Práctica N° 6

Tinciones estructurales, coloración de endosporas,

flagelos y cápsula

1. Introducción
En su mayor parte, los microorganismos son demasiado pequeños para observarse a
simple vista o al microscopio óptico.

Estos microorganismos difieren en características tales como forma de nutrición,

estructura, tamaño, composición entre otros aspectos; es por ello que se emplea
colorantes o tintes que facilitan la observación de ciertas estructuras celulares
(Endosporas, flagelos y cápsula).

Las tinciones selectivas son aquéllas que nos permitirán observar una estructura celular
determinada, ya sea endosporas o flagelos. Respecto a la cápsula, estos componentes no
se combinan con los colorantes, por lo que para la observación de la misma se emplean
tinciones negativas (tinciones simples) con las que se oscurece el fondo de la preparación
y de esta manera se contrastan las cápsulas.
2. Desarrollo experimental
a. Tinción de endosporas: Método de Wirts-Conklin

 Se extrajo, con el asa de siembra, una pequeña colonia de Bacillus subtilis y se le dispersó
en una gota de agua sobre una lámina portaobjeto.
 Se procedió a fijarla al calor, sobre un mechero.

 Se cubrió la muestra con solucion verde-malaquita y se calentó hasta la emisión de

vapores, durante 5 minutos y se lavó con abundante agua.

 Se tiñó con safranina durante 1 minuto, se lavó con agua y se dejó secar.

 Finalmente, se procedió a visualizarlo, con aceite de inmersión, al microscopio.

b. Tinción de flagelos: Método de Leifson
 Se colocaron 2 gotas de cultivo bacteriano (Proteus) en un extremo de la lámina
portaobjeto y se la dejó correr.
 Se dejó secar a temperatura ambiente.
 Se cubrió con el colorante de Leifson, se dejó que actuara durante 10 minutos, se lavó
suavemente con agua destilada y se dejó secar al aire libre.
 Finalmente, se procedió a visualizarlo, con aceite de inmersión, al microscopio.

c. Tinción de cápsulas: Tinción negativa con tinta china

 Se colocó una pequeña muestra de cultivo de Klebsiella pneumoniae sobre una gota de
agua en el extremo de una lámina portaobjeto.
 Al lado de dicha muestra, se colocó una gota de tinta china y con otra lamina se procedió a
hacer una extensión a lo largo de la lámina portaobjeto (se forma una película muy
delgada).

 Se dejó secar al aire libre y se procedió a visualizarlo, con aceite de inmersión, al

microscopio.
 3. Resultados y discusión de resultados

a. Tinción de endosporas: Método de Wirts-Conklin

Figura N° 1: Las endosporas se visualizan de color verde y el soma bacteriano, color rojo.

 A pesar que la bacteria es una estructura muy pequeña, por medio de la tinción
con verde de malaquita, el cual requirió del calor para la penetración, se pudo
observar la estructura interna de la célula bacteriana, las endosporas.

b. Tinción de flagelos: Método de Leifson

Figura N° 2: Flagelos de Proteus sp.

  Los flagelos son estructuras, cuyo diámetro no excede de los 30mm, lo cual está
muy por debajo del poder de resolución del microscópico óptico. Para hacer
visibles a los flagelos se tuvo que aumentar su grosor, para lo cual se emplea una
suspensión de ácido tánico que al precipitarse sobre su cubierta forman una capa
que aumenta aparentemente su diámetro. Lo que propicia que al ser
posteriormente coloreado, tanto los flagelos como su disposición con respecto al
bacilo se hagan visibles al microscopista.

c. Tinción de cápsulas: Tinción negativa con tinta china

Figura N° 3: Muestra de Klebsiella pneumoniae. Se visualizan cápsulas como un halo refringente

sobre un fondo oscuro.

 Se empleó nigrosina o tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta
técnica permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo de
fondo oscuro.

4. Conclusiones
 Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico
oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel
importante en la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas.
 Las tinciones selectivas son aquéllas que permiten observar una estructura celular
determinada. Algunas bacterias tienen la capacidad de producir endosporas o
cápsulas. Las endosporas bacterianas son estructuras de resistencia que se
caracterizan por presentar varias capas compuestas de proteínas y azúcares
complejos, mientras que en el protoplasto de la misma existe un complejo de
dipicolinato de calcio, debido a esta composición, es muy difícil que los colorantes
penetren, por lo que al aplicar una tinción simple, estas aparecen como cuerpos
incoloros (dentro o fuera de la célula).
  La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las
células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia
de cápsulas alrededor de las células bacterianas

5. Cuestionario

1. ¿Qué utilidad tienen los procedimientos descritos en la presente practica? ¿En

qué casos particulares sería recomendable utilizar alguna de las técnicas
mencionadas? (Utilidad práctica de la tinción de flagelos, endosporas y capsula)
 En el caso de la tinción de flagelos, su utilidad yace en la identificación de especies
bacterianas de acuerdo al número y ubicación de sus flagelos.
 La utilidad de tinción de endosporas está en que permiten el diagnóstico oportuno
y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel importante en
la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas.
 La importancia de la tinción de endosporas reside en que se utiliza,
principalmente, para la detección de Cryptococos neoformans, hongo causante de
la criptococosis, infección que puede ser grave en pacientes con un sistema
imnunológico debilitado.

2. Investigue otros métodos de tinción de cápsulas.

 Tinción de Hiss

La tinción de Hiss es una tinción estructural (al igual que la tinción con nigrosina) que sirve
para poder observar cápsulas. Estas tinciones pueden teñir estructuras que sólo están
presentes en algunas especies y, por lo tanto, sirven como criterio de identificación.

 Tinción de Anthony

La tinción de Anthony con sulfato de cobre aumenta la refringencia de la cápsula.

6. Bibliografía
 Laboratorio de microbiología. “Tinciones selectivas”. (Fecha de consulta:
24/09/17). Enlace: http://microbiologiaulat2013.blogspot.pe/2013/12/tinciones-
selectivas.html