: Se diluye la muestra en solución salina estéril y se realiza un frotis con tinción de Gram. Esto para
hacer un examen preliminar para detectar la presencia de bacterias y Hongos.
C).Cultivo: Se deposita la muestra con el hisopo en un medio sólido y se procede por estría múltiple, se incuba a 37 oC
por 24 a 48 horas, para bacterias del oído externo. Para hongos en medio Sabouraud y se incuba a temperatura ambiente por 4 a
6 semanas. En el caso de muestras del oído medio, los medios inoculados se incuban en atmósfera anaeróbica por 24 a 48 horas.
D). Medios de cultivo: Agar sangre, EMB, MacConkey, Medio de Tioglicolato, Agar Chocolate, Columbia CNA, MSA.
E). Flora normal y patógena del oído.
FLORA NORMAL DEL OÍDO FLORA PATÓGENA DEL OÍDO FLORA PATÓGENA DEL
EXTERNO. EXTERNO OÍDO INTERNO
Streptocococcus pneumoniae. Staphylococcus aureus Algunos de los patógenos del oído

Staphylococcus aureus. Streptococcus grupo A. externo anaerobios facultativos..
Algunos Gram negativos. Pseudomonas aeruginosa. Bacteroides spp.
Bacilos Gram negativos. Fusobacterium nucleatum.
Mycoplasma pneumoniae. Peptostreptococcus spp.
Hongos y virus.
3. EXUDADO FARINGEO.
Las infecciones de las vías respiratorias son las más frecuentes, y el médico necesita diferenciar el microorganismo causante de
dicha infección. El aislamiento de uno o más microorganismos conocidos como patógenos sobre la flora normal, se considera un
diagnóstico confiable.
A). Recolección de la muestra: La muestra se recolecta con un hisopo estéril. Cuando se procede a tomar la muestra, se
deberá deprimir la lengua con un abatelenguas, para impedir que obstruya la visión o pueda contaminar la muestra. Con el hisopo
estéril se raspa toda área que muestre exudado, las amígdalas y las paredes, evitando tocar la úvula, retirar cuidadosamente el
hisopo sin tocar lengua ni labios. Colocar el hisopo en su recipiente estéril.
B). Examen directo: Se observa al microscopio un frotis con tinción de Gram.
C).Cultivo: Se deposita la muestra con el hisopo en un medio sólido y se procede por estría múltiple, se incuba a 37 oC
por 24 a 48 horas.
D). Medios de Cultivo: Agar sangre, Medio 110, MSA, TSA, BHI.
E). Flora normal y patógena:


Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes.
Haemophilus influenzae serogrupo B. Corynebacterium diphtheriae.
Staphylococcus aureus. Bordetella pertussis.
Branhamella spp. Haemophilus influenzae
Difteroides. Klebsiella pneumoniae.
Bacteroides, Pseudomonas aeruginosa.
Mycoplasmas. Neisseria meningitidis.
Streptococcus pneumoniae..
4. HECES.
El tracto gastrointestinal contiene una flora normal muy diversa, pero pertenecen a una sola familia de bacterias, las
Enterobacterias.
A). Recolección de la muestra: Para enfermedades gastrointestinales es preferible el examen de heces frescas o también
un raspado del ano con hisopo. La muestra debe ser refrigerada si no se va a cultivar enseguida.
B). Examen directo: No es muy recomendable antes del cultivo, debido a que la morfología microscópica de las
Enterobacterias es muy similar entre ellas y no permitiría una diferenciación entre ellas.
C). Cultivo: Se deposita la muestra con un asa sobre un medio sólido y se procede por estría múltiple, se incuba a 37oC
por 24 a 48 horas.
D). Medios de cultivo: Agar sangre, Agar desoxicolato, EMB, Mac Conkey, SS, Endo agar, etc.
E). Flora normal y patógena.

Bacteroides fragilis. Salmonella typhi
Lactobacilus spp.( anaerobios). Salmonella spp.
Clostridium perfringens Shigella spp.
Peptostreptococcus spp. Escherichia coli (enterotoxina).
Proteus spp. Klebsiella spp.
Candida spp. Yersinia enterocolítica.
Pseudomonas spp. Vibrio cholerae.
PARTE EXPERIMENTAL.
MATERIAL.
Cajas Petri con Agar Sangre.
Cajas Petri con Agar Infusión Cerebro Corazón (BHI).
Cajas Petri con Agar Sal y Manitol (MSA).
Cajas Petri con Agar Salmonella-Shigella (SS).
Cajas Petri con Agar Eosina y Azul de Metileno (EMB).
Cajas Petri con Agar MacConkey.
Tubos de ensaye con rosca conteniendo un hisopo estéril.
Frascos estériles para recolección de muestras.
Mecheros Meker.
Mechero Bunsen.
Asa de Nicromo.
Equipo de Tinción de Gram.
Portaobjetos.
Material Biológico.
Muestra de Orina.
Muestra de materia fecal.
Exudado faringeo.
Exudado del oído.

TÉCNICA.
1. Método para el aislamiento de microorganismos en materia fecal.
A). Toma con el asa estéril un poco de materia fecal y depositarla cerca de la orilla de cada una de las placas.
(Agar sangre, EMB, MacConkey, SS)
B). Proceder al aislamiento por el método de estría cruzada (múltiple).
C). Incubar a 37oC por 24 a 48 horas.
D). Interpretar los resultados, anotando las características morfológicas de cada colonia diferente que haya
crecido.
E). Hacer un frotis de cada colonia diferente, y teñirlo con Gram.
2. Método para el aislamiento de microorganismos en orina.
A). Tomar con el asa una o dos asadas de la muestra y depositarla en las caja con los medios de cultivo. (Agar
sangre, EMB, BHI, MSA).
crecido.
3. Método para el aislamiento de microorganismos de un exudado faringeo.
A). Depositar la muestra del hisopo en las placas con medios de cultivo (Agar sangre, MSA, BHI).
crecido.
4. Método para el aislamiento de microorganismos de un exudado otico.
A). Depositar la muestra del hisopo en las placas con medios de cultivo (Agar sangre, EMB,MSA, BHI).
crecido.
RESULTADOS.
1. Morfología macro y microscópica de bacterias aisladas de materia fecal.
Características C O L O N I A S
morfológicas. 1* 2** 3*** 4****
Tamaño
Elevación
Superficie
Aspecto
Bordes

Densidad
Hemólisis
Consistencia
Fermentación de la
lactosa
Gram
Morfología
microscópica.
Agrupación.
(*) medio de cultivo ________________

(****)medio de cultivo________________
(**)medio de cultivo________________
(***)medio de cultivo________________
2. Morfología macro y micro de bacterias aisladas de orina.
morfológicas. 1* 2** 3*** 4****
Tamaño
Elevación
Superficie
Aspecto
Bordes
Densidad
Hemólisis
Consistencia
Fermentación de la
lactosa
Mannitol
Gram
Morfología
microscópica.
Agrupación.
(*) medio de cultivo ________________

(**)medio de cultivo________________
(***)medio de cultivo________________
(****)medio de cultivo________________
3. Morfología macroscópica y microscópica de bacterias aisladas de Exudado faringeo
morfológicas. 1* 2** 3*** 4****
Tamaño
Elevación
Superficie
Aspecto
Bordes
Densidad
Hemólisis

Consistencia
Fermentación de la
lactosa
Mannitol
Gram
Morfología
microscópica.
Agrupación.
(*) medio de cultivo ________________

(**)medio de cultivo________________
(***)medio de cultivo________________
(****)medio de cultivo________________
4. Morfología macroscópica y microscópica de bacterias aisladas de Exudado otico.
morfológicas. 1* 2** 3*** 4****
Tamaño
Elevación
Superficie
Aspecto
Bordes
Densidad
Hemólisis
Consistencia
Fermentación de la
lactosa
Mannitol
Gram
Morfología
microscópica.
Agrupación.
(*) medio de cultivo ________________

(**)medio de cultivo________________
(***)medio de cultivo________________
(****)medio de cultivo________________
5. Escriba el diagnóstico presuntivo de cada muestra analizada.
A). Muestra fecal ______________________________

B). Muestra de orina____________________________
C). Muestra de exudado faringeo___________________
D). Muestra de exudado otico_____________________

______________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________
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INVESTIGACION:
Morfología colonial y microscópica de la flora normal y patógena de la muestra que proceso, especificar que tipo de enfermedades
puede ocasionar la cepa microbiana que obtuvo.

PRÁCTICA NO. 7
EFECTO DE LOS FACTORES FISICOQUÍMICOS EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO
COMPETENCIA.
Analizar el efecto positivo y negativo de los factores ambientales en el crecimiento microbiano, a través del estudio de la
exposición de los microorganismos a condiciones óptimas, máximas y mínimas de estos factores, cuidando el medio ambiente y
garantizando su seguridad
Las condiciones físicas y químicas del medio en que se desarrollan los microorganismos afectan marcadamente sus
actividades. La comprensión de las influencias ambientales nos ayuda a explicar la distribución de los microorganismos en la
naturaleza y hace posible diseñar o crear métodos para controlar las funciones microbianas y destruir organismos indeseables.
Por regla general los microorganismos son más resistentes a los factores letales, físicos y ambientales que las células de los
organismos superiores, sin embargo una condición letal para un organismo puede ser benéfica para otro por lo tanto se debe de
diferenciar entre los efectos de las condiciones ambientales para la viabilidad de los microorganismos.
EFECTO DE LA TEMPERATURA.
La temperatura es uno de los factores ambientales más importantes que influyen en la proliferación y sobrevida de los
organismos. La temperatura se puede clasificar basándose en el crecimiento microbiano y se les denominan temperaturas
cardinales.
1. Temperatura mínima. Temperatura por debajo de la cual no tiene lugar la proliferación.

2. Temperatura óptima. El crecimiento de los microorganismos es más rápido.
3. Temperatura máxima. Por encima de la cual no es posible el crecimiento.
La temperatura óptima está más cercana de la temperatura máxima, debido a que conforme aumenta la temperatura las
reacciones químicas y enzimáticas tiene lugar a altas velocidades al igual que la proliferación , sin embargo más allá de cierta
temperatura las ácidos nucleicos, las proteínas y otros componentes celulares se vuelven sensibles y se inactivan
irreversiblemente. Mientras que a temperaturas mínimas la membrana suele estar congelada o inactivada, provocando el lento
paso de iones y nutrientes con la consecuencia de una proliferación más lenta.
Las temperaturas cardinales pueden variar en los diferentes microorganismos, observando tres grandes grupos de
microorganismos.
 Psicrófilos (De -1o a 20oC )

 Mesófilos (De 15o a 45oC ).
 Termófilo (De 47o a 65oC )
Los organismos Psicrófilos tiene enzimas que son capaces de catalizar reacciones más eficientemente a temperaturas bajas.
Tienen un alto contenido de ácidos grasos insaturados en la membrana celular, y en consecuencia la membrana permanece
semifluída a temperaturas bajas.
EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA.
La presión osmótica es uno de los factores que continuamente amenazan la existencia de los microorganismos en su
microambiente. Los microorganismos, en sus múltiples ambientes naturales, constantemente se enfrentan con cambios
drásticos en el contenido de agua que constituye su medio. La presión osmótica describe la tendencia del agua a moverse en la
dirección que tienda a igualar la concentración del agua en todas partes del sistema. En todos los casos donde existe el
fenómeno de ósmosis, hay una membrana semipermeable separando dos partes del sistema. En microbiología, generalmente
se trata de la membrana citoplasmática que separa la célula del medio ambiente y que es semipermeable. Por lo tanto, esta
actúa como barrera entre las soluciones protoplásmicas internas y las soluciones del medio ambiente externo. Cuando la
concentración del agua es la misma dentro y fuera de la membrana se establece un estado de equilibrio y se dice que es un
sistema isotónico, en donde el microorganismo no sufre daño alguno. Sin embargo, si la concentración de agua es menor fuera
de la célula que en el interior de esta, el agua tenderá a salirse de la célula para igualar las concentraciones en ambos lados, de

manera que se tiene un sistema hipertónico. De ocurrir esto, la célula sufre plasmólisis. Por el contrario, si la concentración de
agua es mayor fuera de la célula que en el interior, esta tenderá a fluir hacia el citoplasma, hinchando a la célula hasta el grado
de ocasionarle lisis.
EFECTO DEL pH.

Cada microorganismo suele tener un nivel de pH dentro del cual es posible su desarrollo y un pH óptimo bien definido. La mayor
parte de los ambientes naturales tiene valor de pH entre 5 y 9 y por lo tanto, los microorganismos que pueden crecer en ese
rango son los más comunes. Sin embargo, los microorganismos que requieren de un pH bajo se les denomina acidófilos, y por
lo contrario, los que crecen a valores de pH muy altos se denominan alcalinófios. La mayor parte de las bacterias suelen crecer
a valores de pH neutros. Los hongos generalmente tienden a ser más tolerantes a los ácidos de lo que son las bacterias. Si un
microorganismo se deposita en un medio de cultivo con un pH que no es el adecuado para su crecimiento, las membranas
celulares tienden a disolverse y ocurre la lisis.
Como los organismos suelen provocar cambios en el pH de sus ambientes al desarrollarse por la formación de compuestos, lo
mejor es añadir al medio de cultivo un amortiguador que actúe conservando el pH relativamente constante (esto se hace
generalmente con ácido clorhídrico o con hidróxido de sodio).
EFECTO DE COLORANTES.
Varios de los colorantes empleados para teñir microorganismos tienen poder antiséptico. Estos colorantes son de gran utilidad
para ajustar las condiciones de los medios biológicos de tal manera que supriman el crecimiento de ciertas especies. Un
colorante muy usado para este fin es el cristal violeta. A concentraciones relativamente altas, este colorante inhibe tanto
bacterias grampositivas como las negativas. Sin embargo, al reducir la concentración, la acción del colorante se vuelve selectiva
en cuanto que inhibe las bacterias grampositivas pero no las gramnegativas. Si la concentración se reduce todavía más, se
alcanza un nivel tolerable para ambos tipos de bacterias. Y así como el cristal violeta, cualquier otro colorante tiene la capacidad
de inhibir el crecimiento de algunos organismos y de otros no.
EFECTO DE LOS METALES.

Durante siglos se han venido fabricando utensilios de plata para servir la comida, tanto recubiertos como de plata sólida. Esta
costumbre precede la teoría microbiana de la enfermedad. Ahora se sabe que el ion de plata es uno de los iones metálicos de
gran actividad inhibitoria sobre el crecimiento microbiano, incluso en soluciones muy diluidas.
Algunos otros metales (como el cobre, cobalto, etc.) tiene actividad inhibitoria sobre el crecimiento bacteriano, incluso en
soluciones muy diluidas. Parece ser que el efecto está dado por la liberación (en solución) de suficientes iones como para inhibir
el crecimiento.
EFECTO DEL POTENCIAL DE ÓXIDO-REDUCCIÓN.

Los organismos que crecen en ambientes ricos en oxígeno se llaman aeróbios. Esta capacidad se las brinda la cadena
respiratoria que poseen en su estructura , además de las enzimas capaces de metabolizar los productos tóxicos del oxígeno.
Por el contrario, los microorganismos que crecen en ausencia de oxígeno se llaman anaerobios. Estos carecen de sistema
respiratorio y enzimas que degraden los productos tóxicos del oxígeno, al medio de cultivo (caldo), se añade una sustancia
reductora, como el tioglicolato, que reduce el oxígeno a agua. Después de que el tioglicolato reacciona con el oxígeno dentro del
tubo, el oxígeno sólo pude penetrar cerca de la parte superior del tubo, donde el medio entra en contacto con el aire. Los
aeróbios crecerán en la superficie, y los anaerobios en el fondo. Los organismos facultativos lo harán distribuidos en todo el
tubo.
PARTE EXPERIMENTAL.
MATERIAL.
Tubos de ensaye con rosca de16x150 con Caldo Nutritivo con las siguientes especificaciones:
NaCl 1% Sacarosa 1%
NaCl 3% Sacarosa 2.5%
NaCl 5% Sacarosa 5%
NaCl 7% Sacarosa 7.5%
NaCl 9% Sacarosa 10%
NaCl 12% Sacarosa 15%

Tubos con rosca de 16x150 con Caldo nutritivo.

Tubos con rosca de 16x150 con Caldo Nutritivo con pH de :
3.0 5.0 7.0 11.0
Tubos con rosca de 16x150 con Caldo tioglicolato.
Cajas Petri con Agar Nutritivo y:
Crital Violeta 1:1000 Safranina 1:1000
Tubos con rosca de 16x150 con Caldo nutritivo + tween 80:
tween 0.5% tween 3%
tween 1% tween 5%
tween 2%
Cajas Petri con Agar nutritivo y:
Nitrato de Plata al 2% Sulfato de Cobre al 2%.
Sulfato de Magnesio al 2% Sulfato de Cobalto al 2%.
Cloruro de Bario al 2% Mertiolate al 1%.
Dodecil sulfato de Sodio al 2% Cloruro de Benzalconio al 2%.
Mecheros Meker
Mechero Bunsen.
Asa de nicromo
Gradillas
CEPAS DE BACTERIAS.
Escherichia coli
Staphylococcus aureus.
Bacillus subtilis
Candida albicans.
TÉCNICA.
1. Preparación de suspensiones bacterianas.

A). Adicionar 3 ml. de solución salina estéril a cada tubo del cultivo, resuspender y homogeneizar ` con la
misma pipeta.
B). Transferir la suspensión a un tubo de ensaye 16x150 mm previamente marcado con el nombre de la cepa.
C). Determine la turbidez de la suspensión comparándola con la del nefelómetro de MacFarland y registre en
su cuaderno el dato, pues este será el inoculo de experimento.
2. Efecto de la temperatura.
A). Colocar en una gradilla 5 tubos con Caldo Nutritivo, y marcarlos con el nombre de la cepa y la
temperatura a la que se incubarán (4,28,37,55 C).
B). Inocular 0.1 ml. De la suspensión microbiana a cada tubo.
C). Incubar a la temperatura indicada por 24-48 horas.
D). Observar los resultados comparando el crecimiento de cada tuvo con la turbidez de la serie de ampolletas
del nefelómetro de MacFarland.
3. Efecto del pH.

A). Colocar en una gradilla una serie de tubos con caldo nutritivo y con pH de 3, 5, 7 y 11 respectivamente.
B). Marcar los tubos con el nombre de la cepa que se va a estudiar.
C). Inocular 0.1 ml. de la suspensión bacteriana a cada tubo.
D). Incubar los tubos a 37 C durante 24 horas.
E). Observar los resultados comparando el crecimiento de cada tuvo con la turbidez de la serie de ampolletas
4. Efecto de la presión osmótica.

1. Cloruro de sodio.
A). Colocar una serie de tubos con caldo nutritivo y cloruro de sodio al 1,3,5,7,9 y 12 % respectivamente.
B). Marcar cada tubo con el nombre de la cepa que se va a inocular.
C). Inocular en cada tubo 0.1 ml. de la suspensión bacteriana
D). Incubar los tubos a 37 C por 24 a 48 horas.
2. Sacarosa.
A). Colocar una serie de tubos con caldo nutritivo y sacarosa al 1, 2.5, 5, 7.5, 9 y 12 % respectivamente.
5. Efecto de los colorantes.

A). Utilizar caja Petri con agar nutritivo adicionado de cristal violeta y safranina a diferentes concentraciones.
B). Marcar cada caja el nombre de la cepa que se va a inocular.
C). Inocular en cada caja dos asadas de la suspensión bacteriana y sembrar por estría.
D). Incubar las cajas a 37 C por 24 a 48 horas.
E). Observar si hay crecimiento en las cajas, y anotar que concentraciones hubo crecimiento.
6. Efecto de los detergentes.

A). Colocar una serie de tubos con caldo nutritivo y tween 80 al 0.5, 1,2, 3 y,5 % respectivamente.
E). Observar los resultados comparando el crecimiento de cada tubo con la turbidez de la serie de ampolletas
7. Efecto de los metales.

A). Utilizar caja Petri con agar nutritivo y sensidisco impregnados con soluciones metálicas.
B). Marcar cada caja el nombre de la cepa que se va a inocular.
C). Impregnar un hisopo estéril con la suspensión bacteriana
D). Inocular en cada caja con el hisopo por estría múltiple dos a tres veces.
E). Colocar los sensidisco con pinzas y esperar 15 minutos e invertir las cajas.
F). Incubar las cajas a 37 C por 24 a 48 horas.
G). Observar si hay crecimiento en las cajas, y medir los halos de inhibición.
RESULTADOS.
1. Efecto de la temperatura.
Microorganismo Temperatura C
4 Ambiente 37 55
E. coli
B. subtilis
S. aureus
S. typhi
2. Efecto del ph.

Microorganismo pH
3 5 7 11
E. coli
B. subtilis
S. aureus
S. typhi
3. Efecto de la presión osmótica.
A). Cloruro de sodio.
Microorganismo NaCl %
1 3 5 7 9 12
E. coli
B. subtilis
S. aureus
S. typhi
B). Sacarosa
Microorganismo S a c a r o s a %
1 2.5 5 7.5 9 12
E. coli
B. subtilis
S. aureus
S. typhi
4. Efecto de los colorantes.
Microorganismo Crital Violeta S a f ra n i n a

1:1000 1:10000 1:1 mill. 1:1000 1:10000 1:1 mill.
E. coli
B. subtilis
S. aureus
S. typhi
5. Efecto de los detergentes.
Microorganismo tween %
0.5 1 2 3 5
E. coli
B. subtilis
S. aureus
S. typhi

6. Efecto de los metales.
Microorganismo M e t a l e s
1 2 3 4 5 6 7
E. coli
B. subtilis
S. aureus
S. typhi
OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES:
Investigación:
Explicar la clasificación de la cepa bacteriana dependiendo de su reacción ante los efectos fisicoquímicos
1.. Nitrato de plata.

2. Sulfato de magnesio.
3. Cloruro de bario.
4. Dodecil sulfato de sodio.
5. Sulfato de cobre.
6. Sulfato de cobalto
7. Merthiolate.

PRÁCTICA NO. 9
Pruebas metabólicas para la identificación de Género y especie de un
microoganismo.
COMPETENCIA
Identificación de género y especie de un microorganismo, a partir de la demostración de sus propiedades metabólicas y sus
productos, para el apoyo del diagnóstico, con ética, y bioseguridad
la caracterización detallada de cualquier microorganismo general, depende de la determinación de las características fisiológicas
y bioquímicas específicas. La mayoría de las pruebas utilizadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica de las
bacterias, se llevan a cabo usualmente subcultivando el aislamiento primario por transferencia a una serie de medios para
pruebas diferenciales, las cuales pueden ser interpretadas luego de uno o más días de incubación adicional. Con estas pruebas
de la actividad bioquímica de los microorganismos se puede realizar la identificación final de especies. La base de todas estas
pruebas puede ser la presencia o ausencia en el microorganismo de una enzima, de un grupo de enzimas, o una vía metabólica
completa.
Pasos para la identificación de microorganismos de prueba
Los siguientes pasos proporcionan un marco de referencia para realizar la identificación de los cultivos.
1. Obtener un cultivo puro.
2. Determinar sus necesidades de energía: Si es fototrófico, litotrófico o heterotrófico. Por medio de aislamiento y cultivo.
3. Examen microscópico: Gram y morfología colonial.
4. Buscar otras características microscópicas como: esporas, por medio de tinciones, o por siembra en medio que propicien la
esporulación.
5. Comprobar movilidad: En medio húmedos, e intentar deducir si es flagelado polar peritrico, y tinción de flagelos.
6. Examinar colonias o masas de crecimiento de pigmentos u otras características especiales.
7. Probar los requerimientos de oxígeno : aeróbico, anaeróbico, anaeróbico obligado o facultativo, o microaerofílico.
8. Si es un organismo heterotrófilico, probar el catabolismo de la glucosa u otro azúcar simple. Oxidativa o fermentativa (O/F).
9. Si es fototrófico, ver si también crece en la obscuridad aeróbica (característica de la bacteria púrpura no sulfurosa,
Rhodospirillaceae).
10. Si es litrotrófico, por lo general sa ha aislado en un donador de electrones inorgánico (Ej. Azufre, amonio, hierro).
11. Después de todo lo anterior, intentar una identificación preliminar. A partir del grupo de géneros seleccionados completar
las pruebas adicionales, si es necesario, para mejorar la identificación.

En la tabla siguiente se encuentran las pruebas bioquímicas más importantes que se deben practicar para la identificación de un
microorganismo.
Pruebas diagnósticas importantes para bacterias

PRUEBA PRINCIPIO PROCEDIMIENTO EMPLEO MÁS FRECUENTE
Fermentación de Ácido y/o gas durante el crecimiento Medio de caldo con carbohidratos y rojo Diferenciación de bacterias entéricas
carbohidrato fermentativo con azúcares o de fenol como indicador de pH, y tubo (también varios otros genéricos o
alcoholes azucarados. Durham invertido para producción de separaciones de especies con algunaos
gas. azúcares individuales).
Catalasa Enzimas que descomponen el Añadir una gota de H2O2 para espesar Bacillus (+) de Clostridium (-); Streptococcus
peróxido de hidrógeno (H2O2) el cultivo y buscar burbujas (O 2 ). (-) de Micrococcus/Staphylococcus (+).
Utilización de citrato Utilización del citrato como única Medio de citrato con bromotimol azul Klebsiella-Enterobacter (+) de Escherichia (-
fuente de carbono, lo que origina como indicador de pH, buscar color azul ), Edwardsiella (-) de Salmonella (+).
alcalinización del medio. intenso (pH alcalino).
Coagulasa Enzimas que causan la coagulación Suspensión líquida, densa y mixta, de Staphylococcus aureus (+) de S.
del plasma sanguíneo. bacterias con plasma,incubar y buscar epidermidis (-).
signos de coágulo en pocos minutos.
Decarboxilasa (lisina, La decarboxilación de aminoácido Medio enriquecido con aminoácidos, Ayuda a determinar el grupo bacteriano
ornitina,arginina) libera CO2 y amina. Bromocresol púrpura indicador del pH. entre las bacterias entéricas.
En pH alcalino, si hay acción enzimática,
el indicador se vuelve púrpura.
 -Galactosidasa (ONPG) Capacidad enzimática de un Incubar una suspensión pesada de Citrobacter y Arizona (+) de Salmonella (-).
organismo para decarboxilar un cultivo lisado con ONPG para buscar el Identificación de algunas especies de
aminoácido para formar una amina, color amarillo.. Shigella y Pseudomonas.
provocando alcalinidad del medio.
Licuefacción de gelatina Muchas proteasas hidrolizan la Incubar en caldo con 12% de gelatina. Para ayudar a identificar Serratia,
gelatina y destruyen el gel. Enfriar para vigilar la formación de gel. Si Pseudomonas, Flavobacterium, Clostridium.
la gelatina se hidroliza, el tubo
permanece con líquido de enfriamiento.
Producción de sulfuro de El H2S producido por El H2S detectado en medio rico en hierro En bacterias entéricas, para ayudar a
hidrógeno (H2S) descomposición de aminoácidos a partir de la formación de sulfuro ferroso identificar Salmonella, Arizona, Edwardsiella
sulfuro o reducción de tiosulfato. negro (agar hierro de Kliger, agar hierro y Proteus.
azúcar triple, también detectan la
fermentación de carbohidratos).
Prueba del indol El triptófano de las proteínas Detectar el indol en el medio de cultivo Para distinguir Escherichia (+) de Klebsiella-
convertido en indol. con dimetilaminobenzaldehído (color Enterobacter (-); Edwardsiella (+) de
rojo). Salmonella (-)
Prueba del rojo de metilo Fermentadores ácido-mixtos que Medio caldo-glucosa. Añadir indicador Para diferenciar Escherichia (+, cultivo rojo)
producen suficiente ácido para rojo de metilo para una muestra después de Enterobacter y Klebsiella (por lo general,
descender el pH por debajo de 4.3 de incubación. cultivo amarillo).
y que logran mantenerse estables.
Reducción de nitrato Nitrato con aceptor de electrones Caldo con nitrato. Después de la Para ayudar a identificar bacterias entéricas

PRUEBA PRINCIPIO PROCEDIMIENTO EMPLEO MÁS FRECUENTE

alterno, reducido a NO-2 o N2 incubación, detectar nitrito con ácido-- (por lo común positivas).
naftilamina-sulfanilico(color rojo). Si es
negativo, confirma que aún existe NO3-
al añadir polvos de zinc, entonces NO3- a
NO2-. Si no hay color después del zinc,
entonces
NO3-  N2.
Prueba oxidasa El citocromo oxida al receptor de Caldo o agar. Pueden detectarse en Para separar Neisseria y Moraxella (+) de
electrones artificial: tetrametil o agar colonias oxidasas positivas por Azinetobacter (-). Para separar bacterias
dimetil)-p-fenilenediamina. sumersión de la placa con reactivo para entéricas (todas negativas) de
buscar colonias azules o cafés. Pseudomonas (+). Para ayudar a identificar
Aeromonas (+).
Prueba de oxidación- Algunos microorganismos producen Producción de ácido en la parte superior Para diferenciar Micrococcus (sólo
fermentación ácido solo al crecer de modo del tubo de cultivo que contiene azúcar, producción de ácido aeróbico) de
aeróbico. agar suave empleado para restringir la Staphylococcus (ácido anaerobio). Para
mezcla durante la incubación. caracterizar Pseudomonas (Producción de
ácido aeróbico) de enterobacterias (ácido
anaeróbico).
Prueba fenilalanina La desaminación produce ácido Medio enriquecido con fenilalanina. Para caracterizar el género Proteus y el
desaminasa. fenilpirúvico, que se detecta en una Después del crecimiento, añadir reactivo grupo Providencia.
prueba colorimétrica. cloruro férrico, buscar color verde.
Hidrólisis de almidón El iodo-ioduro origina un color azul Crece el microorganismo en la placa que Para identificar hidrolizadores de almidón
con el almidón. contiene almidón. Placa inundada con caracteristicos, como Bacillus spp.
yodo de Gram para buscar zonas claras
alrededor de las colonias.
Prueba de ureasa Urea (H2N-CO-NH2) se desdobla en Medio con urea al 2% e indicador rojo de Para distinguir Klebsiella (+) de Escherichia
2NH3 + CO2. fenol. El amonio produce un aumento del (-). Para distinguir Proteus (+) de
pH, color rosa-rojo intenso. Providencia (-).
Prueba de Voges- Acetona producida por la Prueba química para acetona utilizando Para separa Klebsiella y Enterobacter (+) de
Proskauer. fermentación del azúcar. -naftol. Escherichia (-). Para caracterizar miembros
del género Bacillus.
Brock, Thomas D.; Madigan, Michael T. Microbiología. Capitulo 13, pag. 511-512. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S. A. Sexta edición, 1993.
PARTE EXPERIMENTAL.
MATERIAL.
Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con caldo rojo de fenol con:
Sacarosa.
Manitol.
Glucosa.
Lactosa.
Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con medio KIA
Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con medio LIA.
Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con medio de Citrato de Simmons.
Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con medio de Fenilalanina.

Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con medio MR-VP.

Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con caldo de urea.
Tubos de ensaye 13 X 100 con rosca con medio MIO.
Cajas de Petri con Agar Almidón.
Cajas de Petri con Gelatina.
Cajas de Petri con Agar Sangre.
Mecheros Meker.
Mechero Bunsen.
Alambre de picadura.
Asa de nicromo.
Pipeta Mohr de 1 ml.
Solución de cloruro de mercurio al 12.5%
Reactivo de Kovac.
Papel tornasol rosa.
Solución de lugol.
Solución de rojo de metilo.
Solución de -naftol.
Solución de KOH creatina.
TÉCNICA.
1. Fermentación de los hidratos de Carbono.

A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada uno de los cuatro tubo de caldo Rojo de fenol
que contienen glucosa, lactosa, sacarosa y manitol .
B). Incubación a 37oC por 18 a 24 horas.
C). Interpretación: 1. Positivo.
1.1. Acido (A) pH: 6.8
1.2. Color amarillo.
1.3. Producción de gas . (G). Presencia de burbujas en el tubo de Durham
(positivo) No presencia de burbujas y el medio de cultivo amarillo dentro
del tubo de Durham (negativo).
1.4. Registrar producción de ácido y gas. (AG).
2. Retardada. Colr anaranjado. Volver a inocular.
3. Negativa.
3.1. Alcalina.
3.2. Color rosa-rojizo.
2. Prueba del Citrato. Utilización del Citrato como única fuente de carbono.
A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo inclinado de Citrato de Simmons solo en el
pico de flauta.
B). Incubación a 37oC por 24 a 48 horas. En ocasiones hasta 4 días.
C). Interpretación: 1. Positivo Crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta.
2. Negativo. No se observa crecimiento ni cambio de color (verde).
3. Prueba con agar hierro de Kligler.

A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo inclinado de KIA . Primero con el alambre
de picadura picar en el centro del tubo y proseguir en estría sobre el pico de flauta.
C). Interpretación: 1. Fermentación de la glucosa solamente.
1.1 Pico de flauta alcalino (rojo).
1.2. Capa profunda ácida (amarillo).
1.3. Producción de gas SH2 (negro).
2. Fermentación de la glucosa y la lactosa.
2.1. Pico de flauta acido (Amarillo).
2.2. Capa profunda acida (amarillo).
3. No fermentación de ningun azúcar.

3.1 Pico de flauta alcalino (rojo)

3.2. Capa profunda (rojo).
4. Producción de gas rompimiento del medio o burbujas en el medio se considera
positivo y si no hay producción de gas es negativo (anaerógenico).
4. Prooducción de acetoína. Reacción de Voges-Proskauer.
A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo de caldo de VP.
B). Incubación a 37oC por 24 a 48 horas En ocasiones e necesitan hasta 10 días de incubación..
C). Agregar 1.2 ml. de la solución de -naftol al 5%.
D). Agregar 0.4 ml. de sol. de KOH al 40%.
E). Agitar y dejar reposar 10-15 min.
F). Interpretación.1. Positiva. Color rojo rosado en la superficie del medio.
2. Negativa. Color amarillo en la superficie del medio.
5. Prueba cuantitativa de la producción de ácido. Prueba del rojo de metilo.

A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo de caldo de Rojo de metilo
B). Incubación a 37oC por 3 a 5 días.
C). Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo.
D). Interpretación: 1. Positivo. Color rojo brillante.
2. Negativo. Color amarillo definido.
6. Prueba de la decarboxilasa , desaminación y producción de H2S.

A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo de agar LIA, con alambre de picadura,
primero por picadura en la capa interna y proseguir con estría cruzada en el pico de flauta.
C). Interpretación: 1. Decarboxilación positiva por reacción alcalina en el fondo (púrpura)
2. Desaminación positiva, por coloración roja en la superficie.
3. Producción de H2S por precipitado negro.
4. Fermentación de la glucosa únicamente. Es una reacción negativa (púrpura la
superficie y amarillo el fondo).
7. Prueba de la movilidad, producción de Indol y decarboxilación de ornitina.

A). Inocular una asada con alambre de picadura de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo de medio MIO,
cuidando de picar solo por el centro con mucha precaución.
C). Agregar reactivo de Kovacs o de Ehrlich para interpretar la prueba del Indol..
D). Interpretación: 1. Indol.
1.1. Positivo. Anillo color rojo en la superficie del medio en la capa
alcohólica.
1.2. Negativo. No se produce color, toma el color del reactivo (amarillo).
1.3. Variable. Color anaranjado en la superficie del medio, debido a la
presencia de escatol, compuesto precursor del Indol.
2. Ornitina
2.1. Positivo. Un color púrpura en la superficie del medio (alcalino).
2.2. Negativo. Color púrpura en la superficie, con una banda amarilla a lo
largo del tubo (ácido).
3. Movilidad.
3.1. Positivo. Crecimiento extendido de la línea de inoculación.
3.2. Negativo. Crecimiento solo sobre la línea de inoculación.
8. Prueba de la fenilalanina-desaminasa.
A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo de agar de Fenilalanina.
B). Incubación a 37oC por 4, 18 o 24 horas.
C). Agregar 5 gotas del indicador de cloruro férrico.
D). Interpretación: 1. Positivo. Color verde.
2. Negativo. Color amarillo.

9. Licuefacción de la gelatina.
A). Inocular una caja de Gelatina o un tubo con la cepa bacteriana proporcionada
B). Incubación a 22-25 o 35oC por 24horas a 14 días.
C). Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo.
D). Interpretación: 1. Positivo. Medio licuado.
2. Negativo. Medio sólido.
10. Prueba de la Ureasa.

A). Inocular una asada de la cepa bacteriana proporcionada a cada tubo de caldo de urea.
B). Incubación a 37oC por 8, 12, 24 y 48horas.
C). Interpretación: 1. Positivo. Color rojo rosado intenso en todo el caldo.
2. Negativo. No se produce cambio de color. (Color amarillo anaranjado).
RESULTADOS.
1. PRUEBAS CON CARBOHIDRATOS.
M I C R O O R G A N I S M O S
PRUEBA
Fermentación de glucosa
Fermentación de sacarosa
Fermentación de manitol
Fermentación de lactosa
Utilización de citrato
Rojo de Metilo (MR)
Voges-Proskauer (VP)
KIA
2. PRUEBA CON PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS.
PRUEBA
Decarboxilasa lisina
Decarboxilasa arginina
Decarboxilasa ornitina
Movilidad
Producción de Indol.
Licuenfacción de gelatina
fenilalanina desamilasa
3. PRESENCIA DE ENZIMAS.
PRUEBA
Prueba de la ureasa

Prueba de la catalasa
Prueba de la coagulasa
CUESTIONARIO.
1. Observaciones y conclusiones en una cuartilla, explicando según sus resultados de que Genero y especie es su muestra.
2. Investigar el fundamento de cada una de la pruebas bioquímicas realizadas en el laboratorio y reportarlo como ANEXO 1 en
su reporte final de laboratorio.

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Facultad de Ciencias

Dra. Lilia Angélica Hurtado Ayala

REV.01 OCTUBRE 2017

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

Facultad de Ciencias Químicas e Ingenieria. UABC

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16. Anotar concisamente todo lo nuevo que se observe en cada experiencia,

Facultad de Ciencias Químicas e Ingenieria. UABC

1.- Ejemplos de microorganismos tratados en cada nivel de Bioseguridad.

Facultad de Ciencias Químicas e Ingenieria. UABC

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REQUERIMIENTOS ENERGETICOS Y NO ENERGETICOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

Facultad de Ciencias Químicas e Ingenieria. UABC

FACTORES INHIBIDORES: Compuestos que impiden el crecimiento de algún tipo de microorganismo

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

SEGUN PROPORCION DE AGUA

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C) Preparación de pipetas Mohr para esterilizar con calor húmedo.

D) Preparación de cajas de Petri para esterilizar con calor húmedo.

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E) Preparación de Medios de cultivo

2. Preparación del Agar sangre.

3. Preparación de medios que no se esterilizan:

4. Preparación de los tubos con medio sólido (inclinado).

5. Preparación de los tubos con medio semisólido (recto).

6. Preparación de los tubos con caldo.

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3.- ¿Cuál es el principio de esterilización por tindalización?

9. ¿ Qué pasos se deben seguir en la elaboración de un medio de cultivo?

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PLACAS DE AGAR (CAJA PETRI).

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TUBOS CON CALDO Y AGAR.

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INTERPRETACIÓN DE LOS CULTIVOS.

1. MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA O COLONIAL.

2. TINCIÓN DE GRAM Y MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA.

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MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA O COLONIAL.

CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS USADAS EN LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

1. TAMAÑO. Diámetro en mm.

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REACCIONES EN MEDIOS DE AGAR USADOS EN LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS.

1. HEMÓLISIS EN AGAR SANGRE.

2. PRODUCCIÓN DE PIGMENTOS EN MEDIOS DE AGAR.

A). Pigmentos hidrosolubles, que colorean el medio.

1. TÉCNICA DE SEMBRADO EN ESTRÍA POR AGOTAMIENTO.

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2. TÉCNICA DE SEMBRADO EN ESTRÍA MULTIPLE.

3. TÉCNICA DE SEMBRADO EN ESTRÍA DE LOS TRES GIROS.

4. TÉCNICA DE SEMBRADO CON HISOPO.

5. TÉCNICA DE SEMBRADO CON VARILLA ACODADA.

5. TÉCNICA DE SEMBRADO SEMICUANTITATIVO.

6. TÉCNICA DE SEMBRADO EN TUBO CON MEDIO LÍQUIDO.

A). Inclinar el tubo con caldo en un ángulo de aproximadamente 30o .

7. TÉCNICA DE SEMBRADO EN TUBO CON MEDIO SEMISÓLIDO.

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7. TÉCNICA DE SEMBRADO PARA TUBOS EN “PICO DE FLAUTA”.

A). Tomar una muestra del cultivo con asa estéril.

NOTA: Todas las caja se incuban invertidas

CARACTERÍSTICA RESULTADO CARACTARÍSTICA RESULTADO

CARACTERÍSTICA RESULTADO CARACTARÍSTICA RESULTADO

Hongos:____gr/ml Levaduras_gr/ml Bacterias______gr/ml

Hongosgr/ml. Levadurasgr/ml Bacterias____gr/ml

Hongosgr/ml. Levadurasgr/ml Bacterias____gr/ml