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Curvas de concentración de oxígeno y concentración de

atp en función del tiempo


Si bien el título de este tp es “Curvas de consumo de oxígeno”,
ustedes no tienen que graficar curvas de consumo de oxígeno, no es
lo que les van a pedir en el examen, lo que sí se les va a evaluar son
los gráficos de concentración de oxígeno en función del tiempo y
concentración de atp en función del tiempo.
Para poder realizar estos gráficos, tienen que tener presente los
conceptos generales de cadena respiratoria y fosforilación oxidativa.
La cadena respiratoria es el proceso de transferencia de electrones
desde las coenzimas reducidas (NADH y FADH2, que al ceder sus
electrones, se reoxidan a NAD y FAD) hasta al O2. La cadena
respiratoria está compuesta por 4 complejos: Complejo I (o NADH
deshidrogenasa o NADH: ubiquinona oxido reductasa), complejo II (o
succinato coenzima Q deshidrogenasa), complejo III (ubiquinona –
citocromo c oxido reductasa) y complejo IV (citocromo oxidasa) que
se localizan en la membrana mitocondrial interna. En la cadena
respiratoria, los electrones fluyen desde los componentes de menor
potencial de reducción hacia los de mayor potencial de reducción,
siendo el o2, el aceptor final de electrones, que al recibir los
electrones (junto con protones) se reduce a agua. Simultáneamente
a la transferencia de electrones a través de estos complejos, se
produce un bombeo de protones, desde la matriz mitocondrial hacia
el espacio intermembrana. Por cada par de electrones cedidos a la
cadena respiratoria, el complejo I bombea 4 H+; el complejo II NO es
una bomba, por lo que no bombea protones; el complejo III bombea
4 H+ y el complejo IV bombea 2H+. Este mecanismo tiene como
consecuencia la generación de un gradiente electroquímico (es
químico ya que hay una diferencia de concentración de protones, y
es eléctrico ya que los protones están cargados positivamente, lo
que genera una diferencia de cargas → acumulación de cargas
negativas en la matriz y cargas positivas en el espacio
intermembrana) a través de la membrana mitocondrial interna. La
energía que genera la transferencia de electrones hacia el oxígeno
es almacenada en el gradiente electroquímico que se forma
simultáneamente. Esto es lo que sostiene la teoría quimiosmótica, y,
según esta teoría, la energía contenida en este gradiente
electroquímico (fuerza protón motriz) es utilizada para la síntesis de
ATP catalizada por el componente F1 de la ATP sintasa, ubicada en la
membrana mitocondrial interna, a la vez que los protones retornan
pasivamente (siguiendo el gradiente electroquímico) a la matriz
mitocondrial a través del poro de protones del componente Fo de la
ATP sintasa. Se requieren 4H+ para que la ATP sintasa sintetice 1 ATP
a partir de ADP y fosfato.
Entonces, la cadena respiratoria es el proceso de transferencia de
electrones desde las coenzimas reducidas hasta el O2. En el caso del
NADH+, cede su par de electrones al complejo I de la cadena
respiratoria, por lo cual, su oxidación, bombea 10 H+ desde la matriz
mitocondrial hacia el espacio intermembrana, y por cada 4 H+ se
sintetiza 1 ATP, por lo tanto, el rendimiento de la cadena respiratoria
acoplada a la fosforilación oxidativa es de 2,5 moles de ATP cuando
se oxida un mol de NADH. En el caso de FADH2, cede su par de
electrones al complejo II de la cadena respiratoria, por lo cual, su
oxidación bombea 6 H+ desde la matriz mitocondrial hacia el espacio
intermembrana, por lo tanto el rendimiento de la cadena
respiratoria acoplada a la fosforilación oxidativa es de 1,5 moles de
ATP cuando se oxida un mol de FADH2.
Ambos procesos, cadena respiratoria y fosforilación oxidativa, están
acoplados. Desde el punto de vista termodinámico, dos procesos
están acoplados cuando la energía libre liberada por uno de ellos
(proceso exergónico) es utilizada por el otro (proceso endergónico),
el cual, de otra manera, no podría ocurrir espontáneamente. En la
cadena respiratoria (proceso exegónico), los electrones pueden fluir
solo si el ADP es simultáneamente fosforilado a ATP (proceso
endergónico). La fosforilación oxidativa depende de la cadena de
transporte de electrones ya que necesita del gradiente de H+, para
que la energía de dicho gradiente impulse el bombeo de H+ a la
matriz mitocondrial a través del componente Fo de la ATPsintasa, al
mismo tiempo que el componente F1 sintetiza ATP. La cadena
respiratoria depende de la fosforilación oxidativa ya que necesita de
la disipación del gradiente para poder seguir bombeando H+, debido
a que, si el gradiente no se disipa y se va incrementando, la energía
que se requiere para bombear protones desde la matriz hacia el
espacio intermembrana (en contra de su gradiente) es tan grande,
que iguala o supera la energía que se obtiene en el transporte de
electrones, y de esta forma, se interrumpe la cadena respiratoria.
*Flechas negras: transporte
de electrones

NADH + H+
2 e- MMI

NAD+

Complejo I
4H+
FADH2 2 e-

FAD
Complejo II

Matriz Espacio
mitocondrial Q intermembrana

Complejo III
4H+

CYTC

Complejo IV
2H+
2 e-

½ O2 + 2H H2O

Fo
H+ H+
F1
H+ H+

ADP + Pi

1 ATP
Asimismo, una serie de compuestos químicos tienen efectos tóxicos
debido a que inhiben en sitios específicos, el transporte de
electrones de la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa. Por
ejemplo:
- la rotenona y amital inhiben el complejo I
- malonato inhibe el complejo II
- antimicina A inhibe el complejo III
- monóxido de carbono, azida de sodio y cianuro de
potasio inhiben el complejo IV
- La oligomicina bloquea el componente Fo de la ATP
sintasa.
Al estar ambos procesos acoplados, cualquier inhibidor de los
complejos de la cadena respiratoria, no solo bloquea a la misma sino
también a la fosforilación oxidativa, y viceversa → la oligomicina
bloquea directamente a la atp sintasa, bloqueando de esta forma la
fosforilación oxidativa, y como la cadena respiratoria está acoplada
a la fosforilación oxidativa, ambos procesos se bloquean.
A su vez, existen compuestos denominados desacoplantes, que,
cómo su nombre lo indica, desacoplan la cadena respiratoria de la
fosforilación oxidativa. Tipos de desacoplantes:
• Ácidos débiles (como el dinitrofenol y la aspirina), que
difunden a través de la membrana mitocondrial interna
desde el espacio intermembrana hasta la matriz
mitocondrial en estado no disociado, se disocian en la
matriz mitocondrial, liberan H+ y de esta manera disipan
el gradiente electroquímico de protones.
• Ionóforos, que interaccionan con iones inorgánicos,
rodeándolos, y este complejo formado atraviesa la MMI.
Por ejemplo, la valinomicina, es un ionóforo de potasio,
que forma un complejo lipídico con el potasio, atraviesa
la MMI, aumentando las cargas positivas en la matriz
mitocondrial, neutralizando el exceso de cargas negativas
y de esta forma, se disipa el gradiente eléctrico y
disminuye la fuerza protón motriz.
• Por otra parte, en la mayoría de los mamíferos,
incluyendo el hombre, los recién nacidos tienen un tipo
de tejido adiposo particular, llamado tejido adiposo
pardo, en el cual la oxidación de combustibles no se
utiliza para la síntesis de ATP sino para generar calor y
mantener la temperatura corporal. Las mitocondrias de
este tejido poseen una proteína particular en la
membrana interna, llamada termogenina, que es una
proteína integral de membrana a través de la cual los
protones pueden volver a la matriz mitocondrial sin
atravesar el complejo F1Fo, de este forma, la energía de
oxidación no se conserva en la síntesis de ATP, sino que
se disipa como calor y contribuye a mantener la
temperatura corporal.
Analicemos la función de los desacoplantes:
En el caso de que la fosforilación oxidativa esté bloqueada (por
ejemplo, al agregar oligomicina), la cadena respiratoria también se
bloquea. Sin embargo, al agregar un desacoplante, este permitirá
que la cadena respiratoria vuelva a funcionar, ya que disipan el
gradiente (electroquímico en el caso de los ácidos débiles, solo
eléctrico en el caso de los ionóforos), y de esta forma, la cadena
respiratorio puede seguir bombeando protones.
En el caso de que se agregue un desacoplante cuando ambos
procesos funcionan correctamente, este inhibe la síntesis de ATP
porque elimina o disminuye el gradiente electroquímico. Al disminuir
la fuerza protón motriz, los protones dejan de atravesar el
componente fo de la ATP sintasa por lo que se bloquea la síntesis de
ATP . Esto lleva a un aumento en los niveles de ADP. La concentración
de ADP es el principal regulador de la actividad de la cadena
respiratoria, por lo que al aumentar los niveles de ADP, se
incrementa la actividad de la cadena respiratoria.
En condiciones experimentales, la funcionalidad de la cadena
respiratoria y fosforilación oxidativa, y su acoplamiento, puede ser
evaluada, in vitro, en suspensiones de mitocondrias aisladas de un
tejido dado a pH regulado. Las mitocondrias deben estar intactas y
ser incubadas con un medio rico en: O2 (aceptor final de electrones
de la cadena respiratoria), ADP (sustrato para la síntesis de ATP) y
sustrato oxidable (compuesto con capacidad de oxidarse y dar como
producto coenzimas reducidas). Todos los compuestos se agregan de
manera secuencial.
Recuerden que no agregamos directamente NADH o FADH2 a la
suspensión de mitocondrias ya que, al tratar con mitocondrias
aisladas, no hay lanzaderas, y las coenzimas reducidas no pueden
atravesar la membrana mitocondrial interna. Por tal motivo, se
agregan sustratos oxidables capaces de atravesar la membrana
mitocondrial interna y formar las coenzimas reducidas, como por
ejemplo, el malato y succinato. Ambos son intermediarios del Ciclo
de Krebs. El malato es sustrato de la malato deshidrogenasa, que
utiliza NAD como cofactor (Malato + NAD → Oxalacetato + NADH).
El NADH cede su par de electrones al complejo I de la cadena
respiratoria, por lo tanto, la oxidación del malato da como resultado
la formación 2,5 mol de ATP por mol de malato. El succinato es
sustrato de la succinato deshidrogenasa (única enzima del ciclo de
Krebs que se encuentra adherida a la membrana mitocondrial
interna), que constituye el complejo II de la cadena respiratoria, y
que utiliza FAD como cofactor (Succinato + FAD → Fumarato +
FADH2). El FADH2 cede su par de electrones a la coenzima Q, por lo
tanto, la oxidación de succinato da como resultado la formación de
1,5 mol de ATP por mol de succinato. Si el sustrato oxidable que se
agrega a la suspensión de mitocondrias es el succinato, los
inhibidores del complejo I NO afectan la cadena respiratoria ni la
fosforilación oxidativa, ya que el succinato es sustrato del complejo
II de la cadena respiratoria, por lo que se saltea el complejo I.
Hay ciertos sustratos oxidables que si bien son capaces de formar
coenzimas reducidas, no se pueden agregar a la suspensión de
mitocondrias ya que no atraviesan la membrana mitocondrial
interna, por ejemplo, el oxalacetato.
Los inhibidores del complejo II (malonato), complejo III (antimicina
A) y complejo IV (monóxido de carbono, azida de sodio y cianuro de
potasio) bloquean la cadena respiratoria y fosforilación tanto si se
usa malato como succinato como sustrato oxidable. La oligomicina
bloquea ambos procesos, y el uso del desacoplante bloquea la
síntesis de ATP y aumenta la velocidad de la cadena respiratoria;
además permite la funcionalidad de la cadena respiratoria aun
cuando la fosforilación oxidativa se encuentra bloqueada (por
ejemplo, en el caso de que se haya agregado oligomicina). El gráfico
que se obtiene a partir de estos estudios in vitro se denomina
trazado polarográfico. Si la cadena respiratoria y fosforilación
oxidativa funcionan correctamente, el gráfico de concentración de
oxígeno en función del tiempo debe tener una pendiente con
dirección descendente, y el gráfico de concentración de ATP en
función del tiempo debe tener una pendiente con dirección
ascendente.
Veamos un ejemplo:
• Para una suspensión de mitocondrias respirando activamente,
represente en un gráfico la concentración de oxígeno en
función del tiempo y en otro la síntesis de ATP en función del
tiempo, luego del agregado de las siguientes sustancias en el
orden que se indica: i) Malato, ii) ADP y Pi, iii) Oligomicina, iv)
Dinitrofenol y v) Amital.

Malato ADP + Pi

[O2]
A
B

Oligomicina
Dinitrofenol
C

D Amital

Tiempo
Curva de concentración de oxígeno en función del tiempo:
A. En un primer momento, al solo contener una suspensión de
mitocondrias con O2, no hay actividad de la cadena
respiratoria.
B. Las mitocondrias aisladas contienen una baja cantidad de
ADP en su interior, por lo tanto, al agregar malato, hay una
baja actividad de la cadena respiratoria, lo que lleva a una
pequeña disminución de la concentración de oxígeno.

C. Al agregar ADP + Pi exógeno, la actividad de la cadena


respiratoria se incrementa considerablemente, lo que lleva
a una rápida reducción de la concentración de oxígeno.

D. La oligomicina es inhibidor de la ATP sintasa. Al inhibirse la


actividad de la ATP sintasa, los protones presentes en el
espacio intermembrana no pueden retornar a la matriz por
el componente Fo, de esta manera, el gradiente de protones
formado por el bombeo de la cadena respiratoria no se
disipa y se hace tan grande, que la energía que debe realizar
la cadena respiratoria para seguir bombeando protones
desde la matriz al espacio intermembrana en contra de su
gradiente iguala o supera la energía que se obtiene en el
transporte de electrones, por lo cual la cadena respiratoria
se frena. Ambos procesos están acoplados.

E. Se agrega dinitrofenol, un desacoplante. El dinitrofenol


actúa como ácido débil, atraviesa la membrana mitocondrial
interna de forma no disociada, al llegar a la matriz se
disociada en protones, disipando de esta forma el gradiente
electroquímico. Gracias a la acción del desacoplante, la
cadena de transporte puede volver a bombear protones
desde la matriz hacia el espacio intermembrana, retomando
su actividad.

F. El agregado de amital, inhibidor del complejo I de la cadena


respiratoria, inhibe su actividad, por lo que el oxígeno deja
de consumirse y su concentración no se altera.

[ATP]
Oligomicina Dinitrofenol Amital

ADP + Pi

Malato

Tiempo

En un primer momento, solo se tiene una suspensión de mitocondrias


aisladas oxigenadas, por lo que no hay actividad ni de la cadena
respiratoria ni de la fosforilación oxidativa. Al agregar malato, hay una
baja actividad de la cadena respiratoria y fosforilación oxidativa, ya que
las mitocondrias aisladas contienen una baja concentración de ADP
endógeno. Al agregar ADP + Pi exógeno, se eleva rápidamente la
actividad de ambos procesos, por lo que aumenta signifitivamente la
concentración de ATP. Al agregar oligomicina, inhibidor del
componente Fo de la ATP sintasa, se detiene la fosforilación oxidativa,
por lo que no sigue aumentando la concentración de ATP. El DNP y
amital no modifican la acción de la oligomicina.
Curvas de concentración de oxígeno y concentración de ATP en
función del tiempo. Tp 17, punto b.
Aclaraciones sobres estas curvas:
• Recuerden que los compuestos se van agregando
secuencialmente y de manera individual. Tienen que colocar la
flecha exactamente donde están agregando el compuesto.
• En el gráfico iii, recuerden que el succinato, por acción de la
succinato deshidrogenasa, se oxida a fumarato; y FAD se
reduce a FADH2, el cual cede sus electrones al complejo II. La
rotenona es inhibidor del complejo I, los electrones cedidos por
el FADH2 en este caso no van a pasar por el complejo I, por lo
que la rotenona no bloquea la cadena respiratoria ni la
fosforilación oxidativa si se utiliza succinato como sustrato
oxidable.
• En el gráfico v, cuando se agrega el DNP (sin bloqueo previo de
la fosforilación oxidativa), la velocidad de la cadena respiratoria
se acelera, aumentando el consumo de O2 y disminuyendo su
concentración a mayor velocidad, por motivos ya explicados
anteriormente. La pendiente se hace mas vertical.
• En el gráfico ix, en el gráfico de concentración de oxígeno en
función del tiempo, la cadena respiratoria no se inhibe con el
agregado de oligomicina porque se agregó desacoplante
anteriormente.

Ejercicio c del tp 17
FADH2
FAD

1. Transformación de alfacetoglutarato en succinato: Por acción


de la enzima alfacetoglutarato deshidrogenasa se obtiene 1
NADH+H+, y por acción de la enzima succinil coa sintetasa se
obtiene 1 GTP. Entonces, 1 NADH+H + 1 GTP → 2,5 ATP + 1 ATP
→ 3,5 ATP. Se consume medio mol de oxígeno ya que se oxida
un solo NADH+H
2. Idem 1 en presencia de 2,4 DNP: El DNP es un desacoplante que
disipa el gradiente electroquímico de protones a lo largo de la
membrana mitocondrial interna, como consecuencia, los
protones dejan de fluir a través del componente Fo de la ATP
sintasa, y se inhibe de esta forma la síntesis de ATP por el
componente F1. Al bloquearse la síntesis de ATP, aumenta la
concentración de ADP y cuanto mayor es la disponibilidad de
ADP, la velocidad de la respiración aumenta. No se obtendrán
moles de ATP a partir del NADH+H, solo se tiene el GTP (1 ATP)
obtenido de la reacción de la succinil coa sintetasa. El consumo
de oxígeno debería ser mayor a medio mol ya que la velocidad
de la cadena respiratoria está aumentada.
3. Transformación de isocitrato en succinato: Por acción de la
enzima isocitrato deshidrogenasa se forma 1 NADH+H. Por
acción de la enzima alfa cetoglutarato deshidrogenasa se
forma un 1 NADH+H. y por acción de la succinil coa sintetasa se
forma 1 GTP. En total: 2 NADH + 1 GTP → (2x 2,5 ATP) + 1 ATP→
5 ATP + 1 ATP → 6 ATP. Se consume 1 mol de oxígeno
4. Transformación de succinato en oxalacetato: Por acción de la
enzima succinato deshidrogenasa se forma un FADH2 y por
acción de la enzima malato deshidrogenasa se forma un
NADH+H. 1 FADH2 + 1 NADH+H → 1,5 ATP + 2,5 ATP → 4 ATP.
Se consume 1 mol de oxígeno (medio mal por cada coenzima
reducida)
5. Idem 4 en presencia de rotenona. La rotenona es inhibidor del
complejo I, complejo al cual el NADH+H cede sus electrones,
por lo tanto, la oxidación del NADH+H se encuentra inhibida. El
FADH2 cede sus electrones al complejo II, por lo que la
rotenona no afecta su oxidación. 1 FADH2 → 1,5 ATP. Se
consume medio mol de oxígeno.

Casos clínicos
1. Infarto de miocardio:
a. ¿Cuáles son los efectos de la anoxia sobre:
- respiración celular? Disminuye su actividad
- relación NAD+/NADH mitocondrial? Al estar disminuida
su actividad, las coenzimas reducidas no se reoxidan a la
velocidad que lo hacen normalmente, por lo que
aumenta la concentración de las coenzimas reducidas,
por lo que disminuye la relación NAD/NADH
- la cadena de transporte de electrones: Disminuida
- la síntesis de ATP: Detenida
- la velocidad del ciclo de Krebs? Disminuida, por
reducción de aporte de coenzimas oxidadas
- el pH del tejido? Disminuido, ya que al estar en situación
de anoxia, se estimula la glucólisis anareóbica, dando
como producto final ácido láctico.
b. ¿Por qué al romperse las células del miocardio la enzima
succinato deshidrogenasa es la única enzima del ciclo de
Krebs que no se detecta en plasma? Porque la succinato
deshidrogenasa es la única enzima del ciclo de Krebs que
se encuentra adherida a la membrana mitocondrial interna
c. Por qué el cigarrillo empeoró la situación del paciente?
Porque uno de los compuestos del cigarrillo es la nicotina,
que es vasoconstrictora, por lo que, al disminuir el calibre
de los vasos, disminuye aún más el aporte de oxígeno a los
tejidos.

2. Intoxicación con aspirina: La aspirina actúa como desacoplante,


es un ácido débil, que difunde a través de la membrana
mitocondrial interna, desde el espacio intermembrana hacia la
matriz mitocondrial, en forma no disociada, y se disocian
dentro de la matriz, disipando el gradiente electroquímico.
a. Dibuje el trazado polarográfico de las mitocondrias del
músculo de este paciente
Sustrato oxidable Aspirina
ADP

Aspirina Sustrato

oxidable
[O2] [ATP]

ADP

Tiempo Tiempo

b. ¿Cuál es el efecto de las cantidades de AAS sonbre…


- La cadena de transporte de electrones? Aumentada
- La fosforilación oxidativa? Detenida
- La velocidad del ciclo de Krebs? Aumentada, por mayor
aporte de coenzimas oxidadas, por la mayor actividad
de la cadena de transporte de electrones

c. ¿A qué se debe el aumento de pCO2 y la disminución de


la po2 del paciente? La Pco2 está aumentada debido a
que el ciclo de Krebs se encuentra acelerado, siendo
uno de sus productos el dióxido de carbono. La po2
está disminuida debido a que la cadena de transporte
de electrones se encuentra actuando a mayor
velocidad, lo que lleva a un mayor consumo de
oxígeno y a una disminución en su concentración
d. ¿A qué se debe el aumento en la frecuencia
respiratoria? Porque la aspirina desacopla la
fosforilación oxidativa de la cadena respiratoria,
aumentado la actividad de esta última. Además,
constituye una respuesta compensatoria a la acidosis
metabólica ocasionada por la intoxicación por aspirina

3. Infección bacteriana
a. ¿Qué conclusión se puede sacar de la acción de la
endotoxina sobre la cadena de transporte de electrones? ¿A
qué nivel de la misma ejerce su acción? Justifique. La
endotoxina actúa a nivel de Complejo I, inhibiéndolo, ya
que la cadena respiratoria se encuentra bloqueada cuando
se utiliza malato como sustrato oxidable, no así cuando se
utiliza succinato como sustrato
b. ¿Cuál será el efecto de la endotoxina sobre la fosforilación
oxidativa? ¿Y sobre la velocidad del ciclo de Krebs? La
endotoxina inhibe al complejo I de la cadena respiratoria,
por lo que, al bloquearla, bloquea a su vez a la fosforilación
oxidativa. La velocidad de Krebs se encuentra disminuida
debido el menor aporte de coenzimas oxidadas.
c. ¿A qué se debe la disminución de la diferencia arterio
venosa de o2? Al inhibir la cadena respiratoria, no hay
consumo de oxígeno. La concentración de oxígeno que
llega a los tejidos por la arteria es prácticamente la misma
al que sale por la vena
d. ¿A qué se deben las concentraciones de piruvato y lactato
hallados en la sangre del paciente? Acidosis láctica por
estimulación de glucólisis anaeróbica