FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

DEPARTAMENTO BIOMEDICO
UNIDAD DE BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

MANUAL PRACTICOS FISIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

CARRERA BIOTECNOLOGIA

Nº1: MEMBRANAS Y TRANSPORTE

Las membranas celulares son barreras selectivas que separan las células y forman
compartimentos intracelulares. Entre sus funciones están: la regulación de la entrada y salida de
moléculas, la transmisión de señales que regulan el metabolismo y la mantención de las interacciones
entre las células para formar los tejidos. La membrana celular está compuesta por una doble capa de
fosfolípidos, proteínas y carbohidratos.
La membrana celular actúa como
barrera semipermeable para mantener la
homeostasis de la célula, impidiendo la
entrada de la mayor parte de las moléculas
y dejando pasar otras en forma selectiva.
Para entender estos mecanismos es
necesario repasar los conceptos de
difusión y osmosis.
Esquema de la organización de una membrana plasmática según la visión actual del
modelo de mosaico fluido de Singer y Nicholson (1972)

Se define como difusión al movimiento de las moléculas desde una región de alta concentración
a otra de menor concentración, producido por la energía cinética de las moléculas. No requiere gasto de
energía.
Si consideramos un conjunto de partículas concentradas en una región del espacio al tiempo
inicial, a medida que pasa el tiempo estas se dispersan. Al comienzo existe una diferencia de
concentración entre el sector central y los puntos
alejados de él, lo que genera una gradiente de
concentración. El transporte neto hace que un mayor
número de partículas se aleje de la región de alta
concentración, por lo que la situación final es que las
partículas se distribuyen homogéneamente en el
recipiente que las contiene hasta que el sistema ha
alcanzado el equilibrio.
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El fenómeno de osmosis está estrechamente relacionado con el de difusión y ocurre cuando existe
una membrana que separa ambos recipientes y que sólo permite el paso de solvente (agua) y no del soluto
(moléculas orgánicas e inorgánicas), por lo que sólo ocurre desplazamiento del solvente a través de la
membrana que separa dos soluciones de distinta concentración. El movimiento de solvente sucede
siempre desde el área con menor concentración de soluto (solución más diluida) al área con mayor
concentración de soluto (solución más concentrada), hasta que alcanza su equilibrio osmótico.

En forma práctica, si la concentración

de solutos a ambos lados de la membrana son
iguales, significa que el flujo neto de solvente
a través de la membrana es cero, se dice que
la célula está en una solución isotónica.
Cuando la célula tiene una concentración de
solutos mayor que su ambiente externo, se
dice que la célula está en una solución
hipotónica, y como consecuencia, el agua
entra a la célula causando que se expanda. Si
la concentración de solutos es mayor fuera de
la célula, se dice que la célula está en una
solución hipertónica; la célula pierde agua y
se encoge.

Eritrocitos en ambiente hipertónico: crenación

Eritrocitos en ambiente hipotónico: hemólisis

En las células vegetales, sin embargo, cuando la vacuola se llena de agua, ésta ejerce presión
contra la pared celular hasta llegar a un punto donde se impida que entre más agua (presión de turgencia)
y la célula se encuentra túrgida (firme), lo cual es el estado ideal de estas células. Por otra parte, si la
célula vegetal pierde agua, la célula sufre plasmólisis al separarse la membrana celular de la pared celular,
lo cual suele ser letal para la célula.

Estudios a nivel celular.

La membrana de los glóbulos rojos ha sido de gran utilidad para estudiar muchas de las
características de la doble capa lipídica, las funciones las proteínas que están localizadas en las
membranas plasmáticas como canales y proteínas que unen la membrana con el citoesqueleto, y su
permeabilidad a diversas sustancias.
Entre las razones que explican la utilidad de los eritrocitos como modelo de estudio para entender
el comportamiento de las membranas se cuenta el hecho de que son de fácil obtención, están disponibles
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en gran cantidad en los bancos de sangre y son fácilmente separables de otras células sanguíneas.
Además, al no poseer núcleo ni organelos internos, los resultados obtenidos solo tienen relación con la
membrana plasmática.
Para estudiar las características de la membrana se emplea la técnica del “lavado” del contenido
eritrocitario mediante soluciones hipotónicas, por lo que el agua ingresa a la célula, hinchándolos y
rompiéndolos (hemólisis), liberando la mayor parte de las proteínas no perteneciente a la membrana, la
hemoglobina y otros contenidos celulares. Se obtiene así la membrana pura, que se denomina eritrocito
fantasma, “ghost”.
Los eritrocitos tienden a romperse en un solo lugar, dando lugar a los fantasmas rotos (leaky
ghost). Alternativamente, las células se pueden sellar de nuevo, incubándolas en un buffer isotónico a
37oC. En son los fantasmas sellados (sealed ghost). Una tercera opción es crear un fantasma invertido
(inside-out vesicules), con el objeto de
estudiar aisladamente la cara interna de la
membrana. Las pequeñas vesículas se
producen mecánicamente al perturbar los
fantasmas; la orientación de la membrana de
estas vesículas depende de las condiciones
iónicas utilizadas durante el proceso de
resellado. Existe también la posibilidad de
colocar diversas soluciones en el interior del
glóbulo sellado pudiendo estudiar su
comportamiento.

El presente trabajo práctico se desarrollará en dos partes. La primera corresponde al estudio de

los fenómenos descritos a nivel fisicoquímico, con el fin de comprender su fundamento. La segunda
corresponde al estudio de estos fenómenos y nivel celular, para comprender su función biológica.
Al término de la unidad de membrana y transporte el estudiante deberá ser capaz de:
1. Describir los componentes de las membranas biológicas.
2. Analizar los factores que pueden afectar la integridad de las membranas.
3. Explicar porque los fenómenos de difusión y osmosis son importantes para el funcionamiento
celular.
4. Mencionar los factores que afectan la velocidad de difusión.
5. Explicar que son soluciones hipotónicas, hipertónicas e isotónicas y cuáles son los efectos que
estas tienen sobre las células.
6. Resolver situaciones experimentales relacionadas a los fenómenos descritos.

Actividad 1. Estudio de la difusión en medio sólido.

Materiales y reactivos (por grupo).

1 Cronómetro
1 Micropipeta 100µL
Placas de Petri con agar 0.2, 1.0 y 2.0%
Solución de KMnO4 1M (1 mL)

Procedimiento A.
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1. Agregar 25µL de la solución KMnO4 1M en el centro de cada una de las placas de Petri que
contienen geles de agar de distinta concentración (0.2, 1.0 y 2.0%). Este procedimiento debe
realizarse en forma cuidadosa para no picar el agar, ya que esto afectará el resultado de su
experimento.
2. Observe la difusión de la mancha de KMnO4 en función del tiempo, anote sus resultados en la
tabla.
3. Determine la tasa de difusión, expresándola como el aumento del diámetro por unidad de tiempo
(Δd/Δt) y grafique sus resultados.

Tasa de difusión=distancia (mm, cm) / tiempo (seg, min, h)

Agar 0.2% Agar 1.0% Agar 2.0%

Tiempo
Distancia Δd/Δt Distancia Δd/Δt Distancia Δd/Δt
(min)
0
5
10
15
20
30

Anotar sus observaciones y formular una explicación para este fenómeno.

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Actividad 2. Estudio de la difusión en medio líquido, y el efecto de la temperatura en el fenómeno de

difusión.

Materiales y reactivos (por grupo).

1 Cronómetro
3 vasos de precipitado de 250mL
3 pipetas de 5 mL
Tinta china
Microondas
Refrigerador

Procedimiento B.

1. Llenar tres vasos de precipitado de 250 mL con agua hasta unos 5cm antes de alcanzar el borde
2. Calentar uno de los vasos hasta alcanzar los 90ºC, es importante tener la precaución de no hervir
el agua. El otro vaso enfriarlo en el refrigerador por un par de horas. Y el tercero mantenerlo a
temperatura ambiente. Deje reposar los vasos por un par de minutos para evitar el movimiento
del agua.
3. Adicionar a cada uno de los vasos 2 mL de tinta china. Esto debe realizarse en el centro del vaso,
sobre el agua y al mismo tiempo en todos los vasos.
4. Observar que pasa con la difusión de la tinta china en todos los vasos.
5. Medir el tiempo que demora en difundir completamente la tinta china en cada uno de los vasos.
6. Anotar sus observaciones y formular una explicación para este fenómeno.

¿Cómo afectan las diferentes condiciones de temperatura al fenómeno de difusión? Explique.

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Actividad 3. Estudio del fenómeno de osmosis.

Materiales y reactivos (por grupo).

-Regla
-Marcador
-Pitilla
-Membrana semipermeable (celofán)
-Sacarosa 2M (50mL)
-1 Embudo
-1 Cronómetro
-1 vasos de precipitado de 500mL
-1 pipetas de 10 mL

Procedimiento C.
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1. Marcar el vástago del embudo cada 1 cm, usando la regla

2. Cubrir el embudo con el papel celofán (membrana semipermeable) de forma que quede lo más
extendido posible
3. Sellar el embudo con parafilm, cubriendo todo su contorno hasta el comienzo del vástago y revisar
por fugas de líquido.
4. Llenar al máximo el embudo (hasta la base del vástago) con la solución de Sacarosa 2M, usando
una pipeta pasteur
5. Colocar el embudo invertido en el vaso de precipitado. Este debe permanecer suspendido en el
aire, de la forma que indica la figura
6. Agregar agua destilada hasta un nivel tal que la amarra superior del sistema no quede sumergida
y el embudo no se mueva
7. Observar la altura del líquido dentro del tubo cada 1-5 minutos. Anotar la altura en función del
tiempo.
8. Calcular el flujo de agua a través de la membrana

¿Qué resultado espera obtener si realiza el experimento en forma inversa? Es decir, al poner la solución
sacarosa 2M en el vaso y agua dentro del embudo
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Actividad 4. Estudio del fenómeno de osmosis y su efecto sobre las células animales I

Materiales y reactivos (por grupo). Frotis de sangre

-Microscopio
-1 muestra de frotis de eritrocitos
-muestra sangre (EDTA 10%)
-6 portaobjetos
-6 cubreobjetos
-pizeta con agua destilada
-pipeta pasteur
-NaCl 0.45% (5mL)
-NaCl 0.9% (5mL)
-NaCl 1.8% (5mL)
-NaCl 0.9% + SDS 0.1%

Procedimiento D.

1. Rotular los tubos de ensayo de acuerdo a la solución que van a contener

2. Adicionar a cada tubo de ensayo 1.5 mL de la solución respectiva.
3. Adicionar 100µL de sangre a cada uno de los tubos
4. Mezclar suavemente por inversión
5. Rotular 4 portaobjetos limpios de la misma forma que los tubos de ensayo
6. Realizar preparaciones temporales de frotis de sangre, colocando 1 gota de cada una de las
suspensiones obtenidas en el portaobjetos correspondiente y cubrir cuidadosamente
con un cubreobjetos. No realice las preparaciones al mismo tiempo, para obtener resultados
satisfactorios es muy importante que concluya con la observación de una muestra antes de
preparar la siguiente.
7. Visualizar la morfología eritrocitaria al microscopio en el objetivo 40X

Elaborar los esquemas correspondientes para cada una de las preparaciones. Cada esquema debe
incluir: título, aumento y además señalar las distintas estructuras celulares que se observen. Anote en un
cuadro los resultados de las soluciones hipotónicas, isotónicas e hipertónicas.

ISOTONICO HIPOTONICO HIPERTONICO ISOTONICO+SDS

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Actividad 5. Estudio del fenómeno de osmosis y su efecto sobre las células animales II

Materiales y reactivos (por grupo).

-Microscopio
-1 muestra de frotis de eritrocitos
-muestra sangre (EDTA 10%)
-6 portaobjetos
-6 cubreobjetos
-pizeta con agua destilada
-pipeta pasteur
-buffer isotónico (0.9% NaCl, 5 mM sodium phosphate, pH 8.0)
-buffer hipotónico (5 mM sodium phosphate, pH 8.0)

1. Colocar 500 µL de sangre en un tubo Eppendorf y centrifugar a 1000 rpm por 10 minutos a 4oC.
2. Descartar el sobrenadante y resuspender la células en 3 volumenes de PBS isotónico pH 8.0 frío,
para eliminar los glóbulos blancos por medio de sucesivos lavados. Resuspender las células
suavemente para evitar romperlas
3. Centrifugar a 1000 rpm por 10 minutos a 4oC. Repetir el lavado dos veces.
4. Tomar una alícuota de las células, preparar un frotis y observar al microscopio. Anotar sus
observaciones
5. Lisar los eritrocitos por choque hipotónico con 5 mL de buffer hipotónico
6. Centrifugar a 10000 rpm durante 20 minutos a 4°C. Realizar 5 lavados con el mismo buffer
7. Tomar una alícuota de las células, preparar un frotis y observar al microscopio. Anotar sus
observaciones
8. Una vez que las células estén decoloradas, resuspenderlas en 2 mL de 2% azul de metileno en
buffer isotónico pH 8.0 incubando a 37oC por 15 minutos
9. Lavar las células dos veces con PBS isotónico pH 8.0
10. Observar los glóbulos y compárelos con los de la sangre inicial y con los sometidos a hemólisis.

ISOTONICO HIPOTONICO ISOTONICO + azul de

metileno
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Nº3: ORGANIZACIÓN CELULAR

El conocimiento detallado de los distintos componentes celulares

y de sus funciones requiere que dispongamos de fracciones puras de
los organelos celulares en cantidades adecuadas. El fraccionamiento
celular es usado para investigar la bioquímica y fisiología
de organelos fuera del ambiente complejo de la célula intacta y
consta de tres pasos fundamentales: homogenización,
fraccionamiento por centrifugación y ensayos de los marcadores
específicos.
La primera etapa del proceso es la homogenización. Esta consiste en disgregar los tejidos y romper
las células para obtener su contenido, sin alterar la composición de los organelos. Esto se puede realizar
usando un homogenizador, aplicando shock osmótico,
ultrasonido o haciéndolas pasar por una aguja de pequeño
calibre. Para mantener la integridad de
los organelos y macromoléculas durante el
procedimiento, los tejidos se deben
resuspender en un medio apropiado (solución
amortiguadora, salina o isotónica).

En la mayoría de los procedimientos de fraccionamiento celular la centrifugación juega un rol

preponderante para la separación de las células, organelos celulares y macromoléculas. En la obtención
de fracciones subcelulares habitualmente se comienza realizando varias etapas sucesivas de
centrifugación diferencial, para separar los componentes celulares de acuerdo a su tamaño y densidad.
Cada etapa se realiza de manera que el producto: fuerza centrífuga relativa x tiempo sea mayor que en
la etapa anterior. De esta manera, en cada centrifugación se obtienen fracciones enriquecidas en los
distintos organelos, separados de acuerdo a su coeficiente de sedimentación. Para esta serie de
centrifugaciones se utilizan centrífugas de baja y alta velocidad para las primeras etapas, y eventualmente
ultracentrífugas para las últimas.
Al centrifugar, dependiendo de la magnitud de la
fuerza centrífuga y el tiempo durante el cual se aplique
dicha fuerza se generan dos fracciones (pellet y
sobrenadante). De esta forma, los componentes de
mayor tamaño y más densos (núcleos, células intactas
y restos de tejidos) serán los primeros en decantar.
El sobrenadante postnuclear, que es obtenido de esta
primera centrifugación es nuevamente centrifugado a
una velocidad intermedia y decantarán las
mitocondrias y/o cloroplastos. El material sedimentado
se conoce como fracción mitocondrial. Si se aumenta la
fuerza de centrifugación, decantarán los microsomas
(retículo endoplásmico y Golgi). Finalmente a fuerzas
muy altas y por períodos muy largo de tiempo se logran
precipitar los componentes más pequeños como
ribosomas y grandes moléculas.
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Fracción Contenido Centrifugación (g * min)

N Núcleos y células sin romper 1000 * 10
M Mitocondrias, cloroplastos, lisosomas 10000 * 10
L Lisosomas 25000 * 10
P Microsomas, ribosomas y membranas 100000 * 30
S Proteínas solubles, RNA y otras macromoléculas

El fraccionamiento celular por centrifugación en gradiente de densidad consiste en la separación

de las partículas en función de su equilibrio en un medio relativamente viscoso, debido a la densidad de
flotación. La gradiente pueden ser autogenerada como es el caso del cloruro de cesio (CsCl) donde se
forman la gradiente durante el proceso de centrifugación, o preformados como es el caso de la sacarosa
o del Percol.
La muestra se dispone por encima o mezclada con la solución de soporte y se centrifuga. Cada
componente subcelular se desplazará hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posición en la que
su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra) y ya no se desplazará más. Como
consecuencia se producirán una serie de bandas discretas, las más próximas al fondo del tubo contendrán
las partículas con mayor densidad de flotación.
Las soluciones de Ficoll-Hypaque consisten en un medio de polisucrosa y radiopaco, la cual está
ajustada a una densidad de 1,077. Cuando la sangre se extiende sobre el Ficoll y se expone a fuerzas
centrífugas, las células mononucleares permanecen entre el plasma y la solución HISTOPAQUE, mientras
que los eritrocitos y los granulocitos gravitan hacia el fondo.

Una vez realizado el fraccionamiento subcelular de un tejido, es fundamental la determinación

del rendimiento y pureza (factor de purificación y existencia de fracciones contaminantes) de cada
fracción, mediante el uso de marcadores específicos. Se considera como marcador a una determinada
enzima o molécula localizada única y exclusivamente en un compartimento subcelular. A medida que
purificamos una fracción, la concentración del marcador debe ir aumentando con respecto al total de
moléculas presentes en la muestra, indicando que efectivamente el proceso de separación es eficiente.
Por ejemplo, toda la citocromo oxidasa se localiza en la mitocondria, por tanto es un marcador de esta
fracción. Al determinar la actividad citocromo oxidasa, esta debería estar presente sólo en la fracción
mitocondrial, y estar ausente en las fracciones microsomal o nuclear, si aparece actividad citocromo
oxidasa en estas últimas se considera que la fracción está contaminada con fracción mitocondrial.

ACTIVIDADES ENZIMATICAS USADAS COMO MARCADORES PARA ALGUNOS ORGANELOS

ORGANELO ACTIVIDAD ENZIMATICA
MITOCONDRIAS CITOCROMO C
PEROXISOMAS CATALASA
LISOSOMAS FOSFATASA ALCALINA

El objetivo principal de este laboratorio es aislar los núcleos, mitocondrias y cloroplastos desde
diferentes tejidos usando el método de fraccionamiento celular. Todas las fracciones aisladas se
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examinarán microscópicamente para identificar los organelos presentes o se determinarán marcadores

específicos para cada uno de ellos.

Actividad 1. Aislamiento de las fracciones nucleares y mitocondriales de hígado de rata

Objetivos:
-Fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial
-Obtención de preparados enriquecidos en fracciones subcelulares a partir de hígado de rata
-Identificación de las fracciones subcelulares aisladas en cada etapa de la centrifugación, mediante el
uso de tinciones

Materiales y reactivos (por grupo).

-Microscopio
-Hígado de rata
-1 mortero/ 1 homogenizador vidrio
-gasa
-1 embudo
-1 vaso pp 200 mL
-50 mL Sacarosa 0.3 M/Tris-HCl 10 mM pH 7.5
-1 tubo centrífuga 15 mL
-6 Tubos Eppendorf 2.0 mL
-3 pipetas pasteur
- 1 micropipeta 1 mL
- 1 micropipeta 200 µL
- 6 portaobjetos
- 6 cubreobjetos
- 1 mL Azul de metileno en 0.2% azul de metileno en buffer isotónico pH 8.0
- 1 mL de Verde de Janus 0.1% en NaCl 0.9%)
- hielo

Procedimiento A

1. Lavar el hígado fresco de rata (Rattus norvegicus) con solución fisiológica (NaCl 0,9%) en un vaso
de precipitado de 200 mL
2. Cortar un trozo del hígado (1 lóbulo), transferirlo a un mortero/homogenizador con la ayuda de
una espátula o pinza
3. Picarlo con una tijera en trozos pequeños (0.25 cm aprox) y posteriormente macerarlo/
homogenizarlo hasta formar una pasta
4. Resuspender en 5 mL de solución Sacarosa 0.3 M/Tris-HCl 10 mM pH 7.5 (agregando alícuotas de
1 mL tratando de arrastrar toda la muestra) hasta formar una solución homogenea y filtrar a
través de gasa sobre un tubo de centrifuga de 15 mL
5. Conservar una alícuota de 500 μL de este homogeneizado (H) en hielo
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6. Centrifugar el homogenizado a 1.000 rpm por 10 min. a 4°C.

Verificar que los tubos de centrífuga estén balanceados
7. Transferir el sobrenadante (S1) a un tubo Eppendorf de 2.0 mL.
Centrifugar a 10.000 rpm durante 30 minutos.
8. Descartar el sobrenadante restante y resuspender el pellet (P1) en
1.5 mL de solución Sacarosa 0.3M/Tris-HCl 10 mM pH 7.5.
Resuspender el pellet cuidadosamente con una pipeta para mezclar
su contenido
9. Conservar el P1 (resuspendido) en hielo, para los ensayos
posteriores
10. Una vez finalizado el paso 7, descartar el sobrenadante y
resuspender el pellet (P2) en 500 µL de Sacarosa 0.3M/Tris-HCl 10
mM pH 7.5, almacenar en hielo para los ensayos posteriores

Procedimiento B

1. Realizar tinciones del homogeneizado (H) y de las fracciones P1 y P2, para observar los
componentes celulares presentes
2. Tomar una gota (25 µL) de las distintas fracciones y ponerlas en un portaobjeto, agregar una gota
(25 µL) de cada colorante vital, mezclar con pipeta suavemente, cubrir y observar la preparación
3. Realizar un set para cada tinción (azul de metileno 2% en buffer isotónico pH 8.0, verde de Janus
0.02% en NaCl 0.9%)
4. Dibujar las estructuras observadas y discutir los resultados de cada muestra

H P1 P2

Azul metileno

Verde Janus

5. Realizar un esquema que resuma las etapas de centrifugación y el producto obtenido en cada una
de ellas. Analizar los resultados obtenidos, considerando: ¿En qué condiciones se realizó el
fraccionamiento subcelular (pH, temperatura, composición y osmolaridad del medio)? ¿por qué?
¿A que corresponden las fracciones obtenidas en H, P1 y P2? ¿Qué procedimiento sencillo seguiría
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Ud. para aumentar el grado de pureza de los precipitados obtenidos en el fraccionamiento

subcelular? ¿Qué consecuencias podría traer aumentar a 1 h la centrifugación del paso 6?
Investigue la función de las tinciones usadas.

Actividad 2. Aislamiento de la fracción de cloroplastos de espinaca y análisis por cromatografía en papel

Objetivos:
-Fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial
-Obtención de preparados enriquecidos en fracciones subcelulares a partir de espinaca
-Identificación de las fracciones subcelulares aisladas en cada etapa de la centrifugación, mediante
cromatografía en papel

Materiales y reactivos (por grupo)

-Microscopio
-Hojas de Espinaca
-1 mortero/ 1 homogenizador vidrio
-gasa
-embudo
- papel filtro Whatman N°1
-vaso pp 100 mL
-50 mL Sacarosa 0.3M/Tris-HCl 10 mM pH 7.5
- 5 mL acetona 80%
- 1 tubo centrífuga 15 mL
- 1 micropipeta 1 mL
- 1 micropipeta 200 µL
- puntas azules y amarillas
-6 Tubos Eppendorf 2.0 mL
-3 pipetas pasteur
- 6 portaobjetos
- 6 cubreobjetos
- hielo

Procedimiento A

1. Pesar 25 g de hojas de espinacas previamente desvenadas, lavadas y secadas

2. Cortar las hojas en pequeños trozos y colocarlas en un mortero frío con media cucharadita de
arena, macerar hasta formar una pasta
3. Añadir 10 mL de la solución de sacarosa 0.3M/Tris-HCl 10 mM pH 7.5 (agregando alícuotas de
1 mL tratando de arrastrar toda la muestra) hasta formar una mezcla homogénea y filtrar a
través de gasa sobre un tubo de centrífuga de 15 mL frío (mantenido en hielo)
4. Guardar una alícuota de 0.5 mL del homogeneizado (H) en un tubo Eppendorf rotulado, en
hielo
5. Centrifugar el homogenizado a 1000 rpm por 5 minutos. Verificar que los tubos de centrífuga
estén balanceados
6. Transferir el sobrenadante (S1) a un tubo Eppendorf de 2.0 mL. Centrifugar a 5.000 rpm
durante 15 minutos.
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7. Descartar el sobrenadante restante y resuspender el pellet (P1) en 0.5 mL de la solución de

sacarosa 0.3M/Tris-HCl 10 mM pH 7.5 fría. Resuspender el pellet cuidadosamente con una
pipeta para no destruir la muestra
8. Conservar el P1 (resuspendido) en hielo, para los ensayos posteriores
9. Una vez finalizado el paso 6, descartar el sobrenadante y resuspender el pellet (P2) en 500 µL
de Sacarosa 0.3M/Tris-HCl 10 mM pH 7.5, almacenar en hielo para los ensayos posteriores
10. Tomar 25 µL de las fracciones H, P1 y P2 y realizar una preparación húmeda. Use una pequeña
gota de modo que no tenga que ejercer presión sobre el cubreobjetos, dañando los
cloroplastos
11. Examinar las distintas fracciones bajo el microscopio. Indicar las estructuras que se observan
en cada una de ellas. Observar la morfología de los cloroplastos e identificar sus estructuras

H P1 P2

Procedimiento B

1. Concentrar los extractos obtenidos en la etapa anterior (H, P1 y P2), centrifugando en un tubo
Eppendorf de 1.5 mL a 5000 rpm por 10 min
2. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 µL de acetona 80%
3. Incubar a 37°C por 10 minutos para extraer los pigmentos fotosintéticos desde
los cloroplastos
4.
5. Cortar 3 tiras de papel Whatman nº1 (fase estacionaria) de 18 x 2 cm
6. Dibujar con un lápiz mina una línea a 2 cm de uno de sus extremos
7. Depositar 200 µL de muestra sobre el centro de esta línea. Esperar que se seque
y aplicar nuevamente la muestra, repetir hasta sembrar toda la muestra
8. Introducir cuidadosamente la tira de papel con la muestra en un tubo de 50 mL
que contiene 5 mL de la fase móvil (acetona:éter 1:9). La muestra no debe quedar
sumergida en la fase móvil
9. Incubar por 30 minutos. Sacar la tira de papel, secar y analizar la migración a lo
largo de la fase estacionaria
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Explique sus resultados

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Nº4: CICLO CELULAR

Las células de los distintos organismos pasan por distintos períodos, cada uno de ellos
característico y claramente diferenciado. Cada tipo celular cumple funciones específicas, para lo que
necesita energía que obtiene de la asimilación de nutrientes provenientes de su entorno, con los que
sintetiza nuevas moléculas que le permiten crecer. Al aumenta su tamaño, la eficiencia metabólica se
torna crítica, por lo que tienen que dividirse mediante la mitosis. Las nuevas células originadas en esta
división mitótica poseen una estructura y función similares a las células progenitoras, o bien derivadas de
ellas. Este proceso constituye además un mecanismo de reproducción en los organismos unicelulares.
En los organismos pluricelulares, la mitosis constituye el mecanismo de crecimiento a partir de una célula
(huevo o cigoto),
así como
también
contribuye al
aumento de la
masa tisular y
reparación de los
tejidos
lesionados o
desgastados, por
aumento del
número de
células.
La interfase es el período entre las divisiones celulares,
cuando la célula crece y realiza diversas actividades metabólicas,
que incluye las etapas G1, S y G2 antes de dividirse por mitosis (M).
Las características más relevantes de estas etapas son:

G1: Sigue a la división celular y es la más variable en duración. Las

células “hijas” presentan una gran actividad metabólica, que se ve
reflejado en un aumento acelerado del tamaño celular, la división
de mitocondrias y/o cloroplastos preexistentes, la síntesis de
organelos y otras estructuras celulares (ribosomas y microtúbulos)
y una gran síntesis de ARNm, ARNt y ARNr, además de proteínas
estructurales y enzimas. Cuando las células dejan de crecer, si se agotan los nutrientes o por inhibición
por contacto, salen del ciclo celular (G0). Esto implica que también se
sintetizan las sustancias que estimulan o inhiben distintas fases del
ciclo celular.
S: Es el período de síntesis del ADN. Persisten además altos índices de
síntesis de ARN para obtener las enzimas requeridas en la síntesis de
histonas que formarán parte de la macroestructura del ADN y las
tubulinas relacionadas con el proceso de división celular. La duración
de la fase S es variable.
G2: En esta fase, ya con el ADN duplicado, la célula ensambla las
estructuras necesarias para la separación de las células hijas durante
la división celular y la citocinesis (separación del citoplasma).
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Checkpoints del ciclo celular son puntos donde la célula examina las condiciones de cada fase para pasar a la
siguiente fase para continuar el ciclo celular.

M: La envoltura nuclear se desintegra, la cromatina se condensa hasta formar los cromosomas. Estos
cromosomas (formados por dos cromátidas) pasarán por cada una de las fases de la división celular
(mitosis o meiosis) para concluir con la formación de las células hijas. Las distintas etapas que comprende
la mitosis y sus características se detallan a continuación:

Profase: Es la etapa que inicia la mitosis, ocurre la condensación de la

cromatina en cromosomas mitóticos compactos, duplicación de los
centríolos y desintegración de la membrana nuclear. Una vez que la
membrana nuclear desaparece, los centríolos migran hacia los polos,
se desensambla el citoesqueleto y se ensambla el huso mitótico. Los
cromosomas ya formados se unen a una fibra del huso por su
centrómero (un sólo cromosoma por fibra), de manera que las
cromátidas migran hacia los polos de la célula. En la célula vegetal no
existen centríolos y a veces no se ve el huso mitótico.

Metafase: Es una fase breve que se inicia con la aparición del huso
mitótico, al cual se unen los cromosomas duplicados y se sitúan en el
ecuador de la célula, formando la placa metafásica o ecuatorial.

Anafase: El centrómero se divide y cada cromosoma se separa en sus

dos cromátidas. Los centrómeros migran a lo largo de las fibras del
huso en direcciones opuestas, arrastrando cada uno en su
desplazamiento una cromátide. La anafase constituye la fase crucial
de la mitosis, porque en ella se realiza la distribución de las dos
copias de la información genética original.

Telofase: Los cromosomas se aglomeran en los polos opuestos del huso

mitótico y se descondensan para formar nuevamente la cromatina, se
reconstruye la membrana nuclear alrededor de cada conjunto
cromosómico para definir los nuevos núcleos “hijos”. En muchas células
la mitosis suele ir acompañada de la citocinesis o separación de los
citoplasmas de las células hija.
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Citocinesis: La célula efectivamente se divide en dos células “hijas” diploide

idénticas. En las células animales ocurre por estrangulación del citoplasma
por la formación de un anillo contráctil formado principalmente por
filamentos de actina, que avanza desde la superficie celular hacia dentro. En
las células vegetales ocurre por crecimiento de la pared celular en el centro
de la célula y crece hacia fuera hasta unirse con la pared celular existente.
Una vez finalizada la mitosis y la citocinesis, las dos células hijas que se forman
entran en interfase, durante la cual se prepara para su próxima mitosis.

Actividad 1. Observación de figuras mitóticas en el tejido meristemático de raíz de cebolla y

determinación del índice mitótico en diferentes condiciones de crecimiento.

Objetivos:
-Reconocer las figuras mitóticas en células teñidas con Orceína.
-Evaluar el índice mitótico (IM) y el índice de fases (IF).
-Evaluar los efectos de la cafeína u otros componentes de la coca-cola sobre la mitosis.

Materiales y reactivos (por grupo)

-Agua corriente
-Coca-cola normal y zero
-3 cebollas
-3 vasos de precipitado
-Tijeras
-Vidrio de reloj
-Mechero
-Portaobjetos
-Cubreobjetos
-Microscopio óptico
-Orceína B: Diluir la solución madre 1:2 con ácido acético 45%
-Orceína A: Agregar 0.1 volumenes de HCl 1N a la solución de Orceína B.
Preparación de la solución madre de Orceína: 1. Calentar 110 mL de ácido acético glaciar en un vaso de
precipitados de 250 mL. 2. Al momento de la ebullición agregar 4 g de orceína. 3. Mantener en ebullición
suave por 10 minutos. 4. Dejar enfriar hasta temperatura ambiente. 5. Añadir agua hasta 200 mL y filtrar.

Procedimiento:

1. Poner 3 bulbos de cebolla (Allium cepa) en un vaso de precipitado con

un volumen de agua corriente que cubra la parte inferior del bulbo, sin
que la cebolla caiga dentro del recipiente, dejando crecer la raíces por
4-5 días. Si es necesario, inserte unos mondadientes en los lados de
la cebolla para que se mantenga suspendida y en contacto con el agua.
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2. Transcurrido este tiempo, se habrán formado numerosas raicillas. Reemplazar el agua por coca-cola
normal y zero, y dejar crecer las raíces por 3-4 días más.
3. Cortar el extremo de 2 raicillas de cada una de las condiciones de crecimiento, procurando que su
longitud sea de unos 5 mm, ya que es en esta zona de la raíz donde se encuentran las células en
división. Es conviene realizar la actividad cuando las raicillas se encuentran aún en activa proliferación
y no han crecido demasiado.
4. Enjuagar los trozos de raíz con agua destilada.
5. Colocar las raíces en un vidrio de reloj y adicionar 100 µL de Orceína B calentando por unos 20-30 seg,
hasta que se produzcan vapores (no permita que hierva ni que se seque).
6. Transferir el tejido al portaobjeto y adicionar un par de gotas de Orceína A.
7. Cubrir con el cubreobjeto.
8. Envolver la preparación con un trozo de papel absorbente y presionar fuerte pero cuidadosamente
con la punta del dedo índice, realizando un pequeño giro, para realizar el "extendido por
aplastamiento" o "squach”. Recuerde que mientras más aplastado, las células se separarán más
unas de las otras y se encontrarán en el mismo plano, distinguiéndose mejor las distintas etapas de
la mitosis.
9. Sellar la preparación con esmalte de uñas transparente. Dejar secar por unos 2 minutos.
10. Observar al microscopio las diferentes etapas de la mitosis (profase, metafase, anafase, telofase y a
citocinesis). Usar el objetivo de inmersión si es necesario.
11. Realiza un conteo de campo. Contar 100 células por campo, establecer el estado mitótico en el que
se encuentran y determinar el índice mitótico.

IM: N° núcleos en mitosis X 100 IF: N° célula en fase X 100

N° total núcleos N° total células mitosis

CLAVE PARA IDENTIFICAR LOS ESTADIOS DEL CICLO CELULAR

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Nº5: MEIOSIS Y FECUNDACION

Una ventaja clave de la reproducción sexual es la oportunidad de crear nuevas combinaciones de

genes en cada generación, producto de la recombinación genética. La recombinación genética es el
resultado del intercambio físico de uno o varios segmentos de
ADN entre cromosomas homólogos, proceso que se denomina
entrecruzamiento o “crossing-over”. Aún si la única
redistribución de genes en este proceso proviene de las
combinaciones al azar de los cromosomas paternos en el
núcleo de cualquier gameto, la reproducción sexual daría pie a
una variabilidad genotípica inmensamente aumentada: dos
elecciones para cada uno de “n” cromosomas genera 2n
diferentes combinaciones cromosómicas. Además, existe la
posibilidad de la recombinación de los genes de un solo
cromosoma (genes ligados).
La división meiótica se inicia después de la replicación del ADN en la interfase, de modo que cada
cromosoma replicado está formado por dos cromátidas, y cada cromátida corresponde a una molécula
de ADN. Durante la primera división meiótica, los cromosomas homólogos se aparean y posteriormente
se separan, de ahí que las células resultantes contienen un solo cromosoma replicado (haploide). En la
segunda división meiótica, las cromátidas hermanas de cada cromosoma replicado se separan para
incorporarse a las células hijas con una cromátida no replicada de cada cromosoma. La primera división
produce núcleos cuyo número cromosómico es la mitad del meiocito, y en la segunda división se retiene
este número haploide, pero se reduce el contenido de ADN al nivel haploide en cada
núcleo hijo. Estas células hijas se pueden dividir mitóticamente como esporas o dar lugar a estructuras
somáticas, si no ocurre división posterior se diferenciaran a gametos, los que se fusionan con gametos
complementarios en el caso que ocurra fecundación, en este caso se restablece el número cromosómico
diploide. La primera división meiótica no es igual a la mitosis y puede durar un largo periodo. Es precedida
por una Interfase en la que pueden participar pocos replicones activos. Entonces los cromosomas entran
en la Profase I, en la que se reconocen varias subetapas:

a) Leptoteno: Los cromosomas aparecen como largos filamentos, en la cual la cromatina está dispersa
como una maraña de hilos con cuentas.
b) Zigoteno: Los cromosomas homólogos se aparean en toda su longitud formando la sinapsis,
estabilizada en un complejo sinaptonémico.
c) Paquiteno: Se observan los complejos bivalentes íntimamente unidos, pudiendo ocurrir el
entrecruzamiento y la recombinación genética.
d) Diploteno: Los complejos bivalentes se separan excepto en los puntos donde se produjo el
entrecruzamiento, que recibe el nombre de quiasmas.
e) Diacinesis, se alcanza el estado más condensado de los cromosomas, la membrana nuclear se rompe,
los cromosomas homólogos unidos por quiasmas de sus cromatídas no hermanas se adhieren a las fibras
del huso y los nucléolos se dispersan.
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En la Prometafase I los cromosomas se desplazan y alinean sobre el huso para comenzar la

Metafase I. A diferencia de lo que ocurre en la mitosis, en la Metafase meiótica I los extremos
de los cromosomas están en el ecuador y los centrómeros homólogos están separados. En cada díada (par
de cromatidas), las cromátidas hermanas permanecen estrechamente asociadas al centrómero. Los
homólogos replicados (díadas), se separan en la Anafase I, y los núcleos nuevos tienen un grado variable
de reorganización en la Telofase I. La citocinesis puede ocurrir ahora, o bien puede seguir la meiosis II.

La segunda división meiótica es semejante a una división mitótica. Las díadas en ambos núcleos
se alinean en ambos husos en la metafase II, los dos centrómeros de cada díada se desacoplan en la
anafase II, y las cromátidas hermanas de cada par son atraídas a los polos opuestos de sus husos
respectivos. Durante la telofase II, los cromosomas se desdoblan, surge una membrana nuclear alrededor
de cada uno de los cuatros productos, y se presenta la citocinesis.

Los ciclos reproductivos sexuales de los organismos incluyen dos fases alternantes en las cuales
el número de cromosomas en una fase es el doble del que corresponde a la otra fase.
Típicamente, un ciclo vital consta de una fase Diploide y una fase Haploide. La primera fase se inicia con
la fusión de los gametos haploides; la segunda fase comienza, con la meiosis de un meiocito diploide, pero
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cada uno de estos eventos puede estar separado por extensos períodos extendidos de división celular
mitótica y diferenciación. En los animales, los productos de la meiosis son los gametos mismos, que se
fusionan para restaurar la fase diplode predominante. En algunas formas inferiores, la meiosis del cigoto
sigue inmediatamente a la fusión de los gametos, y la mayor parte del ciclo de vida está representada por
la fase haploide. En las plantas vasculares más evolucionadas las estructuras haploides (gametófitos) están
contenidas y protegidas dentro del esporofito diploide que es predominante en el ciclo de vida. Sólo los
meiocitos son capaces de realizar la meiosis, y estas células únicas están presentes en las gónadas, órgano
que producen y albergan los gametos o los sistemas generadores de éstos. En la meiosis, cada meiocito
diploide se divide dos veces en sucesión para generar cuatro células de las cuales una o todas pueden ser
funcionales.

En los organismos con reproducción sexual el óvulo es fecundado por el espermatozoide

formándose el cigoto, a partir del cual se originará el nuevo individuo. La contribución de los gametos
masculino y femenino al cigoto es muy diferente; el óvulo aporta tanto su conjunto haploide de
cromosomas como un rico citoplasma que posee los requerimientos necesarios para que, al menos, se
inicie el desarrollo. El espermatozoide, sin embargo, aporta principalmente su núcleo y escasos
componentes citoplasmáticos (centríolos). El proceso de fecundación comprende una serie de sucesos
que en la mayor parte de los organismos puede resumirse en:
1. Activación del espermatozoide (capacitación), que ocurre en respuesta a las secreciones del oviducto
(fecundación interna) o al contacto con el medio acuoso (fecundación externa).
2. Reacción acrosómica que permite que el espermatozoide se abra paso a través de las distintas cubiertas
que posee el óvulo hasta la membrana plasmática.
3. Fusión de las membranas plasmáticas del espermatozoide y del óvulo.
4. Bloqueo de la poliespermia para evitar que un mismo óvulo sea fecundado por más de un
espermatozoide.
5. Continuación de la meiosis en caso de que el óvulo expulsado del ovario se encuentre detenido en
alguna de las fases del proceso meiótico (en humanos se encuentra en metafase II, mientras que en
equinodermos ya ha finalizado la meiosis).
6. Fusión de los pronúcleos, formándose un núcleo diploide de fecundación, o bien los cromosomas
maternos y paternos se ordenan directamente sobre la placa ecuatorial en la primera división de
segmentación.
7. Activación metabólica del huevo y comienzo del desarrollo.

Fecundación en equinodermos.

Los equinodermos (erizo de mar) se usan

habitualmente en estudios de biología del desarrollo
ya que sus gametos se obtienen en grandes cantidades,
pueden ser inseminados fácilmente in vitro (en medio
acuoso donde la fecundación ocurre de forma natural)
y también son sencillos de mantener en el laboratorio.
Además, la fecundación en equinodermos y en
mamíferos tiene muchos puntos en común.
Todas las especies de erizos de mar son diocas,
es decir, hay individuos masculinos y femeninos. El
cuerpo de un erizo de mar se divide en dos partes: una
“oral”, que posee la boca y está dirigida hacia el sustrato, y una parte “aboral” que contiene la región
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anal. Las gónadas (lugar donde se forman y almacenan los gametos) están dispuestas en la cara interna
del caparazón, bajo las placas interambucrales, existiendo por tanto cinco gónadas. A través del gonoporo,
situado en las placas genitales aborales, se expulsan los gametos, produciéndose la fecundación en el
agua.
Luego de la fecundación, la fusión de ambos gametos forma una célula única denominada zigoto,
con lo que se recupera el número inicial de cromosomas del individuo. Esto gatilla el inicio de la
segmentación, proceso por el cual, a partir de una célula única, se suceden una serie de divisiones
mitóticas hasta llegar al estado de blástula. La segmentación se inicia con la división del núcleo, quedando
la célula huevo dividida en dos células hijas denominadas blastómeros, cada una de la cuales se divide
para en total 4 células y de esta manera el aumento de blastómeros crece en forma geométrica. En esta
etapa los blastómeros permanecen unidos dando al cigoto el aspecto de una mora (Estado de
Mórula). Tras cada división los blastómeros son más pequeños. La Blástula, el último estado de
segmentación, en el cual podemos encontrar 64 blastómeros formando una capa externa de células
compactas entre sí (blastodermo) y con una gran cavidad interna (blastocele) convirtiendo al embrión en
una especie de esfera hueca. La siguiente fase es la Gastrulación, en la cual el blastodermo da origen a las
capas germinales, el estado resultante se llama gástrula. Posteriormente la gástrula pasa a formar la larva,
en este caso denominada “larva pluteus”. Esta posee boca, ano y tubo digestivo, su forma es cónica y
caracterizada por la presencia de 4 brazos o espinas.

Existen diversas técnicas a través de las cuales se pueden obtener los gametos en un organismo
vivo. Consisten básicamente en estímulos que se aplican al animal en todo el cuerpo o en sectores
localizados con el fin de alterar sus gónadas e inducir la liberación de los gametos. Existen tres métodos
empleados: Estímulo Químico, Estímulo Físico y Estímulo Eléctrico. El estímulo químico consiste en la
aplicación de un compuesto químico o reactivo en el individuo, el cual actúa directamente sobre las
gónadas induciendo la salida de los gametos. El estímulo físico de basa en la aplicación de un agente físico
sobre el individuo como "shocks" térmicos, salinos o estimulación por masajes, como en el caso de los
peces. El estímulo eléctrico consiste en aplicar pequeños golpes de electricidad de bajo voltaje, lo que
cambia la polaridad de las membranas de las gónadas, permitiendo con ello la salida de los gametos.

Actividad 1. Análisis de las etapas de la meiosis.

Actividad 2. Estudio de la fecundación y primeras etapas del desarrollo embrionario en erizo de mar.

Objetivos.

1. Obtención e identificación de los gametos, óvulo y espermatozoide, de erizo.

2. Análisis de la fecundación y segmentación en el desarrollo embrionario de erizo.
Procedimiento.

A) Obtención de los gametos.

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1. Inyectar a través de la membrana oral (peristoma, zona oral) 1 mL de 0,5 M de KCl en agua de mar
2. Colocar el espécimen sobre un recipiente de vidrio que contiene unos mL de agua salina sobre la cara
aboral, lado puesto a la zona oral
3. Observar la aparición de un líquido espeso en la cara aboral, donde se localizan los gonoporos. Si el
líquido es blanquecino se trata de esperma, mientras que si es rojizo corresponde a óvulos (no existe
forma alguna de distinguir los sexos por caracteres externos)
4. Observar al microscopio el aspecto y movimiento de los óvulos y espermatozoides recién eyaculados y
después de diluir con agua (1:10). Los espermatozoides sólo adquieren movilidad después de contactar
con el agua salina. IMPORTANTE: NO UTILIZAR EL MISMO MATERIAL DE VIDRIO NI PLÁSTICO PARA
ÓVULOS Y ESPERMATOZOIDES

Extracción de gametos del erizo. A.- Espécimen sobre la placa

de Petri. B.- Inyección de solución salina a través de la
membrana oral. C.- A los pocos minutos comienza a observarse
la expulsión de gametos. D.- El volumen de la extracción es
considerable. El color blanquecino nos indica que en este caso
se trata de un macho.

B) Fecundación.
1. Colocar sobre un portaobjeto una gota de agua con ovocitos (1 gota de suspensión + 5 mL de agua)
2. Observar en el microscopio con cuidado de que el objetivo no entre en contacto con el agua salina
3. Añadir una gota de esperma (1 gota de semen “seco” + 10 mL de agua)
4. Observar el movimiento de los espermatozoides en dirección a los óvulos
5. Observar la membrana de fecundación que se forma alrededor de los óvulos fecundados (menos de 5
min)
6. Observar en el microscopio los principales cambios morfológicos que suceden después de la
fecundación y que llevan a la formación de la larva Pluteus.
7. Analice y discuta las fases del desarrollo embrionario del erizo de mar observadas en el práctico.

Desarrollo temprano del erizo de mar. A.- Cigoto. Obsérvese la membrana de

fecundación. B.- Embrión de dos células. C.- Embrión de cuatro células. D.- Embrión
de dieciséis células.
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Tiempo Estructura
(h)
5 min Membrana de fecundación
1 División de segmentación
2.5 Embrión de 16 células
6-12 Blástula
24 Gástrula
48 Larva Pluteus