PRODUCCIÓN DE ETANOL A
PARTIR DE
SACHAROMYCES CEREVISIAE
INMOVILIZADA EN ALGINATO DE
CALCIO
1. Abstract
The following laboratory begins with the
idea of ethanol production from bacteria
called Saccharomyces cerevisiae, which
through fermentation the above named
product is generated in addition to this, it is
familiar to counting cells with the use
microscopes, also an analysis of the results
with spectrophotometry and refractive
index. This work is accomplished by
comparing the result of obtaining sugar and
ethanol.
Keywords: Bacteria, Ethanol,
Fermentation, cells, microscopic.
2. Resumen
En el siguiente laboratorio se da inicio con
la producción de Etanol a partir de bacterias
llamadas Sacharomyces cerevisiae, las
cuales por medio de fermentación se genera
el producto anteriormente mencionado,
además de esto, se familiariza con el conteo
de células con la utilización de
microscopios, asimismo se realizo a partir
de un análisis cualitativo con
espectrofotometría e índice de refracción.
Con este trabajo se logra comparar el
resultado de obtención de azúcares y de
etanol.
Palabras Clave: Bacterias, Etanol,
Fermentación, células, microscópico.
3. Introducción
El etanol es un alcohol considerado como
un producto de alto consumo industrial
como lo
es una bebida alcohólica, como antiséptico,
como insumo químico, como combustible
alterno o de reemplazo a la gasolina entre
otros usos. Se clasifica en el grupo de los
Biocombustibles, el tipo de combustible
que derive de la biomasa, de organismos
recientemente vivos o de sus desechos
metabólicos. Estela Escalante, K. M.
(2014)
Éste se obtiene a partir de
microorganismos, los cuales realizan la
fermentación de azúcares que se encuentran
en productos vegetales, los diferentes tipos
de fuentes de fermentación de etanol son las
azucaradas (caña de azúcar, remolacha), las
almidon áceas (cebada, banano, yuca), las
ligno celulósicas (madera, algodón), cuyas
características fisicoquímicas llevan a
diferencias en la adecuación para un
posterior tratamiento común en los tres
casos. Garzon, C. (Agosto de 2009)
Saccharomyces cerevisiae es una levadura
perteneciente al grupo de los hongos
unicelulares, del grupo de los ascomicetos,
incluyendo a más de 60000 especies, entre
ellas las trufas, las colmenillas o el
Penicillium, el hongo que produce la
penicilina, En la naturaleza se encuentra
sobre sustratos ricos en azúcares o en los
exudados y savias dulces de algunas
plantas. Su término alternativo de
"fermento" viene del latín fervere, que
quiere decir hervir y proviene del
movimiento del mosto durante la
producción de vino o cerveza. Esta levadura
está absolutamente condicionada por sus
propiedades para la fermentación del pan, el
vino o la cerveza. Hernandez, A. (2 de
Noviembre de 2013).
Dich fermentación se puede ver afectada
por fenómenos o factores externos La
determinación de los factores que limitan la
glicólisis fermentativa del etanol son
complejos debido a la interrelación
existente y a la naturaleza de los parámetros
intervinientes durante el proceso de
fermentación. Algunos de ellos se deben
tener en cuenta en la fermentación
alcohólica industrial. En las limitaciones
que surgen durante el proceso se pueden
enumerar algunos de los más importantes
como son: Morales, B. M. (Junio de
2003).
● Concentración de etanol
resultante: la principal limitación
del proceso, es la resistencia de las
levaduras a las concentraciones de
etanol (alcohol) que se llegan a
producir durante la
fermentación, la saccharomyces
cerevisiae pueden llegar a soportar
hasta el 20% de concentración en
volumen. En ingeniería bioquímica
estos crecimientos se definen y se
modelizan con las ecuaciones de
crecimiento celular.
● Acidez del substrato: El pH es un
factor limitante en el proceso de la
fermentación ya que las levaduras
se encuentran afectadas claramente
por el ambiente, bien sea alcalino o
ácido. Por regla general el
funcionamiento de las levaduras
presentan un pH óptimo en el rango
que va aproximadamente desde 3.5
a 5.5 pH. Los procesos industriales
procuran mantener los niveles
óptimos de acidez durante la
fermentación usualmente mediante
el empleo de disoluciones tampón.
Los ácidos de algunas frutas (ácido
tartárico, málico) limitan a veces
este proceso. Morales, B. M.
(Junio de 2003).
● Concentración de azúcares: La
concentración excesiva de hidratos
de carbono en forma de
monosacáridos
y disacáridos puede frenar la
actividad bacteriana. De la misma
forma la baja concentración puede
frenar el proceso. Las
concentraciones límite dependen
del tipo de azúcar así como de la
levadura responsable de la
fermentación. Las concentraciones
de azúcares afectan a los procesos
de ósmosis dentro de la membrana
celular. (Uber, G. (2006).
● Contacto con el aire: Una
intervención de oxígeno (por
mínima que sea) en el proceso lo
detiene por completo (es el
denominado Efecto Pasteur). Esta
es la razón por la que los recipientes
fermentadores se
cierren herméticamente.
● La temperatura: La fermentación
es exotérmica, las levaduras tienen
un régimen de funcionamiento en
unos rangos de temperatura
óptimos, se debe entender además
que las levaduras son seres
mesófilos. Si se expone cualquier
levadura presentó su muerte al
momento de presentar una
temperatura cercana o superior a 55
°C por un tiempo de 5 minutos. La
mayoría cumple sus temperaturas
óptima a los 30 °C.
Finalmente se desea realizar el laboratorio
con el objetivo de identificar el porcentaje
de etanol por medio de la levadura
Saccharomyces cerevisiae, la cual se
analizará
por medio del tiempo para identificar si a Erlenmeyer en un agitador orbital a 200rpm y
una temperatura y pH óptimo se optimiza 30°C.
la actividad fermentativa.
Se tomó una muestra de 1ml para medir azucares
reductores y concentración de etanol cada dos
4. Metodología
horas. Dejar fermentar 17 horas y al terminar
1. METODOLOGIA Y
este tiempo tomar la solución de hidróxido de
MATERIALES
calcio y filtrar el precipitado. Colocar en horno
a 60°C para luego determinar la cantidad de
Se preparó una solución de 50ml de
carbonato de calcio y posteriormente por
alginato de sodio al 3% p/V mezclando el
estequiometria el dióxido de carbono.
alginato hasta completa solubilidad. El
alginato se agregó lentamente al agua para
Determinación de azúcares reductores por
evitar formación de grumos. Es importante
medio de ácido dinitrosalicilico (DNS)
una esterilización incipiente mediante
calentamiento a baño maría (92°C) por 20
Para la preparación de la curva estándar es
minutos. Se dejó en reposo la solución a
necesario colocar en 6 tubos de ensayo las
temperatura ambiente hasta que alcanzar
cantidades que aparecen en la siguiente tabla y
una temperatura por debajo de los 40°C.
seguir el procedimiento que aparece a
continuación.
Se pesaron 1,5g de levadura y suspendieron
en 25ml de agua destilada estéril y mezcló
Tabla N°1 Cantidades a utilizar para la
con la solución de alginato preparada. Esta
determinación de azucares reductores
mezcla se debe realizar en cabina de flujo
B 1 2 3 4 5 6
laminar o al lado de un mechero para evitar
Solución 10 12 15
contaminación de la mezcla. Homogenizar - 25 50 75
B (µl) 0 5 0
la mezcla. Colocar la suspensión en una
jeringa estéril y descargar de manera lenta Agua
50 47 45 42 40 37 35
(gota a gota) la suspensión en la solución de destilada
0 5 0 5 0 5 0
cloruro de calcio 0,1M en agitación. (µl)
Volumen 50 50 50 50 50 50 50
Depositar 10 gotas de alginato de sodio en final (µl) 0 0 0 0 0 0 0
10 ml de solución salina isotónica esteril, Concentr
transferir a un balón aforado de 25ml y ación - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
llevar hasta el aforo con solución salina; (mg/ml)
con esta realizar conteo celular en cámara
de Neubauer. Reportar en número de Tomar50µl de la solución de cada muestra
células/esfera. correspondiente a un tiempo determinado y
colocarlos en tubos de ensayo, luego ad
Una vez formadas las esferas esperar unos icionarles 450µl de agua destilada.
60 minutos hasta que endurezcan, luego A todos los tubos, incluyendo los de la curva de
retirarlas de la solución de cloruro de calcio, calibración se le adicionan 500µl de DNS
haciéndolas pasar por un colador al lado del (Solución A), después se llevan los tubos a
mechero; llevarlas a un Erlenmeyer con ebullición durante 5 minutos e inmediatamente
desprendimiento, que contenga 100ml de se pasan a agua-hielo.
medio de cultivo estéril (Glucosa: 100g/l, Se adicionan 5ml de agua destilada, se agita y
KH2PO4: g/l, MgSO4*7H2O: 1g/l, ajustar el deja en reposo durante 15 minutos, luego se lee
pH a 4,5. El medio se esteriliza a 15psi por absorbancia a 540nm en el espectrofotómetro.
15 minutos con agitación, el cual se conecta
a una manguera que burbujeaba solución de Curva de calibración de etanol mediante
hidróxido de calcio (0,1%p/v). Colocar el determinación de índice de refracción
Para la realización de la curva de
calibración del índice de refracción en
función de la concentración de etanol se
parte de una solución de etanol al 99,9%. Se
preparan las siguientes soluciones, luego se
midió índice de refracción a cada tubo.

Tabla N°2 Cantidades a utilizar para la

determinación de la concentración de
Etanol
Figura N°2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 Se visualizarán 25 cuadros de los cuales se
0 1 escogen cinco (los de la esquina y el centro).
Para realizar el conteo se pasa al ocular de
Etanol

40X donde con la ayuda del carro móvil del

(µl)

100
120
140
160
180
200
microscopio efectuara el conteo a los
20
40
60
80
0

cuadros correspondientes.
destilada

Las células se cuentan cuadro por cuadro y

Agua
1000

se hace un total. Se recomienda realizar el

(µl)
980
960
940
920
900
880
860
840
820
800

conteo siguiendo las flechas para evitar que

se cuenten las células dos veces o no que no
se cuenten como lo señala la siguiente
%v/v

10%
12%
14%
16%
18%
20%

imagen
2%
4%
6%
8%
0

Cámara de Neubauer
Esta cámara se utiliza para conteo celular.
1. Limpie la cámara y la laminilla de
cuarzo suavemente con alcohol.
2. Revise la laminilla de cuarzo que no
debe estar desbordada o quebrada.
3. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la Figura N°3
cámara en forma vertical, esta debe
quedar centrada.
4. Proceda a llenar la cámara. Es
recomendable llenarla con micropipeta Bibliografia
pequeña o con una jeringa ya que la  Estela Escalante, K. M. (2014). Efecto de
cámara se llena con una gota. El llenado la aireación en la producción de
debe ser continuo en un solo intento. compuestos volátiles por cultivo mixto
de Brettanomyces intermedius y
Conteo: Se debe enfocar el cuadro de Saccharomyces cerevisiae durante la
conteo con el ocular de 4X. Como las fermentación de sidra. Obtenido de
células que se van a contar son demasiadas
http://www.sciencedirect.com/science/a
pequeñas ubicarse en la cuadricula central y
pasar al ocular de 10X. Se visualizará de la rticle/pii/S1405888X1470316X
siguiente manera:  Garzon, C. (Agosto de 2009). ESTUDIO
COMPARATIVO PARA LA
PRODUCCIÓN DE ETANOL ENTRE
 DOS CEPAS SACCHAROMYCES
CEREVISAE. Obtenido de
http://repositorio.utp.edu.co/dspace
/bitstream/handle/11059/1689/6618
2g245.pdf;jsessionid=074A740B35
8D81756449769FBA23C44F?sequ
ence=1
 Hernandez, A. (2 de Noviembre de
2013). Producción de etanol por
Saccharomyces Cerecisae.
Obtenido de
http://tangara.uis.edu.co/biblioweb/
tesis/2009/131929.pdf
 Morales, B. M. (Junio de 2003).
EVALUACIÓN DE FACTORES
QUE PUEDEN INFLUIR EN EL
PROCESO DE
SACARIFICACIÓN-
FERMENTACIÓN SIMULTÁNEAS
PARA LA PRODUCCIÓN DE
ETANOL A PARTIR DE
MATERIALES AMILÁCEOS.
Obtenido de
https://revistas.ucr.ac.cr/index.php/i
ngenieria/article/view/14665/19682
 Uber, G. (2006). MODIFICACIÓN
GENÉTICA DE LEVADURAS
VÍNICAS. Obtenido de
http://www.tdx.cat/bitstream/handl
e/10803/9532/uber.pdf?sequence=1