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Profesora: E.

Lucia Gutirrez DETERMINACION DE CAFEINA

AOAC Methods 962.13 1990 Mtodo: espectrofotomtrico u.v NORMATIVIDAD: RESOLUCION 4150 de 2009 Por la cual se establece el reglamento tcnico sobre los requisitos que deben cumplir las bebidas energizantes para consumo humano. MAX CAFEINA=32mg/100g NTC 3880, Caf. Determinacin del contenido de Cafena. Mtodo por cromatografa lquida de alta resolucin HPLC

TEORIA

La cafena es un alcaloide, sustancia estimulante del sistema nervioso central; Qumicamente es una purina sustituida. Su frmula es C8H10O2N4 de peso molecular 194.2 es soluble en cloroformo y agua caliente, poco soluble en alcohol, acetona benceno y ter Se permite la presencia de cafena en bebidas de cola hasta en una proporcin de 0.2
La separacin de la cafena se basa en su distinta solubilidad respecto a otros componentes del caf. Los polmeros son insolubles en agua al igual que los triglicridos. En cambio, la cafena, los taninos y la glucosa son muy solubles en agua. El primer paso ser la filtracin del extracto caliente del caf. Los taninos y el cido clorognico se eliminan formando sus sales de plomo, insolubles en agua y separables por filtracin. La glucosa se separa de la cafena extrayendo sta en cloroformo, disolvente en el que la glucosa no es soluble. Aunque la cafena es soluble en agua, es mucho ms soluble en cloroformo y por eso puede ser extrada con este disolvente orgnico, mientras las sales de sodio del cido glico y los taninos permanecen en la fase acuosa. As, la extraccin con cloroformo de la solucin bsica separa la cafena casi pura.

El sulfato de sodio anhidro acta eliminando toda el agua y las sales solubles en agua que se mantienen en el disolvente orgnico (capa orgnica) o accidentalmente transferido en la decantacin. La extraccin lquido-lquido con ayuda del embudo no puede ser demasiado vigorosa, para evitar la formacin de emulsiones que retardan drsticamente la definicin de las dos fases. Una emulsin es una dispersin de gotas muy finas de un lquido en otro inmiscible, y en los procesos de extraccin puede causar tropiezos. Si la emulsin llegara a formarse, es aconsejable adicionar un compuesto inico como cloruro de sodio (NaCl) o sulfato de potasio (K2SO4) a la fase acuosa; los componentes inicos disminuyen la tensin en la superficie de las gotas de agua, e incrementan drsticamente la incompatibilidad entre el agua y los solventes orgnicos, facilitando la rpida y clara distincin de las dos capas.

La cafena tambin se encuentra en bebidas refrescantes como el RedBull de la que tambin es posible llevas a cabo su extraccin puesto que el resto de componentes son solubles en agua. La cafena en estos refrescos se encuentra en una proporcin de unos 0.1 mg/mL, unas seis veces menor que en el caf.

DESCRIPCIN DEL MTODO


Principio del mtodo. La cafena es extrada de la muestra con cloroformo y determinada espectromtricamente a una longitud de onda de 276 nm.

Desgasificar la muestra trasegndola repetidas veces Tomar 5 ml de muestra y llevar a un embudo de separacin Adicionar 2.5 ml de solucin de KMnO4 al 1.5 % y mezclar Dejar en reposo durante 5 minutos exactamente Adicionar 5 ml de solucin reductora y mezclar 2Adicionar 0.5 ml de solucin diluida de cido fosfrico y mezclar Adicionar 0.5 ml de solucin NaOH y mezclar Extraer con 20 ml de CHCl3 agitar por un minuto Esperar a que se separen las fases Pasar la capa de CHCl3 por papel filtro y recibir en un baln volumtrico de 50 ml Lavar con 2- 3 ml de CHCl3 el bastago del embudo de separacin Pasar el CHCl3 por el mismo papel de filtro Hacer una nueva extraccin con 20 ml de CHCl3 y adicionar el CHCl3 al baln de 50 ml pasndolo antes por el papel de filtro

Completar el volumen de 50 ml con CHCl3 y determinar la absorbancia mxima a 276.5 nm. (LA CAFEINA A ESTA LONGITUD DE ONDA PRESENTA UN MAXIMO DE ABSORCION Emplear como blanco CHCl3
4 Clculos De la ecuacin de la recta obtenida. y = mx + b Donde: y = Absorbancia obtenida en la muestra ya procesada. m = Pendiente (coeficiente de absortividad). x = mg cafena/100 mL en la muestra. b = Ordenada al origen. Despejar x y obtener directamente los mg de cafena/100 mL de bebida. mg cafena/100 mL = mg de cafena/100 mL obtenidos de la curva X 100 X F.D. 10 donde: F.D. = Factor de dilucin. 1.5 Expresin de resultados.

PREPARACION DE LA CURVA ESTANDAR

Solucin estndar de cafena: Pesar 50 mg de cafena pura, llevar a un baln de 200 ml y Ajustar el volumen con cloroformo. Esta solucin contiene 0.25 mg de cafena por ml

CURVA ESTANDAR En balones de 50 ml enumerados de 1 a 5 adicionar desde una bureta 0.5 1, 2, 3, 4 ml de solucin estndar de cafena respectivamente. Completar en cada uno de ellos el volumen con CHCl3

Balones de 50 ml

ml de solucin estndar mg de cafena / 50 ml

0.5 0.125

1 0.25

2 0.5

3 0.75

4 1.0

Determinar la absorbancia mxima de cada una de las soluciones a 276.5 nm empleando como blanco CHCl3 y Graficar absorbancia contra concentracin en cada caso PREPARACIN DE

REACTIVOShttp://cdigital.dgb.uanl.mx/la/1020111504/1020111504.PD F Solucin reductora Preparar 5 g de Na2SO3 5.0g de KSCN en agua y diluir a 100 ml

Solucin diluida de cido fosfrico Diluir 15 ml de H3PO4 a 85 ml con agua destilada

Solucin de hidrxido de sodio disolver 25 g de NaOH en 75 ml de agua destilada.

Sulfito de sodio anhidro (Na2SO3) Tiocianato de potasio (KSCN). Acido fosfrico (H3PO4). Hidrxido de sodio (NaOH). Cloroformo (CHCl3). Cafena (C8H10N4O2) Permanganato de potasio (KMnO4).

SEPARACION CAFEINA La separacin de la cafena se basa en la distinta solubilidad de los componentes del caf. Los polmeros como las protenas y la celulosa, son insolubles en agua. Las grasas que son steres de la glicerina y de tres cidos gaseosos, tambin son insolubles en agua. En cambio la cafena, los taninos, la glucosa y el cido clrogeni_ eos,son' bastantes solubles en agu? caliente.Por lo tanto la primera operacina realizar ser la filtracin del extracto del caf.

mr Tanto los taninos como el cido clorognico son cidos, adi cionamos una solucin de acetato de plomo, y dichas sustancias preci pitarn en forma de sales de plomo y se podrn separar de la solu cin acuosa por filtracin.