Comunicación a distancia

Curso básico de bacteriología clínica

Clase 1

GENERALIDADES DE BACTERIOLOGÍA

-INTRODUCCIÓN

El estudio de los microorganismos comprende el conocimiento de su forma,

estructura, reproducción, fisiología, metabolismo e identificación.
Los microorganismos están presentes en todas partes a nuestro alrededor y, a
pesar de sus aspectos más negativos, son absolutamente necesarios para el desarrollo de
la vida en el planeta.
Con el paso del tiempo, han evolucionado para adaptarse prácticamente a
cualquier ambiente.
Por sus propias características, sus ciclos vitales son cortos y rápidos.

-BACTERIA

Las bacterias pertenecen al reino PROCARYOTAE.

Son organismos unicelulares, microscópicos, sin núcleo definido ni clorofila.
La mayoría son de vida libre, a excepción de algunos que son de vida
intracelular obligada.(Chlamydias).
Tienen mecanismos productores de energía y material genético necesario para
su desarrollo y crecimiento.
El grupo de microorganismos procariotas se divide en : ARQUEOBACTERIAS,
que viven en condiciones extremas; y las EUBACTERIAS, entre las que se encuentran las
bacterias de interés médico, ya que viven en aguas, suelo y organismos vivos.
Su tamaño oscila entre 0.5 a 3 micrones. Son visibles a través de microscopio
óptico y electrónico.
 Es la forma de vida más simple y abundante en la naturaleza.
Están presentes en los ciclos naturales del Nitrógeno, Carbono, Fósforo, etc.
Son también aprovechados por la industria en los procesos de fermentación y
para la producción de antibióticos.

-ESTRUCTURA

.La célula bacteriana presenta 3 características principales:

- No tiene núcleo que contenga el ADN, sino que este se encuentra libre
en el citoplasma.
- El citoplasma contiene además moléculas de ARN en los ribosomas, que
sintetizan proteínas que luego tendrán diferentes funciones.
- No poseen compartimientos intracelulares delimitados por membranas.

COMPONENTES:

MEMBRANA PLASMÁTICA:
- Es una estructura vital para la bacteria.
- Tiene un espesor de 8 nm.
- Está formada por fosfolípidos y proteínas.
- Tiene permeabilidad selectiva y permite el ingreso de los nutrientes y la
salida de los desechos por transporte activo y pasivo.
- Sintetiza los componentes de la cápsula y de la pared celular.
- Es el lugar de acción de detergentes y ATB polipeptídicos (polimixina).

PARED CELULAR:
- Está ubicada por fuera de la membrana plasmática.
- Es una estructura compleja y fundamental para la bacteria.
- Está formada por peptidoglicanos.
- Su espesor varía de 1 a 2 moléculas a 50-100 moléculas.
- Le otorga rigidez a la bacteria y la protege de los cambios de presión
osmótica del medio.
- En ella se localiza los componentes que determinan su patogenicidad:
endotoxinas.
- Es el sitio de acción de algunos antibióticos: los betalactámicos.
 - Contiene antígenos que son usados en la clasificación e identificación
bacteriana.
- Se manifiesta con la tinción de Gram, y permite dividir a las bacterias en
2 grandes grupos: GRAM POSITIVAS y GRAM NEGATIVAS.

CITOPLASMA:
- Está formado en un 85 % por agua.
- Contiene ribosomas y cromosoma bacteriano.

RIBOSOMAS:
- Están compuestos por ARN y proteínas.
- Se encuentran libres en el citoplasma. También pueden presentarse
como polirribosomas (cadenas).
- Interviene en la síntesis de proteínas.
- Son el sitio de acción de numerosos ATB: Aminoglucósidos,
Tetraciclinas, Cloranfenicol, Macrólidos y Lincosamidas.

ADN CROMOSÓMICO:
Las bacterias no poseen membrana nuclear, nucléolo ni aparato mitótico, por lo
que se material genético está constituido por un filamento de ADN circular de
doble cadena que se encuentra enrollado sobre sí mismo.

CÁPSULA:
- Es una envoltura externa, ubicada por fuera de la pared celular.
- Está formada por polisacáridos.
- Es de consistencia mucosa, un gel que se adhiere a la célula.
- Protege a la bacteria de la fagocitosis y facilita la invasión.
- Permite la diferenciación en tipos serológicos en base a los antígenos
capsulares.
- No es una estructura vital para la célula; su pérdida no produce la
muerte de la bacteria, pero sí afecta su virulencia.
- Se hace visible al microscopio óptico usando la coloración con tinta
china.

FLAGELO:
- Son filamentos largos y delgados, helicoidales.
- Están formados por una proteína llamada flagelina.
- Son los responsables de la movilidad de la bacteria.
 - Puede variar su cantidad de 1 a cientos.
- No es una estructura vital para la célula.
- Son demasiado pequeños para ser vistos en su estado natural con el
microscopio óptico, por eso existen coloraciones especiales que los dejan
en evidencia.

PILIO FIMBRIAS:
- Son estructuras filamentosas y proteicas.
- No son vitales para la bacteria.
- Cumplen funciones de adherencia a receptores específicos y tienen u
papel fundamental en la colonización de epitelios.
- No cumplen función de movilidad.
- Solo pueden ser vistos por microscopía electrónica.
- Los pilis sexuales intervienen en el intercambio genético entre
bacterias, en donde una célula donadora transfiere Plásmidos a otra
receptora en un proceso denominado conjugación.

PLÁSMIDOS:
- Son secuencias cortas de ADN circular bacteriano que puede existir y
replicarse independientemente del ADN cromosómico.
- No son esenciales para la vida de la bacteria, pero le dan algunas
ventajas: resistencia a los ATB, patogenicidad, etc.
- Pueden transferirse de una bacteria a otra a través de la conjugación.

- REPRODUCCIÓN

La reproducción se lleva a cabo asexualmente por división celular.

- El ADN circular se empieza a replicar.
- A los 20 min. el nuevo cromosoma esta completo y se fija a un sitio de la
célula.
- Aparece una división en el centro de la célula.
- A los 38 min. la división ya es una pared.
- A los 45 min. la división ya se ha completado.
- CLASIFICACIÓN

Se puede decir que en el proceso de identificación de microorganismos se

ponen en juego todos los conocimientos acumulados en Microbiología.
La identificación de las bacterias es más precisa cuanto mayor es el número de
criterios utilizados.
Esta identificación basada en modelos, agrupados en familias y especies, forma
la clasificación bacteriana.
Algunos de los criterios en los que nos basamos son:
- Morfología microscópica y microscópica.
- Requerimiento de O2 para su desarrollo.
- Capacidad para consumir glucosa.
- Composición de su pared celular.

- REQUERIMIENTO DE O2.

- AEROBIAS ESTRICTAS: bacterias que crecen en presencia de O2 y lo

requieren para su continuo crecimiento. (20% de O2.).

- ANAEROBIAS ESTRICTAS: No se desarrollan en presencia de O2.

Utilizan CO2, H2, N2.

- ANAEROBIAS FACULTATIVAS: prefieren crecer en presencia de O2,

aunque pueden hacerlo sin él.

- MICROAERÓFILAS: crecen mejor en condiciones atmosféricas

parcialmente anaerobias: menos de 12 % de O2 y aumento en la
concentración de CO2.

-FORMA Y AGRUPACIÓN:

El examen microscópico de las bacterias nos permite reconocer su morfología.

Así podemos reconocer:

- COCOS: tiene forma esférica u ovalada.

Pueden presentarse: - aislados
-de a pares: diplococos.
 - en cadenas: estreptococos.
- en racimos: estafilococos.

- BACILOS: tienen forma cilíndrica, recta o curva.

Sus extremos pueden ser rectos o redondeados.
Pueden estar aislados, en cadenas o formando letras chinas
y empalizadas.

- ESPIRILOS: tienen forma de espiral. Varían en el número de vueltas.

- VIBRIOS: tiene forma de coma.

-COMPOSICION DE LA PARED CELULAR:

Para evidenciar la pared celular, se utiliza la coloración de Gram

Según la composición de su pared celular, las bacterias pueden clasificarse
en:
Gram +.
Gram -.

Pared de las bacterias Gram Positivas: .

La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas

interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es
peptidoglicano.

Pared de las bacterias Gram Negativa:

La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho
más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una
membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y
lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es
peptidoglicano.
Tipos de coloraciones:

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles

de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el
contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para
distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas,
paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo
más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como
formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el
colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma.
La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un
portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tinción.

Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante
forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras
celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales
inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y
deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos
estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente
existente.

Las tinciones pueden clasificarse en:

-DIFERENCIALES
-SIMPLES
-ESPECÍFICAS
- FLUOROCROMOS
TINCIÓN DIFERENCIAL

-Se utilizan 2 ó más colorantes.

-Permite distinguir entre distintos tipos de microorganismos.
-Tiene al menos 2 etapas: colorante 1rio. y colorante de contraste.
-Ej: Gram, Zielh-Neelsen, Giemsa.

TINCIÓN SIMPLE

- Se utiliza 1 solo colorante.

- Mejora el contraste.
- Ej: Azul de metileno.

TINCIÓN ESPECÍFICA:

-Revelan estructuras particulares.

-Aumenta el contraste.
-Ej: flagelos, esporas.

TINCIÓN NEGATIVA

-Tiñe el medio que rodea al microorganismo.

-Realza el contraste.
-Ej: Tinta china.

TINCIÓN FLUORESCENTE

-Aumenta el contraste por medio de fluorescencia.

-Se utilizan colorantes llamados fluorocromos.
-Ej: Naranja de acridina, auramina.
- TINCIÓN DE GRAM:

Es el método de coloración más importante en el laboratorio de

bacteriología, ya que permite iniciar el reconocimiento de los
microorganismos.
Se llama así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en
1884.
En base a los resultados de la tinción, las bacterias pueden dividirse en
Positivas y Negativas.
Las bacterias se tiñen de forma diferente debido a las diferencias
constitutivas de su pared celular.

Procedimiento:

Preparación y secado del frotis.

Fijación: calor / metanol.
Colorante 1rio: Cristal violeta: 1 min.
Enjuague.
Mordiente: Lugol: 1 min. (Es una solución de Iodo y Ioduro de potasio).
Enjuague.
Decolorante: alcohol acetona. (30% de acetona y 70% de etanol).
Enjuague.
Colorante 2rio: Safranina: 1 min.
Enjuague y secado.

Explicación:

- El primer paso en cualquier tinción debe ser la fijación.

- El cristal violeta penetra en todas las células bacterianas, + y -.

 - El Iodo entra en las células y forma un complejo insoluble en solución
acuosa con el cristal violeta.

- La mezcla de alcohol-acetona sirve para hacer la decoloración, ya que en

la misma es soluble el complejo I/ cristal violeta: los Gram + no se
decolora, mientras que los Gram – sí lo hacen.

- Para poner de manifiesto las células Gram- se usa una coloración de

contraste, como la safranina o la fucsina básica.

-MICROSCOPÍA:

La tinción de Gram nos permite observar dos características de las bacterias:

forma y agrupación y la diferenciación en Gram + o -.
Para observar al microscopio los preparados coloreados, le agregamos una gota
de aceite de inmersión.
Usamos el microscopio óptico con la lente de 100X.

-TINCION DE ZIEHL- NEELSEN

Los BAAR poseen una pared celular rica en lípidos y acido micólico, que
tienen la propiedad de unirse fuertemente al colorante primario cuando se
usa el calor como mordiente. Una vez formado este complejo colorante-
pared, ni siquiera la acción conjunta del ácido y el alcohol pueden
deshacerlo, ya que la pared retiene el colorante en forma resistente.
Pasos:

Preparación y secado del frotis.

Fijación: calor / metanol.
Colorante 1rio: Fucsina.
Mordiente: Calor: Flamear hasta que se desprenda vapor blanco.
Repetir 3 veces.
Enjuague.
Decolorante: alcohol ácido. 1-2 min.
Enjuague.
Colorante 2rio: Azul de metileno.20 min.
Enjuague y secado.
Los BAAR se observan teñidos de rojo y el resto aparece en azul celeste.
Son BAAR las micobacterias, nocardias y algunos hongos.

-OTRAS COLORACIONES:

-GIEMSA:

En microbiología se usa para visualizar parásitos, hongos, levaduras y

espiroquetas.
Reactivos: 1. Metanol o etanol → fijador.
2. Colorante de Giemsa + Agua tamponada (pH 7.2).
El colorante de Giemsa es un colorante compuesto ya que es una mezcla de
varios colorantes. Por esto se dice que la coloración de Giemsa es una
coloración compuesta o diferencial (ya que emplea más de un colorante).

-AZUL DE METILENO:

Azul de metileno (Tinción simple). Permite teñir el interior celular.

Tiñe microorganismos.

-TINTA CHINA:

Es una tinción negativa ya que deja las bacterias sin teñir y colorea el medio
que las rodea.
Su máxima utilidad es revelar la cápsula de algunas bacterias.

-AURAMINA Y NARANJA DE ACRIDINA:

Son tinciones realizadas con diferentes fluorocromos.

Se necesita un microscopio de fluorescencia para observarlas.
Auramina: se usa para teñir bacilos BAAR. Las bacterias aparecen
anaranjadas brillantes contra un fondo verde.
Naranja de acridina: es muy usado en hemocultivos. Se usa para detectar la
presencia de bacterias.
 Lo interesante de estas coloraciones, es que luego, el frotis se puede teñir
con Gram o Ziehl-Neelsen (según el caso) y confirmar el resultado con la
coloración tradicional que, además, permite ver la morfología.

- OBSERVACIÓN EN FRESCO:

No es el método más usado para observar la morfología ya que el citoplasma es

incoloro.
Sí se utiliza para ver la movilidad de las bacterias, para observar parásitos y
hongos.

-CAMPO OSCURO:

Es una variante del examen en fresco y permite observar el movimiento

característico y la morfología de las espiroquetas.

Resumiendo…

BACTERIA

-Organismo unicelular.
-Procariota.
-Microscópico (Uso de coloraciones).
-Reproducción asexual.

CLASIFICACIÓN:

-Morfología: cocos, bacilos, vibrios y espirilos.

-Composición de su pared celular: Gram + y -, AAR.
-Requerimiento de O2.
 Preparación de colorantes:

Preparación de los colorantes para Gram:

CRISTAL VIOLETA

 Cristal violeta 10 g.
 Oxalato de amonio 4 g.
 Etanol 100 ml.
 Agua destilada 900 ml.

Dejar reposar a 37°C 24 hs.

Filtrar con papel de filtro antes usar

LUGOL

 Iodo 10 g.
 Ioduro de potasio 20 g.
 Etanol 250 ml.
 Agua destilada 750 ml.

Dejar reposar a 37°C 24 hs.

Filtrar con papel de filtro antes de usar.

ALCOHOL ACETONA (70/30):

Acetona 300 ml.

Alcohol etílico 700 ml.
SAFRANINA

 Safranina 2,5 g.
 Etanol 100 ml.
 Agua destilada 900 ml.

Dejar reposar a 37°C 24 hs.

Filtrar con papel de filtro antes de usar.

Preparación de los colorantes para Ziehl-Neelsen:

FUCSINA FENICADA

-Fucsina básica 10 g.
- Etanol 100 ml.
- Fenol 50 ml.
- Agua destilada 1000 ml.

Dejar reposar a 37°C 24 hs.

Filtrar con papel de filtro antes usar.

ALCOHOL ÁCIDO

-Etanol 970 ml.

- Ácido clorhídrico 30 ml.

Manipular con precaución el HCl.

AZUL DE METILENO

 Azul de Metileno 1 g.
 Etanol 100 ml.
 Agua destilada 900 ml.

Dejar reposar a 37°C 24 hs.

Filtrar con papel de filtro antes usar.

Ante cualquier duda, no dudes en hacer consultas.

Adriana Núñez
Técnica de laboratorio del Servicio de Microbiología del Hospital de
pediatría Juan P. Garrahan.

Contacto:
cursodebacteriogarrahan@gmail.com