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Fundamentos Teóricos de La Reacción PDF
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INTRODUCCIÓN
PARTE I
añaden en exceso respecto al ADN a amplificar. Como es fácil inferir, la concentración de ADN,
oligonucleótidos, de y ADN polimerasa activa disminuyen después de cada ciclo debido a la
síntesis que se está produciendo por lo que la reacción lleva a un máximo de amplificación,
luego del cual el rendimiento y el número de copias obtenidas no aumentan. A esto se lo
conoce como el efecto “Platteau”.
Los primers se añaden en un vasto exceso comparado con el ADN blanco a ser
amplificado. Estos se hibridizan a las cadenas opuestas del blanco y se orientan enfrentándose
con sus respectivos terminales 3’, de manera tal que la síntesis llevada a cabo por la ADN
polimerasa se extiende a través de todo el segmento del ADN blanco situado entre ellos.
Recordemos que la enzima ADN polimerasa cataliza el crecimiento de cadenas de ADN nuevas
en la dirección 5’ > 3’.
Una PCR ideal debería ser altamente específica, fiel y de gran rendimiento. Cada uno
de estos parámetros está influido por varios componentes de la propia reacción por lo que
muchos casos ajustando las condiciones para la máxima especificidad no se obtiene buen
rendimiento, o bien optimizando para la fidelidad no se obtiene buena eficiencia. En
consecuencia, cada vez que se optimiza una PCR hay que tener en cuenta distintos aspectos
que hacen que dicha reacción sea exitosa.
¿Cuáles son los factores de los que depende una PCR exitosa?
El diseño cuidadoso de primers es uno de los aspectos más importantes de la PCR. Primers
mal diseñados pueden amplificar otros fragmentos de ADN distintos a los buscados
(amplificación inespecífica). En el diseño de los mismos algunas reglas se han demostrado
como útiles, por ejemplo:
I – Cada primer individual debe contar con una longitud de 18-24 bases.
II – Se debe mantener un contenido de G:C (Guanina:Citosina) entre 40 y 60 %.
III – Los dos primers del par deben de tener temperatura de fusión “Tm” cercanos, dentro de
los 5 °C.
IV – La secuencia de los primers individuales debe iniciarse y terminarse con 1 o 2 bases
púricas.
V – Evitar regiones con potencialidad para formar estructuras secundarias internas.
VI – Evitar poli X.
VII – Secuencias adicionales pueden ser agregadas en el extremo 5’ del primer (no incluir
cuando se estima la Tm del primer).
VIII – Se pueden agregar degeneraciones en algunas posiciones del primer:
a - Se incrementa el riesgo de amplificación inespecífica.
b - Se disminuye la concentración en la mezcla de cada uno de los primers posibles
c - No se recomienda utilizar más de 64 primers diferentes en la mezcla.
d - Código IUPAC/IUB:
A adenina R AoG
C citosina W AoT
G guanina S CoG
T timidina en el ADN Y CoT
Uracilo en el ARN K GoT
N AoCoGoT H A o C o T; no G
M AoC B C o G o T; no A
V A o C o G; no T D A o G o T; no C
La elección de las enzimas para ser usada en PCR depende de varios factores. Entre las
ventajas obtenidas mediante la utilización de polimerasas termoestables, comúnmente Taq,
esta la habilidad de sintetizar ADN a altas temperaturas (alrededor de 72 C); las cuales
permiten principalmente la eliminación de la mayoría de las estructuras secundarias presentes
en la molécula blanco. Sin embargo, no todas las polimerasas termoestables son igualmente
eficaces a la hora de amplificar. Taq no posee la actividad correctora 3’- 5’ con lo que su tasa
de error es del orden de 10-4 errores por par de bases incorporadas, Vent del orden de 10-5 y
Pfu del orden 10-7, siempre considerando que una polimerasa normal tiene una tasa de error
de 10-6 errores por par de bases incorporadas.
- Molde de ADN:
Tendremos que cuantificar el DNA para conocer la masa de ácidos nucleicos disuelta,
además de tener indicios acerca de su pureza. Varios autores indican la cantidad de matriz de
ADN a agregar a la reacción, expresándola en micro, nano o picogramos.
Con todo, las condiciones óptimas de la PCR siempre acaban por determinarse
empíricamente.
Este artificio ocurre frecuentemente como resultado del apareamiento de bases entre
dos cebadores (o eventualmente, un extremo de un cebador sobre sí mismo). Dado que la
ADN polimerasa elonga en sentido 5’ > 3’, un oligonucleótido cebador puede permitir a la
enzima que a partir de su extremo 3’ continúe polimerizando según el templado constituido
por el otro cebador.
Los dímeros ocurren frecuentemente cuando la PCR se realiza por más de 30 ciclos o
cuando la matriz está en muy baja concentración. Aunque si existe una alta
complementariedad entre los primers los primeros cambios de temperatura pueden provocar
una predominancia de éstos frente al amplicón deseado, perjudicando enormemente al
resultado de la PCR.
PARTE II
Primer3
Como la PCR es una herramienta de suma importancia, a la que suelen desembocar
muchas investigaciones, es necesario conocerla y utilizarla en cada momento que sea
necesario. Aunque siempre tenemos que poner a punto una reacción de PCR antes de hacer
uso extensivo de ella, uno de los pasos fundamentales es contar con los “primers” y con las
características de los mismos. Esto nos permitirá sortear exitosamente uno de los pasos
primordiales para obtener la mejor calidad y cantidad del producto de amplificación.
Surge entonces la pregunta: si no existen primers descriptos para amplificar una región
dada… ¿cómo los podemos diseñar y analizar? Sin dudas, tendremos que recurrir a los recursos
bioinformáticos básicos, muchos de los cuales se encuentran gratuitamente en Internet.
Para diseñar y analizar un par de primers para ser usados en una reacción de PCR
contamos con varios programas. En éste sencilla guía introductoria, haremos uso de uno
denominado Primer3.
Primer3 es una aplicación que se encuentra libre para su uso en diferentes servidores
web. En esta oportunidad utilizaremos la implementación de éste programa ofrecido por la
página JustBio.com.
Al mover la ventana del navegador hacia abajo encontrará que Primer3 cuenta con
diversas secciones que le permiten controlar una amplia variedad de parámetros relacionados
con el diseño de primers.
Por ser este, nuestro primer acercamiento al diseño de primers mediante esta
herramienta, utilizaremos un set de condiciones mínimas (por default) y la secuencia
correspondiente al ARN mensajero que codifica para el gen Gurken en Drosophila
melanogaster, número de acceso NM_057220.3.
Abra otra ventana y diríjase a la página del National Center for Biotechnology
Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov. En la solapa de búsqueda cambie All Database por
Nucleotide. A continuación escriba el número de acceso y oprima el botón Search. Visualice y
abra la solapa de Display Settings y elija FASTA. Copie la secuencia del gen Gurken y péguela
en el Box vacio del Primer3.
Por defecto Primer3 tiene habilitadas las opciones de encontrar tanto un primer
corriente arriba (pick left primer or use left primer below) como corriente a bajo de nuestra
secuencia.
Los resultados se obtienen en pocos segundos y se presentan en una tabla, cuyo título
es “Primer3 Output”. Estos incluyen un mapa de los mejores pares de oligonucleótidos (left-
izquierdo, right-derecho) de acuerdo a las especificaciones dadas en el formulario. Además, y
por defecto, Primer3 muestra 4 opciones de primers opcionales (en la sección “Additional
Oligos”).
Como habrá notado el programa resulta bastante sencillo de utilizar, la clave para su
utilización se encuentra en el conocimiento que tengamos acerca de los diferentes parámetros
que van a guiar nuestra reacción de PCR.
CODEHOP
CODEHOP (COnsensus – DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers) es un programa
interactivo que ha sido desarrollado para el diseño de primers degenerados provenientes de
bloques conservados de aminoácidos dentro de un alineamiento múltiple de secuencias
proteicas.
El programa se encuentra libre para su uso. Acceda al programa CODEHOP por medio
de la siguiente dirección: http://blocks.fhcrc.org/codehop.html. Después de unos segundos se
encontrará con una página web similar a la imagen siguiente:
Al mover la ventana del navegador hacia abajo, encontrará algunas secciones (muchas
menos en este caso) que le permitirá controlar una variedad de parámetros relacionados con
el diseño de primers.
De forma similar al programa visto anteriormente, por ser este, nuestro primer
acercamiento al diseño de primers degenerados mediante esta herramienta, utilizaremos un
set de condiciones mínimas (por default) y las secuencia correspondientes a los ARN
mensajeros que codifican para la proteína del gen Gurken en distintas especies de Drosophila.
Los números de acceso son los siguientes NP_476568.2 perteneciente a D. melanogaster,
XP_001962566.1 D. ananassae, XP_002018718.1 D. persimilis y XP_002132416.1 D.
pseudoobscura pseudoobscura.
Abra otra ventana y diríjase a la página del National Center for Biotechnology
Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov. En la solapa de búsqueda cambie All Database por
Protein. A continuación escriba el número de acceso y oprima el botón Search. Visualice la
solapa de Display Settings y elija FASTA. Copie las secuencias de los genes y péguelas en un
Bloc de notas.
Una vez cargado el archivo, oprima el botón Submit, luego de unos segundos
aparecerá la siguiente ventana:
Luego de oprimir el botón Look for primers y esperar unos segundos, aparecerá ahora
la página de resultados de CODEHOP:
Una vez que haya obtenido sus primers, su responsabilidad final es verificar que ellos
no hibridicen en cualquier parte – excepto en el lugar que Ud. quiere que hibridicen. Por lo
tanto, es muy recomendable que realice un análisis BLAST, con los primers recién diseñados,
de tal manera que se asegure que dichos primers no sean complementarios a ninguna de las
“posibles secuencias” involucradas en su reacción de PCR (por ejemplo, vectores de clonación).
La metodología para realizar dicho análisis es la misma que se sigue para cualquier análisis
BLAST, para este propósito puede visitar el servidor NCBI BLAST.