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NADH + H+
2 e- MMI
NAD+
Complejo I
4H+
FADH2 2 e-
FAD
Complejo II
Matriz Espacio
mitocondrial Q intermembrana
Complejo III
4H+
CYTC
Complejo IV
2H+
2 e-
½ O2 + 2H H2O
Fo
H+ H+
F1
H+ H+
ADP + Pi
1 ATP
Asimismo, una serie de compuestos químicos tienen efectos tóxicos
debido a que inhiben en sitios específicos, el transporte de
electrones de la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa. Por
ejemplo:
- la rotenona y amital inhiben el complejo I
- malonato inhibe el complejo II
- antimicina A inhibe el complejo III
- monóxido de carbono, azida de sodio y cianuro de
potasio inhiben el complejo IV
- La oligomicina bloquea el componente Fo de la ATP
sintasa.
Al estar ambos procesos acoplados, cualquier inhibidor de los
complejos de la cadena respiratoria, no solo bloquea a la misma sino
también a la fosforilación oxidativa, y viceversa → la oligomicina
bloquea directamente a la atp sintasa, bloqueando de esta forma la
fosforilación oxidativa, y como la cadena respiratoria está acoplada
a la fosforilación oxidativa, ambos procesos se bloquean.
A su vez, existen compuestos denominados desacoplantes, que,
cómo su nombre lo indica, desacoplan la cadena respiratoria de la
fosforilación oxidativa. Tipos de desacoplantes:
• Ácidos débiles (como el dinitrofenol y la aspirina), que
difunden a través de la membrana mitocondrial interna
desde el espacio intermembrana hasta la matriz
mitocondrial en estado no disociado, se disocian en la
matriz mitocondrial, liberan H+ y de esta manera disipan
el gradiente electroquímico de protones.
• Ionóforos, que interaccionan con iones inorgánicos,
rodeándolos, y este complejo formado atraviesa la MMI.
Por ejemplo, la valinomicina, es un ionóforo de potasio,
que forma un complejo lipídico con el potasio, atraviesa
la MMI, aumentando las cargas positivas en la matriz
mitocondrial, neutralizando el exceso de cargas negativas
y de esta forma, se disipa el gradiente eléctrico y
disminuye la fuerza protón motriz.
• Por otra parte, en la mayoría de los mamíferos,
incluyendo el hombre, los recién nacidos tienen un tipo
de tejido adiposo particular, llamado tejido adiposo
pardo, en el cual la oxidación de combustibles no se
utiliza para la síntesis de ATP sino para generar calor y
mantener la temperatura corporal. Las mitocondrias de
este tejido poseen una proteína particular en la
membrana interna, llamada termogenina, que es una
proteína integral de membrana a través de la cual los
protones pueden volver a la matriz mitocondrial sin
atravesar el complejo F1Fo, de este forma, la energía de
oxidación no se conserva en la síntesis de ATP, sino que
se disipa como calor y contribuye a mantener la
temperatura corporal.
Analicemos la función de los desacoplantes:
En el caso de que la fosforilación oxidativa esté bloqueada (por
ejemplo, al agregar oligomicina), la cadena respiratoria también se
bloquea. Sin embargo, al agregar un desacoplante, este permitirá
que la cadena respiratoria vuelva a funcionar, ya que disipan el
gradiente (electroquímico en el caso de los ácidos débiles, solo
eléctrico en el caso de los ionóforos), y de esta forma, la cadena
respiratorio puede seguir bombeando protones.
En el caso de que se agregue un desacoplante cuando ambos
procesos funcionan correctamente, este inhibe la síntesis de ATP
porque elimina o disminuye el gradiente electroquímico. Al disminuir
la fuerza protón motriz, los protones dejan de atravesar el
componente fo de la ATP sintasa por lo que se bloquea la síntesis de
ATP . Esto lleva a un aumento en los niveles de ADP. La concentración
de ADP es el principal regulador de la actividad de la cadena
respiratoria, por lo que al aumentar los niveles de ADP, se
incrementa la actividad de la cadena respiratoria.
En condiciones experimentales, la funcionalidad de la cadena
respiratoria y fosforilación oxidativa, y su acoplamiento, puede ser
evaluada, in vitro, en suspensiones de mitocondrias aisladas de un
tejido dado a pH regulado. Las mitocondrias deben estar intactas y
ser incubadas con un medio rico en: O2 (aceptor final de electrones
de la cadena respiratoria), ADP (sustrato para la síntesis de ATP) y
sustrato oxidable (compuesto con capacidad de oxidarse y dar como
producto coenzimas reducidas). Todos los compuestos se agregan de
manera secuencial.
Recuerden que no agregamos directamente NADH o FADH2 a la
suspensión de mitocondrias ya que, al tratar con mitocondrias
aisladas, no hay lanzaderas, y las coenzimas reducidas no pueden
atravesar la membrana mitocondrial interna. Por tal motivo, se
agregan sustratos oxidables capaces de atravesar la membrana
mitocondrial interna y formar las coenzimas reducidas, como por
ejemplo, el malato y succinato. Ambos son intermediarios del Ciclo
de Krebs. El malato es sustrato de la malato deshidrogenasa, que
utiliza NAD como cofactor (Malato + NAD → Oxalacetato + NADH).
El NADH cede su par de electrones al complejo I de la cadena
respiratoria, por lo tanto, la oxidación del malato da como resultado
la formación 2,5 mol de ATP por mol de malato. El succinato es
sustrato de la succinato deshidrogenasa (única enzima del ciclo de
Krebs que se encuentra adherida a la membrana mitocondrial
interna), que constituye el complejo II de la cadena respiratoria, y
que utiliza FAD como cofactor (Succinato + FAD → Fumarato +
FADH2). El FADH2 cede su par de electrones a la coenzima Q, por lo
tanto, la oxidación de succinato da como resultado la formación de
1,5 mol de ATP por mol de succinato. Si el sustrato oxidable que se
agrega a la suspensión de mitocondrias es el succinato, los
inhibidores del complejo I NO afectan la cadena respiratoria ni la
fosforilación oxidativa, ya que el succinato es sustrato del complejo
II de la cadena respiratoria, por lo que se saltea el complejo I.
Hay ciertos sustratos oxidables que si bien son capaces de formar
coenzimas reducidas, no se pueden agregar a la suspensión de
mitocondrias ya que no atraviesan la membrana mitocondrial
interna, por ejemplo, el oxalacetato.
Los inhibidores del complejo II (malonato), complejo III (antimicina
A) y complejo IV (monóxido de carbono, azida de sodio y cianuro de
potasio) bloquean la cadena respiratoria y fosforilación tanto si se
usa malato como succinato como sustrato oxidable. La oligomicina
bloquea ambos procesos, y el uso del desacoplante bloquea la
síntesis de ATP y aumenta la velocidad de la cadena respiratoria;
además permite la funcionalidad de la cadena respiratoria aun
cuando la fosforilación oxidativa se encuentra bloqueada (por
ejemplo, en el caso de que se haya agregado oligomicina). El gráfico
que se obtiene a partir de estos estudios in vitro se denomina
trazado polarográfico. Si la cadena respiratoria y fosforilación
oxidativa funcionan correctamente, el gráfico de concentración de
oxígeno en función del tiempo debe tener una pendiente con
dirección descendente, y el gráfico de concentración de ATP en
función del tiempo debe tener una pendiente con dirección
ascendente.
Veamos un ejemplo:
• Para una suspensión de mitocondrias respirando activamente,
represente en un gráfico la concentración de oxígeno en
función del tiempo y en otro la síntesis de ATP en función del
tiempo, luego del agregado de las siguientes sustancias en el
orden que se indica: i) Malato, ii) ADP y Pi, iii) Oligomicina, iv)
Dinitrofenol y v) Amital.
Malato ADP + Pi
[O2]
A
B
Oligomicina
Dinitrofenol
C
D Amital
Tiempo
Curva de concentración de oxígeno en función del tiempo:
A. En un primer momento, al solo contener una suspensión de
mitocondrias con O2, no hay actividad de la cadena
respiratoria.
B. Las mitocondrias aisladas contienen una baja cantidad de
ADP en su interior, por lo tanto, al agregar malato, hay una
baja actividad de la cadena respiratoria, lo que lleva a una
pequeña disminución de la concentración de oxígeno.
[ATP]
Oligomicina Dinitrofenol Amital
ADP + Pi
Malato
Tiempo
Ejercicio c del tp 17
FADH2
FAD
Casos clínicos
1. Infarto de miocardio:
a. ¿Cuáles son los efectos de la anoxia sobre:
- respiración celular? Disminuye su actividad
- relación NAD+/NADH mitocondrial? Al estar disminuida
su actividad, las coenzimas reducidas no se reoxidan a la
velocidad que lo hacen normalmente, por lo que
aumenta la concentración de las coenzimas reducidas,
por lo que disminuye la relación NAD/NADH
- la cadena de transporte de electrones: Disminuida
- la síntesis de ATP: Detenida
- la velocidad del ciclo de Krebs? Disminuida, por
reducción de aporte de coenzimas oxidadas
- el pH del tejido? Disminuido, ya que al estar en situación
de anoxia, se estimula la glucólisis anareóbica, dando
como producto final ácido láctico.
b. ¿Por qué al romperse las células del miocardio la enzima
succinato deshidrogenasa es la única enzima del ciclo de
Krebs que no se detecta en plasma? Porque la succinato
deshidrogenasa es la única enzima del ciclo de Krebs que
se encuentra adherida a la membrana mitocondrial interna
c. Por qué el cigarrillo empeoró la situación del paciente?
Porque uno de los compuestos del cigarrillo es la nicotina,
que es vasoconstrictora, por lo que, al disminuir el calibre
de los vasos, disminuye aún más el aporte de oxígeno a los
tejidos.
Aspirina Sustrato
oxidable
[O2] [ATP]
ADP
Tiempo Tiempo
3. Infección bacteriana
a. ¿Qué conclusión se puede sacar de la acción de la
endotoxina sobre la cadena de transporte de electrones? ¿A
qué nivel de la misma ejerce su acción? Justifique. La
endotoxina actúa a nivel de Complejo I, inhibiéndolo, ya
que la cadena respiratoria se encuentra bloqueada cuando
se utiliza malato como sustrato oxidable, no así cuando se
utiliza succinato como sustrato
b. ¿Cuál será el efecto de la endotoxina sobre la fosforilación
oxidativa? ¿Y sobre la velocidad del ciclo de Krebs? La
endotoxina inhibe al complejo I de la cadena respiratoria,
por lo que, al bloquearla, bloquea a su vez a la fosforilación
oxidativa. La velocidad de Krebs se encuentra disminuida
debido el menor aporte de coenzimas oxidadas.
c. ¿A qué se debe la disminución de la diferencia arterio
venosa de o2? Al inhibir la cadena respiratoria, no hay
consumo de oxígeno. La concentración de oxígeno que
llega a los tejidos por la arteria es prácticamente la misma
al que sale por la vena
d. ¿A qué se deben las concentraciones de piruvato y lactato
hallados en la sangre del paciente? Acidosis láctica por
estimulación de glucólisis anaeróbica