Introducción a la toma de muestras

El Proceso Analítico General en un ejemplo: contenido de cafeína en una tableta de

chocolate

El chocolate ha sido la salvación de muchos estudiantes durante las largas noches que
preceden a los exámenes. Una buena tableta de chocolate, preparada con un 33% de grasa y
un 47% de azúcar, nos puede además suministrar energía para practicar deportes. Por otro
lado, además de su alto contenido energético, el chocolate aporta el estimulante cafeína y su
precursor bioquímico la teobromina.

TEOBROMINA: Un diurético, relajante de la musculatura lisa, CAFEÍNA: Un estimulante del sistema nervioso

Demasiada cafeína es perjudicial para muchos y algunos ni siquiera la toleran en pequeñas

cantidades. ¿Cuánta cafeína hay en una tableta de chocolate? ¿Contiene el chocolate más o
menos cafeína que el café o las bebidas refrescantes?. Es necesario ser capaces de resolver
problemas químicos como el planteado, que nos sirva de base para abordar otros problemas
que se nos presenten en nuestra práctica diaria en el laboratorio. Por tanto procuraremos dar
respuesta química a la pregunta: ¿Cómo se determina el contenido en cafeína de una tableta
de chocolate?

Planteamiento general del problema

Para resolver un problema como el que se ha planteado sobre la cafeína, se empieza
consultando en la biblioteca los métodos para analizar cafeína en chocolate.
Mediante una búsqueda por ordenador, a través del Chemical Abstracts, y usando "cafeína" y
"chocolate" como palabras clave, se pueden descubrir numerosos artículos en revistas de
química. Uno de ellos, titulado "Determinación de teobromina y cafeína en productos del cacao
y chocolate por cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC)", describe un proceso
analítico que parece particularmente apropiado para el equipamiento disponible en un
laboratorio.

Preparación de la muestra
El primer paso del procedimiento consiste en pesar una cantidad de chocolate y eliminar la
grasa extrayéndola en un disolvente hidrocarbonado. Es preciso eliminar la grasa porque
interfiere en un paso ulterior del análisis (la cromatografía).
Desgraciadamente, si se agita un trozo de chocolate con un disolvente, la extracción no es muy
efectiva porque el disolvente no penetra en el interior del chocolate. Por eso, lo razonable es
trocear el chocolate en pequeños trozos y colocarlos en un mortero provisto de maza (Figura
1) para triturar el sólido en pequeños fragmentos.

Figura 1. Mortero de cerámica y maza utilizados para pulverizar sólidos

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Ahora bien, este sólido es demasiado blando y pastoso para que pueda ser triturado. Una
alternativa es introducir el mortero y su maza junto con los trozos de chocolate en un
congelador. Una vez congelado, el chocolate se vuelve quebradizo y puede triturarse en el
mortero frío. A continuación se colocan las partículas de chocolate en un tubo de centrífuga,
previamente tarado, de 15 mililitros (ml) y se pesa.

La Figura 2 describe la sucesión de pasos del procedimiento experimental. Se añade al tubo

una porción de 10 ml de disolvente orgánico (éter de petróleo), y se cierra el tubo con un tapón.
Se agita el tubo vigorosamente para disolver la grasa de chocolate. La cafeína y teobromina
son insolubles en este disolvente. Al hacer girar la suspensión en la centrífuga las pequeñas
partículas de chocolate se depositan en el fondo del tubo. El líquido clarificado que contiene la
grasa disuelta puede decantarse (verterse) y desecharse. La extracción con nuevas porciones
de disolvente se repite dos veces más para asegurar la eliminación completa de la grasa en el
chocolate. El disolvente residual en el chocolate se elimina finalmente calentando el tubo de
centrífuga en un vaso con agua hirviendo. Pesando el tubo de centrífuga más su contenido del
residuo de chocolate desengrasado, se puede calcular la masa del residuo de chocolate por
diferencia con la masa conocida del tubo vacío.

Figura 2. Extracción de la grasa del chocolate para obtener un residuo sólido

desengrasado para el análisis posterior

Las sustancias que se determinan —cafeína y teobromina en este caso— se denominan

analitos. El siguiente paso en el procedimiento de preparación de la muestra es la
transferencia cuantitativa (completa) del chocolate desengrasado a un matraz erlenmeyer, y
disolver los analitos en agua para proceder al análisis químico. Si no se transfiriese todo el
residuo del tubo al matraz, el análisis final sería erróneo porque no estaría presente todo el
analito. Para lograr una transferencia cuantitativa se añaden unos pocos mililitros de agua pura
al tubo de centrífuga y se agita, y se calienta para disolver o suspender todo el chocolate
posible. La suspensión del sólido en el líquido se pasa del tubo a un matraz de 50 ml. Este
procedimiento se repite varias veces, con nuevas porciones de agua pura, para asegurar que
hasta la última partícula de chocolate pase del tubo de centrífuga al matraz.

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Para completar la disolución en agua de los analitos presentes en el residuo de chocolate, se

añade agua hasta un volumen de aproximadamente 30 ml. El matraz y su contenido se
calientan en un baño de agua hirviendo para extraer toda la cafeína y teobromina del
chocolate. Para calcular después la cantidad de analito es preciso conocer exactamente la
masa total de disolvente (agua). Para ello, puesto que se conoce la masa del residuo de
chocolate que había en el tubo de centrífuga, basta haber medido previamente la masa del
matraz erlenmeyer vacío y añadir el agua al matraz una vez frío gota a gota hasta una masa
exactamente medida (p. ej. 33,3 g). Más tarde, se compara la disolución desconocida así
preparada con disoluciones de concentración conocida de analito.

Antes de inyectar la disolución desconocida en un cromatógrafo para hacer el análisis químico,

se tiene que purificar aún más la muestra (Figura 3). La suspensión de chocolate en agua
contiene pequeñas partículas sólidas que obturarían la columna cromatográfica, que tiene un
coste elevado, y la estropearían. Por tanto, se pasa una porción de la suspensión a un tubo de
centrífuga, y se centrifuga la mezcla para depositar en el fondo del tubo la mayor parte del
sólido. El líquido sobrenadante (el líquido sobre el sólido depositado), que aún es turbio y
oscuro, se filtra a través de una membrana de tamaño de poro 0,45 micrómetros (0,45 10-6
metros, μm) con objeto de eliminar las partículas más diminutas del sólido.

Es muy importante evitar que se inyecten sólidos en la columna de cromatografía. Por ello, si el
líquido queda aún turbio, es preciso repetir la centrifugación y filtración varias veces más. En
cada ciclo el líquido sobrenadante se filtra y centrifuga, haciéndose cada vez un poco más
claro. Pero puede darse el caso de que nunca acabe de quedar completamente claro, y que al
dejarlo en reposo, vuelva a formarse algo de precipitado en la disolución filtrada. En ocasiones
habrá que ser realista y, dado el tiempo disponible, emprender el análisis.

Figura 3. Centrifugación y filtración para separar un residuo sólido interferente

de la disolución acuosa de los analitos

El procedimiento tedioso descrito hasta ahora se llama preparación de muestra, es decir, la

transformación de la muestra en un estado adecuado para el análisis. En este caso, se tiene

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que eliminar la grasa del chocolate, extraer en agua los analitos y separar los sólidos de la
suspensión acuosa.

Análisis Químico
El primer paso del análisis químico es inyectar la disolución en la columna del cromatógrafo,
para separar los componentes de la mezcla y medir la cantidad de cada analito. La columna de
la Figura 4a está rellena con finas partículas de sílice (SiO2), cuya superficie está cubierta con
moléculas de hidrocarburos unidas por enlaces covalentes. Se inyectan unos 20 microlitros de
la disolución del extracto de chocolate en la columna, y se eluye a una velocidad de 1,0 ml por
minuto con una disolución preparada mezclando 79 ml de agua, 20 ml de metanol y 1 ml de
ácido acético. En el hidrocarburo de la superficie de la sílice, es más soluble la cafeína que la
teobromina, por consiguiente la cafeína "se adhiere" a las partículas de la sílice con más fuerza
de lo que lo hace la teobromina. Dado que los dos analitos son arrastrados a través de la
columna por el flujo del disolvente, la teobromina sale antes que la cafeína, porque aquélla no
se une tan fuertemente como la cafeína a las partículas de sílice recubiertas (Figura 4b).

Figura 4. Fundamento de la cromatografía líquida (a) Cromatografía con un

detector ultravioleta (UV) para detectar los analitos a la salida de la columna. (b)
Separación de la cafeína y teobromina por cromatografía. La cafeína es más
soluble que la teobromina en la capa de hidrocarburos depositada sobre las
partículas de la columna. Por tanto la cafeína se retiene más fuertemente y pasa a
través de la columna más lentamente que la teobromina.

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Los analitos se detectan a la salida de la columna por su capacidad de absorber radiación UV.
A medida que cada compuesto sale de la columna, absorbe la radiación emitida por la lámpara
de la figura 4a, disminuyendo así la radiación que llega al detector. La gráfica de la respuesta
del detector frente al tiempo se denomina cromatograma (Figura 5). Los picos mayores del
cromatograma son de teobromina y de cafeína; los picos pequeños corresponden a otros
componentes del extracto acuoso del chocolate.
El cromatograma solo nos informa sobre los compuestos que hay en la muestra. Si no
conociéramos de antemano lo que esperamos, necesitaríamos un gran esfuerzo para
identificar los picos del cromatograma. Una manera de identificar cada uno de los picos es
medir las características espectrales a medida que emergen de la columna. Otra manera es
añadir cantidad conocida de cafeína o teobromina a la muestra desconocida y ver si alguno de
los picos aumenta de tamaño.

Figura 5. Cromatograma de 20 microlitros de un extracto de chocolate negro.

La columna de 4,6 mm de diámetro por 150 mm de longitud, y rellena con
partículas de ODS de 5 micras, se eluye (se lava) con una mezcla
agua:metanol:ácido acético (79:20:1 en volumen) a una velocidad de 1 ml/min.

La identificación de una muestra desconocida se llama análisis cualitativo. Y la determinación

de cuánto hay presente, análisis cuantitativo. La mayor parte de los análisis corresponden al
análisis cuantitativo.

En la Figura 5, el área debajo de un pico es proporcional a la cantidad del componente que

pasa por el detector. La mejor manera de medir el área (integración) es con un ordenador que
recibe la salida del detector durante el proceso cromatográfico. Cuando no se dispone de
ordenador en el cromatógrafo, en su lugar se puede medir la altura de cada pico.

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Curvas de calibrado
En cromatografía, dos analitos de igual concentración suele dar diferentes respuestas del
detector. Por consiguiente, la respuesta del detector debe medirse frente a concentraciones
conocidas de cada analito. La gráfica que representa la respuesta del detector en función de la
concentración del analito se llama curva de calibrado o curva estándar. Para construir una
curva de calibrado se preparan disoluciones estándar, de concentraciones conocidas de
teobromina o cafeína puras, se inyectan en la columna, y se miden las alturas de los picos que
resultan. La Figura 6 es un cromatograma de una de las disoluciones estándar, y la Figura 7
muestra las curvas de calibrado cuando se inyectan disoluciones que contienen 10,0, 25,0,
50,0 ó 100,0 microgramos de cada analito por g de disolución.

Figura 6. Cromatograma de 20 microlitros de una disolución estándar que

contiene 50 microgramos de teobromina y 50 microgramos de cafeína por gramo
de disolución

Figura 7. Curvas de calibrado, en las que se representa las alturas de pico

observadas frente a las concentraciones de los compuestos puros. Una parte por
millón (ppm) es un microgramo de analito por gramo de disolución. Las
ecuaciones de las rectas trazadas con los datos experimentales se determinan por el
método de mínimos cuadrados.

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Las rectas trazadas a través de los puntos experimentales del calibrado pueden usarse luego
para hallar las concentraciones de teobromina y cafeína en una muestra desconocida. Por
ejemplo, la Figura 7 muestra que si la altura del pico observado de teobromina en una
disolución desconocida es 15,0 cm, la concentración de la disolución es 36,9 microgramos por
gramo (ppm).

Interpretación de los resultados

Una vez conocido el contenido de analito en el extracto acuoso del chocolate se puede calcular
la cantidad de teobromina y cafeína que hay en el chocolate de partida.
Tabla 2tenido de cafeína en bebidas y alimentos

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