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Técnicas de tinción

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Técnicas de tinción.

Fundamentos
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión. La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depós ítos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán. Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe. La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil

de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas. Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Preparación de un frotis
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se t omó la muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla delgada de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme.

Examen de muestras al microscopio
Según la manipulación que efectuemos sobre la muestra a observar y según los colorantes que empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tinción.

Examen microscópico directo de las muestras clínicas Sin Tinción
No se utiliza ningún tipo de colorante. Es el montaje directo húmedo o examen en fresco: las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observación. El material que es

Examen microscópico de las muestras clínicas muy modificadas Diferencial Tinción Se utilizan varios colorantes combinados. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. por ejemplo de la célula huésped. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material. sobre todo en LCR. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la prese ncia de leucocitos.Entamoeba. El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que e l KOH digiere parcialmente los componentes proteicos. Trichomonas. etc En la imagen: Candida sp en un examen en fresco. huevos y quistes de otros parásitos. hifas de hongos. En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tinción con tinta china. Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos móviles de parásitos intestinales como Giardia. Las estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química. larvas y gusanos adultos.demasiado espeso para permitir la diferenciación de sus elementos puede diluirse con igua l volumen de solución salina fisiológica estéril. La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus). Los ejemplos clásicos sería la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen En la imagen: BGN y levaduras en una tinción GRAM microfotografía: Daniel Val . pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos. Azul Metileno de Loeffler. Examen microscópico de las muestras clínicas levemente modificadas Tinción Simple Se utiliza un solo colorante. por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china. Azul de lactofenol).

primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el . negativos. sino simplemente designan dos grupos morfologicos distintos de bacterias). describiremos aquí con algún detalle la tinción de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqué de su funcionamiento. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del Laboratorio de Microbiolog ía las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos. 80% 90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. positivos. Sólo 10% . los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico. quien la desarrolló en 1844. grampositivas y gramnegativas (en este caso. contiene una capa mucho más delgada. Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. se lava con agua. Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram. Lavar y secar. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram. La pared de la célula gram negativa. decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentale s de la pared celular de las distintas bacterias.20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano. las bac terias pueden dividirse en dos grupos. bacilos. únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram -positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. se cubre con solución Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua. etc) se basan justamente en la tinción de GRAM Descripta en forma breve. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. lipopolisacáridos. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen. la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal.Examen de muestras al microscopio: la tinción GRAM La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. por otro lado. y lipoproteínas. Generalmente.

El ingrediente activo es aquí el I2. no son permeables al disolvente ya que éste deshidrata la pared celular y cierra los poros. sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tinción de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. Algunos organismos son más grampositivos que otros y algunos son gram-variables. la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano).exceso de colorante. Habitualmente es un colorante de color rojo. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración. En este estado. todas las células. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo -yoduro potásico. están teñidas de azul. pero las gramnegativas son incoloras. esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bac terias gram-negativas. De nuevo ta nto las células grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. mientras que las grampositivas permanecen azules. unas veces grampositivos y otras gramnegativos. el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. usando una mezcla de alcohol-acetona. La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran. Se lleva a cabo después la decoloración. El yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células. como la safranina o la fucsina básica. 2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células grampositivas. a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido). tanto las grampositivas como las gramnegativas. 3) Cultivos más viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta .yodo. mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. es decir. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules. . Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas. El carácter de grampositivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. Las células grampositivas.

se encuentra la pared celular. El ácido Teicoico es el responsable del determinante antigénico del organismo. Entre la membrana citoplásmica y la pared celular hay un . y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato contacto con el citoplasma. Bacteria Gram Positiva Bacteria Gram Negativa Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. pero el lipopolisacárido entero se llama Endotoxina. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacci n al gram (ver las dos imágenes ó juntas). empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplásmica. La membrana exterior está hecha de proteína. unida a una membrana exterior por lipoproteínas. aminoazúcares. En el lipopolisacárido. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales. Estas sustancias (proteínas. Constituyentes importantes de la pared celular son los aminoácidos. la porción de lípido está embebida en el fosfolípido y el antígeno O polisacárido está en la superficie. Y ácido teicoico de la pared que está en la superficie y se une sólo a la capa de peptidoglicano. grasas) están enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared celular.Morfología ultramicroscópica de las bacterias: estructuras internas Pared celular Debajo de las sustancias extracelulares. Hidratos de carbono. el contenido graso es mucho más elevado en las gram -negativas que en las gram-positivas. El lípido se llama Lípido A y es tóxico. Por ejemplo. las paredes de las bacterias grampositivas contienen menos aminoácidos que las gram-negativas. como son las cápsulas y cubiertas mucilaginosas. Ácido Lipoteicoico que está en la superficie. que es una estructura rígida que da forma a la célula. fosfolípido y lipopolisacárido. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gramnegativas existen importantes diferencias. La pared de la célula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. azúcares y grasas.

Tiene enzimas respiratorias y durante la división celular el cromosoma se une a la membrana de la célula en el sitio llamado Mesosoma. También existen diferencias en la composición de la pared entre las células de las diversas especies. Sin embargo. selectiva. la cual es rica en RNA. y la parte líquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. Membrana Citoplásmica (citoplasmática o protoplasmática) Inmediatamente debajo de la pared celular. que es rica en DNA.espacio periplásmico con enzimas hidrolíticas. Ribosomas . forma partículas o corpúsculos macromoleculares. Estructuras Citoplasmáticas Nucleoide (cuerpo cromatínico) Las células bacterianas no contienen el núcleo característico de las células de las plantas y animales superiores. o partículas que se encuentran en las células animales y vegetales. de unos 200 A de diámetro. que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma. que se denomina membrana citoplásmica o protoplásmica y está formada por una bicapa de fosfolípido integral y proteínas periféricas empotradas. Citoplasma El material celular contenido dentro de la membrana citoplásmica puede dividirse en tres partes. específico para el DNA. combinado con proteínas. o envoltura. y aun cromosomas bacterianos. el ADN de la célula bacteriana se encuentra confinado en este espacio. Estas partículas de RNA-proteína se denominan ribosomas. contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como una estructura nuclear. doble hélice sin proteínas. Como no se trat de un núcleo a discreto. región citoplásmica. región nuclear o cromatínica. existe una membrana fina. y son el equivalente en las bacterias de los microsomas. se ha sugerido que se dé a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatínico. porque la sustancia nuclear es menos densa que el citoplasma cincundante. Se demuestra con el método de tinción de Feulgen. de apariencia granular. Se trata de una membrana semipermeable. La membrana citoplásmica tiene una significación funcional de suma importancia. El RNA. nucleoides. enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte. y po microscopia r electrónica. que controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la célula y la salida de los productos de desecho. equivalentes nucleares. es único y circular.

toxinas y otros factores. Diplococos. También tienen esta propiedad otros géneros de bacterias verdaderas. que son formas celulares muy resistentes. ya hemos explicado anteriormente que hablamos de microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul violeta y de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado. En lo relativo a la coloración. tienden a unirse formando cadenas. aparecen aislados y dispersos tras la división celular. o endosporas. Tinción GRAM: Morfología Bacteriana Ya hemos visto que la tinción de GRAM aporta dos ideas básicas para la deficinión "taxonómica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tinción y la forma que presentan las células bacterianas. Endosporas Algunas bacterias pueden transformarse en pequeños ovoides o esferas. la síntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora. Plásmidos Lazos extracromosómicos de ADN. Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción GRAM: Cocos Micrococos. se produce. Estafilococos. Todos los organismos de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan. aparecen en grupos irregulares. por su propiedad de producir esporas. en cierto período del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado. porque se producen intracelularmente. algún código para la resistencia a drogas. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de células vegetativas durante muchas generaciones. formando cadenas cortas División a lo largo de 2 planos División a lo largo de 3 planos . Sin embargo. pero sólo en casos aislados. en parte. Estreptococoss. aparecen por pares. dentro del citoplasma. a veces de gran tamaño forma esféri División a lo largo del mismo plano.Tienen estrecha relación con la síntesis de proteínas (30S y 50S para formar un complejo 70S). denominadas esporas.

Bacilos lado con lado o en figuras en X. cocobacilos Forma de vara: se llaman Bacilos Dos bacilos juntos: Diplobacilos Cadenas de bacilos: Estreptobacilos Empalizadas.. estreptobacilos. aureus . Borrelias .) Forma espiral rígida se llama: Espirilo Si la espiral es flexible y ondulada se llama: Espiroqueta Utilizamos el término Pleomorfismo para referirnos a la adopción de diferentes formas en una misma especie.ca: se llama Coco 2 cocos juntos: Diplococos 4 . V o Y Espirales (Treponemas. Tinción GRAM: Bacterias Gram-Positivas Cocos Gram-positivos Racimos: forma típica de Staphylococcus sp. como S.20 en cadenas: Estreptococos diferentes: Tétradas regularmente: Sarcinas irregularmente: Estafilococos Bacilos grandes variaciones morfológicas: fusiformes..

Streptococcus grupo B Tetradas: forma típica de Micrococcus sp Bacilos Gram-positivos Gruesos: forma típica de Clostridium sp. C. israelii . como S. perfringens.Cadenas: forma típica de Streptococcus sp. como A. pneumoniae. como C. septicum Finos: forma típica de Listeria sp Ramificados: forma típica de Actinomycetes y Nocardia.

edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.upenn. a menudo. como N.gráficos obtenidos de: http://www.htm Tinción GRAM: Bacterias Gram-Negativas Cocos Gram-negativos Diplococos: forma usual de Neiseria sp. Gram-variable.uphs. que puede ser Gram-positivo o Gram-negativo. Bacilos Gram-negativos . y. Acinetobacter puede ser pleomórfico. Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp. y a veces aparece como coco Gram-positivo. meningitidis También Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfología de diplococos.

edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram. como E.htm Otras tinciones de uso habitual RODAMINA-AURAMINA . como H. como V.uphs. cholerae.upenn. yCampylobacter sp.Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae. influenzae Curvados: forma usual de Vibrio sp. jejuni Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp gráficos obytenidos de: http://www. como C. Coli Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp.

De todos modos. Estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes parciales o débiles. ZIEHL-NEELSEN (BAAR) Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Se ha desarrollado una coloración de ácido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen ácidos-grasos de unos 50 átomos de carbono). evita la fluorescencia inespecífica. de los actinomiceos (muy semejantes pero no ácido-alcohol resistentes). El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. Lavar y teñir durante 3060 seg con Azul de Metileno (color de contraste). que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales. una gran cantidad de estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos positivos. el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción. después de la tinción con colorantes básicos. Lavar y secar . De hecho. De esta forma. si se elimina antes el aceite de inmersión. Lavar con agua. Las micobacterias como M. dependiendo del pH y de la concentración. el color de la fluorescencia puede variar.5 a 1%. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital.Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. NARANJA DE ACRIDINA El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. Estos colorantes se fijan a las bacterias.Nocardia spp son decoloradas por la mezcla ácido -alcohol estándar pero no por un tratamiento más suave con ácido sulfúrico 0. En algunas preparaciones de n aranja de acridina. como el colorante se intercala en el ácido nucleico. El permanganato de potasio. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes. tuberculosis y M. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. que además permiten la diferenciación morfológica. Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo. empleado como contraste. El frotis se tiñe durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. se tiñen con estos colorantes. Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado. incluyendo los esporozoarios parásitos. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia.

TINCIÓN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN) Algunos géneros bacterianos. FUNDAMENTO . producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Al finalizar el proceso de esporogénesis. Cuando el ambiente es favorable. compuestos tóxicos.) formándose una espora por cada forma vegetativa.BLANCO DE CALCOFLÚOR Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras mu estras. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre. según la fuente luminosa que se utilice. la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. En algunos laboratoríos ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana. entre los que destacan Clostridium y Bacillus. este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos. la espora germina generando una nueva forma vegetativa. etc. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes. temperaturas extremas. La capacidad de germinar perdura durante años. También se emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de los hongos. por lo que su estudio y observación son de enorme interés. Según fue descrito por Hageage y Harrington. radiaciones.

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. que quedarán teñidas con el segundo colorante. Además..Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente. estas cubiertas hacen que las esporas aparezca en el n microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción. tras la primera tinción. La tinción específica de esporas requiere dos colorantes: 1. 2.. . y sí lo harán las formas vegetativas. Las endosporas.Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas. no perderán el colorante en el lavado con agua.

Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min. Observar la preparación al microscopio. Nota: evitar que la muestra hierva. el 6. es importante que la muestra no se seque. 7. Anotar la disposición y la morfología de las tres especies del género Bacillus.REALIZACIÓN Se emplearán cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. 5. Teñir safranina 1 min. . Añadir más colorante si éste se evapora. 2. Secar la preparación. 3. Lavar abundante agua colorante. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género. Preparar los frotis bacterianos indicados. el exceso con de con con exceso de 4. 1. Teñir con verde malaquita. Lavar abundante agua colorante. Esta tinción es delicada en su realización y para poder obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones.

fercalx.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion. Objetivos www.com | Wide selection of value-oriented to premier De Lama Sterilizer Pharma&Hospital use.danival.delama. lo que provoca un abombamiento denominado "en huso".terruzzi. sphaericus posee endospora esférica con localización terminal y deformante de la célula vegetativa.asp | More than 50 years of experience in sterilization. Expert help. B. 1. . thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la célula vegetativa.html Métodos de esterilización en el laboratorio químico Enviado por ricardobotta Anuncios Google: Terruzzi Fercalx SpA driers www. Bibliografía: http://www. difieren en la una disposición morfología endosporas. StoneandGlass. subtilis forma una característico cilíndrica espora subterminal no deformante.Exfactory. por lo que suele ser denominada "en palillo de tambor".it/en/home. B.Las tres bacterias y empleadas de las en esta práctica B.com | The steam & vacuum technology Autoclaves and freeze Used Glass Mfg Machinery equipment.

Mesófilos (25 a 47 °C) y Termófilos (50 hasta 113 °C). mecánicos y químicos. aunque la clasificación más común es por la temperatura a la que se reproducen. pero sus esporas aún son viables y cuando encuentran un medio apropiado. los materiales de laboratorio para determinados diagnósticos y los elementos . A través de esta. se reproducen. Un microorganismo es un agente microscópico vivo e imperceptible a los sentidos que generalmente está agrupado en colonias. 6. el polvillo ambiental. que son los resistentes al frío y termorresistentes o resistentes a las altas temperaturas. inactivar o retener gérmenes engeneral y patógenos en particular. 7. LA ESTERILIZACIÓN Esta operación comprende todos los procedimientos físicos. 4.C. la que se desarrolla en un medio apropiado para formar colonias perceptibles. ya que tanto el instrumental como los medios de cultivo son invadidos con suma facilidad por los microbios del medio ambiente. Así se los puede clasificar en Criófilos (-5 a 14 °C).2. aunque bien puede estar como una unidad formadora de colonias (U. que no perjudican al hombre. 3. 8. La Esterilización Métodos físicos Calor húmedo ± Autoclave Chamberland Tyndalización Métodos químicos Radiación Bibliografía OBJETIVOS DE LA ESTERILIZACIÓN: No se puede hablar de esterilización sin considerar el concepto de microorganismo. Por ejemplo. el aire. 5. procedimiento que consiste en destruir todos los gérmenes vivos que existan sobre los objetos o sustancias que se desean libre de ellos (asépticos). El hecho de que existan distintos tipos de gérmenes en el medio ambiente. muchos hongos se destruyen con la temperatura.F.). Con el fin de subsanar éstos inconvenientes se practica la esterilización. Los microorganismos pueden ser patógenos (productores de ciertasenfermedades) o banales (los habitualmente hallados en los alimentos. rico en nutrientes y humedad. crea grandes dificultades en los estudios bacteriológicos. Por tal motivo la tecnología para su destrucción debe considerar éstasvariables. Los Microorganismos pueden clasificarse en criorresistentes. que se emplean para destruir. cuando es necesarioobtener las especies microbianas en estado de pureza.

1 Fuego Directo: Este procedimiento consiste en exponer a la llama de un mechero de Bunsen el objeto que se desea esterilizar. que luego se sustituyó por estufas de aire caliente. Aún así se sigue utilizando el calor seco en todos los laboratorios para la esterilización de placas de petri y pipeteros (recipientes metálicos para alojarpipetas para la siembra de sustancias líquidas). Antes de utilizar el objeto esterilizado es necesario dejarlo enfriar en un sitio aséptico. esto es tóxico por niveles elevados de electrolitos y fusión de membranas. MÉTODOS FÍSICOS: Calor La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura. siendo la más aconsejadas 170º C para el instrumental metálico y a 140º C para el contenido de los tambores. Y llevar el aire interior a una temperatura entre 150 y 190 °C. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos. Uno de los primeros aparatos utilizados para este fin fué el horno de Pasteur. la esterilización nunca es perfecta. 2.quirúrgicos y la pieldel enfermo alcanzan un estado de desinfección que evita la contaminación operatoria. La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos componentes o nutrientes de los microorganismos. el aire caliente generado por unaresistencia eléctrica circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras. 2. Este procedimiento tiene limitaciones debido a que deteriora los objetos y si son de gran volumen. 2.2 Calor Seco: El calor seco produce desecación de la célula. algunas agujas. requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja. a temperaturas vatriables. Cuando éste es de metal se deja permanecer en el área de reducción de la llama hasta que se ponga al rojo (asas de cultivo. en distinto grado. Si es de vidrio se deja untiempo prudencial. residuos que quedan adheridos al objeto estéril. Todos los microorganismos son susceptibles.3 Estufas: Para esterilizar por intermedio del aire caliente es necesario colocar los objetos en aparatos especiales llamados ESTUFAS. Estas constan de una doble cámara. procurando que la llama llegue a todos lados. etc) . CAPÍTULO 2 2. a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas. Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal denominados . fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

Uno de los extremos de éste dispositivo se halla en contacto con un interruptor que corta la alimentación de la resistencia calefactora. Cuando uno se dilata. consistente en dos metales de distinto coeficiente de dilatación. Tanto éste como otros dispositivos electrónicos ofrecen extrema sensibilidad de control. Estos efectos se deben principalmente a dos razones: *El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son producidas por reacciones que eliminan agua. Ventajas del calor seco: y y y No es corrosivo para metales e instrumentos. ya apto mas para estufas de cultivo que para esterilización. manteniendo así la temperatura de la cámara. el otro no lo hace y se arquea. Este tambor está en contacto con una llave interruptora. respecto al calor húmedo. MODERNIZACIÓN EN EL DISPOSITIVO DE CONTROL DE TEMPERATURA: Se ha logrado controlar la temperatura mediante un circuito electrónico que utiliza el microprocesador 555. *El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire. UN AVANCE EN EL CONTROL DE TEMPERATURA: En la actualidad la mayoría de las estufas de esterilización o de cultivo se termorregulan por medio de un termostato hidráulico que consiste en una ampolla metálica con gas en su interior. hermética. unida por medio de un capilar de metal a un tambor que varía su volumen cuando aumenta la temperatura. debido a la baja penetración del calor. utilizando como sensor una termorresistencia.de par bimetálico. CAPÍTULO 3 Calor Húmedo: El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. el que corta un relé que alimenta la corriente de la resistencia de calefacción. . Desventajas: *Requiere mayor tiempo de esterilización. la llave a la que está unido interrumpe el fluido eléctrico a la resistencia. Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas. Esta baja la resistencia a la corriente al aumentar la temperatura y la señal es enviada al procesador. de manera que si el gasinterior del tambor se dilata por el calor. y de sustancias viscosas no volátiles.

A partir de allí se cuenta el tiempo de esterilización. uno para el manómetro. AUTOCLAVE Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. Se cierra asegurando la tapa. para una válvula de seguridad que funciona por contrapeso o a resorte. Atmósferas Grados Centígrados . En 1884 aparece en París con el nombre de Chamberland un equipo para usar en laboratorio. luego del cual se debe esperar al descenso de la temperatura para abrir la espita de purga y la tapa del autoclave nuevamente. Pasteur en 1876. que en la parte inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica. otro para el escape de vapor en forma de robinete (también llamado espita) y el tercero. procurando que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla o canasta de metal.Antecedentes: El primer antecedente fue la marmita de Papin en 1681. Se cierra la espita de vapor y se espera hasta que llegue a la temperatura adecuada. trataba ropa y otros utensilios provenientes de personas infectadas exponiéndolos en una vasija a vapor recalentado y aire caliente obteniendo el material libre de infección. mariposas o charnelas. Equipo: Consta de una caldera de cobre.120° C deexposición al vapor eran equivalentes a una hora de calor seco a 130° . Esta tapa posee tres orificios. el que luego se masificaría en todos los laboratorios biológicos. semejante a una olla a presión que permitía mantener el agua por encima de los 100° C. dejando abierta la válvula de escape hasta que todo el aire se desaloje y comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante. ajustando los bulones y se da calor. médico de Manchester. sostenida por una camisa externa metálica. Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos. En 1830 William Henry. Funcionamiento y método para esterilizar adecuadamente en Autoclave: Se coloca agua en la caldera. El modelo más usado es el de Chamberland. La caldera se cierra en la parte superior por una tapa de bronce sujetada por bulones.150° C. Koch y Wolffhugel en 1881 dan los fundamentos de la esterilización por calor seco y calor húmedo: 30 minutos a 110° .

El vapor de agua a fuerte presión actúa a mayores temperaturas: Tiempos de esterilización en autoclave: Del tiempo. necesitan poco tiempo. Los siguientes datos han sido tomados para una temperatura de esterilización de 250ºF (121ºC) a 15-20 PSI. y el único factor que se varía es el tiempo. y otras características propias de cada material. Generalmente los datos presión y temperatura son fijados. Los materiales necesitan diferentes tiempos de esterilización dependiendo de su textura. mientras otros como el metal quirúrgico necesitan más. Cristalería en General 20 minutos ‡ Agua en frascos 20 minutos ‡ Jeringas de Vidrio 20 minutos ‡ Bandeja 30 minutos ‡ Equipo de transfusión 30 minutos ‡ Paquetes de maternidad 30 minutos ‡ Ropa 30 minutos ‡ Torundas 30 minutos ‡ Paquete quirúrgico 45 minutos ‡ Instrumental de acero inoxidable 45 minutos . porosidad. temperatura y presión usados en la esterilización depende el éxito alcanzado. ‡ Guantes de Caucho (Hule) 15 minutos ‡ Sondas (base tejida) 15 minutos ‡ Sondas (látex) 15 minutos ‡ Frascos de Vidrio.0 100 112 120 128 135 1/2 1 1 1/2 2 Este proceso de esterilización es el que mejor resultados dá en microbiología. Algunos materiales como el hule.

Como Cargar el Autoclave a) Se deben acomodar los bultos o paquetes de tal forma que haya una libre circulación de vapor entre ellos (no tratar de llenar el autoclave hasta sobrecargarlo). 56º u 80º para evitar la descomposición de las sustancias a esterilizar.*Cuando se esteriliza se deben hacer paquetes bien cerrados y bien ordenados. o sea funcionando a la presión normal. Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland. Ventajas del calor húmedo: y y y y y Rápido calentamiento y penetración Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo No deja residuos tóxicos Hay un bajo deterioro del material expuesto Económico . c) Esterilizar los líquidos separándolos de otros materiales. pueden ser destruidas cuando la misma operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones. e) La cristalería deberá esterilizarse colocando los recipientes boca abajo u horizontales (nunca con la boca hacia arriba). hecha en determinadas condiciones. d) Cuando se esterilizan líquidos. El método utilizado para envolver los paquetes deberá garantizar el mantenimiento de las condiciones de esterilidad de los materiales durante sualmacenamiento. b) Colocar de lado las botellas. debe hacerse con los recipientes destapados. por las temperaturas elevadas. Ej. Esto permite un pronto desplazamiento del aire y un rápido contacto del vapor con las superficies de las vasijas y su contenido. dejando abierta la válvula de escape. CAPÍTULO 4 Tyndalización: Esterilización por acción discontinua del vapor de agua. para que haya buena penetración de vapor en el material. No incluir dentro del mismo paquete material con diferentes tiempos de esterilización. frascos y cualquier clase de recipiente no poroso de material seco. También facilita el secado. : Lencería y Vidrio. Puede también realizarse a temperaturas más bajas. se basa en el principio de Tyndall Las bacterias que resisten una sesión de calefacción.

plegado. soluciones intravenosas. medios para cultivos celulares. estos últimos están en el límite de separación según el diámetro de poro que se utilice. platino. Los antiguos filtros se fabricaban en forma de bujías que son cilindros huecos abiertos por una extremidad y cerrados por otra. la que puede efectuarse mediante presión o aspiración. El agua a 100 °C no garantiza una adecuada esterilización. El tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter lamuestra. se aplica la técnica de filtración. de paredes de espesor variable. Un claro ejemplo de ello fue el sistema utilizado hasta hace pocos años para esterilizar jeringas de vidrio y agujas hipodérmicas de níquel con embocadura de bronce ó en el mejor de los casos. En este tipo de filtros la retención de las . refiriéndose tal vez a varios grados de arena). La filtración se reconoció como técnica de esterilización a partir de las observaciones de Koch en 1893. El agua del río Elba. la acción del calor. drogas diagnósticas. Existen tres tipos básicos de filtros: a. La filtración se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolábiles. soluciones oftálmicas. con la epidemia de cólera y la presencia del vibrión en el agua. sin descomponerse . o pegado dentro de los canales de flujo. Cuando el líquido a filtrar no puede resistir. Esta observación fue ilustrada en la epidemia HamburgoAltona en 1892. donde el agua del Elba era filtrada por arenas (nótese el plural. FILTRACIÓN: Este procedimiento es aplicable a la esterilización de líquidos y gases. algunos tipos de pomadas. radiofármacos. especialmente los primeros. no obstante posee la propiedad de desprender las colonias o los microorganismos y destruir aquellos que son susceptibles a ésta temperatura. Se basa en el pasaje de líquidos a través de sustancias porosas que detienen a los microbios. Los filtros de porcelana se llaman "de Chamberland" y los de tierras infusorias calcinadas se denominan "Berkefield" En la actualidad se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. activado. Los filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas. Ebullición: Durante mucho tiempo se "hirvieron" los utensilios y materiales quirúrgicos o jeringas hipodérmicas para esterilizarlas. que contenía Vibrio comma pasab a a las cañerías de agua de Hamburgo.Filtros profundos o Filtros de profundidad: Consisten de un material fibroso o granular prensado. Solo aparecieron unos pocos casos de cólera en el suburbio de Altona. antes de su distribución. y soluciones de antibióticos y vitaminas. Su usa para esterilizar aceites. hirviéndolos en agua.Desventajas: y y No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.

b. éstos métodos tienen una importancia secundaria. ESTUFAS DE ESTERILIZACION POR OXIDO DE ETILENO Destruye todos los organismos y microorganismos conocidos. Schrader y Bossert y . de locales. autores americanos: Bac. celofán. de mesas de trabajo. Cuando la superficie es resistente.Membranas filtrantes: Tienen una estructura continua. c. piel. En comparación con los procedimientos físicos. metal. Esteriliza sin deterioro artículos de goma.partículas se produce por una combinación de absorción y de retención mecánica en la matriz. papel. Partículas más pequeñas al tamaño del poro quedan retenidas en la matriza del filtro debido a efectos electrostáticos. Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente. y para destruir gérmenes que puedan caer enlugares de trabajo. con un soporte de papel siliconado para suQMillipore ha desarrollado membranas de 0. etc.madera. AGENTES QUÍMICOS La Iodopovidona (pervinox).45 protección debido a la fragilidad de la misma. Funcionan como tamices. por lo cual se les considera venenos generales. los destruyen.Filtros de huella de nucleación (Nucleoporo ): Son películas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiación y sustancias químicas. mostrándose como venenos específicos. Este método es óptimo para la antisepsia de las manos del operador. plástico. el Cloruro de Benzalconio (sal de amonio cuaternario o Cloruro de Zefirano) son ejemplos de antisépticos útiles para desinfectar manos y superficies. Algunos de ellos ejercen su acción nociva sobre todas las células. al actuar sobre los gérmenes. lana. En 1928. Cotton y Ellington. Esterilización con embalajes: a este gas son permeables sustancias como polietileno. CAPÍTULO 5 MÉTODOS QUÍMICOS: Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los mic roorganismos. La firma y 14 cm de diámetro. por el contrario otros actúan sobre algunas especies bacterianas. de jaulas de animales. la ue debe ser monada en un soporte estéril y que permita el ingreso del líquido a esterilizar a presión. productos farmacéuticos. Los antisépticos son considerados venenos protoplasmáticos que. incluso esporas y virus. y la retención se debe principalmente al tamaño de la partícula. el mejor agente biocida es el Hipoclorito de Sodio (agua lavandina). evitando el paso de toda partícula con un tamaño mayor al del poro. nylon.

Trabajo de Phillips y Kaye. después de una esterilización. etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo. la humedad. plastico. Es utilizado en la esterilización gaseosa. etc. En 1933 fueron certificadas las propiedades del óxido de etileno en un laboratorio de La Sorbona y en 1939 se estudió en un laboratorio deinvestigación del Ejercito de U. El gas se adquiere en botellas metálicas o cartuchos que se vaporizan. y además cancerigeno. bombas cardiorrespiratorias. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable (goma.S. El Oxido de etileno es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos. el vacío que se produce.15 veces el volumen de óxido de etileno. vidrio.). etc. efectivo a bajas temperaturas y penetra sustancias porosas. Destruye todos los microorganismos incluso virus. Estos compuestos destruyen las esporas. amino. hidroxilos. El tiempo de esterilización que requiere el material depende de múltiples variables. es decir que reduciendo la temperatura aumenta el tiempo de exposición requerido. la concentración del gas expresado en gs. descubrieron las propiedades del óxido de etileno. generalmente en la industria farmacéutica. metal. y luego un enjuague de 10 minutos. El óxido de etileno era bactericida. Puede esterilizar plástico. Con aldehídos Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas. goma. sulfhidrilos. cambian de líquido a gas a 10º C. aniónicos y anfóteros Organo Mercuriales . esporicida.A. etc. Este método tiene la ventaja de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío. Todos los artículos deberán airearse por 6 hs. con gran poder de penetración./l y la temperatura. papel. metal.Autores alemanes: Gassner y Hase. Alcoholes Iodo Antisépticos Agentes catiónicos. para evitar su poder explosivo y su alto potencial inflamable se mezcló con CO2 en una proporción de 7. provocando una modificación irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimática. equipos electrónicos. Glutaraldehído: Consiste en preparar una solución alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos.

que después pueden ser expuesta al calor para un rápida esterilización (acción del gas formaldehído). y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos. en cuya base se colocan las pastillas y se calienta hasta los 60° C y pueden esterilizar materiales de látex. Se utilizan a escala industrial por sus costos. sondas. . CAPÍTULO 6 RADIACIÓN: Su acción depende de: y y y El tipo de radiación El tiempo de exposición La dosis Radiaciones Ionizantes: Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos.plásticos. etc. que son cajas de doble fondo. se utilizan para la esterilización en quirófanos.Colorantes Cloro y Compuestos clorados Aldehídos Desinfectantes y/o Esterilizantes Oxido de Etileno Compuestos Fenólicos Acidos y Alcalis Formaldehído: Se utilizan las pastillas de paraformaldehido. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies. Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas descartables. Rayos Ultravioleta: Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos. las cuales pueden disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o algodón. llamadas también de formalina. etc. Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs. estructuras proteicas y lipídicas. También pueden ser usadas en Estufas de Formol. goma.

.... a 115 °C toma un color verde oscuro) 5..... vacunas.. Esta mezcla toma un color rojo rubí a 110 °C.. Hidrato de Terpina. que viran de color.. Mesentericus de la ... alimentos..Mezcla de Gérard: Fucsina... 0...00 g.. Benzonaftol.. 3..Rayos Gamma: Su empleo esta basado en los conocimientos sobre la energia atomica... Control de calidad: La correcta esterilización se puede controlar mediante dos métodos.. especialmente esporulados y los que presentan mayor resistencia como el bacilus subtilis o el b. Mezcla de Gérard Metil Violeta. 100.1 g.... Verde Brillante.... 1.. Pruebas de cultivo: También pueden colocarse gérmenes vivos..... Benzonaftol........ Este tipo de esterilización se aplica a productos o materiales termolábiles y de gran importancia en el campo industrial...01 g...Mezcla de Demande: Safranina... colocándose junto con el material a esterilizar. Indicadores: Cintas comerciales que se colocan en el paquete o caja a esterilizar. Se describe la composición de los llamados "testigos de esterilización" preparadas por sustancias químicas..250 g... Esta mezcla es azul a la temperatura ordinaria.. Las mezclas se colocan en ampollas y se cierran a la lámpara.. cuando se alcanzan las temperaturas adecuadas para la esterilización. etc.... 1 g....... Acetanilida. Mezcla violeta pálido que a 117 °C se vuelve violeta oscuro.. Puede esterilizar antibióticos. 1 g. 2..... siendo el segundo el más seguro..... Mezcla de Gérard 4.100 g.....100 g....... Ésta mezcla se colorea de rojo cuando sufre una temperatura de 110 °C.

6. 1950. (texto en Francés) Ern. 1919. Bibliografía: 1-Carlos M. Barzizza ± Microbiología ± Tomo 1 y 2± Librería Hachette. 9-Notas.Deutsche Gesellchaft fur thechnische. 8. Proyecto de mantenimiento hospitalario. 3-Catálogo Cole ± Parmer 2002. Ricardo Botta Técnico en Electromedicina ± Químico. UTHEA. esterilizándose conjuntamente con el material para luego sembrar una suspensión de los gérmenes para observarse en agar nutritivo a las 24 Hs. S.papa (también responsable de la filamentación en el pan). 2-Microbiología de ZINSSER. Williams. 2003-2005. As. 5-Téchnique de Sterilisation.com . Paris. ricardobotta[arroba]uolsinectis. Bs. 2002. Vigot fréres. Si existe o nó desarrollo de colonias. Gérard. 2004. experiencias y material personales. 1970. Editorial Elefantre. Salvador. 9.Catálogo Cat-Lab. 4-Catálogo Sigma.ar ricardobotta[arroba]hotmail.7. Revisada por Smith y Martín. 1960.A manual of Bacteriology ± H.com.Material publicado en internet.Blakiston¶s son & Co. Marzo de 1997.

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